Stabilnie ugruntowane dwupunktowe wstrzyknięcie modelu ogniskowej demielinizacji wywołanej lizofosfatydylocholiną u myszy
11 maja 2022
Obecny protokół opisuje dwupunktowe wstrzykiwanie lizofosfatydylocholiny przez ramkę stereotaktyczną w celu wygenerowania stabilnego i powtarzalnego modelu demielinizacji u myszy.
Nasz model jest bardzo przydatny w chorobach demielinizacyjnych, zwłaszcza w stwardnieniu rozsianym. I może przyczynić się do związanego z tym postępu w badaniach klinicznych. Jest to szczegółowy protokół, który może bezpośrednio spowodować ciężką demielinizację szybko i stabilnie u myszy za pomocą zabiegu chirurgicznego.
Wypróbowując tę technikę po raz pierwszy, uzbrój się w cierpliwość i upewnij się, że współrzędne są dokładne. Zacznij od podłączenia igły o rozmiarze 32 do strzykawki o pojemności 5 mikrolitrów. Pobrać 5 mikrolitrów roztworu LPC w celu przygotowania wstrzyknięcia.
Następnie potwierdź głębokość znieczulenia myszy poprzez brak odruchu szczypania palców u stóp, gdy oddech jest płynny. Umieść mysz w ramce stereotaktycznej grzbietem do góry i zabezpiecz głowę stożkiem nosowym i zaciskiem zębowym. Przymocuj mysz do aparatu stereotaktycznego za pomocą obustronnych nauszników.
Upewnij się, że nauszniki są wypoziomowane, a głowa jest pozioma i stabilna. Zdezynfekuj skórę głowy, przecierając jodoforem. Następnie za pomocą skalpela wytnij małe nacięcie na około 1,5 centymetra wzdłuż linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.
Przetrzyj umiejętność bawełnianym wacikiem zamoczonym w 1% nadtlenku wodoru, aż bregma, lambda i tylne ciemiączko zostaną odsłonięte. Umieścić strzykawkę na aparacie stereotaktycznym. Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest ułożona w poziomie i zlokalizuj ciało modzelowate.
Po ustaleniu miejsca wstrzyknięcia zapisz współrzędne i zaznacz markerem na czaszce. Delikatnie wywierć zaznaczone miejsce wiertłem do czaszki. Należy uważać, aby uniknąć krwawienia.
Powoli przesuń igłę do podanych współrzędnych. Aby wywołać demielinizację ciała modzelowatego, należy wstrzyknąć 2 mikrolitry roztworu LPC w każde miejsce wstrzyknięcia z szybkością 0,4 mikrolitra na minutę. Po wstrzyknięciu należy trzymać igłę w każdym miejscu przez dodatkowe 10 minut.
Na koniec zszyj skórę szwem 4-0 i poczekaj, aż zwierzę obudzi się w ciągu 10 minut. Reprezentatywny obraz pokazuje detekcję legionów istoty białej za pomocą szybkiego barwienia na niebiesko Luxol. Na podstawie wyników można zaobserwować stabilną demielinizację ciała modzelowatego po 10 i 28 dniach od wstrzyknięcia.
Przedstawiono tutaj ilościowe określenie obszaru demielinizacji w różnych punktach czasowych. Poprzez barwienie immunofluorescencyjne zdegradowanego białka zasadowego mieliny, zaobserwowano niezwykły wzrost dMBP w grupie, której wstrzyknięto LPC po 10 dniach od wstrzyknięcia, co oznacza utratę mieliny w ciele modzelowatym. Analiza Western blot ekspresji zasadowego białka mieliny (MBP) wykazała znaczną utratę MBP po wstrzyknięciu LPC.
Beta-aktyna została użyta jako kontrola obciążenia do pomiaru ekspresji wyjściowej. Obrazy z mikroskopii elektronowej potwierdzają mielinizację ultrastruktury w ciele modzelowatym grupy pozorowanej i grupie wstrzykniętej LPC. GST-pi jest markerem dojrzewania różnicowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC).
Po 10 dniach od wstrzyknięcia LPC GST-pi zmniejszył się w porównaniu z grupą pozorowaną. Jednocześnie zdolność proliferacji oligodendrocytów może być odzwierciedlona przez stosunek proliferacji oligodendrocytów do całkowitej liczby komórek linii oligodendrocytów. Wyższy współczynnik oznacza większą proliferację oligodendrocytów po 10 dniach od wstrzyknięcia.
Reprezentatywne zdjęcia pokazują ścieżkę pływania myszy w każdej grupie, w obecności platformy i po zdjęciu platformy. Wyniki sugerują, że pamięć przestrzenna myszy zdemielinizowanych jest znacznie upośledzona w dwupunktowym modelu iniekcji LPC. Podczas wykonywania tej procedury należy upewnić się, że szybkość wstrzykiwania jest dokładna i trzymać igłę w każdym miejscu przez dodatkowe 10 minut.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje dwupunktową iniekcję lizofosfatydylocholiny (LPC) z wykorzystaniem zestawu stereotaktycznego w celu stworzenia stabilnego modelu demielinizacji u myszy. Przedstawia on metodę istotną dla badania chorób demielinizacyjnych, w szczególności stwardnienia rozsianego, umożliwiając badanie mechanizmów i skutków demielinizacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania nad demielinizacją
- Mysie modele chorób
Wstęp
- Zrozumienie procesu demielinizacji jest kluczowe dla opracowania metod leczenia chorób takich jak stwardnienie rozsiane.
- Opisana procedura ma na celu wywołanie szybkiej i powtarzalnej demielinizacji w warunkach laboratoryjnych.
- Precyzyjna technika chirurgiczna jest istotna dla powodzenia procedury.
- Do oceny modelu wykorzystuje się analizy histologiczne, takie jak barwienie Luxol fast blue.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu do badania mechanizmów demielinizacji.
- Ułatwienie badań nad potencjalnymi interwencjami terapeutycznymi w schorzeniach związanych z demielinizacją.
- Przedstawienie szczegółowych protokołów chirurgicznych pozwalających na uzyskanie mierzalnych wyników.
Zastosowane metody
- Model obejmuje stereotaktyczne podejście chirurgiczne w celu iniekcji LPC.
- Myszy otrzymują iniekcje roztworu LPC w precyzyjnie określonych lokalizacjach anatomicznych, celując konkretnie w ciało modzelowate.
- Każda iniekcja obejmuje 2 µL LPC podawanych z kontrolowaną prędkością.
- Oceny pooperacyjne w 10. i 28. dniu dostarczają kluczowych pomiarów wyników.
- Do analizy utraty mieliny wykorzystuje się techniki histologiczne, takie jak immunofluorescencja i Western blotting.
Główne wyniki
- Osiągnięto stabilną demielinizację w cielemczystym, którą można było zaobserwować poprzez barwienie histologiczne w wielu punktach czasowych.
- Wzrost markerów wskazujących na utratę mieliny potwierdzono za pomocą różnych analiz.
- Oceny behawioralne wykazały znaczne upośledzenie pamięci przestrzennej po demielinizacji.
- Wyniki sugerują zmiany w proliferacji i różnicowaniu oligodendrocytów w odpowiedzi na traktowanie LPC.
Wnioski
- Niniejsze badanie z sukcesem ustanawia model do badania dynamiki demielinizacji oraz potencjalnych strategii terapeutycznych.
- Wyniki dostarczają wiedzy na temat mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw demielinizacji oraz roli oligodendrocytów.
- Model ten może przyczynić się do pogłębienia zrozumienia stwardnienia rozsianego i schorzeń o podobnym charakterze.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Stabilnie opracowany model dwupunktowej iniekcji LPC umożliwia szybką i powtarzalną indukcję ogniskowej demielinizacji u myszy, bezpośrednio wspierając badania na etapie odkryć w chorobach demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane. Model ten stanowi solidną platformę do ograniczania ryzyka mechanistycznego, walidacji celów terapeutycznych oraz ilościowej oceny utraty i regeneracji mieliny. Jego powtarzalność oraz mierzalne wyniki sprawiają, że jest on kluczowym narzędziem w ocenie przedklinicznej i selekcji projektów w ramach linii badawczych nad chorobami neurozapalnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkryć i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów demielinizacji oraz zaangażowania konkretnych szlaków w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określanie utraty mieliny i odpowiedzi oligodendrocytów.
- Zwiększa wiarygodność prognostyczną przy testowaniu hipotez terapeutycznych w stanach neurozapalnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do późniejszego screeningu związków ukierunkowanych na remielinizację lub neuroprotekcję.
- Umożliwia uzyskanie standaryzowanej, powtarzalnej demielinizacji, odpowiedniej dla ilościowych analiz histologicznych i behawioralnych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę potencjalnych interwencji z mierzalnymi punktami końcowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z patologią istotną dla choroby zaobserwowaną w stwardnieniu rozsianym, co wspiera opracowywanie biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po przedkliniczną walidację strategii terapeutycznych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez modelowanie ostrej demielinizacji i dysfunkcji czynnościowych in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między wczesnymi badaniami nad mechanizmami a badaniami translacyjnymi w chorobach demielinizacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez mierzalną analizę demielinizacji i oligodendrocytów.
- Przesiewy: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne wyniki do oceny związków i badań zależności dawka-odpowiedź.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar utraty mieliny, ekspresji białek i deficytów behawioralnych do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Modeluje punkty końcowe istotne dla choroby w celu dopasowania biomarkerów i walidacji przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zstandaryzowaną, wielokrotnego użytku platformę in vivo dla wielu programów badawczych nad procesami neurozapalnymi.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad demielinizacją.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane, powtarzalne i skalowalne modelowanie in vivo do zastosowań międzyprogramowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową dzięki dostarczeniu solidnych danych przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój projektów dotyczących chorób neurozapalnych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w chirurgii stereotaktycznej i precyzyjnego celowania anatomicznego u myszy.
- Wymaga dostępu do infrastruktury analiz histologicznych, immunofluorescencyjnych oraz behawioralnych.
- Konieczna jest standaryzacja współrzędnych i tempa wtryskiwania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do innych obszarów OUN lub modeli chorobowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Model odzwierciedla przede wszystkim ostrą demielinizację; badania nad demielinizacją przewlekłą lub remielinizacją mogą wymagać dodatkowej walidacji.
