Name: Pomiar wrażliwości Caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj metodę pomiaru wrażliwości Caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny, przy użyciu płytki 24-dołkowej. Protokół umożliwia ilościową analizę paraliżu w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Riyi Dattani i Lauren Hogstrom, które zebrały dane na rysunku 2B,C ślepe na genotyp w BISC413 Advanced Genetics Laboratory (wiosna 2022) na Uniwersytecie Delaware. Dodatkowe informacje na temat BISC413 doświadczenia badawczego opartego na kursach licencjackich (CURE), a także dostęp do podręcznika laboratoryjnego zaprojektowanego przez J. Tanisa, są dostępne na życzenie. Szczepy nicieni zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest wspierane przez NIH-ORIP (P40 OD010440). Praca ta została wsparta nagrodą P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (dla J.E.T.).

1. Przygotowanie płytek do testu lewamizolu
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę dla nicieni (NGM), łącząc 3 g NaCl, 2,5 g peptonu i 17 g agaru z 1 litrem wody dejonizowanej (DI) w kolbie z mieszadłem.</li>
	<li>Po sterylizacji w autoklawie umieścić podłoże na płycie grzejnej ustawionej na 70 °C i mieszać z umiarkowaną prędkością przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodaj kroplami 1 ml cholesterolu 5 mg / ml, aby zapobiec wytrącaniu się, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 i 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu o pH 6,0 do pożywki.</li>
	<li>Przenieś 2 ml pożywki NGM do każdej studzienki 24-dołkowej płytki za pomocą sterylnej pipety serologicznej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Pozostaw talerze do wyschnięcia na blacie na 2 dni przed wysiewem z bakteriami. W przypadku długotrwałego przechowywania należy je umieścić w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieść OP50 E. coli na talerzu bulionu lizogenicznego (LB) i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pobrać pojedynczą kolonię OP50 do bulionu B (10 g tryptonu i 5 g NaCl w 1 L DI H2O) i ustawić kulturę na wstrząs w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety upuść 30 μl zawiesiny OP50 na agar w środku każdej studzienki (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1). 
	UWAGA: Pamiętaj, aby nie uszkodzić powierzchni agaru, ponieważ doprowadzi to do zakopywania się robaków.</li>
	<li>Pozostaw talerze w temperaturze pokojowej na co najmniej 2 dni po wysianiu, aby umożliwić utworzenie się bakteryjnego trawnika. 
	UWAGA: Jeśli bakterie w środkowych studzienkach nie wyschną po 2 dniach, pozostaw płytki otwarte w okapie na 20 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Płytki należy wylać i wysiać bakteriami na 1-2 tygodnie przed testem.</li>
</ol>
2. Synchronizacja C. elegans (dzień 1)
<ol>
	<li>Uprawiaj C. elegans typu dzikiego, unc-63(x26), lev-10(x17) i unc-49(e407) C. elegans do dorosłości na 6 cm płytkach, przygotowując co najmniej osiem płytek na szczep. Upewnij się, że na talerzach znajduje się wiele niewygłodzonych, gravidowych dorosłych. 
	UWAGA: Jest to dwa razy więcej talerzy niż potrzeba; Jednak ważne jest, aby mieć zapasowe płytki na wypadek, gdyby pierwsza partia jaj została zniszczona podczas bielenia.</li>
	<li>Przygotować 10x bufor M9, rozpuszczając 59,6 g Na2HPO4 (dwuzasadowy), 29,9 g KH2PO4 (jednozasadowy), 12,8 g NaCl i 2,5 gMgSO4 w 750 ml wody DI mieszając. Po rozpuszczeniu zwiększyć objętość do 1 l i wysterylizować filtrem. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 i przelać w autoklawie, aby uzyskać 1x bufor M9. 
	UWAGA: Bufor 1x M9 może być wykonany z tygodniowym lub miesięcznym wyprzedzeniem.</li>
	<li>Przygotuj roztwór wybielający pod maską w dniu synchronizacji. Wymieszaj 10 ml wybielacza (tabela materiałów), 2,5 ml 10 N NaOH i 37,5 ml wody DI w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Noś okulary, rękawice i fartuch laboratoryjny podczas pracy z roztworem wybielającym.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej przemyć ciężarne dorosłe robaki z co najmniej czterech płytek za pomocą 1x buforu M9 i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 716 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć supernatant za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Dodać 10 ml roztworu wybielającego. Odwróć lub delikatnie potrząsaj probówką przez ~4 minuty, aż większość, ale nie wszystkie, tuszki robaków się rozpuszczą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Uważaj, aby nie przesadzić z robakami, ponieważ zniszczy to jaja. Niektóre mutacje mogą zwiększać trudność izolacji komórek jajowych.</li>
	<li>Wirować z prędkością 716 x g przez 1 min.</li>
	<li>Wylej roztwór wybielacza jednym ruchem; dopóki probówka nie zostanie w tym momencie wstrząśnięta, jajka przykleją się do boku tubki.</li>
	<li>Dodaj 15 ml 1x buforu M9 i odwróć. Wirować w temperaturze 716 x g przez 1 minutę i jednym płynnym ruchem odlewać bufor M9.</li>
	<li>Wykonaj łącznie trzy mycia z 1x buforem M9, jak opisano w kroku 2.9.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu dodać 10 ml świeżego 1x M9 i umieścić na noc w rotatorze w temperaturze 15 °C, aby wyizolować zsynchronizowaną populację wygłodzonych zwierząt w stadium larwalnym (L1). 
	UWAGA: Przed umieszczeniem na rotatorze sprawdź, czy w buforze M9 znajdują się jaja. Jeśli nie, powtórz przygotowanie z zapasowymi płytkami i wybielaczem przez krótszy czas.</li>
</ol>
3. Poszycie zsynchronizowane C. elegans (dzień 2)
<ol>
	<li>Wydrukuj 24-dołkową mapę płytek i przypisz szczepy do losowych miejsc. Każdy szczep powinien być reprezentowany na płytce 24-dołkowej co najmniej sześć razy.</li>
	<li>Około 24 godziny po przygotowaniu wybielacza, wykluć wyklute, wygłodzone robaki L1 w buforze M9 o stężeniu 716 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć ~9 ml buforu M9 za pomocą plastikowej pipety transferowej, a następnie delikatnie wymieszać zagłodzone pierwsze robaki w stadium larwalnym (L1) w pozostałym buforze M9.</li>
	<li>Natychmiast odpipetować 3 μl robaków w buforze M9 na szkiełko mikroskopowe i określić liczbę L1; pożądana liczba to 20-30 L1 w 3 μL. Odkręć i usuń M9, jeśli stężenie robaka jest zbyt niskie, i dodaj M9, jeśli stężenie jest zbyt wysokie. 
	UWAGA: Sprawdź liczbę robaków na 3 μL co najmniej 2x, za każdym razem odwracając probówkę.</li>
	<li>Odpipetuj 3 μl L1 (łącznie 20-30 robaków) do każdej studzienki zgodnie z wcześniej przygotowaną mapą płytową (krok 3.1; <silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Często odwracaj rurkę z L1 w M9, aby utrzymać równomierny rozkład robaków, ponieważ osiądą one na dnie. Jeśli nie zostanie to zrobione, niektóre studnie będą miały za mało robaków, podczas gdy inne będą miały ich za dużo. Nie należy również przekłuwać agaru końcówką pipety, ponieważ spowoduje to zakopanie się zwierząt.</li>
	<li>Pozwól robakom rosnąć do dorosłości przez 3 dni w temperaturze 20 °C. 
	UWAGA: Stosowanie różnych temperatur wzrostu i niektórych mutacji może wpływać na szybkość dojrzewania, więc należy wziąć pod uwagę cykl życiowy C. elegans.</li>
</ol>
4. Wykonywanie testu na obecność lewamizolu (dzień 5)
<ol>
	<li>Wydrukuj pusty arkusz danych, który będzie używany do rejestrowania liczby robaków poruszających się w każdej studzience co 5 minut przez 1 godz. 
	UWAGA: Uczniowie będą mogli policzyć robaki w maksymalnie 12 dołkach co 5 minut. Pierwsze 12 dołków jest oznaczanych w pierwszej godzinie, a dolne 12 dołków jest oznaczanych w następnej godzinie.</li>
	<li>Sprawdź robaki w płytkach 24-dołkowych. Za pomocą markera zrób "X" na pokrywie talerza nad wszystkimi studzienkami, które są zanieczyszczone, głodują lub mają zbyt wiele robaków (>40), co utrudni liczenie.</li>
	<li>Przygotować 0,4 mM roztworu lewamizolu, dodając 200 μl 100 mM bulionu lewamizolu do 50 ml 1x M9. Przygotować 100 mM bulionu lewamizolu, rozpuszczając 240,76 mg chlorowodorku lewamizolu w 10 mlH2Oi przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Lewaizol należy rozcieńczyć w M9; rozcieńczenie wH2Oprzyspiesza paraliż. Uczniowie powinni nosić rękawiczki. Spożycie wysokich stężeń lewamizolu jest toksyczne.</li>
	<li>Uruchom stoper, a następnie, za pomocą pipety transferowej, dodaj 1 ml 0,4 mM lewamizolu do pierwszych dwóch studzienek, tak aby zwierzęta mogły swobodnie pływać. Kontynuuj dodawanie lewamizolu do sąsiednich studzienek, rozkładając czas w zależności od liczby studzienek, które mają być badane. 
	UWAGA: Na przykład, jeśli testuje się 10 studzienek, lewamizol zostanie dodany w następujący sposób: studzienki 1 i 2 w czasie 0, studzienki 3 i 4 po 1 minucie, studzienki 5 i 6 po 2 minutach, studzienki 7 i 8 po 3 minutach, a studzienki 9 i 10 po 4 minutach.</li>
	<li>Po 5 minutach zacznij ręcznie liczyć tylko liczbę poruszających się robaków w każdym dołku, zaczynając od pierwszego dołka, i zapisz tę liczbę w arkuszu danych (Rysunek 1). Liczniki mogą być używane, ale nie są wymagane do dokładnego określenia liczby poruszających się robaków. 
	UWAGA: Uczniowie muszą pilnować licznika czasu, ponieważ czasami zostaną w tyle we wczesnych punktach czasowych, zanim wiele robaków sparaliżuje. W razie potrzeby można dostosować liczbę punktów czasowych lub w razie potrzeby w każdym punkcie czasowym można oznaczyć mniejszą liczbę dołków.</li>
	<li>Kontynuuj liczenie poruszających się robaków w każdym studzience co 5 minut przez 1 godz. 
	UWAGA: Zanurzenie w M9 wywołuje ciągły ruch pływacki w trakcie tego 1-godzinnego testu, co eliminuje potrzebę szturchania robaków w celu oceny paraliżu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Narażenie na 0,4 mM roztworu lewamizolu wywołuje paraliż zależny od czasu, który obserwuje się po zaprzestaniu pływania; Robaki, które paraliżują, nie wracają do zdrowia.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.4.-4.6. dla pozostałych dołków w płycie.</li>
	<li>Na końcu testu lub gdy czas na to pozwala, należy zanotować całkowitą liczbę robaków w każdym dołku.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Uzyskać mapę płyt (krok 3.1) i zapisać, które odkształcenie odpowiada każdej studzience. 
	UWAGA: Ze względu na ilość zebranych danych, późniejsza analiza i omówienie danych zajmie co najmniej kilka godzin.</li>
	<li>Wprowadź dane do arkusza kalkulacyjnego, zaczynając od całkowitej liczby robaków w każdej studzience i porządkując je według genotypu.</li>
	<li>Łącząc dane z odwiertów, określ liczbę robaków poruszających się w każdym punkcie czasowym dla każdego szczepu.</li>
	<li>Wykorzystaj te dane do stworzenia "krzywej przeżycia" w oprogramowaniu statystycznym (Tabela materiałów), aby wizualnie przedstawić zależny od czasu paraliż populacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Utwórz tabelę danych w taki sposób, aby kolumna po lewej stronie wskazywała czas, a kolejne kolumny zawierały dane dla każdego szczepu. Dla każdego zwierzęcia, które zostanie sparaliżowane w ciągu pierwszych 5 minut, utwórz rząd i wprowadź "1" na 5 minut. Powtórz to dla każdego punktu czasowego. W przypadku wszystkich zwierząt, które nie zostaną sparaliżowane do końca testu, wprowadź "0" na 60 minut.</li>
	<li>Wykonaj porównania parami za pomocą testu logarytmicznego (Mantela-Coxa) w oprogramowaniu statystycznym (Tabela materiałów), aby określić, czy istnieje statystycznie istotna różnica między dwoma różnymi szczepami.</li>
	<li>W przypadku dodatkowej/alternatywnej analizy, zamiast wykonywać kroki 5.3 i 5.4, należy określić odsetek zwierząt poruszających się w każdym dołku w każdym punkcie czasowym. Wykreśl średnią z błędem standardowym w każdym punkcie czasowym dla wszystkich szczepów testowanych za pomocą arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania statystycznego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
</ol>

<ol><li>Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+myasthenic+syndromes%3A+Pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment.</a> The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).</li>
<li>Mahjneh, I., Lochmüller, H., Muntoni, F., Abicht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOK7+limb-girdle+myasthenic+syndrome+mimicking+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).</li>
<li>Rodríguez Cruz, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+myopathies+with+secondary+neuromuscular+transmission+defects%3B+A+case+report+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).</li>
<li>Montagnese, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+patients+with+GMPPB+mutation%3A+The+overlapping+phenotypes+of+limb-girdle+myasthenic+syndrome+and+limb-girdle+muscular+dystrophy+dystroglycanopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy.</a> Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).</li>
<li>Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+structure%2C+and+maintenance+of+C.+elegans+body+wall+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle.</a> WormBook. , 1-59 (2017).</li>
<li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).</li>
<li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li>
<li>Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmembrane+protein+required+for+acetylcholine+receptor+clustering+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).</li>
<li>Eimer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nicotinic+receptor+trafficking+by+the+transmembrane+Golgi+protein+UNC-50%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50.</a> The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).</li>
<li>Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+complement-control-related+protein+ensures+acetylcholine+receptor+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering.</a> Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).</li>
<li>Chaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+genome-wide+RNAi+screen+for+altered+levamisole+sensitivity+identifies+genes+required+for+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047(2021).</li>
<li>Vashlishan, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNAi+screen+identifies+genes+that+regulate+GABA+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses.</a> Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).</li>
<li>Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FER-1%2FDysferlin+promotes+cholinergic+signaling+at+the+neuromuscular+junction+in+C.+elegans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice.</a> Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).</li>
<li>Gottschalk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+novel+nicotinic+receptor-associated+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).</li>
<li>Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+postsynaptic+transmembrane+protein+affecting+neuromuscular+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).</li>
<li>Treinin, M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+transmission+in+C.+elegans%3A+Functions%2C+diversity%2C+and+maturation+of+ACh-activated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels.</a> Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).</li>
<li>Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+immunoglobulin-domain+protein+required+for+clustering+acetylcholine+receptors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans.</a> The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).</li>
<li>Kim, S., Sieburth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+receptor+tyrosine+kinase+network+regulates+neuromuscular+function+in+response+to+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).</li>
<li>Oh, K., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldicarb-induced+paralysis+assay+to+determine+defects+in+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-Protocol. 7 (14), 2400(2017).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Zmieniona odpowiedź na lewamizol może zidentyfikować geny wymagane do postsynaptycznej sygnalizacji cholinergicznej i funkcji mięśni. Niniejszy protokół opisuje test płynnego lewamizolu stosowany do ilościowego oznaczania paraliżu zależnego od czasu w okresie 1 godziny. Uczniowie dokonują przewidywań dotyczących skutków pewnych mutacji genetycznych, przeprowadzają eksperyment na dużej próbie, a następnie oceniają ilościowo swoje wyniki. Ten test jest prostym i skutecznym sposobem ilościowego oznaczania paraliżu wywołanego lewamizolem bez wybierania lub szturchania zwierząt, dzięki czemu nadaje się do laboratoriów licencjackich, a także naukowców zajmujących się przekaźnictwem nerwowo-mięśniowym. Omówiono tutaj niektóre z najczęstszych pułapek, ograniczenia testu oraz odmianę protokołu, która umożliwia jego stosowanie u zwierząt z nokautem RNAi; Omówiono tutaj również, w jaki sposób ten test można osadzić w doświadczeniu badawczym opartym na kursie licencjackim.
Niezbędne jest prawidłowe przygotowanie płytek 24-dołkowych. Po pierwsze, trawniki bakteryjne muszą być całkowicie suche, zanim zauważy się zwierzęta L1 w studniach. Jeśli nie zostaną wystarczająco wysuszone, bakterie mieszają się z roztworem lewamizolu podczas testu, zmieniając płyn w mętny i uniemożliwiając osobnikom policzenie robaków. Po drugie, podczas synchronizacji robaków za pomocą preparatu wybielającego, zwierzęta nie mogą być zbyt długo wystawione na działanie roztworu wybielacza, ponieważ spowoduje to rozpad powłoki ochronnej na jajach. Po trzecie, ważne jest, aby dostrzec tylko 20-30 L1 na odwiert, ponieważ zbyt wiele robaków w studniach niezwykle utrudnia dokładne policzenie liczby poruszających się w wyznaczonym czasie. Wreszcie, ważne jest, aby zachować technikę aseptyczną podczas przygotowywania płytek, ponieważ nie można zbadać zanieczyszczonych studni. 
Istnieje kilka ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania tego testu. Po pierwsze, liczenie liczby poruszających się robaków w każdym dołku co 5 minut może być przytłaczające dla osób, które nie mają wcześniejszego doświadczenia laboratoryjnego, a to może prowadzić do nieprecyzyjnego zbierania danych. Jeśli chodzi o inne testy stosowane do określania wrażliwości leku 18,19, eksperyment ten można przeprowadzić z mniejszą liczbą punktów czasowych. Po drugie, posiewanie wygłodzonych L1 wyizolowanych z preparatu wybielającego jest łatwą metodą uzyskania zsynchronizowanej populacji; Należy jednak dokonać dostosowań, jeśli czas rozwoju różni się między badanymi szczepami. Do tego testu możliwe jest pobranie zwierząt w późnym czwartym stadium larwalnym (L4) na 24-dołkową płytkę; Jednak przy przygotowywaniu wielu talerzy jest to zbyt pracochłonne. Alternatywnie, należy określić czas potrzebny każdemu szczepowi do osiągnięcia L4, a następnie umieścić L1 w studzienkach w różnym czasie, aby dostosować się do różnic w szybkości dojrzewania. Wreszcie, podczas gdy test ten może być wykorzystany do identyfikacji nowych genów ważnych dla postsynaptycznej funkcji mięśni11, zmieniona odpowiedź lewamizolu może być również spowodowana mutacją lub knockdownem RNAi genów presynaptycznych12. W przypadku zaobserwowania zmienionej wrażliwości lewamizolu, należy przeprowadzić dodatkowe eksperymenty w celu ustalenia przyczyny tego fenotypu.
Dokonując kilku modyfikacji w 24-dołkowych płytkach, opisany test pływania lewamizolu można również przeprowadzić na zwierzętach z nokautem RNAi11. Nokaut genów przez RNAi można osiągnąć poprzez karmienie bakterii C. elegans, które wyrażają dwuniciowe RNA odpowiadające genowi będącemu przedmiotem zainteresowania20. Do przygotowania płytek RNAi należy dodać 1 ml 1M IPTG i 1 ml 25 mg/ml karbenicyliny na litr pożywki po wyjęciu z autoklawu. Kultury bakteryjne hoduje się, wybierając pojedynczą kolonię do 3 ml bulionu LB plus 3 μl 25 mg/ml karbenicyliny i wytrząsając w temperaturze 37 °C przez noc, a mapa płytki jest tworzona, gdy różne bakterie zostaną zauważone w studzienkach. C. elegans są synchronizowane przez preparat wybielający zgodnie z opisem; jednak szczep eri-1 (mg366) nadwrażliwy na RNAi powinien być stosowany zamiast typu dzikiego, aby zwiększyć knockdown genu. Knockdowny RNAi skutkują tymi samymi fenotypami lewamizolu, które obserwuje się w przypadku mutantów utraty funkcji11. 
Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany w badaniach laboratoryjnych, jako samodzielny eksperyment w laboratorium licencjackim lub w pierwszych tygodniach zaawansowanego kursu licencjackiego jako wprowadzenie do podstawowych technik C . elegans i funkcji nerwowo-mięśniowych. Na bardziej zaawansowanym kursie opartym na odkryciach studenci mogą użyć tego testu, aby określić, czy utrata homologów genów C. elegans zmutowanych u osób z zespołami miastenicznymi, dystrofiami mięśniowymi lub miopatiami zmienia wrażliwość na lewamizol. Podsumowując, ten prosty, niedrogi test wrażliwości na lewamizol zapewnia praktyczne podejście do nauki sygnalizacji w NMJ i zdobywania doświadczenia w pracy z systemem modelowym C. elegans .

Aktywacja postsynaptycznych receptorów acetylocholiny (AChR) na mięśniach szkieletowych powoduje sygnał elektryczny, który prowadzi do skurczu mięśni. Zaburzenie funkcji nerwowo-mięśniowej powoduje powstawanie zespołów miastenicznych i dystrofii mięśniowych u ludzi1,2,3,4. Nicienie Caenorhabditis elegans były szeroko wykorzystywane do poznawania ewolucyjnie zachowanych podstawowych procesów biologicznych i mechanizmów chorób. Mięśnie szkieletowe kręgowców i mięśnie ściany ciała C. elegans są funkcjonalnie równoważne w kontroli lokomocji5. Tutaj przedstawiono prosty test, który można wykorzystać do porównania C. elegans typu dzikiego z mutantami, które mają zmienioną sygnalizację nerwowo-mięśniową lub funkcję mięśni.
Pobudzające i hamujące dane wejściowe otrzymywane odpowiednio z cholinergicznych i GABA-ergicznych neuronów ruchowych powodują kurczenie się mięśni po jednej stronie ciała C. elegans, podczas gdy mięśnie po drugiej stronie rozluźniają się, umożliwiając skoordynowaną lokomocję6. Lewamizol, środek przeciwrobaczy stosowany w leczeniu infekcji pasożytniczych nicieni, wiąże się i konstytutywnie aktywuje jedną klasę AChR na mięśniach ściany ciała, powodując paraliż zależny od czasu7. W ten sposób zmieniona wrażliwość na lewamizol może być wykorzystana do identyfikacji C. elegans z defektami w równowadze sygnalizacji pobudzającej i hamującej7,8,9,10,11,12,13,14,15. Na przykład mutacje w podjednostkach wrażliwego na lewamizol AChR (L-AChR), takich jak UNC-63, a także homolog C. elegans Cubiliny, LEV-10, który jest wymagany do grupowania L-AChR w synapsie, wpływają na sygnalizację pobudzającą i powodują oporność na lewamizol7,8. Mutacje w receptorze GABAA UNC-49 zmniejszają sygnalizację hamującą i powodują nadwrażliwość na lewamizol12.
Nadwrażliwość lub odporność na lewamizol była tradycyjnie oceniana poprzez przenoszenie zwierząt na płytki agarowe zawierające lewamizol, a następnie regularne szturchanie robaków w celu określenia punktu czasowego, w którym następuje paraliż13,14,15. Opracowaliśmy płynny test pływania z lewamizolem, który eliminuje potrzebę fizycznej manipulacji zwierzętami i pozwala na badanie przesiewowe setek zwierząt w ciągu zaledwie 1 godziny. Tutaj opisano zastosowanie tego testu ze zwierzętami typu dzikiego, UNC-63 (x26), LEV-10 (x17) i UNC-49 (E407). Jednak protokół ten można również przeprowadzić na C. elegans wystawionych na działanie RNAi, tak jak zrobiono to w celu walidacji knockdownów zidentyfikowanych w badaniu przesiewowym RNAi całego genomu pod kątem zmienionej wrażliwości na lewamizol11.
Dla tego testu farmakologicznego, robaki hodowano do dorosłości na 24-dołkowych płytkach, do każdej studzienki dodawano 0,4 mM lewamizolu w buforze M9, a liczba poruszających się zwierząt była rejestrowana co 5 minut przez 1 godzinę. Paraliż wywołany lewamizolem był wizualnie obserwowany w czasie, a po zakończeniu testu, dane zostały określone ilościowo. Ocena mutantów wraz z C. elegans typu dzikiego pozwala uczniom najpierw przewidzieć potencjalne skutki fenotypowe, a następnie przeprowadzić eksperymenty w celu przetestowania swoich hipotez. Podsumowując, ten prosty, niedrogi, płynny test lewamizolu jest idealnym sposobem na wykazanie wpływu utraty określonych genów na funkcję NMJ.

<table><tbody><tr><td>60 mm bez wentylacji, ostra krawędź Szalki Petriego</td><td>TriTech Research</td><td>Cat #: T3308</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Bacto Agar</td><td>Fisher Scientific Cat</td><td>#: DF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 24 Well Multidish</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#: 12-556-006</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#: BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>MP Biomedicals</td><td>Kot#: 02101382-CF</td><td></td></tr><<tr><td>em>eri-1(MG366)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>GR1373</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#: DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Tryptone</td><td>Fisher Scientific Kot</td><td>#: DF0123-17-3</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (oprogramowanie statystyczne)</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lev-10(x17)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>ZZ17</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek lewamizolu</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#: AC187870100</td><td></td></tr><tr><td>Zwykły wybielacz o niskim rozprysku - 121 uncji - w górę i w górę</td><td>Wyszukiwanie celów</td><td>target.com</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#: BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td> typu dzikiego Bristol <td>N2</td><td></td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Fisher Scientific Cat</td><td>#: BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Kot #: BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#: BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu 10N</td><td>Fisher Scientific</td><td>Kot#: SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#: BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>unc-49(e407)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>CB407</td><td></td></tr><tr><td> unc-63(x26)</td>Centrum <td>Genetyki Caenorhabditis (CGC)</td><td>ZZ26 </td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar wrażliwości caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Na skrzyżowaniu nerwowo-mięśniowym (NMJ), wiązanie pobudzającego neuroprzekaźnika acetylocholiny (ACh) z receptorami postsynaptycznymi prowadzi do skurczu mięśni. Podobnie jak w mięśniach szkieletowych kręgowców, do poruszania się wymagana jest sygnalizacja cholinergiczna w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego Caenorhabditis elegans. Narażenie na lewamizol, farmakologicznego agonistę jednej klasy receptorów ACh na mięśniach ściany ciała, powoduje zależny od czasu paraliż zwierząt typu dzikiego. Zmieniona wrażliwość na lewamizol sugeruje defekty w sygnalizacji w NMJ lub funkcji mięśni. W tym miejscu przedstawiono protokół testu płynnego lewamizolu przeprowadzonego na C. elegans hodowanych na płytkach 24-dołkowych. Energiczne pływanie zwierząt w płynie pozwala na ocenę i ilościowe określenie paraliżu wywołanego lewamizolem u setek robaków w ciągu jednej godziny bez konieczności fizycznej manipulacji. Procedura ta może być stosowana zarówno w przypadku dzikich typów, jak i mutantów, które mają zmienioną wrażliwość na lewamizol, aby zademonstrować funkcjonalne konsekwencje zmienionej sygnalizacji w NMJ.

Sygnalizacja poprzez AChR i receptory GABA pozwala mięśniom po jednej stronie ciała C. elegans na skurcz, podczas gdy mięśnie po drugiej stronie rozluźniają się, co umożliwia skoordynowaną lokomocję6,16. Wiązanie lewamisolu do jonotropowych L-AChR powoduje skurcz, prowadząc do zależnego od czasu paraliżu zwierząt typu dzikiego. Tutaj oceniliśmy wrażliwość na lewamisol u C. elegans typu dzikiego, mutantów L-AChR unc-63, mutantów klastrowania L-AChR lev-10 oraz mutantów receptora GABAA unc-49. Mutacje w podjednostkach L-AChR, a także w genach wymaganych do transportu L-AChR do błony plazmatycznej mięśni, klastrowania postsynaptycznych L-AChR oraz w kaskadzie sygnalizacyjnej Ca2+ poniżej receptora, powodują oporność na paraliż indukowany lewamisolem7,8,9,10,11,16,17, co zaobserwowano u mutantów unc-63 i lev-10 (Rycina 2B,C). Utrata zależnego od GABA kanału jonowego UNC-49 spowodowała nadwrażliwość na lewamisol (Rycina 2B,C) z powodu zaburzenia właściwej równowagi między sygnalizacją cholinergiczną a GABAergiczną12. Gdy ten test był niedawno przeprowadzany przez studentów studiów licencjackich w zaawansowanym laboratorium genetyki, 100% studentów zaobserwowało oporność na lewamisol u mutantów unc-63 i lev-10, podczas gdy 88% zaobserwowało nadwrażliwość na lewamisol u mutanta unc-49. Dane te, zebrane za pomocą płynnego testu pływania z lewamisolem, są zgodne z fenotypami obserwowanymi w tradycyjnych testach lewamisolu na szalkach7,8,11,12,13.
<img alt="Schemat badania C. elegans: synchronizacja w wybielaczu, traktowanie lewamisolem, wykres analizy ruchu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64056/64056fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przygotowania i przeprowadzenia testu z lewamisolem. Przygotowuje się 24-dołkowe płytki NGM; 2 dni później w dołkach wysiewa się Escherichia coli OP50. C. elegans poddaje się synchronizacji poprzez obróbkę wybielaczem, a następnego dnia do dołków pipetuje się zwierzęta w pierwszym stadium larwalnym (L1) dla każdego badanego szczepu (typ dziki, czarny; unc-63(x26), purpurowy; lev-10(x17), zielony; unc-49(e407), niebieski) zgodnie z wcześniej ustalonym planem rozmieszczenia na płytce. Po 3 dniach wzrostu w temperaturze 20 ºC lub po osiągnięciu przez zwierzęta stadium dorosłego, do każdego dołka dodaje się 0,4 mM lewamisolu w buforze M9, a liczbę poruszających się zwierząt zlicza się co 5 min przez 1 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64056/64056fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza aktywności motorycznej; wykresy przeżywalności; efekty lewamisololu; porównanie szczepów mutantów; wykresy liniowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64056/64056fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Paraliż indukowany lewamisolollem u dzikiego typu i reprezentatywnych mutantów C. elegans. (A) Ekspozycja na 0.4 mM lewamisololu powoduje zależny od czasu paraliż; zjawiska tego nie zaobserwowano u zwierząt pływających w buforze 1x M9 przez 1 h. (B) Zależny od czasu paraliż zwierząt dzikiego typu (czarny), unc-63(x26) (magenta), lev-10(x17) (zielony) i unc-49(e407) (niebieski) w teście pływania z lewamisololem. Utrata podjednostki L-AChR UNC-63 lub białka klastrującego L-AChR LEV-10 skutkowała opornością na lewamisolol, a utrata receptora GABAA UNC-49 spowodowała nadwrażliwość na lewamisolol. n ≥ 50 na genotyp, p &lt; 0.0001 dla wszystkich mutantów w porównaniu z dzikim typem w tym reprezentatywnym eksperymencie. (C) Wykorzystując te same dane, co w panelu (B), dla każdego szczepu określono procent poruszających się zwierząt w każdym punkcie czasowym (średnia procentów dla każdej studzienki ± SE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64056/64056fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Obecny protokół opisuje test określający odpowiedź na lewamizol, farmakologicznego agonistę jednej klasy receptorów acetylocholiny Caenorhabditis elegans. W tym płynnym teście pływania z lewamizolem naukowcy wizualnie obserwują i określają ilościowo zależny od czasu paraliż zwierząt hodowanych na 24-dołkowych płytkach.

Pomiar wrażliwości Caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Protokół ten pozwala naukowcom obserwować, jak C-elganie reagują na agonistę receptora acetylocholiny Lewamizol. Zmieniona wrażliwość lewamizolu może sugerować defekty sygnalizacji w ich połączeniu nerwowo-mięśniowym lub funkcji mięśni. Główną zaletą jest to, że energiczne pływanie C-elganów w roztworze lewamizolu pozwala naukowcom na ilościowe oszacowanie zależnego od czasu paraliżu setek robaków w ciągu zaledwie jednej godziny.Liczenie robaków w każdej studni co pięć minut może być przytłaczające. W razie potrzeby można dostosować liczbę badanych dołków lub punkty czasowe. Na początek przygotuj pożywkę do hodowli nicieni, łącząc trzy gramy chlorku sodu, 2,5 grama tonu pep i 17 gramów agaru z jednym litrem wody dejonizowanej w kolbie z mieszadłem.Po autoklawowaniu umieść pożywkę na gorącej płycie ustawionej na 70 stopni Celsjusza i mieszaj z umiarkowaną prędkością przez godzinę. Dodaj kroplami jeden mililitr pięciu miligramów na mililitr cholesterolu, aby zapobiec wytrącaniu się. Jeden mililitr jednego molowego chlorku wapnia, jeden mililitr jednego molowego siarczanu magnezu i 25 mililitrów jednego molowego buforu fosforanu potasu o pH 6,0 do pożywki.Przenieść dwa mililitry pożywki do hodowli nicieni do każdej studzienki 24-dołkowej płytki za pomocą sterylnej pipety serologicznej. Pozostawiono talerze do wyschnięcia na blacie stołu przez dwa dni przed usadzeniem z bakteriami. Wybierz pojedynczą kolonię op 50 do bulionu B i ustaw kulturę na wstrząsanie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Za pomocą sterylnej pipety upuść 30 mikrolitrów zawiesiny OP50 na agar pośrodku każdej studzienki. Pozostaw talerze w temperaturze pokojowej na co najmniej dwa dni po usadzeniu, aby umożliwić uformowanie się bakteryjnego trawnika. Uprawiaj dzikie odmiany unc-63 Lev10 i unc-49 C-elgan do dorosłości na sześciocentymetrowych płytkach, przygotowując co najmniej osiem płytek na odmianę.Przygotuj roztwór wybielający pod maską w dniu synchronizacji. Wymieszaj 10 mililitrów wybielacza, 2,5 mililitra wodorotlenku sodu i 37,5 mililitrów wody dejonizowanej w 50-mililitrowej probówce kronikowej. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przemyj gravidy dorosłe robaki z co najmniej czterech płytek buforem M9 i przenieś je do 15-mililitrowej probówki kronikowej.Obracaj 716 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie usuń super natant za pomocą pipety transferowej. Dodaj 10 mililitrów roztworu wybielającego. Delikatnie potrząsaj probówką przez cztery minuty, aż większość, ale nie wszystkie tuszki robaków się rozpuszczą.Wirować z prędkością 716 G przez jedną minutę. Odlej roztwór wybielacza jednym ruchem. Dopóki probówka nie zostanie wstrząśnięta w tym momencie, jaja przykleją się do boku probówki przy 15 mililitrach buforu M9 i odwrócą się.Wirować z prędkością 716 G przez minutę i wylać bufor M9 jednym płynnym ruchem. Powtórz to mycie roztworem buforowym trzy razy. Po ostatnim umyciu dodaj 10 mililitrów świeżego M9 i umieść na noc na rotatorze w temperaturze 15 stopni Celsjusza, aby wyizolować zsynchronizowaną populację wygłodzonych zwierząt w pierwszym stadium larwalnym.Wydrukuj na płytce 24-dołkowej i przypisz szczepy do losowych miejsc. Około 24 godziny po przygotowaniu wybielacza, odwiruj wyklute, wygłodzone robaki L1 o sile 716 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Usuń około dziewięciu mililitrów buforu M9 za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia, a następnie delikatnie wymieszaj wygłodzone pierwsze robaki w stadium larwalnym w pozostałym buforze M9.Natychmiast odpipetować trzy mikrolitry robaków i bufor M9 na szkiełko mikroskopowe i określić liczbę L1. Pożądana liczba to od 20 do 30 L1 w trzech mikrolitrach. Odpipetuj trzy mikrolitry L1 do każdej studzienki zgodnie z wcześniej przygotowaną mapą płytkową, pozwól robakom rosnąć do dorosłości przez trzy dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Wydrukuj pusty arkusz danych, który będzie używany do rejestrowania liczby robaków poruszających się w każdym studzience co pięć minut przez jedną godzinę. Sprawdź robaki w płytkach 24-dołkowych. Za pomocą markera zrób X na pokrywie talerza nad wszystkimi studniami, które są zanieczyszczone, głodują lub mają zbyt wiele robaków, co utrudni liczenie.Przygotować 0,4 milimolowy roztwór lewamizolu, dodając 200 mikrolitrów 100-milimolowego bulionu lewamizolu do 50 mililitrów M9. Uruchom minutnik, a następnie za pomocą pipety transferowej dodaj jeden mililitr 0,4 milimola lewamizolu do pierwszych dwóch studzienek, tak aby zwierzęta swobodnie pływały. Kontynuuj dodawanie lewamizolu do sąsiednich studzienek, rozkładając czas w zależności od liczby studzienek, które mają być badane. Po pięciu minutach zacznij ręcznie liczyć tylko liczbę poruszających się robaków w każdym dołku, zaczynając od pierwszego dołka, i zapisz tę liczbę w arkuszu danych.Kontynuuj liczenie poruszających się robaków w każdej studzience co pięć minut przez jedną godzinę. Na zakończenie testu lub gdy czas na to pozwala, należy zapisać całkowitą liczbę robaków w każdym dołku. Uzyskać tabliczkę, zmapować i zapisać, który szczep odpowiada każdemu dołkowi.Wprowadź dane do arkusza kalkulacyjnego, zaczynając od całkowitej liczby robaków w każdym dołku i organizując je według genotypu. Łącząc dane z odwiertów, określ liczbę robaków poruszających się w każdym punkcie czasowym. Użyj tego, aby obliczyć liczbę, która paraliżuje w każdym punkcie czasowym.Utwórz tabelę danych w taki sposób, aby kolumna po lewej stronie wskazywała czas, a kolejne kolumny zawierały dane dla każdego szczepu. Dla każdego zwierzęcia, które zostanie sparaliżowane w ciągu pierwszych pięciu minut, utwórz rząd i wprowadź jeden na pięć minut. Powtórz to dla każdego punktu czasowego.Dla wszystkich zwierząt, które nie zostaną sparaliżowane do końca testu, wprowadź zero na 60 minut. Wykorzystaj te dane do stworzenia krzywej przeżycia w specyficznym oprogramowaniu statystycznym użytym tutaj, aby wizualnie przedstawić zależny od czasu paraliż populacji. Dane dla wszystkich badanych szczepów muszą być wprowadzone do tej samej tabeli danych, pozostawiając w razie potrzeby puste miejsca.Mutacje w podjednostkach receptora acetylocholiny lewamizolu, a także w genach wymaganych do grupowania postsynaptycznych receptorów acetylocholiny wrażliwych na lewamizol, powodują oporność na paraliż wywołany lewamizolem, co zaobserwowano odpowiednio w mutantach unc-63 i Lev-10. Utrata kanału jonowego bramkowanego GABA unc-49 spowodowała nadwrażliwość na lewamizol z powodu zaburzenia prawidłowej równowagi sygnalizacji cholinergicznej i GABA-ergicznej. Niezbędne jest właściwe przygotowanie płytek 24-dołkowych.Jeśli trawniki bakteryjne nie są suche przed zauważeniem L1, roztwór lewamizolu może stać się mętny podczas testu, co hamuje obserwację. Modyfikując płytki 24-dołkowe, protokół ten można wykonać z powalonymi zwierzętami RNAi. Dzięki temu naukowcy mogą badać geny C-elgana, dla których mutanty nie są dostępne.

measuring-caenorhabditis-elegans-sensitivity-to-acetylcholine

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy film demonstruje, w jaki sposób wykorzystać dwa stymulanty neuronalne, aldikarb i pentylenotetrazol (PTZ), w sposób komplementarny do badania funkcji synaptycznych u nicienia C. elegans. To komplementarne podejście może być również wykorzystane do wyjaśnienia ewolucyjnie konserwatywnych mechanizmów modulujących synchronizację neuronalną i ma znaczenie w badaniach nad epilepsją oraz napadami drgawkowymi.

Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej u C. elegans

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Test EIW (egg-in-worm) jest użyteczną metodą do ilościowego określenia zachowania podczas składania jaj. Zmiany w składaniu jaj mogą być reakcją behawioralną organizmu modelowego Caenorhabditis elegans na potencjalnie szkodliwe substancje środowiskowe, takie jak te wytwarzane przez bakterie chorobotwórcze.

Pomiar wpływu bakterii na zachowanie C. elegans za pomocą testu retencji jaj

Przedstawiamy tu specyficzny dla Caenorhabditis elegans test zaprojektowany w celu oceny zmian w zachowaniu unikania miedzi i zdolności do zlokalizowania wspólnego źródła pożywienia, w miarę jak organizm przechodzi ze stanu dobrze odżywionego do stanu głodnego.

A Caenorhabditis elegans test oparty na unikaniu miedzi w oparciu o status żywienia

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Produkty translacyjne związane z powtarzalnością, niezależne, są wyłaniającymi się cechami patogennymi kilku powtarzających się chorób opartych na ekspansji. Celem opisanego protokołu jest ocena toksyczności spowodowanej przez te peptydy przy użyciu testów behawioralnych i komórkowych w systemie modelowym C. elegans.

Pomiar toksyczności peptydów RAN u C. elegans

Tu przedstawiamy protokół do testowania uczenia się skojarzeniowego poprzez przeprowadzenie klasycznego uwarunkowywania u organizmu modelowego C. elegans. Paradygmat opiera się na łączeniu stężenia soli w środowisku z obecnością lub brakiem pokarmu, co zmienia ich chemotaksję w kierunku soli lub w jej kierunku przeciwnym.

Ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę pomiaru wrażliwości Caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny, przy użyciu płytki 24-dołkowej. Protokół umożliwia ilościową analizę paraliżu w badaniach neurobiologicznych.

Pomiar wrażliwości Caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny

Przeglądaj więcej filmów