Name: Nowy, wysokowydajny model ran skóry owiec ex vivo do testowania nowych antybiotyków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj nowy model ran skóry owiec ex vivo do testowania antybiotyków przeciwko Staphylococcus aureus. Ta metoda zapewnia szybsze i bardziej wiarygodne wyniki w badaniach przedklinicznych niż tradycyjne techniki mikrobiologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować EPSRC (EP/R513313/1) za dofinansowanie. Autorzy chcieliby również podziękować R.B. Elliotowi i Son Abattoir w Calow, Chesterfield, za dostarczenie głów jagniąt i za to, że byli tak przychylni na wczesnych etapach projektu, Kasi Emery za jej wsparcie podczas opracowywania tego protokołu oraz Fionie Wright z Wydziału Infekcji, Odporności i Chorób Sercowo-Naczyniowych na Uniwersytecie w Sheffield za przetwarzanie próbek histologicznych i bycie tak niezwykle pomocnym podczas całego projektu.

Głowy jagniąt z rzeźni R.B Elliott and Son zostały użyte jako źródło próbek skóry w tym projekcie. Wszystkie jagnięta były zabijane w celu spożycia jako żywność. Zamiast wyrzucać głowy, zostały one ponownie wykorzystane do badań. Zgoda etyczna nie była wymagana, ponieważ tkanka pochodziła z odpadów wyrzuconych z rzeźni.
1. Sterylizacja
<ol>
	<li>Zdezynfekuj kleszcze przed pobraniem głów, pobierając czyste kleszcze i wykonując sterylizację na sucho w piecu w temperaturze 200 °C przez 1 godzinę. Przed użyciem należy sterylizować w autoklawie wszystkie szklane naczynia w temperaturze 121 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Wszystkie opisane prace należy wykonać w szafie mikrobiologicznej klasy 2. Przygotuj wszystkie odczynniki zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>W rzeźni jagnięta Swaledale były zabijane przez ogłuszenie przy użyciu elektryczności lub pistoletu z bolcem i wykrwawiane. Głowy jagnięce zbierać nie później niż 4 godziny po uboju.</li>
</ol>
3. Przygotowanie głów
<ol>
	<li>Zdezynfekować część czoła jagnięcia, wlewając około 100 ml roztworu dwutlenku chloru o stężeniu 200 ppm na obszar próbki. Ogol czoło głowy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia i umyj obszar 200 ml roztworu dwutlenku chloru o stężeniu 200 ppm.</li>
	<li>Przetrzyj obszar etanolem i niebieską rolką i przykryj obszar próbki kremem do depilacji przez 35 minut. Delikatnie zeskrob krem do depilacji za pomocą narzędzia do skrobania i oceń obszar próbki. Jeśli pozostała znaczna ilość włosów, powtórz proces usuwania włosów.</li>
	<li>Użyj kolejnych 200 ml roztworu dwutlenku chloru, aby spłukać obszar, a następnie spłucz etanolem i przetrzyj niebieską rolką.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego dziurkacza do biopsji o średnicy 8 mm wytnij 8 mm próbki skóry z przygotowanego obszaru. Usuń próbki za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela z 15 ostrzami, upewniając się, że cały tłuszcz skórny został usunięty.</li>
	<li>Umieść próbki w sterylnym słoiku o pojemności 0,5 l wypełnionym sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), a następnie przenieś je do sterylnych probówek o pojemności 50 ml z 50 ml roztworu 200 ppm dwutlenku chloru, dwukrotnie odwróć i pozostaw do sterylizacji na 30 minut.</li>
	<li>Wyjąć próbki z roztworu dwutlenku chloru i umyć je, umieszczając je w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 40 ml sterylnego PBS. Po umyciu każdą pojedynczą próbkę skóry należy umieścić w oddzielnym dołku na 24-dołkowej płytce.</li>
	<li>Dodać 350 μl wstępnie podgrzanej pożywki, utrzymując próbkę na granicy faz powietrze-ciecz. Skład pożywki jest następujący: pożywka MK (pożywka 199 z solami Hanksa, L-glutaminianem i 1,75 mg/ml wodorowęglanu sodu) oraz F12 Hama w stosunku 1:1, z dodatkiem FBS (10% v/v), EGF (10 ng/ml), insuliny (5 μg/ml), penicyliny-streptomycyny (100 U/ml) i amfoterycyny B (2,5 μg/ml).</li>
	<li>Uszczelnić 24-dołkowe płytki płytką przepuszczającą gaz, uszczelnić i inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze tkanek o stężeniu 5% CO2 przez okres do 24 godzin.</li>
</ol>
4. Konserwacja próbek skóry
<ol>
	<li>Po inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną i przepłukać próbki w 500 μl sterylnego PBS. Do każdej próbki dodać pożywkę wolną od antybiotyków i inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze tkanek o stężeniu 5% CO2 przez 24 godziny w celu usunięcia pozostałości antybiotyków z próbki.</li>
	<li>Jeśli po 24 godzinach w pożywce wolnej od antybiotyków wystąpi zmętnienie lub infekcja grzybicza, należy wyrzucić próbkę.</li>
</ol>
5. Przygotowanie inokulum
<ol>
	<li>Przygotuj probówkę o pojemności 50 ml z 10 ml sterylnego tryptycznego bulionu sojowego. Weź świeżą płytkę agarową S. aureus i za pomocą wacika przenieś kilka kolonii do bulionu. Inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C przy 150 obr./min.</li>
	<li>Wirować przy 4 000 x g przez 3 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml sterylnego PBS. Powtórz dwukrotnie, aby zapewnić odpowiednie umycie komórek.</li>
	<li>Ustawić inokulum na 0,6 OD600 w sterylnym PBS. Potwierdzić ładunek inokulum, przeprowadzając ręczne liczenie żywotnych płytek.</li>
</ol>
6. Zakażenie próbek skóry
<ol>
	<li>Przygotuj świeżą 24-dołkową płytkę z 400 μl wstępnie podgrzanej pożywki wolnej od antybiotyków i dodaj 24-dołkowe wkładki za pomocą sterylnych kleszczyków.</li>
	<li>Usunąć podłoże z próbek skóry, przemyć 500 μl sterylnego PBS i usunąć płyn do płukania. Użyj sterylnych kleszczy, aby delikatnie przytrzymać próbkę na dnie studzienki.</li>
	<li>Użyj biopsji dziurkowania 4 mm, aby wykonać centralny płat rany, przebijając się na przybliżoną głębokość 1-2 mm. Następnie za pomocą skalpela z 15 ostrzami i sterylnych ząbkowanych kleszczyków tkankowych allis należy usunąć wierzchnią warstwę płata rany. Zmienność wymiarów rany może mieć wpływ na wynik zakażenia i końcowe jednostki tworzące kolonie (CFU).</li>
	<li>Gdy wszystkie próbki zostaną zranione, przenieś je do wkładek 24-dołkowych za pomocą sterylnych kleszczy. Odpipetować 15 μl inokulum bakteryjnego do łożyska rany. Następnie inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze tkankowym o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Jeśli konieczne są dłuższe okresy inkubacji, należy usunąć pożywkę i zastąpić ją nową pożywką co 24 godziny i inkubować w tych samych warunkach.</li>
</ol>
7. Określenie obciążenia bakteryjnego
<ol>
	<li>Usuń media z dna studzienek. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś każdą próbkę do oddzielnej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 1 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Użyj homogenizatora z cienką końcówką, aby homogenizować powierzchnię próbki. Należy upewnić się, że łożysko rany ma bezpośredni kontakt z końcówką homogenizatora.</li>
	<li>Homogenizować każdą próbkę przez 35 s na średnim/wysokim. Homogenizator odrywa bakterie od powierzchni łożyska rany, aby umożliwić zliczenie ładunku bakteryjnego.</li>
	<li>Po przetworzeniu wszystkich próbek, przed pipetowaniem należy kolejno zawirować każdą próbkę. Ma to na celu zapewnienie wymieszania homogenatu bakteryjnego.</li>
	<li>Pobrać pipetą 20 μl homogenatu z wirem do odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej 180 μl sterylnego PBS.</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę homogenatu do 1 x 10−7 i pipetować 10 μl rozcieńczonego homogenatu na tryptyczną płytkę agarową sojową w trzech powtórzeniach.</li>
	<li>Inkubować płytkę agarową przez 18 godzin w temperaturze 37 °C. Następnie policz liczbę kolonii, aby określić CFU dla każdej próbki.</li>
</ol>

<ol><li>Claeys, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+application+of+published+risk+factors+for+methicillin-resistant+S.+aureus+in+acute+bacterial+skin+and+skin+structure+infections%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).</li>
<li>Rahim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+contribution+in+chronicity+of+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Bacterial contribution in chronicity of wounds.</a> Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).</li>
<li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costs+and+outcomes+in+evaluating+management+of+unhealed+surgical+wounds+in+the+community+in+clinical+practice+in+the+UK%3A+A+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study.</a> BMJ Open. 8 (12), 022591(2018).</li>
<li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+A+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li>
<li>Wilcox, M. H., Dryden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+epidemiology+of+healthcare-acquired+bacterial+infections%3A+Focus+on+complicated+skin+and+skin+structure+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).</li>
<li>Han, G., Ceilley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+healing%3A+A+review+of+current+management+and+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chronic wound healing: A review of current management and treatments.</a> Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).</li>
<li>Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+tolerance+and+the+significance+of+persister+cells+in+recalcitrant+chronic+wound+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).</li>
<li>Dheman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+antibacterial+drug+development+trends+in+the+United+States%2C+1980-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019.</a> Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).</li>
<li>MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue-engineered+skin+and+oral+mucosa+for+clinical+and+experimental+use%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+ex+vivo+porcine+skin+explant+model+for+the+assessment+of+mature+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).</li>
<li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).</li>
<li>Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+murine+model+for+delayed+wound+healing+using+a+biological+wound+dressing+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).</li>
<li>Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+human+tissues+for+research%3A+What+investigators+need+to+know%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">The use of human tissues for research: What investigators need to know.</a> Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).</li>
<li>Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+human+skin+model+for+studying+skin+barrier+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair.</a> Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).</li>
<li>Torres, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+murine+skin+model+for+B.+burgdorferi+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm.</a> Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).</li>
<li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+wound+healing+in+diabetic+%28db%2Fdb%29+mice+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+challenge%3A+A+model+for+the+study+of+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds.</a> Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).</li>
<li>Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+biofilms+impair+wound+healing+by+delaying+reepithelialization+in+a+murine+cutaneous+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).</li>
<li>Trøstrup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB%2Fc+mice+in+a+novel+chronic+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li>
<li>Thompson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gallium+citrate+formulations+against+a+multidrug-resistant+strain+of+Klebsiella+pneumoniae+in+a+murine+wound+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).</li>
<li>Maboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+skin+explant+model+to+study+anaerobic+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404(2017).</li>
<li>Macneil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+opportunities+for+tissue-engineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress and opportunities for tissue-engineered skin.</a> Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).</li>
<li>Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+preclinical+antibacterial+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The global preclinical antibacterial pipeline.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).</li>
<li>Miethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+sustainable+discovery+and+development+of+new+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics.</a> Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).</li>
<li>Guedes, G. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+situ+model+of+biofilm-associated+wounds%3A+Providing+a+host-like+environment+for+the+study+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).</li>
<li>Johnson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmenting+the+activity+of+chlorhexidine+for+decolonization+of+Candida+auris+from+porcine+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin.</a> Journal of Fungi. 7 (10), 804(2021).</li>
<li>Horton, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+auris+Forms+High-Burden+Biofilms+in+Skin+Niche+Conditions+and+on+Porcine+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin.</a> mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).</li>
<li>Ashrafi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+biofilm+formation+on+human+skin+wound+models+and+demonstration+of+clinically+translatable+bacteria-specific+volatile+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures.</a> Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).</li>
<li>Brackman, G., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+biofilm+wound+models+and+their+application%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo biofilm wound models and their application.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).</li>
<li>Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRumbaugh%2C+KP+%22Biofilm+Infections%22">Biofilm Infections</a>. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).</li>
<li>Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sheep+model+to+investigate+the+role+of+fungal+biofilms+in+sinusitis%3A+Fungal+and+bacterial+synergy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Forum+of+Allergy+%26+Rhinology%22%5BJournal%5D)">A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy.</a> International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).</li>
<li>Williams, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+of+biofilm+implant-related+osteomyelitis+to+test+combination+biomaterials+using+biofilms+as+initial+inocula%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).</li>
<li>Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+sheep+models%3A+From+asthma+to+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines.</a> Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).</li>
<li>Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+replacement+skin%3A+The+crossroads+of+biomaterials%2C+wound+healing%2C+embryonic+development%2C+stem+cells+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration.</a> Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).</li>
<li>Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogenous+skin+fibroblast+transplantation+enhances+excisional+wound+healing+following+alloxan+diabetes+in+sheep%2C+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial.</a> International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).</li>
<li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+mesenchymal+stem+cells+improve+the+wound+healing+process+of+sheep+skin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Roberts, C. D., Windsor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+pain+management+solutions+in+animals+may+provide+improved+wound+pain+reduction+during+debridement+in+humans%3A+An+opinion+informed+by+veterinary+literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature.</a> International Wound Journal. 16 (4), 968(2019).</li>
<li>Mazzone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+and+in+utero+transplantation+of+fetal+skin+in+the+sheep+model%3A+A+crucial+step+towards+clinical+application+in+human+fetal+spina+bifida+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).</li>
<li>Olkowska, E., Gržinić, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909(2022).</li>
<li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Opracowanie środków przeciwdrobnoustrojowych jest ważnym, ale kosztownym przedsięwzięciem, które szacuje się na około 1 miliard dolarów, a jego ukończenie zajmie około 15 lat. Ponad 90% badań nad odkrywaniem leków przeciwdrobnoustrojowych i badaniami przedklinicznymi nad skutecznością leków przeciwdrobnoustrojowych jest przeprowadzanych przez naukowców akademickich oraz małe i średnie firmy zatrudniające zazwyczaj mniej niż 50 pracowników22. Zespoły te są bardzo ograniczone finansowo, co sprawia, ...

Infekcje skóry są poważnym globalnym problemem, z dużymi kosztami ekonomicznymi dla dostawców usług medycznych na całym świecie. Rozwój oporności wielolekowej i tworzenie biofilmu przez patogeny odgrywa kluczową rolę w występowaniu niegojących się ran1,2,3,4. W związku z tym infekcje skóry i tkanek miękkich są jednym z najczęstszych powodów przedłużającej się hospitalizacji i późniejszej readmisji5. Opóźnienia w gojeniu się ran są kosztowne zarówno dla pacjenta, jak i pracowników służby zdrowia, a niektóre szacunki sugerują, że rocznie w USA dotyka ich około 6,5 miliona pacjentów. W Wielkiej Brytanii infekcje skóry i związane z nimi powikłania powodują około 75 000 zgonów rocznie2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) to groźny patogen ran, często izolowany z ran pacjenta2,7. Tempo pojawiania się oporności wielolekowej drastycznie wzrosło w 2000 roku. W tym czasie około 60% ostrych bakteryjnych infekcji skóry i struktury skóry było dodatnich w posiewie na obecność opornego na metycylinę S. aureus1. Rosnąca liczba szczepów wielolekoopornych wśród gronkowców, a także innych patogenów, w ciągu ostatnich 2 dekad wskazuje na pilną potrzebę szybkiego opracowania antybiotyków o nowych sposobach działania, które mogą przezwyciężyć oporność.
Jednak od początku 2000 roku, programy odkrywania antybiotyków były zdominowane przez dłuższy czas rozwoju i niskie wskaźniki sukcesu, a tylko 17% nowych antybiotyków wchodzących w fazę badań klinicznych w USA uzyskało aprobatę rynkową8. Sugeruje to rozbieżność między wynikami badań in vitro nowo pojawiających się antybiotyków a ich wynikami klinicznymi. Można twierdzić, że rozbieżność ta wynika w dużej mierze z różnic w fizjologii bakterii podczas zakażeń in vivo oraz podczas konwencjonalnych metod mikrobiologicznych podczas testowania skuteczności antybiotyków w fazie przedklinicznej in vitro. Dlatego potrzebne są nowatorskie metody laboratoryjne, które są bardziej reprezentatywne dla fizjologii bakterii podczas infekcji, aby poprawić wskaźniki sukcesu w programach odkrywania antybiotyków.
Obecne metody badania infekcji skóry obejmują badania na żywych zwierzętach (np. myszach), modelach skóry ex vivo (np. świniach) oraz modelach skóry 3D inżynierii tkankowej (np. ludzkiej)9,10,11,12. Badania na żywych zwierzętach są ściśle regulowane i mają stosunkowo niską przepustowość. W modelach zwierzęcych zranienia i infekcje powodują znaczny stres u zwierząt i budzą obawy etyczne. Modele ludzkiej skóry, ex vivo lub inżynierii tkankowej, wymagają zatwierdzenia etycznego, zgodności z lokalnymi i globalnymi przepisami (Ustawa o tkankach ludzkich, Deklaracja Helsińska) i występują trudności w pozyskiwaniu tkanek, a niektóre żądania trwają latami, a spełnienie niektórych żądań trwa latami13,14. Oba typy modeli są pracochłonne i wymagają znacznej wiedzy specjalistycznej, aby zapewnić sukces eksperymentalny. Niektóre obecne modele zakażeń skóry ex vivo wymagają wstępnie zaszczepionych krążków i dodatków do łożyska rany, aby umożliwić infekcję; Chociaż modele te są niezwykle przydatne, istnieją ograniczenia w procesie infekcji, ponieważ dodatki ograniczają wykorzystanie łożyska rany jako źródła składników odżywczych10,15,16,17. Model opisany w tym badaniu nie wykorzystuje żadnych dodatków do łożyska rany, co zapewnia, że patologia infekcji i liczba żywotnych komórek są wynikiem bezpośredniego wykorzystania łożyska rany jako jedynego źródła składników odżywczych.
Biorąc pod uwagę potrzebę nowych metod laboratoryjnych, opracowano nowy, wysokoprzepustowy model infekcji skóry owiec ex vivo do wykorzystania w ocenie skuteczności pojawiających się antybiotyków. Badania nad infekcjami skóry napotykają wiele wyzwań - wysokie koszty, obawy etyczne i modele, które nie pokazują pełnego obrazu20,21. Modele ex vivo i modele 3D eksplantatów pozwalają na lepszą wizualizację procesu chorobowego i wpływu, jaki leczenie może mieć z bardziej istotnego klinicznie modelu. W tym miejscu opisano konfigurację nowatorskiego modelu skóry owczej, który jest prosty, powtarzalny i klinicznie istotny oraz ma wysoką przepustowość. Wybrano skórę owczą, ponieważ owce są jednym z dużych ssaków powszechnie wykorzystywanych do modelowania odpowiedzi na infekcje in vivo. Co więcej, są one łatwo dostępne w rzeźniach, co zapewnia stały dopływ skóry do badań, a ich tusze nie są parzone, co zapewnia dobrą jakość tkanek. W badaniu tym wykorzystano S. aureus jako przykładowy patogen; Jednak model dobrze współpracuje z innymi mikroorganizmami.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płytka towarzysząca</td><td>SLS&nbsp;</td><td></td><td></td>353504</tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 4 mm</td><td>Williams Medical</td><td>D7484</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10788561</tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 8 mm</td><td>Williams Medical</td><td>D7488</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B, sterylny</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Bezprzewodowa maszynka do strzyżenia włosów Colour Pro Style</td><td>Wahl</td><td>9639-2117X</td><td>Maszynka do strzyżenia włosów</td></tr><tr><td>Inkubator z podwójnym</td><td>piekarnikiem SLS</td><td>OVe1020</td><td>Piec sterylizujący</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu&nbsp;</td><td>SLS</td><td>E5036-200UG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Honeywell</td><td>458600-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>F12 HAM</td><td>Sigma</td><td>N4888</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Kleszcze Labtech International</td><td>CA-115/500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>15307805</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Veet</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i</td><td>Thermo Scientific</td><td>15373212&nbsp;</td><td>Inkubator do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td>VWR</td><td>521-2242</td><td>Homogenizator wirówkowy</td></tr><tr><td>220, ręczny</td> homogenizator <td>Fisher Scientific</td><td>15575809</td><td></td></tr><tr><td>220, stożki do mieszania tworzyw sztucznych</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15585819</tr><tr><td>Insert Individual 24-dołkowa membrana 0,4um</td><td>VWR International</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, rekombinowana ludzka</td><td>SLS</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 (MK media)</td><td>Sigma</td><td>M0393</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, hodowla komórkowa Costar 96 well</td><td>Fisher Scientific</td><td>10687551</td><td></td></tr><tr><td>Multitron</td><td>Infors</td><td>Nie dotyczy</td><td>Inkubator bakteryjny</td></tr><tr><td>Tabletki PBS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>SLS&nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki płytowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>ESI-B-100</td><td></td></tr><tr><td>Safe 2020</td><td>Szafa bezpieczeństwa mikrobiologicznego</td><td>Fisher Scientific</td><td>1284804</td> klasy II</tr><tr><td>Ostrze skalpela numer 15</td><td>Skalpel Fisher Scientific</td><td>O305</td><td></td></tr><tr><td>Swann Morton</td><td>Fisher Scientific</td><td>11849002</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ząbkowane kleszczyki do tkanek Allis</td><td>Rocialle</td><td>RSPU500-322</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>14432-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>41298-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Vimoba Tabletki</td><td>Quip Labs</td><td>VMTAB75BX</td><td></td></tr></tbody></table>

nowy, wysokowydajny model ran skóry owiec ex vivo do testowania nowych antybiotyków

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Rozwój środków przeciwdrobnoustrojowych jest kosztownym procesem o coraz niższych wskaźnikach sukcesu, co sprawia, że dalsze inwestowanie w badania nad badaniami nad środkami przeciwdrobnoustrojowymi staje się mniej atrakcyjne. Odkrywanie leków przeciwdrobnoustrojowych, a następnie ich komercjalizacja mogą stać się bardziej lukratywne, jeśli podejście "szybko i tanio" zostanie wdrożone na etapach optymalizacji leadów, w których naukowcy mają większą kontrolę nad projektowaniem i formułowaniem leków. W tym artykule opisano konfigurację modelu skóry zranionej ex vivo owiec zakażonego Staphylococcus aureus, która jest prosta, opłacalna, wysokowydajna i powtarzalna. Fizjologia bakterii w modelu naśladuje tę podczas infekcji, ponieważ namnażanie się bakterii zależy od zdolności patogenu do uszkodzenia tkanki. Ustalenie się zakażenia rany jest weryfikowane przez wzrost liczby żywotnych bakterii w porównaniu z inokulum. Model ten może być wykorzystany jako platforma do testowania skuteczności pojawiających się środków przeciwdrobnoustrojowych na etapie optymalizacji ołowiu. Można twierdzić, że dostępność tego modelu zapewni naukowcom opracowującym środki przeciwdrobnoustrojowe model "szybki i tani w razie awarii", co pomoże zwiększyć wskaźniki sukcesu w kolejnych badaniach na zwierzętach. Model ten ułatwi również ograniczenie i udoskonalenie wykorzystywania zwierząt do celów badawczych, a ostatecznie umożliwi szybsze i bardziej opłacalne zastosowanie nowatorskich środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w zakażeniach skóry i tkanek miękkich w praktyce klinicznej.

Identyfikacja metody sterylizacji skóry przed przygotowaniem modelu infekcji rany była problematyczna. Wyzwanie polegało na przeprowadzeniu sterylizacji skóry bez uszkodzenia jej poszczególnych warstw, co w przeciwnym razie mogłoby doprowadzić do niezamierzonych skutków w przebiegu infekcji. W celu opracowania odpowiedniego schematu sterylizacji przetestowano różne metody przez zróżnicowany czas trwania, zgodnie z opisem w Tabela 1Kontaminację odnotowano jako pojawienie się zmętnienia po 48 h w pożywce M...

Protokół opisuje krok po kroku metodę tworzenia ex vivo modelu zranionej skóry owcy zakażonej Staphylococcus aureus. Ten wysokowydajny model lepiej symuluje infekcje in vivo w porównaniu z konwencjonalnymi technikami mikrobiologicznymi i stanowi dla naukowców fizjologicznie istotną platformę do testowania skuteczności nowo pojawiających się środków przeciwdrobnoustrojowych.

Nowy, wysokowydajny model ran skóry owiec ex vivo do testowania nowych antybiotyków

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Model ten pozwoli naukowcom na krytycznych etapach przedklinicznych dokładniej określić skuteczność przeciwdrobnoustrojową nowych preparatów i zapewni naukowcom większą kontrolę nad projektowaniem i formułowaniem leków. Model ten umożliwia szybkie uzyskanie powtarzalnych wyników w reprezentatywnym środowisku rany. Zmniejsza to zapotrzebowanie na zwierzęta hodowane w tym celu i ułatwia szybsze przekazywanie miejscowych środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w zakażeniach ran do kliniki.Głównymi wyzwaniami są zanieczyszczenie i zręczność. Niezbędna jest ścisła technika aseptyczna i cierpliwość w przetwarzaniu tkanek; Do powodzenia tej metody potrzebne jest precyzyjne i celowe usuwanie klapy. Rozpocznij od dezynfekcji kleszczy, wystawiając je na suchą sterylizację cieplną w temperaturze 200 stopni Celsjusza przez godzinę.Autoklaw wszystkie szklane naczynia w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut przed użyciem. Zdezynfekuj czoło lampy, wlewając około 100 mililitrów roztworu dwutlenku chloru o stężeniu 200 PPM na obszar próbki. Ogol część czoła za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia, a następnie umyj 200 mililitrami roztworu dwutlenku chloru o stężeniu 200 PPM.Przetrzyj obszar etanolem i niebieską rolką, a następnie przykryj obszar próbki kremem do depilacji. Po 35 minutach delikatnie zeskrob krem do depilacji za pomocą narzędzia do skrobania i oceń obszar próbki. Powtórz proces usuwania włosów, jeśli pozostała znaczna ilość włosów.Przepłukać czysty obszar próbki 200 mililitrami roztworu dwutlenku chloru, a następnie etanolem i niebieską bułką. Użyj sterylnego ośmiomilimetrowego stempla do biopsji, aby wyciąć ośmiomilimetrową próbkę skóry z przygotowanego obszaru. Następnie usuń próbkę za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela z ostrzem 15, upewniając się, że cały tłuszcz skórny został usunięty.Umieść próbki w sterylnym słoiku o pojemności 0,5 litra wypełnionym sterylnym PBS. Następnie przenieś je do sterylnych 50-mililitrowych probówek wypełnionych 50 mililitrami roztworu dwutlenku chloru o stężeniu 200 PPM. Odwróć probówkę dwukrotnie i pozostaw do sterylizacji na 30 minut.Przenieś próbki do 50-mililitrowej probówki wypełnionej 40 mililitrami sterylnego PBS. Po umyciu PBS każdą próbkę skóry umieścić w oddzielnym dołku na 24-dołkowej płytce. Dodaj 350 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do studzienki, utrzymując próbkę na granicy faz powietrze-ciecz.Uszczelnij 24-dołkowe płytki uszczelką przepuszczającą gaz przed umieszczeniem płytki do inkubacji w wilgotnym inkubatorze tkanek w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną i przepłukać próbki w 500 mikrolitrach sterylnego PBS. Usuń pozostałości antybiotyków z próbki, traktując je pożywką wolną od antybiotyków w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Jeśli w pożywce wolnej od antybiotyków rozwinie się zmętnienie lub infekcja grzybicza, próbkę należy wyrzucić. Następnie przygotuj 50-mililitrową tubkę z 10 mililitrami sterylnego tryptycznego bulionu sojowego. Następnie przenieś kilka kolonii Staphylococcus aureus ze świeżej płytki agarowej S.aureus do bulionu i inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 150 obr./min przez 18 godzin.Po odwirowaniu probówek o sile 4 000 G przez trzy minuty, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach sterylnego PBS. Powtórz płukanie PBS dwa razy przed dostosowaniem inokulum do 0,6 gęstości optycznej przy długości fal 600 nanometrów przy użyciu sterylnego PBS. Potwierdzić ładunek inokulum za pomocą ręcznego liczenia żywotnych płytek.Aby zainfekować próbkę skóry, przygotuj świeżą 24-dołkową płytkę z 400 mikrolitrami wstępnie podgrzanego podłoża wolnego od antybiotyków i dodaj 24 dołki za pomocą sterylnych kleszczyków. Usunąć podłoże z próbek skóry. Umyj je 500 mikrolitrami sterylnego PBS i usuń pranie.Użyj sterylnych kleszczy, aby delikatnie przytrzymać próbkę na dnie studzienki. Użyj czteromilimetrowej biopsji dziurkowej, aby przebić próbkę skóry na przybliżoną głębokość od jednego do dwóch milimetrów i wykonać centralny płat rany. Następnie użyj skalpela z ostrzem 15 i kleszczyków do tkanek Allis o sterylnych zębach, aby usunąć górną warstwę płata rany.Gdy wszystkie próbki zostaną zranione, przenieś je do 24 wkładek dołkowych za pomocą sterylnych kleszczyków. Pobrać pipetą 15 mikrolitrów inokulum bakteryjnego do łożyska rany przed inkubacją przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze tkankowym. W przypadku dłuższych okresów inkubacji należy usunąć pożywkę, zastąpić ją nową pożywką co 24 godziny i inkubować płytki w tych samych warunkach.Aby określić obciążenie bakteryjne, usuń pożywkę z dna studzienek. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś każdą próbkę do osobnej 50-mililitrowej probówki wypełnionej jednym mililitrem sterylnego PBS. Następnie należy odłączyć bakterie od powierzchni łożyska rany, homogenizując powierzchnię próbki homogenizatorem z cienką końcówką.Upewnij się, że łożysko rany styka się bezpośrednio z końcówką homogenizatora. Po przetworzeniu wszystkich próbek, należy zawirować każdą próbkę przed przeniesieniem 20 mikrolitrów homogenatu do odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej 180 mikrolitrów sterylnego PBS. Każdą próbkę należy seryjnie rozcieńczyć homogenatem w proporcji 1 razy 10 do wartości ujemnej 7 i odpipetować 10 mikrolitrów rozcieńczonego homogenatu na trzykrotnie ułożoną płytkę z tryptycznym agarem sojowym.Inkubuj płytkę z agarem sojowym Tryptic w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a po 18 godzinach policz liczbę kolonii, aby określić jednostki tworzące kolonie lub CFU dla każdej próbki. Określono odpowiedni reżim sterylizacji skóry przy użyciu różnych metod leczenia przez różny okres czasu. Integralność tkanek monitorowano za pomocą histologii, a następnie barwienia hematoksyliną i eozyną bezpośrednio po zabiegu.Najskuteczniejszym sposobem leczenia był 30-minutowy zabieg z dwutlenkiem chloru, z powtarzalną sterylizacją tkanki skórnej przy zachowaniu integralności tkanki. Biały film w łożysku rany był widoczny na tkance 48 godzin po zakażeniu. Chociaż model zadrapania zawierał wyższą średnią liczbę CFU po 24 godzinach, technika zranień spowodowanych usunięciem płata przyniosła bardziej spójne wyniki.Po 48 godzinach z uszkodzonej tkanki odzyskano około 100 razy więcej bakteryjnych CFU w porównaniu z inokulum, co wskazuje na udaną infekcję. Wycinki histologiczne zakażonej tkanki wybarwione metodą Grama wykazały obecność komórek S.aureus w łożysku rany, których nie było w skrawkach niezakażonej tkanki. Po tej procedurze można przeprowadzić immunohistochemię w celu zbadania odpowiedzi tkanek, zmodyfikowane barwienie metodą Grama w celu wizualizacji lokalizacji bakterii oraz liczbę żywotnych płytek po ekspozycji na środki przeciwdrobnoustrojowe w celu zbadania skuteczności przeciwdrobnoustrojowej.Dla naukowców opracowujących nowe środki przeciwdrobnoustrojowe model ten zapewni większą kontrolę nad optymalizacją ołowiu, zmniejszy zależność od kosztownych i ściśle regulowanych badań na zwierzętach oraz umożliwi szybkie zastosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych w praktyce klinicznej.

a-novel-high-throughput-ex-vivo-ovine-skin-wound-model-for-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: de Vries, C. R., et.al. Model opóźnionej inokulacji przewlekłej infekcji rany Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje opóźnione szczepienie luminescencyjnego Pseudomonas aeruginosa u myszy noszącej dwie pełnogrube rany grzbietowe pokryte przezroczystym opatrunkiem foliowym. Ułatwia to powstawanie biofilmu i powstawanie przewlekłych infekcji. Regularne monitorowanie bioluminescencji umożliwia ilościowe określenie obciążenia bakteriami oraz śledzenie postępu infekcji...

Opracowywanie mysiego modelu przewlekłej infekcji skóry Pseudomonas aeruginosa 

Ten film opisuje protokół tworzenia modelu ex vivo dla bakteryjnego zapalenia rogówki za pomocą guzika korneo-twardówkowego wypreparowanego z oka świni. Zaszczepione bakterie przechodzą przez nacięcia nabłonka rogówki, aby zaatakować leżące poniżej zrąb i wywołać infekcję w tkankach rogówki, która naśladuje infekcję in vivo.

Model rogówki ex vivo świńskiego bakteryjnego zapalenia rogówki: technika ustalania infekcji bakteryjnej w komórkach nabłonka rogówki

Ten film demonstruje technikę generowania mysiego modelu infekcji ran skóry. Po zakażeniu myszy – zmodyfikowanych do ekspresji białka fluorescencyjnego w neutrofilach – genetycznie zmodyfikowanym bioluminescencyjnym Staphylococcus aureus – bakterią chorobotwórcze. Obciążenie bakteryjne w miejscu zakażenia i dynamikę rekrutacji neutrofili można badać za pomocą obrazowania całego zwierzęcia.

Model zakażenia rany skóry myszy do badania odpowiedzi immunologicznej na patogen bakteryjny

Film pokazuje generowanie modelu skóry owczej ex vivo zakażonego Staphylococcus aureus. Wiąże się to z leczeniem biopsji skóry czoła jagniąt antybiotykami, ustaleniem łożyska rany, umieszczeniem go na przepuszczalnej membranie w wielodołkowej płytce z pożywką wolną od antybiotyków oraz ustaleniu infekcji bakteryjnej w ranie skóry.

Generowanie ex vivo modelu zranionej skóry owcy zakażonej patogenem bakteryjnym

Tutaj opisujemy nowy model myszy z cukrzycą, wykorzystujący bezwłose myszy do nieinwazyjnego monitorowania w czasie rzeczywistym infekcji ran biofilmu bioluminescencyjnych Pseudomonas aeruginosa. Metodę tę można zaadaptować do oceny infekcji innymi gatunkami bakterii i mikroorganizmami modyfikowanymi genetycznie, w tym biofilmami wielogatunkowymi, oraz do testowania skuteczności strategii zwalczania biofilmu.

Przejdźmy na jasną stronę mocy: monitorowanie in vivo zakażeń biofilmem Pseudomonas aeruginosa w ranach przewlekłych w modelu myszy bezwłosej z cukrzycą

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Tutaj opisane są dwa modele gojenia ran u myszy, jeden przeznaczony do oceny reakcji na gojenie się ran komórkowych i cytokinowych, a drugi do ilościowego określania szybkości zamykania ran. Metody te mogą być stosowane w złożonych modelach chorób, takich jak cukrzyca, w celu określenia mechanizmów różnych aspektów złego gojenia się ran.

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Ten artykuł opisuje krok po kroku procedurę tworzenia modelu ex vivo świńskiego zapalenia bakteryjnego rogówki. Pseudomonas aeruginosa jest używany jako organizm prototypowy. Ten innowacyjny model naśladuje infekcję in vivo, ponieważ namnażanie się bakterii zależy od zdolności bakterii do uszkadzania tkanki rogówki.

Ustanowienie modelu rogówki ex vivo świni do badania leczenia farmakologicznego przeciwko bakteryjnemu zapaleniu rogówki

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowaną technikę oceny gojenia ran za pomocą ludzkiej skóry ex vivo w połączeniu z podejściem polegającym na barwieniu całego wierzchowania. Metodologia ta stanowi przedkliniczną platformę do oceny potencjalnych terapii ran.

Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry

Przewlekłe rany, które są odporne na antybiotyki, stanowią poważne zagrożenie dla systemu opieki zdrowotnej. Infekcje biofilmem są uporczywe i wrogie i mogą powodować nieprawidłowe zamykanie się ran. Przedstawiamy klinicznie istotny model świń z przewlekłymi ranami pełnej grubości zakażonymi biofilmem. Model ten jest przydatny zarówno w badaniach mechanistycznych, jak i w testowaniu interwencji.

Świński model zakażenia biofilmem i niewidocznymi ranami

Urządzenie LED z niebieskim światłem o średnicy 405 nm wykazuje skuteczność antybakteryjną przeciwko szerokiemu zakresowi patogenów ran podczas oceny na syntetycznym modelu skóry opartym na kolagenie. To uproszczone podejście in vitro oferuje powtarzalną i etycznie wykonalną alternatywę dla wczesnej fazy oceny terapii przeciwdrobnoustrojowych opartych na świetle.

Badanie urządzenia LED z niebieskim światłem w celu tłumienia patogenów ran z wykorzystaniem syntetycznego modelu skóry na bazie kolagenu

Poznaj nowy model ran skóry owiec ex vivo do testowania antybiotyków przeciwko Staphylococcus aureus. Ta metoda zapewnia szybsze i bardziej wiarygodne wyniki w badaniach przedklinicznych niż tradycyjne techniki mikrobiologiczne.

Nowy, wysokowydajny model ran skóry owiec ex vivo do testowania nowych antybiotyków

Przeglądaj więcej filmów