Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca²⁺ w miocytach gryzoni

Takie podejście wykrywa zmiany w funkcji skurczowej podczas rozwoju niewydolności serca. Można również badać funkcjonalną odpowiedź miocytów na neurohormony i potencjalne środki terapeutyczne. Pozycjonowanie miocytów może wymagać praktyki, ale jest niezbędne do uzyskania spójnego obrazowania długości sarkomeru.

Demonstracją tej procedury jest Margaret Westfall, profesor nadzwyczajny i główny badacz laboratorium. Przed rozpoczęciem eksperymentu podgrzej żel i podłoże w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Włącz elementy platformy funkcji skurczu, jak wspomniano w manuskrypcie, i zmontuj rurki w pompie perystaltycznej.

Następnie przenieś podgrzany pakiet żelu do uchwytu probówki i włącz podciśnienie w zasilaniu stymulatora komórkowego. Umieść 50-mililitrową rurkę z mediami w izolowanym uchwycie probówki, aby rozpocząć perfuzję z prędkością 0,5 mililitra na minutę przez rurkę pompy perystaltycznej. Następnie dodaj dwa mililitry podgrzanej pożywki do małej łodzi wagowej i przenieś jedno szkiełko nakrywkowe zawierające miocyty z komory stymulacji do łodzi wagowej.

Umieść komorę stymulacji z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zdejmij szkiełko nakrywkowe z łodzi wagowej i delikatnie wytrzyj spód przed przeniesieniem go do świeżo nasmarowanej komory szkiełka nakrywkowego i dodaniem kropli podłoża na szkiełko nakrywkowe. Umieść platynowy uchwyt elektrody na szkiełku nakrywkowym, a następnie połóż nowy szkiełko nakrywkowe na wierzchu za pomocą kleszczyków i umieść górny uchwyt na kanapce z szkiełkiem nakrywkowym.

Wkręć dwie lub cztery z stożkowym ściętym o numerze zero, aby zakończyć montaż komory. W pompie perystaltycznej, gdy media są obecne w całej rurce, podłącz rurkę do podgrzewacza, a podgrzewacz do komory szkiełka pokrywowego. Następnie rozpocznij perfuzję z prędkością 0,5 mililitra na minutę i umieść chusteczkę higieniczną pod komorą, aby upewnić się, że nie ma wycieków.

Po umieszczeniu komory szkiełka nakrywkowego w adapterze stolika mikroskopu, włącz system grzewczy i równoważ montaż przez pięć do 10 minut, aby osiągnąć stałą temperaturę medium 37 stopni Celsjusza w środku komory. Obserwuj, jak perfaktorskie media są zbierane na przeciwległym końcu komory z rurkami podłączonymi do systemu próżniowego. W czasie równowagi wizualizuj miocyty za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzonego w wodzie na mikroskopie.

Aby aktywować stymulator stymulacji, ustaw napięcie na 35 do 40 woltów i dostosuj częstotliwość stymulacji do 0,2 herca, aby zoptymalizować funkcję skurczu i przeżycie miocytów. Aby zebrać ślady skracania sarkomeru, otwórz oprogramowanie na komputerze i wybierz okej, plik i nowe karty. Przygotuj szablon ekranu, wybierając ślady, edytuj limity użytkowników i długość sarkomeru.

Zapisz ślady długości sarkomeru za pomocą pliku i nowych zakładek, zidentyfikuj kurczący się miocyt i ustaw miocyt wzdłuż osi podłużnej aparatu, tak aby wzór prążkowania był pionowy. Użyj myszy komputerowej, aby umieścić obszar zainteresowania lub pole ROI nad miocytami. Wybierz opcję collect i rozpocznij rejestrowanie funkcji skurczu.

Rejestruj skracanie przez 60 sekund z każdego miocytu przy niskich częstotliwościach stymulacji 0,5 Hz. Zapisz skrócenie sarkomeru od pięciu do 10 komórek na szkiełko nakrywkowe. Aby zmierzyć skrócenie w zakresie częstotliwości, umieść miocyty na każdej częstotliwości, aby uzyskać skrócenie w stanie ustalonym przed zapisem.

Podwój szybkość perfuzji i rozpocznij nagrywanie od 15 do 20 sekund po stymulacji z nową częstotliwością w zakresie od 0,2 do dwóch herców i zapisuj nie więcej niż dwa miocyty na szkiełko nakrywkowe w celu skrócenia w danym zakresie częstotliwości stymulacji. Zarejestruj co najmniej siedem skurczów na komórkę, aby uzyskać wiarygodne dane uśrednione sygnałem. Wybierz plik, wybierz nagrany ślad, a następnie wybierz pozycję Otwórz.

Wybierz zakładkę jedną ze ścieżek podstawowych, a następnie ustaw żółty panel u góry ścieżki, aby uzyskać długość sarc. Przygotuj szablon analizy z operacjami, opcjami monotonnej analizy stanów nieustalonych i znacznikiem zdarzenia TTL w polu definicji T Zero w odpowiednich opcjach z menu. Zapisz te opcje analizy, wybierając szablony i zapisz szablon analizy z identyfikatorem.

Załaduj szablon analizy przed przeanalizowaniem każdego śladu. Aby przeanalizować dane, wybierz znaczniki, bramkę, dodaj stan nieustalony, a następnie przekonwertuj ze znacznika zdarzenia i zakresu analizy. Ustaw zakres czasu od minus 0,01 do 1,20 sekundy dla miocytów w tempie 0,2 Hz.

Wybierz krótszy zakres czasu dla miocytów stymulowanych wyższymi częstotliwościami. Wybierz operacje i uśrednione zdarzenia, aby wygenerować uśredniony zapis sygnału poniżej oryginalnego śladu podstawowego. Następnie wybierz zakładkę jedną ze śladów uśrednionego sygnału, a następnie przejdź do znaczników w górnym menu, a następnie dodaj stan nieustalony, wybierz operacje i monotoniczną analizę stanów nieustalonych, aby wyświetlić uśrednione wartości sygnału dla podstawowych parametrów sarkomeru w panelu wyświetlania uśrednionego sygnału.

Wybierz eksport monotonicznej analizy stanów nieustalonych i prądu schowka oraz przenieś przejściową analizę sarkomerową do arkusza kalkulacyjnego w celu złożonej analizy wielu miocytów. Aby skopiować uśredniony ślad sygnału, wybierz eksport, bieżący ślad, a następnie zakładki schowka i opcje w kolejności i ustaw miejsca dziesiętne na pięć. Wybierz ogranicznik tabulatorów i kliknij OK.

Umieść uśrednione ślady sygnału dla każdego zapisu miocytów w drugim arkuszu kalkulacyjnym. Badanie wykazało, że przeciążenie ciśnieniem lub PO zmniejszyło funkcję skurczową miocytów w porównaniu z grupą pozorowaną. Jednak cztery dni po transferze genu troponiny sercowej IT 144D lub cTnIT144D zdolność kurczliwości miocytów PO powróciła do poziomu pozorowanego, co wskazuje, że funkcja miocytów może zostać przywrócona.

We wstępnych badaniach transfer genu cTnIT144D poprawił skrócenie pików i podwyższony rozkurczowy poziom wapnia w porównaniu z CTnI. Często konieczne są drobne korekty w ustawieniu miocytów serca, aby uzyskać wyraźne ślady skracające. Protokół ten można również wykonać na miocytach serca obciążonych wrażliwymi na wapń barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak Fura-2 AM, w celu wykrycia stanów przejściowych wapnia oprócz skracania.