Name: Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj spektrometrię mas z wymianą wodoru i deuteru w skali milisekundowej do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny. Ta metoda umożliwia analizę konformacyjną białek wewnętrznie nieuporządkowanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NS jest finansowany przez Stypendium Diamentowego Jubileuszu Rady Uniwersyteckiej. JJP jest wspierane przez UKRI Future Leaders Fellowship [numer grantu: MR/T02223X/1].

1. Ekspresja białka i oczyszczanie aSyn
<ol>
	<li>Przygotuj aSyn zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem9.</li>
	<li>Dializować do bezpiecznego buforu do przechowywania (np. Tris, pH 7,2 ).</li>
	<li>W razie potrzeby zagęścić próbkę (np. probówki do mikrowirówek z filtrem wirowym przy użyciu 3 kDa MWCO, 14 000 x g przez około 10-30 minut, patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Zaleca się, aby nie koncentrować się nadmiernie. Integralność zespołu monomerów nie została zweryfikowana w zakresie powyżej 25 μM.</li>
	<li>Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C 
	UWAGA: Białko monomeru aSyn jest stabilne przez okres do 1 roku w tych warunkach przechowywania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie bufora HDX
UWAGA: Ponieważ Tris ma wysoki współczynnik temperatury, pomiar pH musi być dostosowany do temperatury, w której będzie przeprowadzana reakcja HDX, która w tym protokole wynosi 20 °C.
<ol>
	<li>Przygotować bufor równowagi dla stanu A i stanu B, ważąc 0,002 mola Tris w 100 ml wody klasy LC-MS. Dla stanu B dodać 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 i 836 mg NaCl do buforu Tris. Dostosuj pH do 7,40 ± 0,05, 
	UWAGA: Bufor równowagi musi zawierać warunki, w których aSyn ma być badany. W tym przypadku jest to 20 mM Tris przy pH 7,4 +/- sole.</li>
	<li>Przygotuj bufor do etykietowania dla stanu A i stanu B, ważąc 0,002 mola Tris w 100 ml deuterowanej wody. Dla stanu B dodać 29,8 mg KCl, 14,2 mg MgCl2, 36,8 g CaCl2 i 836 mg NaCl do buforu znakującego Tris. PD buforu do znakowania odpowiada pH buforu równowagi. Ponieważ pH = pD - 0,41, dostosuj tak, aby pH-metr wskazywał 6,99 ± 0,0523,24, 
	UWAGA: Bufor do etykietowania musi mieć te same składniki, co bufor równowagi, z wyjątkiem tego, że jest przygotowywany przy użyciu wody deuterowanej.</li>
	<li>Przygotować bufor hartowniczy przez odważenie 0,010 mola Tris i 0,050 mola mocznika i uzupełnić do 100 ml wodą klasy LC-MS. Dostosuj pH do 2,50 ± 0,05 przy 0,5 °C. 
	UWAGA: Przed eksperymentami z HDX należy przeprowadzić badanie przesiewowe buforu wygaszającego w celu zidentyfikowania najlepszego buforu wygaszającego dla interesującego białka. Różne stężenia i kombinacje denaturantów (np. mocznika i chlorowodorku guanidyny) oraz środków redukujących (np. tris(2-karboksyetylo)fosfiny) są badane pod kątem parametrów fizycznych, takich jak objętość i temperatura wychwytywania, aby skutecznie rozwinąć i strawić stłumione białko. Bufor hartowniczy składający się ze 100 mM Tris i 0,5 M mocznika o pH 2,50 jest optymalny dla niniejszego badania.</li>
	<li>Przygotować bufor do płukania kolumny wytrawiającej, ważąc 0,125 mola chlorowodorku guanidyny do szklanej butelki Duran. Dodać 25 ml metanolu i 250 μl kwasu mrówkowego. Uzupełnić do 250 ml wodą klasy LC-MS. 
	UWAGA: W przypadku kolumny z enzymatyczną pepsyną BEH (patrz tabela materiałów) należy użyć buforu do przemywania kolumny zawierającego 0,5 M chlorowodorku guanidyny, 10% (v/v) metanolu i 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę do płukania przez pipetowanie 0,5 μl kwasu mrówkowego do 249,5 ml wody klasy LC-MS.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę do mocnego płukania, mieszając równe części wody klasy LC-MS, metanolu, acetonitrylu i izopropanolu. Dodać kwas mrówkowy do końcowego stężenia 2% (v/v). 
	UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między różnymi a białkiem oraz aby umożliwić czyszczenie portu iniekcyjnego, bardzo ważne jest, aby przygotować roztwory do płukania strzykawek i aby ścieżka przepływu do zaworu (często nazywana "wkładką płuczącą") była całkowicie zalana cieczą. Kwas mrówkowy jest opcjonalny w przypadku słabego mycia strzykawki.</li>
</ol>
3. Procedura mapowania peptydów
<ol>
	<li>Przygotuj próbkę, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Przefiltrować rozmrożony wywar białkowy aSyn z zamrażarki w temperaturze −80 °C za pomocą filtrów strzykawkowych 0,22 μm. Zmierzyć absorbancję przefiltrowanego białka podstawowego przy długości fali 280 nm, aby określić stężenie zgodnie z prawem Beera-Lamberta. Rozcieńczyć białko do stężenia 5 μM w buforze równowagi (etap 2.1). 
		UWAGA: Prawo Beera-Lamberta: A = εcl, gdzie A to absorbancja, ε to współczynnik ekstynkcji białka na mierzonej długości fali (tutaj 280 nm) w jednostkach M−1cm−1, c to stężenie białka w M, a l to długość drogi w cm. Dla typu dzikiego aSyn26, ε = 5960 M−1cm−1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj metodę chromatografii cieczowej.
	<ol>
		<li>Utwórz plik wlotowy o czasie ładowania/wychwytywania wynoszącym 3 minuty pod ciśnieniem 7000-9000 psi, po którym następuje gradient od 5% acetonitrylu do 40% acetonitrylu w ciągu 7 minut, a następnie powtarzane etapy mycia 5%-95% acetonitrylu w wodzie przez 10 minut.</li>
		<li>Upewnij się, że spray zamka (np. enkefalina leucyny, patrz Tabela materiałów) przepływa pod ciśnieniem 2000 psi i jest podłączony do sondy rozpylającej blokadę źródła spektrometru masowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj metody spektrometrii mas MSE. 
	UWAGA:MS E to szerokopasmowa metoda akwizycji niezależna od danych, bez prekursorowej izolacji masy. W związku z tym wszystkie jony w wybranym zakresie m/z są dalej fragmentowane za pomocą dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID)27.
	<ol>
		<li>W pliku metody MS wybierz MSE Continuum i ustaw czas akwizycji w zakresie 2-10 min, źródło elektronatrysku i tryb dodatniej rozdzielczości. Zdobądź MSE powyżej 50-2000 Da, skanując co 0,3 s.</li>
		<li>Dla funkcji 1 (niska energia) ustaw pułapkę i przenieś energię zderzenia na 4 V. Dla funkcji 2 (wysoka energia) należy ustawić energię zderzenia przeniesienia rampy tak, aby była stała na poziomie 4 V, a energia zderzenia pułapki była taka, jak podano w tabeli 1 dla każdego poziomu energii mapowania. 
		UWAGA: Można również stosować metody MSE z ruchliwością jonową. Alternatywne metody mapowania (np. akwizycja zależna od danych lub atrybucja danych) mogą być stosowane według uznania użytkownika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj robota z automatycznym podajnikiem próbek (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl białka 5 μM do fiolki z całkowitym odzyskiem. Umieścić fiolkę w pozycji próbki w prawej komorze HDX. Upewnij się, że ta komora ma temperaturę 0.5 °C.</li>
		<li>Dodaj jedną fiolkę z odczynnikiem z buforem równowagi i dwie fiolki z odczynnikiem z buforem do znakowania do pozycji odczynnika pierwszej, drugiej i trzeciej w lewej komorze HDX. Upewnij się, że ta komora ma temperaturę 20 °C, ustawiając regulator temperatury Peltiera (patrz Tabela materiałów). Dodaj jedną fiolkę z odczynnikiem z buforem hartowniczym do pozycji odczynnika w prawej komorze HDX.</li>
		<li>Dodać osiem fiolek całkowitego odzysku w pozycjach reakcyjnych lewej komory HDX i osiem fiolek maksymalnego odzysku w pozycjach reakcyjnych prawej komory HDX. 
		UWAGA: Aby zapewnić pełne czyszczenie i maksymalną powtarzalność dozowanych objętości, zaleca się wykonanie mycia strzykawek i mycia zalewowego strzykawek z automatycznym podajnikiem próbek. Na przykład, przed rozpoczęciem eksperymentów z mapowaniem należy wykonać sekwencję (1) słabego prania, (2) silnego prania, (3) słabego prania. Sekwencję tę można powtarzać w dużym stopniu i zaleca się wykonywanie jej do 20 razy lub do momentu, gdy strzykawka zostanie całkowicie zwilżona.</li>
		<li>Skonfiguruj przykładową listę z odpowiednimi metodami LC i MS w oprogramowaniu do planowania i uruchom harmonogram. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu Chronos jest używany jako oprogramowanie do planowania (patrz Spis materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie danych mapowania.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj peptydy z plików eksperymentu mapowania za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Zaimportuj dane identyfikacyjne peptydów do DynamX (patrz tabela materiałów) przy użyciu następujących parametrów progu peptydowego: minimalna intensywność = 5000, minimalna długość sekwencji = 0, maksymalna długość sekwencji = 40, minimalna liczba produktów = 1, minimalna ilość produktów na aminokwas = 0,25, minimalna sekwencja produktów = 2, minimalna suma intensywności dla produktów = 0, minimalny wynik = 0 i maksymalny błąd MH+ (ppm) = 0, 
UWAGA: Alternatywnie, optymalizuj ustawienia zgodnie z zalecanym przepływem pracy28.</li>
		<li>Wybierz Dane z menu i kliknij Importuj wyniki PLGS. Kliknij przycisk Dodaj, aby wybrać odpowiednie pliki danych do przypisania spektralnego. Gdy wszystkie zostaną dodane, kliknij Dalej i wprowadź powyższe ustawienia filtra. Następnie kliknij Zakończ.</li>
		<li>Ręcznie dobieraj przypisania izotopów, aby uzyskać ostateczną mapę pokrycia peptydów aSyn w DynamX.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Badanie milisekundowej wymiany wodoru i deuteru
<ol>
	<li>Wyczyść prototyp przyrządu FastHDX (patrz Tabela materiałów) przed rozpoczęciem eksperymentów HDX.
	<ol>
		<li>Otwórz kompatybilny graficzny interfejs użytkownika oprogramowania HDX i poczekaj na inicjalizację systemu.</li>
		<li>Wprowadzić temperaturę w komorze próbki na 20 °C, a w komorze hartowania na 0,5 °C. Kliknij Ustaw, aby zastosować nowe temperatury.</li>
		<li>Ustaw probówki wirówkowe z wodą klasy LC-MS na wszystkich wlotach.</li>
		<li>Na karcie Zasilanie titratora sprawdź zarówno lewą, jak i prawą strzykawkę, a następnie kliknij przycisk Prime, aby usunąć wszelkie ukryte pęcherzyki powietrza z probówek. Powtarzaj, aż wszystkie bąbelki znikną.</li>
		<li>W zakładce Makra zaznacz wszystkie pola dotyczące strzykawek. Kliknij na Kalibruj pozycję początkową strzykawek. Kliknij pętlę ładowania strzykawki do mycia. Kliknij Umyj wszystkie objętości pętli mieszania.</li>
		<li>Powtórz krok 4.1.5. 1x więcej.</li>
		<li>Jeśli w strzykawkach buforowych pojawią się jakiekolwiek pęcherzyki, należy odgazować strzykawkę, odłączając strzykawkę i wyrzucając pęcherzyk pionowo. Wymienić strzykawkę i ponownie skalibrować do pozycji zerowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj prototyp instrumentu FastHDX do eksperymentów HDX.
	<ol>
		<li>Dodać 500 μL przefiltrowanego 5 μM aSyn do fiolki z całkowitym odzyskiem i umieścić w lodówce stołowej, aby zapobiec oligomeryzacji i agregacji wywołanej temperaturą.</li>
		<li>Dodać 50 ml równowagi, znakowania i gaszenia do każdego buforu (2. Kroki przygotowania bufora HDX 1-3) wlot w lewej i prawej komorze.</li>
		<li>Dodać 50 ml buforu do przemywania kolumn (2. Przygotowanie buforu HDX etap 4) do wlotu do płukania pepsyny.</li>
		<li>Aby zalać przewody do płukania białek i kolumn 1x, sprawdź zarówno lewą, jak i prawą strzykawkę w zakładce Dostarczanie hydrauliczne titratora i kliknij raz Zalej. 
		UWAGA: Każde kolejne kliknięcie na Prime spowoduje dodatkowe powtórzenia procesu prime, co spowoduje zużycie dużych ilości próbki białka. Zaleca się ostrożność, aby tego uniknąć, nawet jeśli po próbie kliknięcia przycisku wystąpi opóźnienie w oprogramowaniu.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.1.5. 1x.</li>
		<li>Na karcie Manual Quench Flow (Ręczny przepływ wygaszania) wprowadź wymagane ustawienia, opisane w krokach 4.2.7.-4.2.10.</li>
		<li>W przypadku eksperymentu z przebiegiem czasu wprowadź czasy w milisekundach za pomocą przycisku Kropki symboliczne. Jeśli wymagane są powtórzenia, należy dodać ten sam punkt czasowy wiele razy, np. w przypadku trzykrotności 50 ms należy wprowadzić 50 50 50. Przykładowa lista w oprogramowaniu spektrometru mas (tutaj używany jest MassLynx, patrz Tabela materiałów) musi dokładnie pasować do tych punktów czasowych. 
		UWAGA: Nazwy plików listy próbek spektrometru mas i/lub tekst próbki powinny być używane w celu zapewnienia trwałego zapisu czasów etykietowania HDX odpowiadających czasom wprowadzonym w graficznym interfejsie użytkownika oprogramowania FastHDX. Czasy etykietowania dla każdej serii próbnej nie będą przechowywane nigdzie indziej.</li>
		<li>Ustaw Czas pułapki (w minutach) jako długość czasu zalewkowania. Tutaj jest godzina 3.00.</li>
		<li>Ustaw oczekiwanie na HPLC (min) = (czas pułapki + czas pracy + 1,5 min). 
		UWAGA: Na przykład w przypadku eksperymentu z 3-minutowym zalewkowaniem i 17-minutowym gradientem będzie to 21,50 min.</li>
		<li>Kliknij pole Uruchom puste tylko w przypadku uruchamiania pustych eksperymentów między przykładowymi przebiegami. Jeśli tak, upewnij się, że po każdym przebiegu próbnym znajduje się wpis (tj. prawidłowy wiersz na liście próbek) w oprogramowaniu dla ślepej próby.</li>
		<li>Gdy lista próbek jest gotowa w oprogramowaniu, zaznacz odpowiednie wpisy i rozpocznij przebieg w oprogramowaniu, klikając przycisk Odtwórz i FastHDX w oprogramowaniu. 
		UWAGA: Ze względu na szyfrowanie wodoru/deuteru, metody oparte wyłącznie na MS lub techniki miękkiej fragmentacji (dysocjacja transferu elektronów, dysocjacja wychwytu elektronów i fotodysocjacja w ultrafiolecie) mogą być używane tylko wtedy29. Dla aSyn przy fizjologicznym pH 7,40 najbardziej odpowiednie są punkty czasowe od 50 ms do 300 s, ponieważ obejmują one całą krzywą absorpcji deuteru8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Załaduj plik z peptydami przypisanymi spektralnie z eksperymentów mapowania peptydów. Otwórz menu Plik i kliknij Otwórz w oprogramowaniu DynamX (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Zaimportuj surowe pliki do preferowanego oprogramowania do pomiaru masy (np. DynamX, HDExaminer itp.). Otwórz menu "Dane" i kliknij MS Files. Kliknij Nowy stan, aby utworzyć stany dla każdego badanego stanu białka.
	<ol>
		<li>Kliknij opcję Nowa ekspozycja, aby dodać każdy punkt czasowy HDX. Kliknij Nowy RAW, aby zaimportować .raw pliki. Przeciągnij każdy plik .raw do właściwej pozycji. Kliknij OK po zakończeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Najpierw automatycznie przypisz izotopy (jest to automatyczne po kroku 5.2 powyżej), a następnie ręcznie wybierz przypisanie izotopów, aby zapewnić wysoką jakość danych.</li>
	<li>Wyeksportuj dane klastra do pliku .csv z kolumnami w następującej kolejności: nazwa białka, numer początkowy sekwencji, numer końcowy sekwencji, sekwencja, modyfikacja, fragment, maksymalny możliwy wychwyt, masa gatunków monoizotopowych, nazwa stanu, czas ekspozycji, nazwa pliku, ładunek, czas retencji, intensywność i środek ciężkości.</li>
	<li>Otwórz menu Dane w oprogramowaniu do pomiaru masy i kliknij Eksportuj dane klastra.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Załaduj wyeksportowane dane klastra do preferowanego oprogramowania do analizy HDX. Tutaj używany jest HDfleX30 (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dopasuj dane eksperymentalne dla wszystkich peptydów i stanów, wybierając odpowiednie metody korekcji wymiany zwrotnej, aby uzyskać obserwowane stałe szybkości dla reakcji HDX.</li>
	<li>Oblicz globalny próg istotności za pomocą preferowanej metody (HDfleX obsługuje kilka opcji w tym zakresie) i wykonaj hybrydowe testy istotności, aby określić istotne różnice między porównywanymi stanami31,32. 
	UWAGA: Jeśli zaobserwowana różnica jest większa niż próg globalny, a wartość p jest mniejsza niż wybrany poziom ufności (np. 95%), różnicę uznaje się za znaczącą.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W niniejszym artykule opisano następujące procedury: (1) przeprowadzanie eksperymentów mapowania peptydów na monomerycznym aSyn w celu uzyskania najwyższego pokrycia sekwencji, (2) pozyskiwanie milisekundowych danych HDX-MS na monomerycznym aSyn w warunkach fizjologicznych oraz (3) przeprowadzanie analizy i interpretacji otrzymanych danych HDX-MS. Dostarczone procedury są na ogół proste do wykonania, każdy eksperyment etykietowania trwa zwykle tylko około 8 godzin dla trzech powtórzeń i ośmiu punktów czasowych, a ekspery...

Choroba Parkinsona (PD) jest chorobą neurodegeneracyjną dotykającą miliony ludzi na całym świecie1. Charakteryzuje się tworzeniem inkluzji cytoplazmatycznych znanych jako ciała Lewy'ego i neuryty Lewy'ego w regionie istoty czarnej pars compacta mózgu. Stwierdzono, że te inkluzje cytoplazmatyczne zawierają agregaty wewnętrznie nieuporządkowanego białka aSyn2. W PD i innych synukleinopatiach aSyn przekształca się z rozpuszczalnego stanu nieuporządkowanego w nierozpuszczalny, wysoce ustrukturyzowany stan chorobowy. W swojej natywnej formie, monomeryczny aSyn przyjmuje szeroki zakres konformacji stabilizowanych przez oddziaływania elektrostatyczne dalekiego zasięgu między jego końcami N i C oraz oddziaływania hydrofobowe między jego końcem C a regionem nieamyloidowego składnika beta (NAC)3,4,5,6. Wszelkie zakłócenia w tych stabilizujących interakcjach, takie jak mutacje, modyfikacje potranslacyjne i zmiany w środowisku lokalnym, mogą prowadzić do nieprawidłowego fałdowania monomeru, uruchamiając w ten sposób proces agregacji7.
Chociaż istnieje ogromna ilość badań nad oligomerycznymi i fibrylarnymi formami aSyn8,9,10,11, istnieje kluczowa potrzeba zbadania monomerycznej formy białka i lepszego zrozumienia, które konformery są funkcjonalne (i jak), a które są podatne na agregację8,9,10,11. Będąc wewnętrznie nieuporządkowanym, o wielkości zaledwie 14 kDa i trudnym do krystalizacji, monomer aSyn nie jest podatny na większość technik biologii strukturalnej. Jednak jedną z technik zdolnych do pomiaru dynamiki konformacyjnej monomerycznego aSyn jest milisekundowy HDX-MS, który ostatnio wygenerował ważne obserwacje strukturalne, które byłyby trudne lub niemożliwe do uzyskania w inny sposób12,13,14. Milisekundowy HDX-MS z czułością mierzy średnią zespołu konformacyjnego białek poprzez monitorowanie wymiany izotopowej w wodorach amidowych, wskazując dostępność rozpuszczalnika i udział sieci wiązań wodorowych określonego regionu białka w milisekundowej skali czasowej. Konieczne jest podkreślenie aspektu milisekundowego HDX-MS, ponieważ ze względu na swoją natywnie rozwiniętą, metastabilną naturę, aSyn wykazuje bardzo szybką kinetykę wymiany wodoru, która manifestuje się znacznie poniżej dolnej granicy konwencjonalnych systemów HDX-MS. Na przykład większość cząsteczki aSyn całkowicie wymieniła wodór na deuter w warunkach wewnątrzkomórkowych w czasie krótszym niż 1 s. Kilka laboratoriów zbudowało już oprzyrządowanie do szybkiego miksowania; w tym przypadku używany jest prototypowy przyrząd do szybkiego mieszania, zdolny do wykonywania HDX-MS z czasem martwym 50 ms i rozdzielczością czasową 1 ms15. Podczas gdy milisekundowy HDX-MS stał się ostatnio niezwykle ważny w badaniach nad aSyn, może być cenny w badaniu wewnętrznie nieuporządkowanych białek/regionów w szerszym zakresie i dużej liczby białek z pętlami/regionami, które są tylko słabo stabilne. Na przykład leki peptydowe (np. insulina; GLP-1/glukagon; tirzepatyd) i białka fuzyjne peptydów (np. inhibitor HIV FN3-L35-T1144) są głównymi formatami leków, w których informacje o strukturze i stabilności fazy roztworu mogą być krytycznym wkładem przy podejmowaniu decyzji dotyczących rozwoju leku, a jednak ugrupowanie peptydowe jest często tylko słabo stabilne i trudne do opanowania przez HDX-MS w skali sekundowej sup16,17,18,19,20. Wykazano, że pojawiające się metody HDX-MS z etykietowaniem w domenach sekund/minut uzyskują informacje strukturalne dla G-kwadrupleksów DNA, ale powinno być możliwe rozszerzenie tego na bardziej zróżnicowane struktury oligonukleotydowe poprzez zastosowanie milisekundowego HDX-MS21.
Eksperymenty HDX-MS mogą być przeprowadzane na trzech różnych poziomach: (1) bottom-up (gdzie znakowane białko jest trawione proteolitycznie), (2) middle-down (gdzie znakowane białko jest trawione proteolitycznie, a powstałe peptydy są dalej fragmentowane przez techniki miękkiej fragmentacji), oraz (3) top-down (gdzie techniki miękkiej fragmentacji bezpośrednio fragmentują znakowane białko)22. W związku z tym submolekularne dane HDX-MS pozwalają nam zlokalizować zachowanie wymiany w określonych regionach białka, co sprawia, że kluczowe znaczenie ma odpowiednie pokrycie sekwencji dla takich eksperymentów. Rozdzielczość strukturalna każdego eksperymentu HDX-MS zależy od liczby peptydów proteolitycznych lub fragmentów pochodzących z białka odpowiednio podczas trawienia lub miękkiej fragmentacji. W każdym z trzech typów eksperymentów opisanych powyżej, zmiana wymiany amidu w każdym peptydzie/fragmencie jest odwzorowywana z powrotem na pierwszorzędową strukturę białka, aby wskazać zachowanie zlokalizowanych regionów białka. Podczas gdy najwyższą rozdzielczość strukturalną osiąga się poprzez miękką fragmentację, opis tych eksperymentów wykracza poza zakres obecnego badania, które koncentruje się na pomiarze konformacji monomeru aSyn. Doskonałe wyniki można uzyskać dzięki powszechnie stosowanemu "oddolnemu" przepływowi pracy opisanemu tutaj.
Tutaj podane są procedury dotyczące (1) jak przygotować i obchodzić się z próbkami aSyn i HDX-MS, (2) jak przeprowadzić mapowanie peptydów dla oddolnego eksperymentu HDX-MS, (3) jak pozyskać dane HDX-MS na monomerycznym aSyn w warunkach fizjologicznych, szczególnie w dziedzinie czasu milisekundowego (przy użyciu specjalnie skonstruowanego instrumentu; alternatywne instrumenty do znakowania milisekundowego również zostały opisane), oraz (4) sposób przetwarzania i analizowania danych HDX-MS. Przedstawiono tu przykłady metod wykorzystujących monomeryczny aSyn przy fizjologicznym pH (7,40) w dwóch warunkach roztworu. Chociaż są one niezwykle przydatne w badaniach nad aSyn, procedury te mogą być stosowane do dowolnego białka i nie ograniczają się do białek wewnętrznie nieuporządkowanych.

<table><tbody><tr><td>1 & razy; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &mu; m Kolumna C18&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>186002346</td><td>Kolumna analityczna</td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy HPLC >99,9% HiPerSolv</td><td>VWR</td><td>20060.420</td><td>Do faz ruchomych LC</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Sól do HDX</td></tr><tr><td>Chronos</td><td>Axel Semrau (zakupiona od Waters Corporation)</td><td>667006090</td><td>Oprogramowanie do planowania umożliwiające automatyczne wstrzykiwanie wielu próbek HDX-MS. Alternatywne oprogramowanie jest dostępne u innych dostawców, np. HDXDirector lub LEAP Shell</td></tr><tr><td>Chlorek deuteru</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-2-50</td><td>Do do znakowania HDX</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru (99,9% D2O)</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-4</td><td>Woda deuterowana</td></tr><tr><td>DynamX 3.0</td><td>Waters Corporation</td><td>176016027</td><td>Przypisanie izotopów i obliczanie inkorporacji deuteru</td></tr><tr><td>Enzymat BEH Pepsin Column</td><td>Waters Corporation</td><td>186007233</td><td>Kolumna do wytrawiania pepsyny</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy, 99,0% LC / MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>10596814</td><td>Do faz ruchomych LC</td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD001-500G</td><td>Chaotrop/Denaturant</td></tr><tr><td>HDfleX</td><td>Uniwersytet w Exeter</td><td>Nie</td> dotyczy <td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>Sól do HDX</td></tr><tr><td>LEAP HDX-2 CTC Robot do pobierania próbek PAL</td><td>Waters Corporation</td><td>725000637</td><td>Robot Autosampler</td></tr><tr><td>Leucine enkephalin</td><td>Waters Corporation 186006013</td><td></td><td>Do kalibracji lockspray spektrometrii mas.</td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters Corporation</td><td>667004007</td><td>Oprogramowanie sterujące metodami wlotu i spektrometrem masowym</td></tr><tr><td>Fiolki o maksymalnym odzysku</td><td>Waters Corporation</td><td>600000670CV</td><td>100 opakowanie wraz z nakrętkami - używane do tacki hartowniczej w LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>Aldrich M8266</td><td>Sól do HDX</td></tr><tr><td>Milipore 0,22 i mikro; m filtry strzykawkowe</td><td>Millipore</td><td>N9CA7069B</td><td>Filtry strzykawkowe</td></tr><tr><td>ms2min</td><td>Applied Photophysics Ltd</td><td>N/A</td><td>fast-mix quench-flow milisekundowy instrument hdx</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>Sól do HDX</td></tr><tr><td>Regulator temperatury Peltiera</td><td>LEAP Technologies Inc.</td><td>Sterownik HP115-COOL/D</td><td>Peltiera do precyzyjnego ustawiania temperatury komór w robocie LEAP.</td></tr><tr><td>ProteinLynx Global Server 3.0</td><td>Waters Corporation</td><td>715001030</td><td>oprogramowanie do identyfikacji peptydów. Alternatywne oprogramowanie jest dostępne u innych dostawców.</td></tr><tr><td>Nasadki do odczynników</td><td>Waters Corporation</td><td>186004632</td><td>opakowanie 100</td></tr><tr><td>Pojemniki na odczynniki do LEAP HDX-2</td><td>Waters Corporation</td><td>186001420</td><td>opakowanie 100 bez nakrętek - używane do w LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>Deuterotlenek sodu (99,5% w D2O)</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-57</td><td>Do do znakowania HDX</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek z filtrem wirowym (3 kDa MWCO)</td><td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td><td>UFC5003</td><td>Mikroprobówki wirówkowe do zagęszczania białka. Ułatwia to wymianę i dokładne ładowanie próbek do eksperymentów HDX-MS.</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Synapt G2-Si</td><td>Waters Corporation</td><td>176850035</td><td>Spektrometr masowy</td></tr><tr><td>Fiolki całkowitego odzysku</td><td>Waters Corporation</td><td>600000671CV</td><td>100 opakowanie wraz z nakrętkami - służy do etykietowania tacki w LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-250G</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Trizma</td><td>baza Sigma Aldrich</td><td>T60040-B2005</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378-1KG</td><td>Chaotrope/Denaturant</td></tr><tr><td>VanGuard 2,1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 kolumna&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>186004623</td><td>Kolumna odsalająca pułapki</td></tr></tbody></table>

spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Alfa-synukleina (aSyn) jest wewnętrznie nieuporządkowanym białkiem, którego fibrylarne agregaty są obfite w ciała Lewy'ego i neuryty, które są cechami charakterystycznymi choroby Parkinsona. Jednak znaczna część jego aktywności biologicznej, jak również jego agregacji, obejmuje centralnie rozpuszczalną formę monomeru białka. Wyjaśnienie mechanizmów molekularnych biologii i patofizjologii aSyn wymaga metod o wysokiej rozdzielczości strukturalnie i jest wrażliwe na warunki biologiczne. Jego natywnie rozwinięte, metastabilne struktury sprawiają, że monomeryczny aSyn jest trudny do opanowania przez wiele technik biologii strukturalnej. W tym miejscu opisano zastosowanie jednego z takich podejść: spektrometria mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) w milisekundowej skali czasowej do badania białek o niskiej stabilności termodynamicznej i słabych współczynnikach ochronnych, takich jak aSyn. W milisekundowej skali czasowej dane HDX-MS zawierają informacje o dostępności rozpuszczalnika i strukturze wiązań wodorowych aSyn, które są tracone przy dłuższych czasach znakowania, ostatecznie uzyskując rozdzielczość strukturalną aż do poziomu aminokwasów. W związku z tym HDX-MS może dostarczać informacji w wysokich rozdzielczościach strukturalnych i czasowych na temat dynamiki konformacyjnej i termodynamiki, interakcji wewnątrz- i międzycząsteczkowych oraz strukturalnego wpływu mutacji lub zmian w warunkach środowiskowych. Chociaż ma szerokie zastosowanie, pokazano, jak pozyskiwać, analizować i interpretować milisekundowe pomiary HDX-MS w monomerycznym aSyn.

Ze względu na wewnętrznie nieuporządkowaną naturę, trudno jest uchwycić skomplikowane zmiany strukturalne w aSyn przy fizjologicznym pH. HDX-MS monitoruje wymianę izotopową wodorów amidowych szkieletu, badając dynamikę konformacyjną oraz oddziaływania białka. Jest to jedna z niewielu technik pozwalających na uzyskanie tych informacji z wysoką rozdzielczością strukturalną i czasową. Niniejszy protokół ma szerokie zastosowanie w odniesieniu do wielu białek i warunków buforowych, co zobrazowano poprzez pomiar kinetyki wymia...

Strukturalny zespół monomerycznej alfa-synukleiny wpływa na jej fizjologiczne funkcje i właściwości fizykochemiczne. Niniejszy protokół opisuje, w jaki sposób przeprowadzić spektrometrię mas z wymianą milisekundową wodór/deuter i późniejsze analizy danych w celu określenia informacji konformacyjnych na monomerze tego wewnętrznie nieuporządkowanego białka w warunkach fizjologicznych.

Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Wszystkie organizmy mają nieporządek w swoim proteomie, szacowany do 33%Regiony te można obserwować za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej, ale tylko w zakresie milisekund. Nasz protokół pokaże Ci, jak to zrobić skutecznie. Jest to w pełni zautomatyzowana technika analityczna.Po prostu wszystko ustawiasz, programujesz żądane pomiary czasu, naciskasz go i odchodzisz. Technika ta otwiera ekscytującą możliwość badań przesiewowych w kierunku związków, które stabilizują specyficzne potwierdzenia wewnętrznie nieuporządkowanych białek, takich jak alfa-synukleina. Aby rozpocząć przygotowanie próbki do mapowania peptydów, najpierw weź fiolkę z przechowywanym białkiem alfa-synukleiny z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.A po rozmrożeniu przefiltruj za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 mikrometra. Następnie zmierz absorbancję roztworu przy 218 nanometrach, aby określić stężenie białka za pomocą prawa Beera-Lamberta i rozcieńczyć białko buforem równowagi do końcowego stężenia pięciu mikromolowych. Następnie, aby skonfigurować robota z automatycznym podajnikiem próbek, dodaj 50 mikrolitrów pięciomikromolowego roztworu białka do fiolki całkowitego odzyskiwania i umieść fiolkę w pozycji próbki w prawej komorze robotyki wymiany wodor/deuter lub HDX zgodnie ze spektrometrem mas.Następnie umieść jedną fiolkę buforu równowagi i dwie fiolki buforu do płukania pepsyny w pozycjach odczynników w jednej, czwartej i piątej lewej komorze oraz jedną fiolkę buforu hartującego w pozycji odczynnika pierwszej w prawej komorze HDX i ustaw temperaturę na 20 stopni Celsjusza za pomocą regulatora temperatury Peltiera. Następnie dodać równą liczbę fiolek całkowitego odzysku i fiolek maksymalnego odzysku w tych samych pozycjach reakcyjnych, odpowiednio, w lewej i prawej komorze HDX. Następnie skonfiguruj przykładową listę z odpowiednimi metodami LC i MS w oprogramowaniu do planowania i uruchom harmonogram.Aby uzyskać ostateczną mapę pokrycia peptydów, ręcznie wybierz przypisania izotopów w oprogramowaniu do analizy danych DynamX HDX. Po wyczyszczeniu prototypu instrumentu Fast HDX otwórz graficzny interfejs użytkownika kompatybilnego oprogramowania HDX, aby zainicjować system. Wprowadź 20 stopni Celsjusza i 0,5 stopnia Celsjusza jako odpowiednio temperaturę komory próbki i komory hartowania, a następnie kliknij przycisk set, aby zastosować nowe temperatury.Aby wyczyścić i przygotować urządzenie, ustaw probówki wirówkowe z wodą klasy LC/MS na wszystkich wlotach, a następnie sprawdź zarówno lewą, jak i prawą strzykawkę w zakładce doprowadzania titratora i kontynuuj klikanie przycisku zalewania, aż wszystkie ukryte pęcherzyki powietrza w probówkach znikną. Aby zaznaczyć wszystkie pola dotyczące strzykawek, najpierw przejdź do zakładki makra i kliknij pozycję początkową kalibruj strzykawki, a następnie najpierw kliknij pętlę ładowania strzykawki do mycia, a następnie umyj wszystkie objętości pętli mieszania. Jeśli w strzykawce buforowej znajdują się pęcherzyki, odłącz strzykawkę i odgazuj ją, wyrzucając pęcherzyk pionowo.Przed ponowną kalibracją do pozycji zerowej należy wymienić strzykawkę. Aby skonfigurować prototypowy przyrząd Fast HDX do eksperymentów z HDX, należy najpierw włożyć lewą rurkę wlotową miareczkowania do fiolki z całkowitym odzyskiem. Aby zapobiec oligomeryzacji i agregacji wywołanej temperaturą, umieść probówkę w lodówce stołowej.Następnie dodaj 50 mililitrów do równowagi, etykietowania, hartowania i płukania pepsyny do odpowiednich wlotów buforu w prawej i lewej komorze instrumentu, a następnie dodaj 50 mililitrów buforu do płukania kolumny do wlotu płukania pepsyny. Aby zalać przewody do płukania białka i kolumny, sprawdź prawą i lewą strzykawkę na karcie podawania titratora i kliknij raz zalać. Po zaznaczeniu wszystkich pól na strzykawki, jak pokazano wcześniej, przejdź do zakładki ręczny przepływ wygaszania, aby wprowadzić wymagane ustawienia.W eksperymencie z kursem czasu użyj przycisku z symboliczną kropką, aby wprowadzić czasy w milisekundach. Następnie ustaw czas pułapki na trzy i oczekiwanie, aż HPLC uwięzi czas plus czas pracy plus 1,5 minuty. Jeśli ślepe eksperymenty są uruchamiane między przykładowymi przebiegami, kliknij puste pole uruchamiania po upewnieniu się, że po każdym przebiegu próbki w oprogramowaniu do akwizycji znajduje się wpis dla ślepego przebiegu.Gdy lista próbek jest już gotowa, a odpowiednie wpisy zostaną podświetlone, rozpocznij bieg, klikając play i Fast HDX w oprogramowaniu. W celu przetworzenia danych otwórz menu pliku peptydów przypisanych spektralnie z eksperymentów mapowania peptydów i kliknij przycisk Otwórz w oprogramowaniu DynamX, a następnie zaimportuj nieprzetworzone pliki do oprogramowania DynamX. Po otwarciu menu danych kliknij MS Files.Aby utworzyć stany dla każdego badanego stanu białka, kliknij nowy stan. Aby dodać każdy punkt czasowy HDX, kliknij nową ekspozycję, a następnie kliknij nowy raw. Aby zaimportować pliki RAW, przeciągnij każdy plik w odpowiednie miejsce i kliknij OK po zakończeniu.Po automatycznym przypisaniu izotopów należy ręcznie wybrać przypisanie izotopów, aby zapewnić wysoką jakość danych. Wyeksportuj dane klastra w pliku csv z kolejnością kolumn zgodnie z opisem w manuskrypcie. Otwórz menu danych w oprogramowaniu do pomiaru masy i kliknij eksport danych klastra.W celu analizy danych najpierw załaduj wyeksportowane dane klastrowe do oprogramowania analitycznego HDX HDfleX. Aby dopasować dane eksperymentalne do wszystkich eksperymentów i stanów, wybierz odpowiednie metody korekcji wymiany wstecznej, aby uzyskać obserwowane stałe szybkości dla reakcji HDX. Następnie oblicz globalny próg istotności przy użyciu preferowanej metody w HDfleX i wykonaj hybrydowe testy istotności, aby określić istotne różnice między porównywanymi stanami.Eksperyment mapowania alfa-synukleiny wygenerował mapę pokrycia peptydów, która pokryła 100% sekwencji białka ze średnią nadmiarowością 3,79. Co więcej, protokół ten umożliwił wygenerowanie krzywych wychwytu deuteru dla różnych peptydów alfa-synukleiny, które następnie wyrażono jako wykresy z korektą dopasowania i wymiany wstecznej. Było oczywiste, że większość wymiany wodoru i deuteru w alfa-synukleinie zachodziła w ciągu jednej sekundy.Różnica konformacyjna między stanami A i B alfa-synukleiny była również widoczna w wyższym wychwycie deuteru przez stan B zarówno na poziomie peptydów, jak i aminokwasów. W przypadku tak czułej techniki ważne jest, aby podczas porównywania danych stosować solidne testy istotności statystycznej. Tutaj użyliśmy naszego oprogramowania HDfleX.

millisecond-hydrogendeuterium-exchange-mass-spectrometry-for-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje proces ilościowego określania akumulacji alfa-synukleiny w embrionalnych mysich neuronach dopaminowych wstępnie potraktowanych wstępnie uformowanymi włókienkami alfa-synukleiny. Przedstawia etapy utrwalania, barwienia i ilościowego oznaczania neuronów dopaminowych zawierających agregaty alfa-synukleiny za pomocą immunofluorescencji.

Badanie akumulacji alfa-synukleiny w pierwotnych embrionalnych mysich neuronach dopaminowych

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Syntetazy lantipeptydu katalizują wieloetapowe reakcje podczas biosyntezy naturalnych produktów peptydowych. W tym miejscu opisujemy ciągły, oddolny przepływ pracy spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS), który można wykorzystać do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantipeptydów, a także innych podobnych enzymów zaangażowanych w biosyntezę naturalnych produktów peptydowych.

Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Prezentowany tutaj jest protokół metody wymiany wodoru i deuteru (HDX) opartej na elektroforezie kapilarnej w połączeniu ze spektrometrią mas z góry na dół. Podejście to charakteryzuje różnicę w strukturach wyższego rzędu między różnymi gatunkami białek, w tym białkami w różnych stanach i różnymi proteoformami, poprzez prowadzenie jednoczesnej różnicowej separacji HDX i elektroforetycznej.

Wymiana wodorowo-deuterowa oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas z góry na dół

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Choroba Parkinsona była wiązana z ekspozycją na pestycydy. Przedstawiamy tutaj metodę podawania pestycydów za pomocą zgłębnika żołądkowego w pożądanym stężeniu oraz metodę analizy ich wpływu na gromadzenie się alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym.

Podawanie rotenonu drogą doustną za pomocą zgłębnika oraz analiza obrazowa inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

Poznaj spektrometrię mas z wymianą wodoru i deuteru w skali milisekundowej do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny. Ta metoda umożliwia analizę konformacyjną białek wewnętrznie nieuporządkowanych.

Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych (Wideo) | JoVE Journal

Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

Przeglądaj więcej filmów