Name: Stabilnie ugruntowane dwupunktowe wstrzyknięcie modelu ogniskowej demielinizacji wywołanej lizofosfatydylocholiną u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Poznaj metodę dwupunktowego wstrzyknięcia lizofosfatydylocholiny u myszy do tworzenia stabilnego modelu demielinizacji ciała modzelowatego. Technika stereotaksyczna umożliwia badanie mechanizmów stwardnienia rozsianego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Granty: 82071380, 81873743).

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Instytutu Opieki nad Zwierzętami Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Chiny. Do niniejszego badania wykorzystano dorosłe samce i samice myszy C57BL/6 (typ dziki, WT; 20-25 g; 8-10 tygodni). Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów). Myszy trzymano w specyficznym pomieszczeniu dla zwierząt wolnym od patogenów (SPF), z wodą i pokarmem dostarczanym ad libitum. Trzymano je w naprzemiennym 12-godzinnym cyklu światła i ciemności w standardowych warunkach temperatury 22 °C i wilgotności względnej 55%-60%.
1. Przygotowanie roztworu LPC
<ol>
	<li>Rozpuścić 25 mg proszku LPC (patrz tabela materiałów) w 250 μl zmieszanego roztworu chloroformu i metanolu (1:1) w celu uzyskania 10% roztworu LPC i przenieść go do probówki wirówkowej o pojemności 500 μl. 
	UWAGA: Jeśli LPC nie jest całkowicie rozpuszczony, umieść probówkę wirówkową w myjce ultradźwiękowej i ultradźwięki pod częstotliwością 40 kHz przez ~1 h, aby uzyskać jednolity roztwór.</li>
	<li>Podzielić roztwór na 3 μl/probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Roztwór może być przechowywany przez ~2 lata.</li>
	<li>Przed zabiegiem należy rozcieńczyć roztwór (krok 1.2) 27 μl 0,9% roztworu NaCl i przechowywać roztwór w łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Roztwór należy przygotować tuż przed rozpoczęciem wstrzykiwania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie chirurgiczne
<ol>
	<li>Za pomocą igły 32 G, 2 cale połączyć ze strzykawką o pojemności 5 μl (patrz Tabela Materiałów). Upewnij się, że strzykawka z mikrolitrami jest drożna. Pobrać 5 μl roztworu LPC w celu przygotowania wstrzyknięcia.</li>
	<li>Znieczulenie myszy w komorze indukcyjnej podłączonej do parownika izofluranu z 3% izofluranem zmieszanym ze 100% tlenem z szybkością około 0,3 l/min.</li>
	<li>Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania palców u stóp, gdy oddech jest płynny.</li>
	<li>Ogol głowę myszy między uszami za pomocą golarki elektrycznej. Zastosuj nawilżające krople do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.</li>
	<li>Następnie umieść mysz w ramce stereotaktycznej (patrz Tabela materiałów) grzbietem do góry i zabezpiecz głowę stożkiem nosowym i zaciskiem na ząb. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1,2%-1,6% izofluranu przez nos. 
	UWAGA: Stężenie izofluranu można dostosować w zależności od stanu oddechowego myszy.</li>
</ol>
3. Zabieg chirurgiczny
UWAGA: Zwierzęta są umieszczane na poduszce grzewczej podczas wszystkich procedur.
<ol>
	<li>Przymocuj mysz do aparatu stereotaktycznego za pomocą obustronnych nauszników. Upewnij się, że nauszniki są wypoziomowane, a głowa jest pozioma i stabilna.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę na głowie, przecierając ją kilkakrotnie jodoforem, a następnie alkoholem okrężnymi ruchami. Następnie za pomocą skalpela wytnij małe nacięcie o długości około 1,5 cm wzdłuż linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.</li>
	<li>Przetrzyj czaszkę bawełnianym wacikiem zamoczonym w 1% nadtlenku wodoru, aż bregma, lambda i tylne ciemiączko zostaną odsłonięte. Umieścić strzykawkę na aparacie stereotaktycznym. 
	UWAGA: Używaj nadtlenku wodoru ostrożnie i unikaj dotykania otaczających tkanek.</li>
	<li>Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest ułożona w poziomie (zarówno przód, jak i tył oraz lewo i prawo).
	<ol>
		<li>Wyreguluj pokrętło osi Z ramy stereotaktycznej tak, aby końcówka igły i czaszka po prostu stykały się bez zginania, a następnie zmierz współrzędną osi Z. Sprawdź współrzędne Z bregmy i ciemiączka tylnego.</li>
		<li>Wyreguluj listwę douszną tak, aby różnica między współrzędnymi Z bregmy i ciemiączka tylnego nie przekraczała 0.02 mm. Następnie postępuj zgodnie z tą samą metodą, aby zmierzyć współrzędne Z odpowiednich pozycji po lewej i prawej stronie linii środkowej. Wyreguluj pasek douszny, aby upewnić się, że lewy i prawy są na tym samym poziomie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zlokalizuj ciało modzelowate. Ustaw początek układu współrzędnych XYZ na bregma. 
	UWAGA: Pierwsze miejsce wstrzyknięcia znajduje się 1,0 mm bocznie w stosunku do bregmy, 2,4 mm głębokości i 1,1 mm z przodu. Drugie miejsce wstrzyknięcia znajduje się 1,0 mm bocznie w stosunku do bregmy, na głębokości 2,1 mm i 0,6 mm z przodu. Na przykład współrzędna bregmy to (0,0,0). Zmierz współrzędną Z odpowiedniego położenia oznaczonego jako (-1, 1.1, X) i (-1, 0.6, Y). Można określić współrzędną pierwszego miejsca wstrzyknięcia ciała modzelowatego (-1, 1,1, −[X + 2,4]), a drugiego miejsca wstrzyknięcia (-1, 0,6, −[Y + 2,1]).</li>
	<li>Po ustaleniu miejsca wstrzyknięcia należy wykonać na czaszce znak sterylnym markerem i zapisać współrzędne.</li>
	<li>Delikatnie wywierć zaznaczone miejsce wiertłem do czaszki (patrz Tabela materiałów). Należy uważać, aby uniknąć krwawienia.</li>
	<li>Powoli przesunąć igłę do podanych współrzędnych i rozpocząć wstrzykiwanie. Aby wywołać demielinizację ciała modzelowatego, należy wstrzyknąć 2 μl roztworu LPC (krok 1.) w każde miejsce wstrzyknięcia (krok 3.5) z szybkością 0,4 μl/min.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy trzymać igłę w każdym miejscu przez dodatkowe 10 minut. 
	UWAGA: Należy upewnić się, że odstęp między dwoma wstrzyknięciami nie przekracza 20 minut.</li>
	<li>Zszyj skórę szwem 4-0 i poczekaj, aż zwierzę obudzi się w ciągu 10 minut. Pooperacyjne leki przeciwbólowe należy podawać zgodnie z przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami. 
	UWAGA: Zalecany czas eutanazji można określić w zależności od celu eksperymentu. </li>
</ol>
4. Pobieranie próbek do ogniskowej demielinizacji
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tego kroku, zobacz poprzednio opublikowany raport14.
<ol>
	<li>Rozpuść obojętny czerwony barwnik (patrz tabela materiałów) w 1% roztworze w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>godzin przed poświęceniem myszy (aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz poprzedni odnośnik<klasa sup="xref">10), wstrzyknij 500 μl 1% neutralnego czerwonego barwnika do PBS przez wstrzyknięcie dootrzewnowe dla każdej myszy.</li>
	<li>Wykonaj perfuzję serca12 z 30 ml 0,1% PBS wstępnie schłodzonego w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pokrój mózg na 1 mm za pomocą formy do mózgu (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wizualizuj zmianę zabarwioną neutralną czerwienią pod mikroskopem i dysocjuj zmianę. 
	UWAGA: Usuń jak najwięcej otaczającej normalnej tkanki, aby poprawić dokładność późniejszej analizy. Tkankę zmiany chorobowej można badać za pomocą RT-PCR, mikroskopii elektronowej i analiz western blot.</li>
</ol>
5. Barwienie histologiczne i immunofluorescencja
<ol>
	<li>Do barwienia histologicznego i immunofluorescencji12, po perfuzji serca (krok 4.3.), usuń brain10, utrwal w 4% PFA przez noc (w temperaturze 4 °C) i całkowicie odwodnij w 30% sacharozy.</li>
	<li>Pokrój na 20-milimetrowe skrawki mózgu koronalnego za pomocą mrożonej krajalnicy10 w stałej temperaturze (−20 °C).</li>
	<li>Użyj plastrów do barwienia Luxol fast blue (LFB), immunofluorescencji i western blot 10.</li>
</ol>

<ol><li>Gaire, B. P., Choi, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+lysophospholipid+receptors+in+activation+of+neuroglia+and+their+neuroinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+mechanisms+in+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).</li>
<li>Filippi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43(2018).</li>
<li>Villoslada, P., Steinman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+targets+and+therapeutics+for+neuroprotection%2C+remyelination+and+repair+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Investigational+Drugs%22%5BJournal%5D)">New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).</li>
<li>Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis pathology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).</li>
<li>Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+the+CNS%3A+From+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Remyelination in the CNS: From biology to therapy.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).</li>
<li>Gentile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+exercise+in+experimental+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2197(2019).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+microglial+Hv1+channel+is+associated+with+activation+of+autophagic+pathway+and+ROS+production+in+LPC-induced+demyelination+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333(2020).</li>
<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+easily+reproducible+model+of+focal+white+matter+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).</li>
<li>Blakemore, W. F., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+experimental+models+of+toxin-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).</li>
<li>Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+relaxation+characteristics+during+preacute+stage+of+lysophosphatidyl+choline-induced+demyelinating+lesion+in+rat+brain%3A+An+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis.</a> Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination%3A+A+primary+lipid+disrupting+myelinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy.</a> Glia. 66 (2), 327-347 (2018).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+oligodendrocyte+differentiation+by+Olig2+and+Sox10%3A+evidence+for+reciprocal+interactions+and+dosage-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms.</a> Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).</li>
<li>Kassis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+expression+in+white+matter+oligodendrocytes+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke.</a> Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).</li>
<li>Vorhees, C. V., Williams, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze%3A+Procedures+for+assessing+spatial+and+related+forms+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory.</a> Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).</li>
<li>Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+focal+EAE+model+of+cortical+demyelination%3A+multiple+sclerosis-like+lesions+with+rapid+resolution+of+inflammation+and+extensive+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination.</a> Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+macrophages+in+progressive+multiple+sclerosis%3A+Relationship+to+neurodegeneration+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).</li>
<li>Kutzelnigg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+and+diffuse+white+matter+injury+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis.</a> Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).</li>
<li>Lassmann, H., Bradl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+Experimental+models+and+reality%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: Experimental models and reality).</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).</li>
<li>Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+accelerates+remyelination+after+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination+in+the+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum.</a> Journal of Neuroimmunology. 334, 576995(2019).</li>
<li>Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuprizone+model+for+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurologica+Scandinavica.+Supplementum%22%5BJournal%5D)">The cuprizone model for demyelination.</a> Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).</li>
<li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuprizone+model%3A+Dos+and+do+nots%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The cuprizone model: Dos and do nots.</a> Cells. 9 (4), 843(2020).</li>
<li>Torre-Fuentes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+demyelination+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologia+%28Barcelona%2C+Spain%29%22%5BJournal%5D)">Experimental models of demyelination and remyelination.</a> Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).</li>
<li>Merkler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+common+marmoset+reflects+the+immunopathology+of+pattern+II+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Journal%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions.</a> Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).</li>
<li>Ucal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+cortical+demyelination+of+both+hemispheres+can+be+induced+by+injection+of+pro-inflammatory+cytokines+via+an+implanted+catheter+in+the+cortex+of+MOG-immunized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats.</a> Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stwardnienie rozsiane, przewlekła choroba demielinizacyjna OUN, jest jedną z najczęstszych przyczyn dysfunkcji neurologicznych u młodych dorosłych20. Klinicznie około 60%-80% pacjentów ze stwardnieniem rozsianym doświadcza cyklu nawrotów i remisji przed rozwinięciem się wtórnie postępującego stwardnienia rozsianego21,22, co ostatecznie prowadzi do skumulowanych zaburzeń ruchowych i deficytów poznawczych w czasie23. ...

Sygnalizacja lizofosfolipidowa za pośrednictwem receptorów obejmuje różnorodne procesy fizjologiczne prawie wszystkich układów narządowych1. W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) sygnalizacja ta odgrywa kluczową rolę w patogenezie autoimmunologicznych chorób neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM). Stwardnienie rozsiane jest przewlekłym zaburzeniem o podłożu immunologicznym, charakteryzującym się patologiczną demielinizacją i reakcją zapalną, powodującą dysfunkcję neurologiczną i upośledzenie funkcji poznawczych2,3. Po ciągłym nawrocie i remisji we wczesnej fazie choroby, większość pacjentów ostatecznie przechodzi do etapu wtórnie postępującego, co może spowodować nieodwracalne uszkodzenie mózgu i wynikającą z tego niepełnosprawność4. Uważa się, że patologiczną cechą charakterystyczną przebiegu wtórno-postępującego są blaszki demielinizacyjne spowodowane zmianami zapalnymi5. Istniejące metody leczenia stwardnienia rozsianego mogą znacznie zmniejszyć ryzyko nawrotu choroby. Jednak nadal nie ma skutecznej terapii długotrwałych uszkodzeń demielinizacyjnych spowodowanych przez postępujące MS6. W związku z tym do badania przedklinicznych terapii, które koncentrują się na zwyrodnieniu istoty białej, wymagany jest stabilny i łatwo odtwarzalny model.
Demielinizacja i remielinizacja to dwa główne procesy patologiczne w rozwoju stwardnienia rozsianego. Demielinizacja to utrata osłonki mielinowej wokół aksonów wywołana przez mikroglej o fenotypach prozapalnych7, która prowadzi do powolnego przewodzenia impulsów nerwowych i powoduje utratę neuronów oraz zaburzenia neurologiczne. Remielinizacja jest endogenną reakcją naprawczą, w której pośredniczą oligodendrocyty, w której zaburzenia mogą prowadzić do neurodegeneracji i upośledzenia funkcji poznawczych8. Reakcja zapalna ma kluczowe znaczenie dla całego procesu, wpływając zarówno na stopień uszkodzenia mieliny, jak i na jej naprawę.
Dlatego stabilny model zwierzęcy uporczywej demielinizacji zapalnej jest znaczący dla dalszego badania strategii terapeutycznych dla SM. Ze względu na złożoność stwardnienia rozsianego, stworzono różne typy modeli zwierzęcych naśladujących zmiany demielinizacyjne in vivo, w tym eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE), modele toksyczno-demielinizacyjne, cuprizone (CPZ) i lizofosfatydylocholina (LPC)9. LPC jest endogennym lizofosfolipidem związanym ze stanem zapalnym i może wywoływać szybkie uszkodzenia z toksycznością lipidów mielinowych, prowadząc do ogniskowej demielinizacji. Na podstawie wcześniejszych raportów i badań10,11, przedstawiono szczegółowy protokół wstrzykiwania dwupunktowego z pewnymi modyfikacjami. Ogólnie rzecz biorąc, klasyczny jednopunktowy model iniekcji LPC powoduje tylko miejscową demielinizację w miejscu wstrzyknięcia i często towarzyszy jej spontaniczna remielinizacja12,13. Jednak model LPC z dwupunktowym wstrzyknięciem może wykazać, że LPC może bezpośrednio indukować demielinizację w ciele modzelowatym myszy i powodować trwalszą demielinizację przy niewielkiej regeneracji mieliny.

<table><tbody><tr><td>L-&alfa;-Lizofosfatydylocholina z żółtka jaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4129-25MG</td><td></td></tr><tr><td>32 gauge Igła</td><td>HAMILTON</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l strzykawka</td><td>HAMILTON</td><td>80014</td><td></td></tr><tr><td>szybkobieżna wiertarka czaszki</td><td>mocna, korea</td><td>strong204</td><td></td></tr><tr><td>wiertarka</td><td>Hager & Meisinger, Niemcy&nbsp;</td><td>REF 500 104 001 001 005</td><td></td></tr><tr><td>Respirator Matrx Animal Aneathesia</td><td>MIDMARK</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>Przenośny instrument stereotaktyczny dla myszy</td><td>Nagroda</td><td>68507</td><td></td></tr><tr><td>Mikrostrzykawka</td><td>Nagroda</td><td>KDS LEGATO 130</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp;</td><td>VETEASY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>LuxoL fast bLue</td><td>Servicebio</td><td>G1030-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Szew</td><td>FUSUNPHARMA</td><td>20152021225</td><td></td></tr><tr><td>Pleśń mózgowa</td><td>Nagroda</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalacz</td> <td>mikroskopu elektronowegoServicebio</td><td>G1102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neutralny czerwony (CI 50040), do mikroskopii Certistain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.01376</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko mielinie&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#AB5864</td><td></td></tr> Przeciwciało monoklonalne <tr><td>anty-GST-P MBL</td><td></td><td>#311</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (SolA15)</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific</td><td>14-5698-95</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne beta aktyny</td><td>Proteintech</td><td>66009-1-IG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mielina Podstawowe białko Przeciwciało poliklonalne</td><td>Proteintech</td><td>10458-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>OLIG2 Przeciwciało poliklonalne</td><td>Proteintech</td><td>13999-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp; AffiniPure&nbsp; Anty-Królik Osła&nbsp; IgG (H+L)</td><td>YEASEN</td><td>34206ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34412ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594&nbsp; AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34212ES60</td><td></td></tr><tr><td>HRP Koza Anty-Królicza IgG (H+L)</td><td>abklonalna</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>HRP Koza Anty-Mysia IgG (H+L)&nbsp;</td><td>abclonal</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>Dorosły C57BL/6 samce i samice myszy</td><td>Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stabilnie ugruntowane dwupunktowe wstrzyknięcie modelu ogniskowej demielinizacji wywołanej lizofosfatydylocholiną u myszy

A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice

Sygnalizacja lizofosfolipidowa za pośrednictwem receptorów przyczynia się do patofizjologii różnych chorób neurologicznych, zwłaszcza stwardnienia rozsianego (SM). Lizofosfatydylocholina (LPC) jest endogennym lizofosfolipidem związanym ze stanem zapalnym i może wywoływać szybkie uszkodzenia z toksycznością lipidów mielinowych, prowadząc do ogniskowej demielinizacji. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół stereotaktycznego dwupunktowego wstrzyknięcia LPC, który może bezpośrednio spowodować ciężką demielinizację i szybko i stabilnie odtworzyć eksperymentalne uszkodzenie demielinizacyjne u myszy za pomocą zabiegu chirurgicznego. W związku z tym model ten ma duże znaczenie dla chorób demielinizacyjnych, zwłaszcza stwardnienia rozsianego, i może przyczynić się do związanych z tym postępów w badaniach klinicznych. Zastosowano również metody immunofluorescencji i szybkiego barwienia na niebiesko Luxol, aby zobrazować przebieg czasowy demielinizacji ciała modzelowatego u myszy, którym wstrzyknięto LPC. Ponadto metodę behawioralną wykorzystano do oceny funkcji poznawczych myszy po modelowaniu. Ogólnie rzecz biorąc, dwupunktowe wstrzyknięcie lizofosfatydylocholiny przez ramkę stereotaktyczną jest stabilną i powtarzalną metodą generowania modelu demielinizacji u myszy do dalszych badań.

Dwupunktowa injekcja LPC spowodowała bardziej trwałą demielinizację 
LPC prowadzi głównie do szybkiego uszkodzenia z toksycznością wobec mieliny oraz naruszeniem integralności aksonów15. Dzień injekcji uznano za dzień 0. Myszy utrzymywano przez okres od 10 do 28 dni (10 dpi i 28 dpi). Do oceny obszaru demielinizacji u myszy w tych punktach czasowych wykorzystano barwienie Luxol Fast Blue (LFB)10. W modelu dwupunktowej injekcji w 10 dpi stwierdzono znaczn...

Obecny protokół opisuje dwupunktowe wstrzykiwanie lizofosfatydylocholiny przez ramkę stereotaktyczną w celu wygenerowania stabilnego i powtarzalnego modelu demielinizacji u myszy.

Stabilnie ugruntowane dwupunktowe wstrzyknięcie modelu ogniskowej demielinizacji wywołanej lizofosfatydylocholiną u myszy

Receptor-mediated lysophospholipid signaling contributes to the pathophysiology of diverse neurological diseases, especially multiple sclerosis (MS). ...

Nasz model jest bardzo przydatny w chorobach demielinizacyjnych, zwłaszcza w stwardnieniu rozsianym. I może przyczynić się do związanego z tym postępu w badaniach klinicznych. Jest to szczegółowy protokół, który może bezpośrednio spowodować ciężką demielinizację szybko i stabilnie u myszy za pomocą zabiegu chirurgicznego.Wypróbowując tę technikę po raz pierwszy, uzbrój się w cierpliwość i upewnij się, że współrzędne są dokładne. Zacznij od podłączenia igły o rozmiarze 32 do strzykawki o pojemności 5 mikrolitrów. Pobrać 5 mikrolitrów roztworu LPC w celu przygotowania wstrzyknięcia.Następnie potwierdź głębokość znieczulenia myszy poprzez brak odruchu szczypania palców u stóp, gdy oddech jest płynny. Umieść mysz w ramce stereotaktycznej grzbietem do góry i zabezpiecz głowę stożkiem nosowym i zaciskiem zębowym. Przymocuj mysz do aparatu stereotaktycznego za pomocą obustronnych nauszników.Upewnij się, że nauszniki są wypoziomowane, a głowa jest pozioma i stabilna. Zdezynfekuj skórę głowy, przecierając jodoforem. Następnie za pomocą skalpela wytnij małe nacięcie na około 1,5 centymetra wzdłuż linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.Przetrzyj umiejętność bawełnianym wacikiem zamoczonym w 1% nadtlenku wodoru, aż bregma, lambda i tylne ciemiączko zostaną odsłonięte. Umieścić strzykawkę na aparacie stereotaktycznym. Upewnij się, że głowa zwierzęcia jest ułożona w poziomie i zlokalizuj ciało modzelowate.Po ustaleniu miejsca wstrzyknięcia zapisz współrzędne i zaznacz markerem na czaszce. Delikatnie wywierć zaznaczone miejsce wiertłem do czaszki. Należy uważać, aby uniknąć krwawienia.Powoli przesuń igłę do podanych współrzędnych. Aby wywołać demielinizację ciała modzelowatego, należy wstrzyknąć 2 mikrolitry roztworu LPC w każde miejsce wstrzyknięcia z szybkością 0,4 mikrolitra na minutę. Po wstrzyknięciu należy trzymać igłę w każdym miejscu przez dodatkowe 10 minut.Na koniec zszyj skórę szwem 4-0 i poczekaj, aż zwierzę obudzi się w ciągu 10 minut. Reprezentatywny obraz pokazuje detekcję legionów istoty białej za pomocą szybkiego barwienia na niebiesko Luxol. Na podstawie wyników można zaobserwować stabilną demielinizację ciała modzelowatego po 10 i 28 dniach od wstrzyknięcia.Przedstawiono tutaj ilościowe określenie obszaru demielinizacji w różnych punktach czasowych. Poprzez barwienie immunofluorescencyjne zdegradowanego białka zasadowego mieliny, zaobserwowano niezwykły wzrost dMBP w grupie, której wstrzyknięto LPC po 10 dniach od wstrzyknięcia, co oznacza utratę mieliny w ciele modzelowatym. Analiza Western blot ekspresji zasadowego białka mieliny (MBP) wykazała znaczną utratę MBP po wstrzyknięciu LPC.Beta-aktyna została użyta jako kontrola obciążenia do pomiaru ekspresji wyjściowej. Obrazy z mikroskopii elektronowej potwierdzają mielinizację ultrastruktury w ciele modzelowatym grupy pozorowanej i grupie wstrzykniętej LPC. GST-pi jest markerem dojrzewania różnicowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC).Po 10 dniach od wstrzyknięcia LPC GST-pi zmniejszył się w porównaniu z grupą pozorowaną. Jednocześnie zdolność proliferacji oligodendrocytów może być odzwierciedlona przez stosunek proliferacji oligodendrocytów do całkowitej liczby komórek linii oligodendrocytów. Wyższy współczynnik oznacza większą proliferację oligodendrocytów po 10 dniach od wstrzyknięcia.Reprezentatywne zdjęcia pokazują ścieżkę pływania myszy w każdej grupie, w obecności platformy i po zdjęciu platformy. Wyniki sugerują, że pamięć przestrzenna myszy zdemielinizowanych jest znacznie upośledzona w dwupunktowym modelu iniekcji LPC. Podczas wykonywania tej procedury należy upewnić się, że szybkość wstrzykiwania jest dokładna i trzymać igłę w każdym miejscu przez dodatkowe 10 minut.

a-stably-established-two-point-injection-lysophosphatidylcholine

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Ten film demonstruje procedurę chirurgicznego dostępu do nerwu wzrokowego u znieczulonego zwierzęcia i precyzyjnego dostarczania lizolecytyny w celu wywołania ogniskowej demielinizacji, tworząc warunki neuropatologiczne do dalszych badań.

Indukowanie miejscowej demielinizacji w nerwie wzrokowym za pomocą lizolecytyny

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Ten film przedstawia generowanie ogniskowego modelu myszy demielinizacji przy użyciu dwupunktowego wstrzyknięcia lizofosfatydylocholiny (LPC). Czaszka znieczulonej myszy jest odsłonięta. Określane są współrzędne iniekcji i wiercony jest otwór, aby umożliwić wstrzyknięcia LPC w docelowych miejscach. LPC indukuje ogniskową demielinizację neuronów poprzez stan zapalny, podczas gdy dwupunktowe wstrzyknięcie zapewnia jego trwałość.

Ustalenie ogniskowego modelu myszy demielinizacji poprzez dwupunktowe wstrzyknięcie lizofosfatydylocholiny

Ten film przedstawia metodę indukowania demielinizacji w neuronach rdzenia kręgowego myszy za pomocą wstrzyknięć lizolecytyny, a następnie remielinizacji poprzez migrację i różnicowanie komórek prekursorowych oligodendrocytów. Proces ten upośledza, a następnie stopniowo przywraca transmisję sygnału neuronalnego.

Demielinizacja i remielinizacja neuronów rdzenia kręgowego myszy

Źródło: Wang, X. et. al., Dostarczanie leków oparte na pompie osmotycznej w badaniach remielinizacji in vivo na ośrodkowym układzie nerwowym. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia metodę dostarczania leków neuroterapeutycznych za pomocą pompy osmotycznej w zdemielinizowanym modelu myszy. Kontrolowane uwalnianie leku sprzyja remielinizacji poprzez aktywację komórek wytwarzających mielinę w ciele modzelowatym.

 Podawanie leków neuroterapeutycznych opartych na pompie osmotycznej w zdemielinizowanym modelu myszy

Nowy preparat ex vivo do obrazowania rdzenia kręgowego myszy. Protokół ten pozwala na obrazowanie dwufotonowe żywych interakcji komórkowych w całym rdzeniu kręgowym.

Dwufotonowe obrazowanie dynamiki komórkowej w rdzeniu kręgowym myszy

Choroby demielinizacyjne mogą być modelowane u zwierząt poprzez ogniskowe zastosowanie lizolecytyny do OUN. Pojedyncze wstrzyknięcie lizolecytyny do rdzenia kręgowego myszy powoduje zmianę, która spontanicznie naprawia się w czasie. Celem jest zbadanie czynników zaangażowanych w de- i remielinizację oraz przetestowanie środków usprawniających naprawę.

Eksperymentalna demienizacja i remielinizacja mysiego rdzenia kręgowego przez ogniskowe wstrzyknięcie lizolecytyny

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na reprodukcję rozległej demielinizacji istoty szarej obu półkul korowych u dorosłych samców szczurów Dark Agouti. Metoda polega na domózgowym wszczepieniu cewnika, subklinicznej immunizacji przeciwko glikoproteinie mielinowych oligodendrocytów oraz domózgowej iniekcji prozapalnej mieszaniny cytokin przez wszczepiony cewnik.

Szczurzy model rozległej demielinizacji kory mózgowej indukowanej przez domózgowe wstrzyknięcie cytokin prozapalnych

Demielinizacja ma miejsce w wielu chorobach ośrodkowego układu nerwowego. Niezawodna technika dostarczania leków in vivo jest niezbędna do remielinizacji testów leków. Protokół ten opisuje metodę opartą na pompie osmotycznej, która umożliwia długotrwałe dostarczanie leku bezpośrednio do miąższu mózgu i poprawia biodostępność leku, z szerokim zastosowaniem w badaniach nad remielinizacją.

Dostarczanie leków na bazie pompy osmotycznej do badań remielinizacji in vivo nad ośrodkowym układem nerwowym

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Poznaj metodę dwupunktowego wstrzyknięcia lizofosfatydylocholiny u myszy do tworzenia stabilnego modelu demielinizacji ciała modzelowatego. Technika stereotaksyczna umożliwia badanie mechanizmów stwardnienia rozsianego.

Stabilnie ugruntowane dwupunktowe wstrzyknięcie modelu ogniskowej demielinizacji wywołanej lizofosfatydylocholiną u myszy

Przeglądaj więcej filmów