Pomiar wrażliwości Caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny

Protokół ten pozwala naukowcom obserwować, jak C-elganie reagują na agonistę receptora acetylocholiny Lewamizol. Zmieniona wrażliwość lewamizolu może sugerować defekty sygnalizacji w ich połączeniu nerwowo-mięśniowym lub funkcji mięśni. Główną zaletą jest to, że energiczne pływanie C-elganów w roztworze lewamizolu pozwala naukowcom na ilościowe oszacowanie zależnego od czasu paraliżu setek robaków w ciągu zaledwie jednej godziny.

Liczenie robaków w każdej studni co pięć minut może być przytłaczające. W razie potrzeby można dostosować liczbę badanych dołków lub punkty czasowe. Na początek przygotuj pożywkę do hodowli nicieni, łącząc trzy gramy chlorku sodu, 2,5 grama tonu pep i 17 gramów agaru z jednym litrem wody dejonizowanej w kolbie z mieszadłem.

Po autoklawowaniu umieść pożywkę na gorącej płycie ustawionej na 70 stopni Celsjusza i mieszaj z umiarkowaną prędkością przez godzinę. Dodaj kroplami jeden mililitr pięciu miligramów na mililitr cholesterolu, aby zapobiec wytrącaniu się. Jeden mililitr jednego molowego chlorku wapnia, jeden mililitr jednego molowego siarczanu magnezu i 25 mililitrów jednego molowego buforu fosforanu potasu o pH 6,0 do pożywki.

Przenieść dwa mililitry pożywki do hodowli nicieni do każdej studzienki 24-dołkowej płytki za pomocą sterylnej pipety serologicznej. Pozostawiono talerze do wyschnięcia na blacie stołu przez dwa dni przed usadzeniem z bakteriami. Wybierz pojedynczą kolonię op 50 do bulionu B i ustaw kulturę na wstrząsanie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Za pomocą sterylnej pipety upuść 30 mikrolitrów zawiesiny OP50 na agar pośrodku każdej studzienki. Pozostaw talerze w temperaturze pokojowej na co najmniej dwa dni po usadzeniu, aby umożliwić uformowanie się bakteryjnego trawnika. Uprawiaj dzikie odmiany unc-63 Lev10 i unc-49 C-elgan do dorosłości na sześciocentymetrowych płytkach, przygotowując co najmniej osiem płytek na odmianę.

Przygotuj roztwór wybielający pod maską w dniu synchronizacji. Wymieszaj 10 mililitrów wybielacza, 2,5 mililitra wodorotlenku sodu i 37,5 mililitrów wody dejonizowanej w 50-mililitrowej probówce kronikowej. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przemyj gravidy dorosłe robaki z co najmniej czterech płytek buforem M9 i przenieś je do 15-mililitrowej probówki kronikowej.

Obracaj 716 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie usuń super natant za pomocą pipety transferowej. Dodaj 10 mililitrów roztworu wybielającego. Delikatnie potrząsaj probówką przez cztery minuty, aż większość, ale nie wszystkie tuszki robaków się rozpuszczą.

Wirować z prędkością 716 G przez jedną minutę. Odlej roztwór wybielacza jednym ruchem. Dopóki probówka nie zostanie wstrząśnięta w tym momencie, jaja przykleją się do boku probówki przy 15 mililitrach buforu M9 i odwrócą się.

Wirować z prędkością 716 G przez minutę i wylać bufor M9 jednym płynnym ruchem. Powtórz to mycie roztworem buforowym trzy razy. Po ostatnim umyciu dodaj 10 mililitrów świeżego M9 i umieść na noc na rotatorze w temperaturze 15 stopni Celsjusza, aby wyizolować zsynchronizowaną populację wygłodzonych zwierząt w pierwszym stadium larwalnym.

Wydrukuj na płytce 24-dołkowej i przypisz szczepy do losowych miejsc. Około 24 godziny po przygotowaniu wybielacza, odwiruj wyklute, wygłodzone robaki L1 o sile 716 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Usuń około dziewięciu mililitrów buforu M9 za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia, a następnie delikatnie wymieszaj wygłodzone pierwsze robaki w stadium larwalnym w pozostałym buforze M9.

Natychmiast odpipetować trzy mikrolitry robaków i bufor M9 na szkiełko mikroskopowe i określić liczbę L1. Pożądana liczba to od 20 do 30 L1 w trzech mikrolitrach. Odpipetuj trzy mikrolitry L1 do każdej studzienki zgodnie z wcześniej przygotowaną mapą płytkową, pozwól robakom rosnąć do dorosłości przez trzy dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Wydrukuj pusty arkusz danych, który będzie używany do rejestrowania liczby robaków poruszających się w każdym studzience co pięć minut przez jedną godzinę. Sprawdź robaki w płytkach 24-dołkowych. Za pomocą markera zrób X na pokrywie talerza nad wszystkimi studniami, które są zanieczyszczone, głodują lub mają zbyt wiele robaków, co utrudni liczenie.

Przygotować 0,4 milimolowy roztwór lewamizolu, dodając 200 mikrolitrów 100-milimolowego bulionu lewamizolu do 50 mililitrów M9. Uruchom minutnik, a następnie za pomocą pipety transferowej dodaj jeden mililitr 0,4 milimola lewamizolu do pierwszych dwóch studzienek, tak aby zwierzęta swobodnie pływały. Kontynuuj dodawanie lewamizolu do sąsiednich studzienek, rozkładając czas w zależności od liczby studzienek, które mają być badane. Po pięciu minutach zacznij ręcznie liczyć tylko liczbę poruszających się robaków w każdym dołku, zaczynając od pierwszego dołka, i zapisz tę liczbę w arkuszu danych.

Kontynuuj liczenie poruszających się robaków w każdej studzience co pięć minut przez jedną godzinę. Na zakończenie testu lub gdy czas na to pozwala, należy zapisać całkowitą liczbę robaków w każdym dołku. Uzyskać tabliczkę, zmapować i zapisać, który szczep odpowiada każdemu dołkowi.

Wprowadź dane do arkusza kalkulacyjnego, zaczynając od całkowitej liczby robaków w każdym dołku i organizując je według genotypu. Łącząc dane z odwiertów, określ liczbę robaków poruszających się w każdym punkcie czasowym. Użyj tego, aby obliczyć liczbę, która paraliżuje w każdym punkcie czasowym.

Utwórz tabelę danych w taki sposób, aby kolumna po lewej stronie wskazywała czas, a kolejne kolumny zawierały dane dla każdego szczepu. Dla każdego zwierzęcia, które zostanie sparaliżowane w ciągu pierwszych pięciu minut, utwórz rząd i wprowadź jeden na pięć minut. Powtórz to dla każdego punktu czasowego.

Dla wszystkich zwierząt, które nie zostaną sparaliżowane do końca testu, wprowadź zero na 60 minut. Wykorzystaj te dane do stworzenia krzywej przeżycia w specyficznym oprogramowaniu statystycznym użytym tutaj, aby wizualnie przedstawić zależny od czasu paraliż populacji. Dane dla wszystkich badanych szczepów muszą być wprowadzone do tej samej tabeli danych, pozostawiając w razie potrzeby puste miejsca.

Mutacje w podjednostkach receptora acetylocholiny lewamizolu, a także w genach wymaganych do grupowania postsynaptycznych receptorów acetylocholiny wrażliwych na lewamizol, powodują oporność na paraliż wywołany lewamizolem, co zaobserwowano odpowiednio w mutantach unc-63 i Lev-10. Utrata kanału jonowego bramkowanego GABA unc-49 spowodowała nadwrażliwość na lewamizol z powodu zaburzenia prawidłowej równowagi sygnalizacji cholinergicznej i GABA-ergicznej. Niezbędne jest właściwe przygotowanie płytek 24-dołkowych.

Jeśli trawniki bakteryjne nie są suche przed zauważeniem L1, roztwór lewamizolu może stać się mętny podczas testu, co hamuje obserwację. Modyfikując płytki 24-dołkowe, protokół ten można wykonać z powalonymi zwierzętami RNAi. Dzięki temu naukowcy mogą badać geny C-elgana, dla których mutanty nie są dostępne.