Name: Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca2+ w miocytach gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metody pomiaru kurczliwości miocytów szczura i stanów przejściowych wapnia w badaniach fizjologii serca. Protokoły te umożliwiają analizę dysfunkcji serca i testowanie potencjalnych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez National Institutes of Health (NIH) grant R01 HL144777 (MVW).

Badania przeprowadzone na gryzoniach były zgodne z Polityką Publicznej Służby Zdrowia w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Michigan. Na potrzeby tego badania miocyty wyizolowano od 3-34-miesięcznych szczurów Sprague-Dawley i F344BN o wadze ≥ 200 g5. Zastosowano zarówno stawki męskie, jak i żeńskie.
1. Stymulacja miocytów w badaniach funkcji skurczu
<ol>
	<li>Przygotuj świeże pożywki na bazie M199 dla każdego zestawu izolowanych miocytów (tabela materiałów). 1 dzień przed stymulacją, płytka 2 x 104 tolerancyjne na Ca2+, pręcikowe miocyty na 22 mm2 szklanych szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą (CS), jak opisano wcześniej8.</li>
	<li>Aby przygotować komory, namocz każdą komorę w 10% wybielaczu przez 1 godzinę. Następnie płucz komory bieżącą wodą z kranu przez 30-45 minut, następnie wodę destylowaną wymieniaj co 5 minut przez 30 minut, a następnie wodę dejonizowaną wymieniaj co 5 minut przez 30 minut i końcowe płukanie w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Suszyć komory na czystej powierzchni przez 20-30 minut (rysunek uzupełniający 1A-C). Następnie poddaj komory działaniu promieniowania UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 5 minut w każdym kierunku (łącznie = 20 minut). Ten krok nie jest wymagany w przypadku komór wstępnie wysterylizowanych. 
	UWAGA: Opuść obszar, aby zminimalizować ekspozycję na promieniowanie UV.</li>
	<li>Zdejmij pokrywę z komory, dodaj 3 ml pożywki na bazie M199 (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki (rysunek uzupełniający 1B), załóż pokrywę i podgrzej komorę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 20% O2 .</li>
	<li>Sterylizuj kleszcze w sterylizatorze z gorącymi kulkami w temperaturze 250 °C przez 20-25 s. Przenieś podgrzaną komorę stymulacji z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Przenieś każde szkiełko nakrywkowe (CS) zawierające miocyty serca do poszczególnych studzienek w komorze stymulacji za pomocą sterylnych kleszczy. Przenoś CS po cztery na raz, a następnie podgrzewaj przez 10 minut przed przeniesieniem pozostałych czterech CS, aby utrzymać temperaturę mediów.</li>
	<li>Przymocuj podnośniki bananowe do komory stymulacji z jednej strony (rysunek uzupełniający 1C), a z drugiej do stymulatora (rysunek uzupełniający 1D).</li>
	<li>Ustaw częstotliwość stymulatora na 0,2 Hz i ustaw napięcie (~12 V), aby osiągnąć skurcz w ~10%-20% wszystkich miocytów serca w kształcie pręcików w studzience. Aby określić liczbę kurczących się miocytów, umieść komorę pod odwróconym mikroskopem o powiększeniu od 4x do 10x.</li>
	<li>Umieścić komorę stymulacji w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 (rysunek uzupełniający 1E). Zmieniaj pożywkę co 12 godzin, używając pożywki podgrzanej w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 20-25 minut. Kontynuuj stymulację elektryczną do 3 dni z wymianą pożywki co 12 godzin.</li>
</ol>
2. Analiza funkcji kurczliwości miocytów serca dorosłego szczura
<ol>
	<li>Przed eksperymentem podgrzej żel i pożywkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Włącz elementy platformy funkcji kurczliwości wymienione w tabeli materiałów i pokazane na rysunku uzupełniającym 2, zwracając szczególną uwagę na kluczowe elementy, do których należą stół antywibracyjny (rysunek uzupełniający 2A-1) z odwróconym mikroskopem z filtrem ciemnoczerwonym (590 nm) (rysunek uzupełniający 2A-2,3) i kamerą CCD (rysunek uzupełniający 2A-4) podłączoną do kontrolera CCD (Rysunek uzupełniający 2A-5 i rysunek uzupełniający 2C-5) oraz zintegrowany z komputerem PC (rysunek uzupełniający 2B-14).</li>
	<li>Zamontować rurkę w pompie perystaltycznej (rysunek uzupełniający 2A-8; Rysunek uzupełniający 2A-8), przenieś podgrzany pakiet żelu do uchwytu probówki (rysunek uzupełniający 2A-9) i włącz próżnię (rysunek uzupełniający 2A-11) i zasilanie stymulatora komórkowego (rysunek uzupełniający 2B-13).</li>
	<li>Umieść probówkę o pojemności 50 ml z pożywką w izolowanym uchwycie probówki (rysunek uzupełniający 2A-9) i rozpocznij perfuzję z prędkością ~0,5 ml / min przez rurkę pompy perystaltycznej (rysunek uzupełniający 2E-8).</li>
	<li>Dodaj niewielką ilość podgrzanego podłoża do małej łódki wagowej (~2 ml). Przenieść jeden CS zawierający miocyty z komory stymulacyjnej do łodzi wagowej. Przywrócić temperaturę komory stymulacji do 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2</li>.
	<li>Wyjmij CS z łodzi wagowej i delikatnie wytrzyj spód. Przenieś CS do świeżo natłuszczonej komory CS (rysunek uzupełniający 2A, F-10; strzałka) i delikatnie dodaj kroplę pożywki (~200 μL) na CS.</li>
	<li>Umieść platynowy uchwyt elektrody na CS (rysunek uzupełniający 2F; szara strzałka) i połóż nowy CS na górze za pomocą kleszczy. Umieść górne mocowanie (rysunek uzupełniający 2F; biała strzałka) nad kanapką CS, a następnie wkręć dwie lub cztery z stożkowym stożkowym stożkowym stożkowym #0, aby zakończyć montaż komory.</li>
	<li>Gdy media znajdą się w przewodach pompy, podłącz rurkę do podgrzewacza, a następnie podłącz podgrzewacz do komory CS zmontowanej w kroku 2.7. Rozpocznij perfuzję od 0,5 ml/min i umieść chusteczkę chusteczkową pod komorą, aby upewnić się, że nie ma wycieków.</li>
	<li>Umieść komorę CS w stage adapter. Perfaktoryzowane media są zbierane na przeciwległym końcu komory za pomocą rurki podłączonej do systemu próżniowego. Włącz system grzewczy (rysunek uzupełniający 2A, D-7) i zrównoważ komorę, obiektyw i podgrzewacz przez ~5-10 minut, aby osiągnąć stałą temperaturę medium 37 °C. Wizualizuj miocyty za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzenia w wodzie pod mikroskopem w tym czasie równowagi.</li>
	<li>Aktywuj stymulator stymulacji (rysunek uzupełniający 2B-13), ustawiając napięcie na 1,5 raza większe niż ustawienie potrzebne do skurczenia się 80% komórek w kształcie pręcików, co zwykle wynosi 35-40 V. Ustaw częstotliwość stymulacji na 0,2 Hz, aby zoptymalizować funkcję skurczu i przeżycie miocytów.</li>
	<li>Zbierz ślady skracania i ponownego wydłużania skurczu z miocytów poddanych ciągłej perfuzji i stymulacji. Do zbierania pomiarów skracania należy użyć kamery CCD (rysunek uzupełniający 2A-4) podłączonej do sterownika CCD (rysunek uzupełniający 2B-5,C) oraz dedykowanego komputera z płytką kontrolera I/O (rysunek uzupełniający 2B-14; patrz tabela materiałów). Platforma mierzy skrócenie sarkomeru w miocytach szczurów, chociaż podobne wyniki uzyskuje się z pomiarów miocytów pobranych z podłużnych krawędzi miocytów (patrz Ecklerle et al.14).</li>
	<li>Aby zebrać ślady skracania sarkomeru, otwórz oprogramowanie na komputerze, wybierz OK, a następnie Plik > Nowy. Przygotuj szablon ekranu, wybierając opcję Ślady > Edytuj limity użytkownika > długości sarkomeru, a następnie ustawiając wartości maksymalne i minimalne, które zwykle mieszczą się w zakresie od 2,0 μm do 1,5 μm. Skalibruj kamerę CCD za pomocą siatki 0,01 mm przed wykonaniem pomiarów w miocytach (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
	<li>Aby zarejestrować ślady długości sarkomeru, wybierz opcję Plik > Nowy. Zidentyfikuj kurczący się miocyt i umieść miocyt wzdłuż osi podłużnej aparatu, tak aby wzór prążkowania był pionowy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Użyj myszy komputerowej, aby umieścić pole obszaru zainteresowania (ROI) (różowe pole) nad miocytami (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Wybierz opcję Zbierz i Rozpocznij, aby zarejestrować funkcję skurczu. Zapisuj skracanie przez 60 s z każdego miocytu przy niskich częstotliwościach stymulacji (≤0,5 Hz).</li>
	<li>Zapisz skrócenie sarkomeru od 5-10 komórek na CS. Wykonaj pomiary przy 1 komórce/CS, jeśli badania obejmują leczenie agonistami/antagonistami. Przygotuj oddzielne wstępnie podgrzane podłoże i inny, dedykowany kawałek rurki perfuzyjnej załadowany do wielokanałowej pompy perystaltycznej i postępuj zgodnie z krokami 2.9.-2.14. do pomiaru wpływu dostarczania leków lub neurohormonów na funkcję skurczową miocytów.</li>
	<li>Aby zmierzyć skrócenie w zakresie częstotliwości, nadaj tempo miocytom przy każdej częstotliwości, aby uzyskać skrócenie w stanie ustalonym przed nagraniem5. W przypadku tych badań należy podwoić szybkość perfuzji i rozpocząć rejestrację 15-20 s po stymulacji z nową częstotliwością, aby uzyskać spójne odpowiedzi skurczowe w stanie ustalonym dla częstotliwości w zakresie 0,2 Hz i 2 Hz. Zazwyczaj rejestruj nie więcej niż 2 miocyty / CS w celu skrócenia w danym zakresie częstotliwości stymulacji.</li>
	<li>Zapisz co najmniej 7 skurczów na komórkę, aby uzyskać wiarygodne dane uśrednione sygnałem podczas analizy nagrań (patrz krok 3.).</li>
</ol>
3. Analiza danych funkcji skurczowej w izolowanych miocytach
<ol>
	<li>Aby rozpocząć, wybierz pozycję Plik, wybierz zarejestrowany ślad, a następnie wybierz pozycję Otwórz. Wybierz Tab 1 (lewa strona) śladu podstawowego, a następnie ustaw żółty panel w górnej części ścieżki na Sarc-Length. Wybierz opcję Ślady i szablon ekranu przygotowany w kroku 2.12.</li>
	<li>Aby przygotować szablon analizy, wybierz Operacje, Opcje monotonnej analizy stanów nieustalonych, Znacznik zdarzenia TTL w polu Definicja t0, a także następujące opcje z menu: Linia bazowa (spoczynkowa długość sarkomeru), Prędkość odlotu względem t0 (dep v), Szczyt (wysokość piku i %wysokość szczytu/linia bazowa lub bl%szczyt h), Prędkość powrotu względem tPeak (ret v), Czas do osiągnięcia szczytu 50% (TTP50%) przy użyciu t0 i czas do punktu odniesienia 50% (TTR50%) przy użyciu tPeak. Zapisz te opcje analizy, wybierając opcję Szablony > Zapisz szablon analizy z identyfikatorem. Załaduj ten szablon analizy przed analizą każdego śladu.</li>
	<li>Aby rozpocząć analizę danych, wybierz opcję Znaczniki > bramie > Dodaj stan przejściowy > Konwertuj ze znacznika zdarzenia > zakresu analizy. Teraz ustaw zakres czasu od -0,01 s do 1,20 s dla miocytów w tempie 0,2 Hz (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, czerwone znaki w dolnej części surowego śladu). Wybierz krótszy zakres czasu dla miocytów stymulowanych wyższymi częstotliwościami.</li>
	<li>Utwórz ślad uśredniony według sygnału, wybierając pozycję Operacje > Średnia liczba zdarzeń. Nagranie uśrednione sygnałem pojawia się poniżej oryginalnej ścieżki podstawowej.</li>
	<li>Wybierz pozycję Tab 1 uśrednionego sygnału (po lewej stronie ekranu), a następnie wybierz pozycję Znaczniki w górnym menu, a następnie pozycję Dodaj stan przejściowy. Wybierz Operacje z górnego menu i Monotoniczna analiza stanów nieustalonych, aby wyświetlić uśrednione wartości sygnału dla podstawowej długości sarkomeru, wysokości piku, bl% peak h, dep v, ret v, TTP50% i TTR50% w panelu wyświetlania uśrednionego sygnału.</li>
	<li>Przenieś każdą analizę stanów przejściowych sarkomeru do arkusza kalkulacyjnego w celu złożonej analizy wielu miocytów, wybierając opcję Eksportuj > Monotoniczną analizę stanów nieustalonych > Prąd schowka. Wklej te dane do arkusza kalkulacyjnego dla każdego śladu.</li>
	<li>Aby skopiować ślad uśredniony > sygnału, wybierz opcję Eksportuj bieżący ślad > Opcje schowka > i ustaw liczbę miejsc dziesiętnych na 5, a następnie wybierz opcję Ogranicznik tabulatorów i kliknij przycisk OK, a następnie przycisk OK. Wklej uśrednione sygnałowo ślady dla każdego zapisu miocytów do drugiego arkusza kalkulacyjnego.</li>
</ol>
4. Rejestrowanie stanów przejściowych Ca2+ w miocytach serca dorosłych szczurów
<ol>
	<li>Przed pomiarem stanów nieustalonych Ca2+ włącz komponenty platformy opisane w kroku 2.2 wraz z dodatkowymi komponentami obrazowania fluorescencyjnego (patrz dodatkowe komponenty do analizy obrazowania Ca2+ w Tabeli materiałów; Rysunek uzupełniający 2A-5,6; 2B-12).</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy Fura-2AM zawierający 1 mM Fura-2AM plus 0,5 M probenecyd w dimetylosulfotlenku (DMSO). Probenecyd minimalizuje wyciek Fura-2AM15.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy do 5 μM Fura-2AM i 2,5 mM probenecydu w 2,5 ml pożywki (patrz tabela materiałów) w jednym dołku na płytce 6-dołkowej. Dodać 2,5 ml samej pożywki (bez Fura-2AM) do trzech dodatkowych studzienek w płytce, przykryć płytkę folią aluminiową i podgrzać pożywkę do 37 °C.</li>
	<li>Przenieść CS zawierający miocyty z komory stymulacyjnej do studzienki zawierającej Fura-2AM, przykryć i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 minuty. Zamontować rurkę w pompie perfuzyjnej i perfaktorować pożywką w okresie ładowania Fura-2AM, jak opisano w kroku 2.4.</li>
	<li>Wyłącz lub zminimalizuj oświetlenie w pomieszczeniu, aby zmniejszyć fotowybielanie fluorescencyjne i zoptymalizować sygnał fluorescencji. Wyjąć 6-dołkową płytkę z inkubatora, a następnie umyć CS przez 10 sekund w każdym z trzech dołków zawierających samą pożywkę. Przenieś CS do małej łodzi wagowej zawierającej wstępnie podgrzane podłoże (bez dodatku Fura-2AM).</li>
	<li>Zamontuj CS w świeżo nasmarowanej komorze CS po delikatnym wytarciu spodu CS. Delikatnie dodaj kroplę nośnika do CS, a następnie zamontuj mocowanie elektrody nad CS, a następnie drugi CS i górne mocowanie. Użyj z stożkowym stożkowym stożkowym #0, aby zakończyć montaż komory ogniwa, zgodnie z opisem w krokach 2.6.-2.7.</li>
	<li>Podłącz rurkę pompy wypełnioną mediami do podgrzewacza, podłącz podgrzewacz do komory CS i umieść w stage adapter, jak opisano w kroku 2.8. Zebrać media za pomocą systemu przewodów próżniowych i włączyć system grzewczy (rysunek uzupełniający 2A,D-7), aby wyrównać temperaturę komory do 37°C, jak opisano w krokach 2.8.-2.9.</li>
	<li>Aktywuj stymulator stymulacji (rysunek uzupełniający 2B-13) ustawiony na 35-40 V i 0.2 Hz, jak opisano w kroku 2.10.</li>
	<li>Przed nagraniem stanu przejściowego Ca2+ włącz małą latarkę lub latarkę do książek zamontowaną w pobliżu klawiatury komputera, aby pomóc zobaczyć klawiaturę. Ponadto zapisz tło fluorescencyjne w obszarze bez miocytów serca. Aby rozpocząć, wybierz pozycję Plik > Rozpocznij > Nowy, zgodnie z opisem w kroku 2.12.</li>
	<li>Wybierz ROI i ustaw jedną zakładkę (lub pasek śledzenia, po lewej stronie) dla surowego licznika i drugą zakładkę dla surowego mianownika, zdefiniowaną w górnej środkowej części każdej karty. Nagrywaj tło przez 10-20 s. Kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij nad jednym panelem paska śledzenia, aby uzyskać surowe wartości licznika i mianownika uśrednione dla sygnału. Wprowadź te wartości, wybierając Operacje > Stałe, a następnie wprowadź wartości nieprzetworzone.</li>
	<li>Przygotuj nowy szablon ekranu, aby zebrać zarówno skróty, jak i stany nieustalone Ca2+. W przypadku długości sarkomeru wybierz zakładkę 1 i użyj tego samego procesu, który opisano w kroku 2.13. W przypadku obrazowania Ca2+ wybierz opcję Tab 2 > Ratio (górny środek karty) > Ślady > Edytuj limity użytkowników, aby ustawić minimalne i maksymalne poziomy współczynnika, które są zwykle ustawiane w zakresie od 1 do 5. Użyj tego samego procesu, aby zdefiniować zakresy licznika i mianownika dla kart 3 i 4 (po lewej stronie).</li>
	<li>Umieść pole ROI na obrazie miocytów, zgodnie z opisem w kroku 2.14. Wybierz pozycję File (Plik> Nowy > zbierz. Teraz wybierz Start, aby zebrać dane skracania i ratiometryczne Ca2+. Rejestruj skurcze ≥7 na komórkę w celu analizy uśrednionej sygnału.</li>
	<li>Powtórz zapis śladu tła opisany w kroku 4.10 po zarejestrowaniu 2-4 miocytów. Zazwyczaj zapisuj 4-5 miocytów/CS lub mniej miocytów, jeśli występują znaczące zmiany w odczycie tła.</li>
</ol>
5. Analiza danych stanów przejściowych Ca2+ w izolowanych miocytach.
<ol>
	<li>Otwórz żądany plik do analizy i wybierz Szablony > Szablon ekranu do skracania oraz stany nieustalone Ca2+. Następnie wybierz zakładki 1 i 2 (po lewej), aby pokazać odpowiednio długość sarkomeru i stosunek Ca2+. Wybierz Operacje > Stałe i wprowadź wartości licznika i mianownika ze śladu tła Ca2+.</li>
	<li>Przygotuj szablony analizy do skracania oraz dane przejściowe Ca2+. Wybierz kartę 1 (po lewej stronie) i użyj tego samego procesu, który opisano w kroku 3.2. , aby ustawić szablon analizy długości sarkomeru.</li>
	<li>Wybierz zakładkę 2 (po lewej stronie) i wybierz Operacje, Opcje monotonnej analizy stanów nieustalonych, znacznik zdarzenia TTL w polu Definicja t0 oraz następujące opcje z menu: Linia bazowa (stosunek podstawowy), Prędkość odlotu względem t0 (dep v), Szczyt (wysokość piku i %wysokość szczytu/linia bazowa lub bl%szczyt h), Prędkość zaniku względem tPeak (ret v), Czas do osiągnięcia szczytu 50% (TTP50%) przy użyciu t0 i czas do punktu odniesienia 50% (TTR50%) przy użyciu tPeak. Zapisz te opcje analizy, wybierając Szablony i Zapisz szablon analizy przy użyciu nowej nazwy identyfikatora. Załaduj ten szablon analizy przed analizą każdego śladu.</li>
	<li>Użyj tego samego procesu, jak opisano w krokach 3.3.-3.6., aby uśrednić sygnał, a następnie przeanalizować długość sarkomeru, a następnie wykonaj te same kroki dla stanów nieustalonych Ca2+. Ustaw osobne znaczniki dla długości sarkomeru i dla śladu współczynnika stanów przejściowych Ca2+.</li>
</ol>

<ol><li>Reihle, C., Bauersachs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+models+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Small animal models of heart failure.</a> Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).</li>
<li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li>
<li>Rossman, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+frequency-dependent+responses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+in+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).</li>
<li>McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+myofilament+contractile+function+in+human+donor+and+failing+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 468(2020).</li>
<li>Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+contractile+dysfunction+and+protein+kinase+C-mediated+myofilament+phosphorylation+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging.</a> The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).</li>
<li>Chaudhary, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+myocardial+Ca2%2B+cycling+after+left+ventricular+assist+device+support+in+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).</li>
<li>Walker, C. A., Spinale, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+the+cardiac+myocyte%3A+A+review+of+fundamental+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).</li>
<li>Lang, S. E., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).</li>
<li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+heart+performance+by+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Designing heart performance by gene transfer.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).</li>
<li>Sweitzer, N. K., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+loaded+shortening+velocity+in+single+cardiac+myocytes+permeabilized+with+a-hemolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin.</a> Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unloaded+shortening+increases+peak+of+Ca2%2B+transients+but+accelerates+their+decay+in+rat+single+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).</li>
<li>Racca, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+developing+human+fetal+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle.</a> The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).</li>
<li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+expression+and+basal+lamina+remodeling+in+human+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure.</a> Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).</li>
<li>Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody+effects+on+cellular+function+of+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e4237(2013).</li>
<li>Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+probenecid%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The history and future of probenecid.</a> Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Sakthivel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+analysis+of+cardiac+troponin+I+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B-ATPase+during+progression+of+left+ventricular+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy.</a> The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).</li>
<li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+basis+of+Starling%27s+law+of+the+heart%3A+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li>
<li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li>
<li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li>
<li>Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shortening+and+%5BCa2%2B%5D+dynamics+of+left+ventricular+myocytes+isolated+from+exercise-trained+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Protokół przewlekłej stymulacji opisany w kroku 1 wydłuża użyteczny czas badania izolowanych miocytów i oceny wpływu dłuższych terapii. W naszym laboratorium spójne wyniki uzyskano do 4 dni po izolacji, mierząc funkcję skurczu za pomocą długości sarkomeru na miocytach o przewlekłym tempie. Jednak funkcja skurczu miocytów szybko się pogarsza, gdy używa się pożywek starszych niż 1 tydzień do stymulacji miocytów.
W przypadku badań funkcji skurczowych dane zbiera się w temperaturze 37 °C, która je...

Analiza funkcji pompy serca często wymaga szeregu podejść w celu uzyskania odpowiedniego wglądu, szczególnie w przypadku zwierzęcych modeli niewydolności serca (HF). Echokardiografia lub pomiary hemodynamiczne dostarczają wglądu w dysfunkcję serca in vivo1, podczas gdy podejścia in vitro są często stosowane w celu określenia, czy dysfunkcja wynika ze zmian w miofilamentach i/lub transjencie Ca2+ odpowiedzialnym za wzbudzenie sprzężenia, czy też potencjału czynnościowego z funkcją skurczu (np. sprzężenie wzbudzenie-skurcz [E-C]). Podejścia in vitro dają również możliwość badania przesiewowego funkcjonalnej odpowiedzi na neurohormony, zmiany genetyczne wywołane przez wektory, a także potencjalne środki terapeutyczne2 przed zastosowaniem kosztownych i/lub pracochłonnych strategii leczenia in vivo.
Dostępnych jest kilka podejść do badania funkcji kurczliwości in vitro, w tym pomiary siły w nienaruszonych beleczkach3 lub permeabilized miocytes4, a także niezaładowane skracanie i przejściowe Ca2+ w nienaruszonych miocytach w obecności i braku HF5,6. Każde z tych podejść koncentruje się na funkcji skurczowej miocytów serca, która jest bezpośrednio odpowiedzialna za funkcję pompy serca2,7. Jednak analiza zarówno skurczu, jak i sprzężenia E-C jest najczęściej wykonywana poprzez pomiar skrócenia długości mięśni i stanów przejściowych Ca2+ w izolowanych, tolerancyjnych na Ca2 + dorosłych miocytach. Laboratorium wykorzystuje szczegółowy, opublikowany protokół do izolacji miocytów z serc szczurów na tym etapie8.
Zarówno przejścioweCa2+, jak i miofilamenty przyczyniają się do skracania i ponownego wydłużania nienaruszonych miocytów i mogą przyczyniać się do dysfunkcji kurczliwości2,7. Dlatego takie podejście jest zalecane, gdy analiza funkcjonalna in vitro wymaga nienaruszonego miocytu zawierającego maszynerię rowerową Ca2 + oraz miofilamenty. Na przykład, nienaruszone izolowane miocyty są pożądane do badania funkcji skurczu po modyfikacji funkcji cyklicznej miofilamentu lub Ca2+ poprzez transfer genów9. Ponadto sugeruje się podejście oparte na nienaruszonych miocytach do analizy funkcjonalnego wpływu neurohormonów podczas badania wpływu szlaków sygnałowych drugiego przekaźnika i/lub odpowiedzi na środki terapeutyczne2. Alternatywny pomiar siły zależnej od obciążenia w pojedynczych miocytach jest najczęściej wykonywany po przepuszczalności błony (lub skórowaniu) w niskich temperaturach (≤15 °C) w celu usunięcia przejściowego wkładu Ca2+ i skupienia się na funkcji miofilamentu10. Pomiar siły zależnej od obciążenia plus stany nieustalone Ca2+ w nienaruszonych miocytach jest rzadki, głównie ze względu na złożone i techniczne wyzwanie podejścia11, zwłaszcza gdy potrzebna jest wyższa przepustowość, na przykład do pomiaru odpowiedzi na sygnalizację neurohormonalną lub jako badanie przesiewowe dla środków terapeutycznych. Analiza beleczków serca pozwala przezwyciężyć te wyzwania techniczne, ale może również mieć na nią wpływ brak miocytów, zwłóknienie i/lub przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej2. Każde z opisanych powyżej podejść wymaga preparatu zawierającego dorosłe miocyty, ponieważ miocyty noworodków i miocyty pochodzące z indukowalnych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) nie wyrażają jeszcze pełnego zestawu dorosłych białek miofilamentowych i zwykle brakuje im poziomu organizacji miofilamentów obecnego w dorosłym miocytach w kształcie pałeczek2. Dotychczasowe dane w iPSC wskazują, że pełne przejście do dorosłych izoform trwa ponad 134 dni w culture12.
Biorąc pod uwagę, że ta kolekcja skupia się na HF, protokoły zawierają podejścia i analizy do różnicowania funkcji skurczowej u nieuszkodzonych i nieuszkodzonych miocytów. Reprezentatywne przykłady przedstawiono z miocytów szczurów badanych 18-20 tygodni po koarktacji nadnerkowej, opisanej wcześniej5,13. Następnie dokonuje się porównań z miocytami szczurów leczonych pozorowo.
Opisany tutaj protokół i platforma obrazowania są używane do analizy i monitorowania zmian w przejściowych skrótach i Ca2+ w pręcikowatych miocytach serca podczas rozwoju HF. Na potrzeby tej analizy 2 x 104 tolerancyjne na Ca2+, pręcikowe miocyty są powlekane na 22 mm2 powlekanych lamininą szklanych szkiełkach nakrywkowych (CS) i hodowane przez noc, jak opisano wcześniej8. Komponenty zmontowane dla tej platformy obrazowania, wraz z mediami i używanymi do optymalnego obrazowania, znajdują się w Tabeli Materiałów. Dostępny jest również przewodnik dotyczący analizy danych za pomocą oprogramowania oraz reprezentatywne wyniki. Ogólny protokół jest podzielony na oddzielne podsekcje, przy czym pierwsze trzy sekcje koncentrują się na izolowanych miocytach szczurów i analizie danych, a następnie na przejściowych eksperymentach komórkowych Ca2 + i analizie danych w miocytach.

<table><tbody><tr><td>MEDIA</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma (Roche)</td><td>3117057001</td><td>Stężenie końcowe = 0,2% (w/v)</td></tr><tr><td>Glutation</td><td>Sigma</td><td>G-6529</td><td>Stężenie końcowe = 10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td>Stężenie końcowe = 15 mM</td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M-2520</td><td>1 butelka wystarcza na 1 l; pH 7.45</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S-8875</td><td>Stężenie końcowe = 4 mM</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Fisher</td><td>15140122</td><td>Stężenie końcowe = 100 U/ml penicyliny, 100 &mu; g/ml streptomycyny</td></tr><tr><td>ODCZYNNIKI SPECJALNIE DO OBRAZOWANIA Ca2+</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Invitrogen (sondy molekularne)</td><td>F1221</td><td>50 &mu; g / fiolka; &nbsp; Przygotować roztwór podstawowy 1 mM Fura-2AM + 0,5 M probenicydu w DMSO; &nbsp; Końcowe stężenie Fura2-AM w pożywkach wynosi&nbsp; 5 &mu; M</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Invitrogen (Fisher)</td><td>P36400</td><td>Dodać 7,2 mg probenicydu (0,5 M) do 1 mM Fura-2AM zapasu; Końcowe stężenie w pożywce wynosi 2,5 mM</td></tr><tr><td>MATERIAŁY DO STYMULACJI MIOCYTÓW SZCZURÓW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1 22&nbsp; mm2 szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Corning</td><td>2845-22</td><td></td></tr><tr><td>3 x 36 cali z gniazdami bananowymi</td><td>Pomona Electronics</td><td>B-36-2</td><td>Rysunek uzupełniający 1, panel C</td></tr><tr><td>37oC Inkubator&nbsp; z 95% O2:5% CO2&nbsp;</td><td>Forma</td><td>3110</td><td>Rysunek uzupełniający 1, panel E.&nbsp; Wiele modeli jest odpowiednich</td></tr><tr><td>Klasa II A/B3 Szafa bezpieczeństwa biologicznego z lampą UV</td><td>Forma</td><td>1286</td><td>Wiele modeli jest odpowiednich</td></tr><tr><td>Kleszcze - Dumont #5 5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator gorących kulek</td><td>Fine Science Tools</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony o małym powiększeniu</td><td>Leica</td><td>DM-IL&nbsp;</td><td>Umieść ten mikroskop w pobliżu inkubatora, aby monitorować pobudzone miocyty pod kątem skurczu na początku stymulacji i po zmianie pożywki; Zalecane obiektywy 4X i 10X</td></tr><tr><td>Komora stymulacji</td><td>Niestandardowy</td><td></td><td>Rysunek uzupełniający 1, panel A. System Ionoptix C-pace jest dostępną na rynku alternatywą lub patrz 22</td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>Ionoptix</td><td>Myopacer</td><td>Rysunek uzupełniający 1, panel D.</td></tr><tr><td>MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION i/lub Ca2+ ANALIZA OBRAZOWA</td><td></td><td></td><td>ID na rysunku uzupełniającym 2 i Alternatywy/Zalecane opcje Dodatkowe</td></tr><tr><td>komponenty do analizy obrazowania Ca2+</td><td>Elementy systemu Ionoptix</td><td>Essential: -- System zliczania fotonów&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Zasilacz ksenonowy z podwójnym źródłem światła wzbudzenia&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Interfejs fluorescencji</td><td>&nbsp;- System zliczania fotonów zawiera rurkę fotopowielacza (PMT) i zwierciadło dichroiczne i jest zainstalowany obok kamery CCD&nbsp; (panel A #4).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Zasilanie źródła światła żarówki ksenonowej (patrz panel A #5 i panel C, po lewej) jest zintegrowane z podwójnym interfejsem wzbudzenia (wzbudzenie 340/380 nm i emisja 510 nm) pokazanym na panelu A #6. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Interfejs fluorescencyjny między komputerem a&nbsp; źródło światła pokazano na panelu B, #12.</td></tr><tr><td>Kamera CCD z akwizycją obrazu&nbsp; sprzęt i oprogramowanie (240 klatek/s)</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>Myocam z kontrolerem CCD&nbsp;</td><td>Kontroler Myocam i CCD pokazano na rys. 2, panel A #4&nbsp; i&nbsp; odpowiednio panel A #5 i panel C #5 (po prawej).&nbsp; Sterownik jest zintegrowany z systemem komputerowym PC (panel B #14).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Stymulator komorowy</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td></td><td>Panel Mięśniowy B, #13; Alternatywa:&nbsp; Trawiasty model S48</td></tr><tr><td>Komora perfuzyjna montowana na szkiełku nakrywkowym</td><td>Niestandardowa komora do szkiełka nakrywkowego 22 mm2 z silikonowym adapterem i 2-4 Phillips z stożkowym stożkowym #0&nbsp; (strzałka, panel F)</td><td></td><td>Panel A #10 i panel F; &nbsp; &nbsp; Temperatura komory jest kalibrowana do 37oC za pomocą sondy TH-10Km i regulatora temperatury TC2BIP (patrz regulator temperatury).&nbsp; Alternatywy komercyjne:&nbsp; Komórka Ionoptix FHD lub C-stim&nbsp; Komory; System stymulacji hodowli Cell MicroControls</td></tr><tr><td>Dedykowany komputer i oprogramowanie do zbierania i analizy danych o stanach nieustalonych funkcji/Ca2+</td><td>Ionoptix</td><td>PC z płytą PC Ionwizard i oprogramowaniem</td><td>Panel B, #14; Funkcja kurczliwości jest mierzona za pomocą modułów akwizycji SarcLen (długość sarkomeru) lub SoftEdge (długość miocytów) oprogramowania IonWizard. Oprogramowanie Ionwizard zawiera również oprogramowanie do akwizycji PMT dla ratiometric&nbsp; Obrazowanie Ca2+ w mioyctesach załadowanych Fura-2AM. - Do umieszczenia somputera i stymulatora komórkowego zalecana jest 4-słupkowa elektroniczna szafa rackowa i półki.&nbsp; Interfejs fluorescencyjny do obrazowania Ca2+ również znajduje się w tej szafie (patrz poniżej).</td></tr><tr><td>Kleszcze - Dumont #5 TI</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td>Panel F</td></tr><tr><td>Izolowany uchwyt na rurkę do mediów</td><td>Niestandardowy</td><td></td><td>panel A #9; Ten uchwyt można łatwo zmontować za pomocą styropianu i wstępnie podgrzany pakiet żelowy utrzymujący ciepło</td></tr><tr><td>podłoża Mikroskop odwróconego jasnego pola</td><td>Nikon</td><td>TE-2000S</td><td>Zainstaluj obrotową wieżyczkę do epi-fluorescencji (Panel A #2) do obrazowania Ca2+.&nbsp; &nbsp; Zalecany jest również ciemnoczerwony (590 nm) filtr kondensatorowy, aby zminimalizować wybielanie fluorescencyjne podczas obrazowania Ca2+.</td></tr><tr><td>Stół izolacyjny</td><td>TMC Vibration Control</td><td>30 x 36 cali</td><td>Panel A, #1; Pożądane:&nbsp; regały podwyższone, osłona Faradaya&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Okulary mikroskopowe i obiektyw</td><td>Okulary</td><td>Nikon 10X CFI Wodoodporny obiektyw CFI Plan Fluor</td><td>Panel A #3; Obiektyw 40X:&nbsp; n.d. 0,08; w.d. 2 mm.&nbsp; Grzejnik obiektywowy Cell MicroControls HLS-1 jest zamontowany wokół obiektywu (patrz regulator temperatury poniżej).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; UWAGA:&nbsp; Dozowniki zanurzeniowe w wodzie są teraz dostępne również dla celów opartych na wodzie.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>Panel A #8 i panel E</td></tr><tr><td>mała łódź wagowa</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Cell MicroControls</td><td>TC2BIP</td><td>Panel A #7; Panel D. Ten regulator temperatury podgrzewa komorę szkiełka nakrywkowego do 37oC.&nbsp; &nbsp; &nbsp; Dla tej platformy zalecany jest podgrzewacz wstępny i grzejnik obiektywowy.&nbsp; Podgrzewacz Cell MicroControls HPRE2 i&nbsp; Grzejniki obiektywowe HLS-1 są sterowane&nbsp; przez regulator temperatury TC2BIP dla naszych badań.</td></tr><tr><td>Oświetlenie podszafkowe LED z czujnikiem ruchu&nbsp;</td><td>Lampa LED Sylvania</td><td>#72423</td><td>Zalecana do zbierania danych podczas obrazowania przejściowego Ca2+ przy minimalnym oświetleniu pomieszczenia. &nbsp; Alternatywa:&nbsp; Klips latarki / latarki do książki z elastyczną szyjką - dostępnych jest wielu dostawców.</td></tr><tr><td>Przewód podciśnieniowy z liniową kolbą Ehrlenmeyera i filtrem ochronnym</td><td>Fisher</td><td>Tygon - E363; &nbsp; kolba polipropylenowa Ehrlenmeyer - 10-182-50B; Filtr próżniowy - 09-703-90</td><td>Panel A #11</td></tr></tbody></table>

analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych ca2+ w miocytach gryzoni

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Dysfunkcja skurczowa i przejściowe stany Ca2+ są często analizowane na poziomie komórkowym jako część kompleksowej oceny uszkodzeń i/lub przebudowy wywołanych przez serce. Jednym z podejść do oceny tych zmian funkcjonalnych jest nieobciążone skracanie i analizy przejściowe Ca2 + w pierwotnych dorosłych miocytach serca. W tym podejściu dorosłe miocyty są izolowane przez trawienie kolagenazy, uzyskuje tolerancję Ca2+, a następnie przykleja się do szkiełek nakrywkowych pokrytych lamininą, a następnie następuje stymulacja elektryczna w pożywce wolnej od surowicy. Ogólny protokół wykorzystuje miocyty serca dorosłych szczurów, ale można go łatwo dostosować do miocytów pierwotnych innych gatunków. Zmiany funkcjonalne w miocytach z uszkodzonych serc można porównać do miocytów pozorowanych i/lub do leczenia in vitro. Metodologia obejmuje podstawowe elementy potrzebne do stymulacji miocytów, a także elementy komory komórkowej i platformy. Szczegółowy protokół dla tego podejścia obejmuje etapy pomiaru nieobciążonego skrócenia za pomocą detekcji długości sarkomeru i komórkowych stanów przejściowych Ca2+ mierzonych za pomocą wskaźnika ratiometrycznego Fura-2 AM, a także do analizy surowych danych.

Badania funkcji skurczowej przeprowadza się na miocytach szczura począwszy od dnia następującego po izolacji (dzień 2) aż do 4 dni po izolacji. Chociaż pomiary z miocytów można rejestrować dzień po izolacji (tj. w dniu 2), często wymagany jest dłuższy czas hodowli po transferze genów lub zastosowaniu terapii w celu zmodyfikowania funkcji skurczowej8. W przypadku miocytów hodowanych przez ponad 18 h po izolacji, protokół stymulacji opisany w sekcji 1 pomaga utrzymać strukturę kanalików T oraz zapew...

Przedstawiono zestaw protokołów, które opisują pomiar funkcji skurczu za pomocą wykrywania długości sarkomeru wraz z pomiarem przejściowym wapnia (Ca2+) w izolowanych miocytach szczurów. Uwzględniono również zastosowanie tego podejścia w badaniach na zwierzęcych modelach niewydolności serca.

Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca2+ w miocytach gryzoni

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Takie podejście wykrywa zmiany w funkcji skurczowej podczas rozwoju niewydolności serca. Można również badać funkcjonalną odpowiedź miocytów na neurohormony i potencjalne środki terapeutyczne. Pozycjonowanie miocytów może wymagać praktyki, ale jest niezbędne do uzyskania spójnego obrazowania długości sarkomeru.Demonstracją tej procedury jest Margaret Westfall, profesor nadzwyczajny i główny badacz laboratorium. Przed rozpoczęciem eksperymentu podgrzej żel i podłoże w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Włącz elementy platformy funkcji skurczu, jak wspomniano w manuskrypcie, i zmontuj rurki w pompie perystaltycznej.Następnie przenieś podgrzany pakiet żelu do uchwytu probówki i włącz podciśnienie w zasilaniu stymulatora komórkowego. Umieść 50-mililitrową rurkę z mediami w izolowanym uchwycie probówki, aby rozpocząć perfuzję z prędkością 0,5 mililitra na minutę przez rurkę pompy perystaltycznej. Następnie dodaj dwa mililitry podgrzanej pożywki do małej łodzi wagowej i przenieś jedno szkiełko nakrywkowe zawierające miocyty z komory stymulacji do łodzi wagowej.Umieść komorę stymulacji z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Zdejmij szkiełko nakrywkowe z łodzi wagowej i delikatnie wytrzyj spód przed przeniesieniem go do świeżo nasmarowanej komory szkiełka nakrywkowego i dodaniem kropli podłoża na szkiełko nakrywkowe. Umieść platynowy uchwyt elektrody na szkiełku nakrywkowym, a następnie połóż nowy szkiełko nakrywkowe na wierzchu za pomocą kleszczyków i umieść górny uchwyt na kanapce z szkiełkiem nakrywkowym.Wkręć dwie lub cztery z stożkowym ściętym o numerze zero, aby zakończyć montaż komory. W pompie perystaltycznej, gdy media są obecne w całej rurce, podłącz rurkę do podgrzewacza, a podgrzewacz do komory szkiełka pokrywowego. Następnie rozpocznij perfuzję z prędkością 0,5 mililitra na minutę i umieść chusteczkę higieniczną pod komorą, aby upewnić się, że nie ma wycieków.Po umieszczeniu komory szkiełka nakrywkowego w adapterze stolika mikroskopu, włącz system grzewczy i równoważ montaż przez pięć do 10 minut, aby osiągnąć stałą temperaturę medium 37 stopni Celsjusza w środku komory. Obserwuj, jak perfaktorskie media są zbierane na przeciwległym końcu komory z rurkami podłączonymi do systemu próżniowego. W czasie równowagi wizualizuj miocyty za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzonego w wodzie na mikroskopie.Aby aktywować stymulator stymulacji, ustaw napięcie na 35 do 40 woltów i dostosuj częstotliwość stymulacji do 0,2 herca, aby zoptymalizować funkcję skurczu i przeżycie miocytów. Aby zebrać ślady skracania sarkomeru, otwórz oprogramowanie na komputerze i wybierz okej, plik i nowe karty. Przygotuj szablon ekranu, wybierając ślady, edytuj limity użytkowników i długość sarkomeru.Zapisz ślady długości sarkomeru za pomocą pliku i nowych zakładek, zidentyfikuj kurczący się miocyt i ustaw miocyt wzdłuż osi podłużnej aparatu, tak aby wzór prążkowania był pionowy. Użyj myszy komputerowej, aby umieścić obszar zainteresowania lub pole ROI nad miocytami. Wybierz opcję collect i rozpocznij rejestrowanie funkcji skurczu.Rejestruj skracanie przez 60 sekund z każdego miocytu przy niskich częstotliwościach stymulacji 0,5 Hz. Zapisz skrócenie sarkomeru od pięciu do 10 komórek na szkiełko nakrywkowe. Aby zmierzyć skrócenie w zakresie częstotliwości, umieść miocyty na każdej częstotliwości, aby uzyskać skrócenie w stanie ustalonym przed zapisem.Podwój szybkość perfuzji i rozpocznij nagrywanie od 15 do 20 sekund po stymulacji z nową częstotliwością w zakresie od 0,2 do dwóch herców i zapisuj nie więcej niż dwa miocyty na szkiełko nakrywkowe w celu skrócenia w danym zakresie częstotliwości stymulacji. Zarejestruj co najmniej siedem skurczów na komórkę, aby uzyskać wiarygodne dane uśrednione sygnałem. Wybierz plik, wybierz nagrany ślad, a następnie wybierz pozycję Otwórz.Wybierz zakładkę jedną ze ścieżek podstawowych, a następnie ustaw żółty panel u góry ścieżki, aby uzyskać długość sarc. Przygotuj szablon analizy z operacjami, opcjami monotonnej analizy stanów nieustalonych i znacznikiem zdarzenia TTL w polu definicji T Zero w odpowiednich opcjach z menu. Zapisz te opcje analizy, wybierając szablony i zapisz szablon analizy z identyfikatorem.Załaduj szablon analizy przed przeanalizowaniem każdego śladu. Aby przeanalizować dane, wybierz znaczniki, bramkę, dodaj stan nieustalony, a następnie przekonwertuj ze znacznika zdarzenia i zakresu analizy. Ustaw zakres czasu od minus 0,01 do 1,20 sekundy dla miocytów w tempie 0,2 Hz.Wybierz krótszy zakres czasu dla miocytów stymulowanych wyższymi częstotliwościami. Wybierz operacje i uśrednione zdarzenia, aby wygenerować uśredniony zapis sygnału poniżej oryginalnego śladu podstawowego. Następnie wybierz zakładkę jedną ze śladów uśrednionego sygnału, a następnie przejdź do znaczników w górnym menu, a następnie dodaj stan nieustalony, wybierz operacje i monotoniczną analizę stanów nieustalonych, aby wyświetlić uśrednione wartości sygnału dla podstawowych parametrów sarkomeru w panelu wyświetlania uśrednionego sygnału.Wybierz eksport monotonicznej analizy stanów nieustalonych i prądu schowka oraz przenieś przejściową analizę sarkomerową do arkusza kalkulacyjnego w celu złożonej analizy wielu miocytów. Aby skopiować uśredniony ślad sygnału, wybierz eksport, bieżący ślad, a następnie zakładki schowka i opcje w kolejności i ustaw miejsca dziesiętne na pięć. Wybierz ogranicznik tabulatorów i kliknij OK.Umieść uśrednione ślady sygnału dla każdego zapisu miocytów w drugim arkuszu kalkulacyjnym. Badanie wykazało, że przeciążenie ciśnieniem lub PO zmniejszyło funkcję skurczową miocytów w porównaniu z grupą pozorowaną. Jednak cztery dni po transferze genu troponiny sercowej IT 144D lub cTnIT144D zdolność kurczliwości miocytów PO powróciła do poziomu pozorowanego, co wskazuje, że funkcja miocytów może zostać przywrócona.We wstępnych badaniach transfer genu cTnIT144D poprawił skrócenie pików i podwyższony rozkurczowy poziom wapnia w porównaniu z CTnI. Często konieczne są drobne korekty w ustawieniu miocytów serca, aby uzyskać wyraźne ślady skracające. Protokół ten można również wykonać na miocytach serca obciążonych wrażliwymi na wapń barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak Fura-2 AM, w celu wykrycia stanów przejściowych wapnia oprócz skracania.

analysis-cardiac-contractile-dysfunction-ca2-transients-rodent

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Mysi mięsień brodawkowaty lewej komory może być użyty do zbadania kurczliwości serca in vitro. W tym artykule szczegółowo opisano izolację i protokoły eksperymentalne do badania charakterystyki kurczliwości serca.

Pomiary kurczliwości izolowanych mięśni brodawkowatych w celu zbadania inotropii serca u myszy

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Ten artykuł opisuje protokół, który ocenia zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2+ podczas skurczu w izolowanych miocytach serca szczura. Wraz z elektrofizjologią serca, skurczowymi/rozkurczowymi poziomami cytozolu Ca2+ i skurczem/rozluźnieniem, pomiar ten jest niezbędny do wzmocnienia mechanizmów pośredniczących w sprzężeniu pobudzenia-skurczu serca w zdrowych i chorych sercach.

Ocena wrażliwości miofilamentu ca2+ leżącej u podstaw sprzężenia wzbudzenia-skurczu serca

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Ten protokół ma na celu opisanie krok po kroku techniki ekstrakcji i oceny funkcji serca za pomocą kardiomiocytów ze skóry. Metodologia ta umożliwia pomiar i ostrą modulację funkcji miofilamentów za pomocą małych zamrożonych biopsji, które można pobrać z różnych lokalizacji serca, od myszy po mężczyzn.

Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą

Przedstawiamy protokół oceny elektromechanicznych efektów aktywacji GtACR1 w kardiomiocytach królików. Dostarczamy szczegółowych informacji na temat izolacji komórek, hodowli i transdukcji adenowirusa oraz na temat eksperymentów funkcjonalnych z użyciem technik patch-clamp i włókna węglowego.

Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Ten protokół opisuje, jak mierzyć kurczliwość u pierwotnych kardiomiocytów dorosłych ludzi z serc dawców za pomocą systemu MyoBLAZER, niezawodnej platformy do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem podczas rozwoju przedklinicznego.

Pomiar kurczliwości serca w izolowanych kardiomiocytach pierwotnych u dorosłych ludzi

Ten protokół wprowadza dwubarwne optyczne mapowanie serc myszy uzyskanych od zwierząt typu dzikiego i knock-in dotkniętych katacholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym, w tym elektrofizjologiczne pomiary napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+ o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej.

Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym

Poznaj metody pomiaru kurczliwości miocytów szczura i stanów przejściowych wapnia w badaniach fizjologii serca. Protokoły te umożliwiają analizę dysfunkcji serca i testowanie potencjalnych terapii.

Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca²⁺ w miocytach gryzoni

Przeglądaj więcej filmów