Name: Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę edycji genów CRISPR/Cas9 w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych. Protokół zachowuje zdolność do samoodnawiania komórek in vitro, poprawiając skuteczność terapii genowej chorób monogenowych i zakażeń takich jak HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować personelowi zakładu cytometrii przepływowej i zakładu dla zwierząt CSCR. A. C. jest finansowany przez stypendium ICMR-SRF, K. V. K. jest finansowany przez stypendium DST-INSPIRE, a P. B. jest finansowany przez stypendium CSIR-JRF. Praca ta została sfinansowana przez Departament Biotechnologii Rządu Indii (grant nr 1). BT/PR26901/MED/31/377/2017 oraz BT/PR31616/MED/31/408/2019)

<ol><li>Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+stem-cell-based+gene+therapy+for+inherited+disorders%3A+State+of+the+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 443(2019).</li>
<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+hematopoiesis%3A+Current+stage+of+clinical+translation+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958(2019).</li>
<li>Srivastava, A., Shaji, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cure+for+thalassemia+major+-+From+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation+to+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy.</a> Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).</li>
<li>Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+developmental+gamma-globin+gene+expression%3A+An+approach+for+healing+hemoglobinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies.</a> Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253(2020).</li>
<li>Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivector-mediated+clonal+tracking+reveals+intrinsic+heterogeneity+in+the+human+hematopoietic+stem+cell+compartment+and+culture-induced+stem+cell+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment.</a> Blood. 103 (2), 545-552 (2004).</li>
<li>Piras, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+escape+innate+sensing+but+trigger+p53+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).</li>
<li>Christopher, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+human+CD34%2BCD133%2BCD90%2B+hematopoietic+stem+cells+enhances+gene-modified+cell+frequency+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).</li>
<li>Karuppusamy, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCR5+gene+edited+CD34%2B+CD90%2B+hematopoietic+stem+cell+population+serves+as+an+optimal+graft+source+for+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 792684(2022).</li>
<li>Hopman, R. K., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+stem+cell+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in stem cell mobilization.</a> Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).</li>
<li>Hoffman, T. L. Counting Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffman%2C+TL+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+handbook%22">Cell Biology: A laboratory handbook</a>. 1, Elsevier. Chapter 3 21-24 (2006).</li>
<li>Antoniani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+fetal+hemoglobin+synthesis+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+the+human+b-globin+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus.</a> Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).</li>
<li>Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology-directed+gene-editing+approaches+for+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12, 500(2021).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Bagchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+immortalized+erythroid+progenitor+cell+lines+from+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells.</a> Cells. 10 (3), 1-18 (2021).</li>
<li>Ravi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+HPFH-like+mutations+by+CRISPR+base+editing+that+elevates+the+expression+of+fetal+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin.</a> eLife. 11, 65421(2020).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R%CE%B3null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+busulfan+reduces+human+CD34%2B+cell+doses+required+for+engraftment+in+c-kit+mutant+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).</li>
<li>Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+asphyxia+on+the+development+of+synaptic+junctions+in+the+brains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatrica+Japonica%3B+Overseas+Edition%22%5BJournal%5D)">Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice.</a> Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).</li>
<li>Audigé, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+leukocyte+reconstitution+in+NSG+mice+transplanted+with+human+cord+blood+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells.</a> BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-receptors+as+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Fc-receptors as regulators of immunity.</a> Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Ngom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UM171+enhances+lentiviral+gene+transfer+and+recovery+of+primitive+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).</li>
<li>Park, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+proliferation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+by+a+combination+of+hyper-interleukin-6+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+therapy+of+hematopoietic+stem+cells+in+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Rai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cell+culture+conditions+promote+ex-vivo+manipulation+and+expansion+of+primitive+hematopoietic+stem+cells+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy finansowe.

Pomyślny wynik terapii genowej HSPC zależy przede wszystkim od jakości i ilości możliwych do wszczepienia HSC w przeszczepie. Jednak na właściwości funkcjonalne HSC duży wpływ ma faza przygotowawcza produktów terapii genowej, w tym hodowla in vitro i toksyczność związana z procedurą manipulacji genami. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zidentyfikowaliśmy idealne warunki hodowli HSPC, które zachowują macierzystość HSC CD34 + CD133 + CD90 + w hodowli ex vivo. Wiele grup b...

Niedostępność do dawców z ludzkim antygenem leukocytarnym (HLA) w warunkach transplantacji allogenicznej oraz szybki rozwój wysoce wszechstronnych i bezpiecznych narzędzi inżynierii genetycznej sprawiają, że autologiczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) jest strategią leczenia dziedzicznych chorób krwi1,2. Terapia genowa autologicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) obejmuje pobieranie HSPC pacjentów, manipulację genetyczną, korektę mutacji powodujących chorobę oraz przeszczepienie HSPC skorygowanych genowo do pacjenta3,4. Jednak pomyślny wynik terapii genowej zależy od jakości przeszczepu zmodyfikowanego genowo. Etapy manipulacji genami i hodowla ex vivo HSPC wpływają na jakość przeszczepu poprzez zmniejszenie częstości występowania długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC), co wymaga infuzji dużych dawek HSPC manipulowanych genami2,5,6.
Kilka małych molekuł, w tym SR1 i UM171, jest obecnie wykorzystywanych do rozbudowy HSPC krwi pępowinowej7,8. W przypadku dorosłych HSPC, ze względu na wyższą wydajność komórek uzyskaną podczas mobilizacji, nie jest wymagana silna ekspansja. Jednak zachowanie macierzystej izolowanych HSPC w hodowli ex vivo ma kluczowe znaczenie dla zastosowań terapii genowej. W związku z tym opracowano podejście skupiające się na wzbogacaniu hodowli krwiotwórczych komórek macierzystych (HSC) przy użyciu kombinacji małych cząsteczek: Resweratrol, UM729 i SR1 (RUS)7. Zoptymalizowane warunki hodowli HSPC sprzyjają wzbogacaniu HSC, co skutkuje zwiększoną częstotliwością modyfikowanych genowo HSC in vivo i zmniejsza potrzebę manipulowania dużymi dawkami HSPC przez geny, ułatwiając opłacalne podejścia do terapii genowej8.
Tutaj opisany jest obszerny protokół hodowli HSPC, wraz z infuzją i analizą komórek z edytowanymi genami in vivo.

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&reg; X Jednostka</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&trade; X Kit (16-dołkowy nukleokulet i handel; Paski)</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100X)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD45 APC</td><td>BD BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD13 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555394 <tr><td>Anty-ludzki CD19 PerCP</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 340421 <tr><td>Anty-ludzki CD3 PE-Cy7</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>557749</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD90 APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>561971 Anty-ludzki CD133/1&nbsp;</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-113-673</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki CD34 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>Anty-mysie CD45.1 PerCP-Cy5</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>560580</td><td></td></tr><tr><td>Iraladior krwi-2000</td><td>&nbsp; BRIT (Wydział Biotechnologii, Indie)</td><td>BI 2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych (płytki 6-dołkowe poddane obróbce powierzchniowej delta)</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>140675 <tr><td>CrysoStor CS10</td><td>BioLife roztwory</td><td>#07952</td><td></td></tr><tr><td>Busulfan</td><td>CELON LABS (60mg/10mL)</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guide-it Rekombinowany Cas9</td><td>TAKARA BIO</td><td>632640</td><td></td></tr><tr><td>Cas9-eGFP</td><td>SIGMA</td><td>C120040&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Probówka wirówkowa-15ml</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Probówka wirówkowa-50ml</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>339652 <tr><td>DMSO</td><td>MPBIO</td><td>219605590</td><td></td></tr><tr><td>DNAaza</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>6469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami - 1X</td><td>HYCLONE</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Ludzki zestaw selekcji pozytywnej CD34 II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>17856</td><td></td></tr><tr><td>Magnes EasySep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka do elektroforezy</td><td>POMARAŃCZOWA INDIE</td><td>HDS0036</td> FBS THERMO SCIENTIFIC 10270106 <td></td></tr> Cytometr <tr><td></td><td></td><td></td> przepływowy &ndash;<td></td></tr><tr><td> ARIA III</td><td>BD BIOSCIENCE-</td><td>&NBSP;</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo&nbsp;</td><td>BD BIOSCIENCE&</td><td>nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>Flt3-L</td><td>PEPROTECH</td><td>300-19-1000</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania żelem</td><td>CELL BIOSCIENCES</td><td>11630453</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik HighPrep DTR</td><td>MAGBIOGENOMICS</td><td>DT-70005</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki blok BD Fc</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PEPROTECH</td><td>200-06-50</td><td></td></tr><tr><td>IMDM media</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Lampa na podczerwień</td><td>MURPHY-Strzykawka</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>insulinowa 6mm 31G</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 324903 <tr><td>Ketamina</td><td>KETMIN 50-Loading</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>dye 6X</td><td>TAKARA BIO</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik myszy</td> Spektrofotometr <td>AVANTOR</td><td>TV-150</td><td></td></tr><tr><td>Nano kropli</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Komora zliczania komórek Neubauer</td><td>ROHEM INSTRUMENTS</td><td>CC-3073</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>RRID:IMSR_JAX:005557</td><td></td></tr><tr><td>NOD,B6. SCID Il2r&gamma; &minus;/&minus; ZestawW41/W41 (NBSGW)</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>RRID:IMSR_JAX:026622</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa Nunc</td><td>delta THERMO SCIENTIFIC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowa rurka okrągłodenna</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>pierwotna komórka P3 Roztwór nukleofekcji</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>PBP3-02250</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia PCR</td><td>TAKARA BIO</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Klatka na ciasto dla myszy</td><td>FISCHER SCIENTIFIC</td><td>50-195-5140</td><td></td></tr><tr><td>polistyrenowa rurka okrągłodenna (12 x 75 mm)</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>Primer3</td><td>Instytut Badań Biomedycznych Whitehead</td><td><a href="https://primer3.ut.ee/">https://primer3.ut.ee/</a></td><td></td></tr><tr><td>Szybki ekstrakt i handel; Roztwór do ekstrakcji DNA</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>Reserveratrol</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72862</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>300-07-1000</td><td></td></tr><tr><td>SFEM-II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>SYNTHEGO</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN</td><td>TARSON</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StemReginin 1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72342</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do analizy ICE</td><td>SYNTHEGO</td><<td>a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA roztwór buforowy (TE) 1X</td><td>SYNTHEGO</td><td>Dostarczany z gRNA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>4375305</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>300-18-1000</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>HIMEDIA LABS</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>UM729</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72332</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

edycja genów crispr/cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 to bardzo wszechstronne i skuteczne narzędzie do edycji genów, powszechnie stosowane do korygowania różnych mutacji genetycznych. Możliwość manipulacji genami hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) in vitro sprawia, że HSPC są idealną komórką docelową do terapii genowej. Jednak HSPC umiarkowanie tracą swój potencjał wszczepienia i ponownego zasiedlenia wieloliniowego w hodowli ex vivo. W niniejszym badaniu opisano idealne warunki hodowli, które poprawiają wszczepianie HSPC i generują zwiększoną liczbę komórek zmodyfikowanych genowo in vivo. Bieżący raport przedstawia zoptymalizowane warunki hodowli in vitro, w tym rodzaj pożywki hodowlanej, unikalną suplementację koktajlami małocząsteczkowymi, stężenie cytokin, płytki do hodowli komórkowych i gęstość hodowli. Oprócz tego zapewniona jest zoptymalizowana procedura edycji genów HSPC wraz z walidacją zdarzeń edycji genów. W przypadku walidacji in vivo wyświetlana jest infuzja HSPC z edytowanym genem i analiza po wszczepieniu u biorców myszy. Wyniki pokazały, że system hodowli zwiększył częstość występowania funkcjonalnych HSC in vitro, co skutkowało solidnym wszczepianiem komórek z edytowanymi genami in vivo.

Niniejsze badanie określa optymalne warunki hodowli HSPC, które ułatwiają utrzymanie komórek HSC CD34+CD133+CD90+ w hodowli ex vivo. Aby wykazać wzbogacenie populacji HSC w hodowli wraz ze zwiększoną generacją zmodyfikowanych genetycznie komórek HSC, przedstawiono zoptymalizowane procedury izolacji PBMNC, oczyszczania komórek CD34+, hodowli, edycji genów, transplantacji, charakterystyki engraftmentu oraz komórek zmodyfikowanych genetycznie in vivo (<strong cla...

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

Hodowla ex vivo może hamować potencjał ponownego zasiedlania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. Nasz protokół zachowuje łodygę podczas hodowli, a tym samym poprawia częstotliwość komórek modyfikowanych genetycznie in vivo. Terapia genowa hematopoetycznych komórek macierzystych jest obecnie stosowana w chorobach monogenowych i chorobach zakaźnych, takich jak HIV.Protokół terapii genowej HSPC w dużym stopniu opiera się na hodowli ex vivo. Nasz protokół powinien być zgodny z każdą procedurą, która wykorzystuje posiew ex vivo. Zademonstruje ten protokół Vigneshwaran Venkatesan, doktorant z mojego laboratorium.Po wyizolowaniu HSPC należy je hodować w pożywce do hodowli komórek macierzystych, która zawiera cytokiny i małe cząsteczki Resweratrol, UM729 i StemRegenin1. Przed edycją genów ustaw ThermoMixer na 37 stopni Celsjusza, aby odtworzyć przewodnik RNA, a następnie podgrzej bufor TE w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Odwirować syntetyczną chemicznie modyfikowaną fiolkę sgRNA w temperaturze 11 000 razy g przez 1 minutę w temperaturze 4 stopni Celsjusza i dodać 15 mikrolitrów buforu TE do fiolki zawierającej 1,5 nanomola liofilizowanego sgRNA i wymieszać przez delikatne mieszanie, aby uzyskać końcowe stężenie 100 pikomolarów na mikrolitr.Inkubować fiolkę w mieszalniku ThermoMixer, wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 40 sekund. Delikatnie postukaj w fiolkę po bokach i obróć fiolkę, aby zebrać 15 mikrolitrów sgRNA. Zrób porcje o pojemności 1 mikrolitra i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do 1 roku.W przypadku nukleofekcji osad 2 razy 10 do 5 komórek, wirując 200 razy g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 20 mikrolitrach buforu. Zawiesinę komórkową należy delikatnie wymieszać z przygotowanym kompleksem RNP, unikając pęcherzyków powietrza.Teraz przenieś zawiesinę do komercyjnego paska nukleofekcji i elektroporuj komórki za pomocą 4D-Nucleofector wybierając kod impulsu DZ-100. Do elektroporowanych komórek w pasku nukleofekcji dodać 100 mikrolitrów wstępnie inkubowanej pożywki hodowlanej i pozostawić komórki w spokoju na 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przenieść zawartość na płytkę hodowlaną zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi.Umieść myszy NSG w klatkach na ciasto na 6 do 8 godzin przed przeszczepem HSPC. Naświetlić myszy pod kątem 3,5 szarości za pomocą dostępnego w handlu naświetlacza. W przypadku NBSGW należy przygotować 6 do 8 tygodniowych samców i samice myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie busulfanu w dawce 12,5 miligrama na kilogram masy ciała na 48 godzin przed przeszczepem HSPC.Do zaparzenia 1 myszy osad 6 razy 10 do 5 komórek w 1,5-mililitrowej probówce, odwirowując 200 razy g przez 5 minut. w temperaturze pokojowej. Delikatnie odpipetować supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 mikrolitrach PBS.Umieść wstępnie kondycjonowane myszy NSG lub NBSGW w ograniczniku myszy i wstrzyknij HSPC przez wstrzyknięcie żyły ogonowej. Przytrzymaj końcówkę myszy i delikatnie popchnij wtyczkę, aby przytrzymać mysz. Delikatnie przetrzyj ogon myszy 70% etanolem.Za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 31 odessać 100 mikrolitrów zawiesiny komórek. Teraz skieruj światło z lampy podczerwonej na ogon na 30 do 40 sekund, pokrywając obszar ciała myszy fałdami bibuły. Aby utrzymać ogon w osi strugarki za pomocą strzykawki, podnieś go lewym palcem wskazującym.Delikatnie włóż skośną część igły do lewej lub prawej żyły ogonowej ogona pod kątem 20 stopni. Wcisnąć tłok, aby wprowadzić zawiesinę komórkową do żyły i delikatnie ucisknąć bibułką w pobliżu przekłutego obszaru i wyciągnąć igłę. Po znieczuleniu ustaw zwierzę w pozycji leżącej brzusznej i delikatnie potrząśnij myszami, aby otworzyły oko, pozwalając gałce ocznej lekko wystawać.Delikatnie wprowadzić pipetę pastwiskową pod kątem 30 do 45 stopni do przyśrodkowej kanty oka pod błoną nazębną. Po umieszczeniu pipety Pasteura we właściwej pozycji, lekko dociśnij rurkę i zacznij delikatnie obracać probówkę. Po pobraniu od 50 do 80 mikrolitrów krwi obwodowej delikatnie wyjmij pipetę z przyśrodkowej kantu oka.Po eutanazji wykonaj pionowe nacięcie 1 centymetr powyżej cewki moczowej i rozciągnij do 1 centymetra poniżej przepony. Cięcie poziomo w rogach naciętego obszaru, aby otworzyć okolicę brzucha. Po wypreparowaniu kości udowej i piszczelowej za pomocą nożyczek usuń tkanki miękkie przyczepione do kości udowej i piszczelowej i delikatnie wyszoruj kości bibułą.Za pomocą skalpela wykonaj mały otwór o średnicy nie większej niż 0,2 centymetra na dnie 0,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Usuń bliższe końce kości za pomocą skalpela i umieść kości przeciętą stroną skierowaną w stronę otworu 0,5-mililitrowej mikrorurki wirówkowej. Teraz umieść 0,5-mililitrową probówkę z kośćmi w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej 100 mikrolitrów sterylnego PBS.Zamknij pokrywkę, obracaj probówki 200 razy g przez 3 minuty w sterylnych warunkach w temperaturze pokojowej i wyrzuć 0,5-mililitrowe probówki zawierające kości z pustą jamą szpiku. Do 1,5-mililitrowej probówki reakcyjnej zawierającej szpik kostny dodaj 1 mililitr PBS, a następnie za pomocą 1-mililitrowej pipety delikatnie ponownie zawieś komórki 10 razy. Przenieś 1 mililitr zawiesiny komórek do 15-mililitrowej probówki zawierającej 9 mililitrów buforu do lizy RBC.Inkubuj komórki w lodzie przez 7 minut, delikatnie odwracając probówkę co dwie minuty. Po inkubacji odwirować probówkę o ciśnieniu 200 razy g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i powtarzać mycie, aż do uzyskania klarownego, bladobiałego osadu. Częstość żywych komórek i komórek CD34-dodatnich, CD90-dodatnich wzrosła w grupie RUS po 48 godzinach od nukleofekcji.Po 72 godzinach odsetek i częstość występowania indelu wzrosły w grupie leczonej RUS w porównaniu z grupą leczoną DMSO, co sugeruje wzrost edycji genów. Bezwzględna liczba komórek CD34-dodatnich, CD90-dodatnich i całkowitej liczby komórek jądrzastych jest znacznie wyższa 48 godzin po edycji. Analiza cytometrii przepływowej ludzkich komórek CD45-dodatnich u myszy NSG wykazała zwiększone wszczepienie w warunkach hodowli.Analiza częstości edycji genów w mysich komórkach BM wykazała zwiększone wszczepianie HSPC z edytowanymi genami w warunkach hodowli uzupełnionych RUS. Hodowla HSPC w ilości 200 000 komórek na ml ma kluczowe znaczenie dla poprawy funkcjonowania komórek macierzystych. Amplifikacja komórek macierzystych krwi pępowinowej i komórek macierzystych pochodzących z iSPC to nowe obszary, w których testowany jest ten protokół.

crisprcas9-gene-editing-hematopoietic-stem-progenitor-cells-for-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje test do edycji genów w ludzkich limfocytach T przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Mieszanina pierwotnych limfocytów T CD4 + i CD8 + jest połączona z kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9, ukierunkowanym na określone geny w celu nokautu. Po elektroporacji sgRNA kieruje Cas9 do docelowej sekwencji DNA, tworząc precyzyjne cięcia. Cięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczny mechanizm łączenia końców komórki, co prowadzi do nokautu genu.

Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Tutaj prezentujemy protokół do genetycznej edycji komórek CAR-T za pomocą systemu CRISPR/Cas9.

Wykorzystanie CRISPR/Cas9 do wyeliminowania GM-CSF w komórkach CAR-T

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Tutaj prezentujemy protokół edycji genów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą technologii CRISPR Cas do modyfikacji komórek CAR-T.

Produkcja ludzkich komórek CAR-T zmodyfikowanych przez CRISPR

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Poznaj zoptymalizowaną metodę edycji genów CRISPR/Cas9 w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych. Protokół zachowuje zdolność do samoodnawiania komórek in vitro, poprawiając skuteczność terapii genowej chorób monogenowych i zakażeń takich jak HIV.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Przeglądaj więcej filmów