Spektrometria mas z wymianą milisekundową wodoru i deuteru do badania dynamiki strukturalnej alfa-synukleiny w warunkach fizjologicznych

Wszystkie organizmy mają nieporządek w swoim proteomie, szacowany do 33%Regiony te można obserwować za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej, ale tylko w zakresie milisekund. Nasz protokół pokaże Ci, jak to zrobić skutecznie. Jest to w pełni zautomatyzowana technika analityczna.

Po prostu wszystko ustawiasz, programujesz żądane pomiary czasu, naciskasz go i odchodzisz. Technika ta otwiera ekscytującą możliwość badań przesiewowych w kierunku związków, które stabilizują specyficzne potwierdzenia wewnętrznie nieuporządkowanych białek, takich jak alfa-synukleina. Aby rozpocząć przygotowanie próbki do mapowania peptydów, najpierw weź fiolkę z przechowywanym białkiem alfa-synukleiny z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

A po rozmrożeniu przefiltruj za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 mikrometra. Następnie zmierz absorbancję roztworu przy 218 nanometrach, aby określić stężenie białka za pomocą prawa Beera-Lamberta i rozcieńczyć białko buforem równowagi do końcowego stężenia pięciu mikromolowych. Następnie, aby skonfigurować robota z automatycznym podajnikiem próbek, dodaj 50 mikrolitrów pięciomikromolowego roztworu białka do fiolki całkowitego odzyskiwania i umieść fiolkę w pozycji próbki w prawej komorze robotyki wymiany wodor/deuter lub HDX zgodnie ze spektrometrem mas.

Następnie umieść jedną fiolkę buforu równowagi i dwie fiolki buforu do płukania pepsyny w pozycjach odczynników w jednej, czwartej i piątej lewej komorze oraz jedną fiolkę buforu hartującego w pozycji odczynnika pierwszej w prawej komorze HDX i ustaw temperaturę na 20 stopni Celsjusza za pomocą regulatora temperatury Peltiera. Następnie dodać równą liczbę fiolek całkowitego odzysku i fiolek maksymalnego odzysku w tych samych pozycjach reakcyjnych, odpowiednio, w lewej i prawej komorze HDX. Następnie skonfiguruj przykładową listę z odpowiednimi metodami LC i MS w oprogramowaniu do planowania i uruchom harmonogram.

Aby uzyskać ostateczną mapę pokrycia peptydów, ręcznie wybierz przypisania izotopów w oprogramowaniu do analizy danych DynamX HDX. Po wyczyszczeniu prototypu instrumentu Fast HDX otwórz graficzny interfejs użytkownika kompatybilnego oprogramowania HDX, aby zainicjować system. Wprowadź 20 stopni Celsjusza i 0,5 stopnia Celsjusza jako odpowiednio temperaturę komory próbki i komory hartowania, a następnie kliknij przycisk set, aby zastosować nowe temperatury.

Aby wyczyścić i przygotować urządzenie, ustaw probówki wirówkowe z wodą klasy LC/MS na wszystkich wlotach, a następnie sprawdź zarówno lewą, jak i prawą strzykawkę w zakładce doprowadzania titratora i kontynuuj klikanie przycisku zalewania, aż wszystkie ukryte pęcherzyki powietrza w probówkach znikną. Aby zaznaczyć wszystkie pola dotyczące strzykawek, najpierw przejdź do zakładki makra i kliknij pozycję początkową kalibruj strzykawki, a następnie najpierw kliknij pętlę ładowania strzykawki do mycia, a następnie umyj wszystkie objętości pętli mieszania. Jeśli w strzykawce buforowej znajdują się pęcherzyki, odłącz strzykawkę i odgazuj ją, wyrzucając pęcherzyk pionowo.

Przed ponowną kalibracją do pozycji zerowej należy wymienić strzykawkę. Aby skonfigurować prototypowy przyrząd Fast HDX do eksperymentów z HDX, należy najpierw włożyć lewą rurkę wlotową miareczkowania do fiolki z całkowitym odzyskiem. Aby zapobiec oligomeryzacji i agregacji wywołanej temperaturą, umieść probówkę w lodówce stołowej.

Następnie dodaj 50 mililitrów do równowagi, etykietowania, hartowania i płukania pepsyny do odpowiednich wlotów buforu w prawej i lewej komorze instrumentu, a następnie dodaj 50 mililitrów buforu do płukania kolumny do wlotu płukania pepsyny. Aby zalać przewody do płukania białka i kolumny, sprawdź prawą i lewą strzykawkę na karcie podawania titratora i kliknij raz zalać. Po zaznaczeniu wszystkich pól na strzykawki, jak pokazano wcześniej, przejdź do zakładki ręczny przepływ wygaszania, aby wprowadzić wymagane ustawienia.

W eksperymencie z kursem czasu użyj przycisku z symboliczną kropką, aby wprowadzić czasy w milisekundach. Następnie ustaw czas pułapki na trzy i oczekiwanie, aż HPLC uwięzi czas plus czas pracy plus 1,5 minuty. Jeśli ślepe eksperymenty są uruchamiane między przykładowymi przebiegami, kliknij puste pole uruchamiania po upewnieniu się, że po każdym przebiegu próbki w oprogramowaniu do akwizycji znajduje się wpis dla ślepego przebiegu.

Gdy lista próbek jest już gotowa, a odpowiednie wpisy zostaną podświetlone, rozpocznij bieg, klikając play i Fast HDX w oprogramowaniu. W celu przetworzenia danych otwórz menu pliku peptydów przypisanych spektralnie z eksperymentów mapowania peptydów i kliknij przycisk Otwórz w oprogramowaniu DynamX, a następnie zaimportuj nieprzetworzone pliki do oprogramowania DynamX. Po otwarciu menu danych kliknij MS Files.

Aby utworzyć stany dla każdego badanego stanu białka, kliknij nowy stan. Aby dodać każdy punkt czasowy HDX, kliknij nową ekspozycję, a następnie kliknij nowy raw. Aby zaimportować pliki RAW, przeciągnij każdy plik w odpowiednie miejsce i kliknij OK po zakończeniu.

Po automatycznym przypisaniu izotopów należy ręcznie wybrać przypisanie izotopów, aby zapewnić wysoką jakość danych. Wyeksportuj dane klastra w pliku csv z kolejnością kolumn zgodnie z opisem w manuskrypcie. Otwórz menu danych w oprogramowaniu do pomiaru masy i kliknij eksport danych klastra.

W celu analizy danych najpierw załaduj wyeksportowane dane klastrowe do oprogramowania analitycznego HDX HDfleX. Aby dopasować dane eksperymentalne do wszystkich eksperymentów i stanów, wybierz odpowiednie metody korekcji wymiany wstecznej, aby uzyskać obserwowane stałe szybkości dla reakcji HDX. Następnie oblicz globalny próg istotności przy użyciu preferowanej metody w HDfleX i wykonaj hybrydowe testy istotności, aby określić istotne różnice między porównywanymi stanami.

Eksperyment mapowania alfa-synukleiny wygenerował mapę pokrycia peptydów, która pokryła 100% sekwencji białka ze średnią nadmiarowością 3,79. Co więcej, protokół ten umożliwił wygenerowanie krzywych wychwytu deuteru dla różnych peptydów alfa-synukleiny, które następnie wyrażono jako wykresy z korektą dopasowania i wymiany wstecznej. Było oczywiste, że większość wymiany wodoru i deuteru w alfa-synukleinie zachodziła w ciągu jednej sekundy.

Różnica konformacyjna między stanami A i B alfa-synukleiny była również widoczna w wyższym wychwycie deuteru przez stan B zarówno na poziomie peptydów, jak i aminokwasów. W przypadku tak czułej techniki ważne jest, aby podczas porównywania danych stosować solidne testy istotności statystycznej. Tutaj użyliśmy naszego oprogramowania HDfleX.