Name: Pobieranie i decelularyzacja kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora opartego na perfuzji ex vivo do unaczynionej allotransplantacji kompozytowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj technikę decelularyzacji kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora z perfuzją ex vivo. Ta metoda redukuje immunogenność tkanek i ułatwia badania nad unaczynionymi przeszczepami kompozytowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rysunek 3A został stworzony w BioRender.com.

Do wszystkich eksperymentów wykorzystano zwłoki samców szczurów rasy Lewis (300-430 g) otrzymane z Toronto General Hospital Research Institute. We wszystkich procedurach chirurgicznych stosowano sterylne narzędzia i materiały w celu zachowania aseptyki (patrz Tabela materiałów). Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami w Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Kanada). Łącznie poddano decelularyzacji cztery kończyny tylne.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Przygotuj 50 mL 5% soli fizjologicznej z heparyną. Z 50 mL worka z solą fizjologiczną pobierz 2,5 mL roztworu soli za pomocą strzykawki 5 mL i wylej. Używając strzykawki 5 mL, dodaj 2,5 mL heparyny do worka z solą fizjologiczną. Odwróć worek, aby wymieszać jego zawartość.</li>
	<li>Umieść szczura (preparat pośmiertny) w pozycji tyłem na niebieskiej podkładce. Ogól obwodowo tylną kończynę oraz obszar pachwiny za pomocą golarki elektrycznej i usuń włosy.</li>
	<li>Przenieś szczura na stanowisko chirurgiczne i za pomocą gazy nanieś roztwór do mycia Povidone iodine na tylną kończynę oraz obszar pachwiny. Następnie użyj gazy i 70% alkoholu izopropylowego, aby wytrzeć roztwór do mycia.</li>
	<li>Wyrzuć niebieską podkładkę z kroku 1.2 i załóż nowe, sterylne rękawiczki.</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie kończyny tylnej szczura
<ol>
	<li>Wykonać nacięcie skóry za pomocą skalpela nr 10 i uchwytu do ostrzy nr 3 wzdłuż poziomu więzadła pachwinowego, przesuwając się w kierunku od bocznego do przyśrodkowego (Rysunek 1A). Użyć pęsety Adsona do odciągnięcia otaczającej skóry, aby zapewnić gładkie nacięcie.</li>
	<li>Po odsłonięciu tkanki tłuszczowej, zastosować rozczepianie tępe, aby ostrożnie przejść przez tłuszcz. Zlokalizować naczynia nabrzuszne górne.</li>
	<li>Za pomocą mikronożyczek przeprowadzić preparację proksymalnie, aby odsłonić leżący pod spodem nerw udowy, tętnicę oraz żyłę na poziomie więzadła pachwinowego.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym zidentyfikować naczynia udowe i przeprowadzić preparację tętnicy oraz żyły proksymalnie, używając precyzyjnej pęsety, aby uzyskać odpowiednią długość od punktów rozwidlenia sieci tętniczej (Rysunek 1B).</li>
	<li>Podwiązać oddzielnie tętnicę i żyłę udową, używając szwów 6-0.</li>
	<li>Przeprowadzić preparację obwodową wokół pozostałej części kończyny tylnej, nie naruszając podwiązanych naczyń udowych.</li>
	<li>Przeciąć kość udową w połowie jej długości za pomocą kleszczyków do kości.</li>
	<li>Aby całkowicie wyizolować kończynę tylną, przeciąć podwiązane naczynia udowe poniżej wiązań za pomocą mikronożyczek.</li>
	<li>Kaniulować tętnicę udową za pomocą kaniuli angiograficznej 24 G pod mikroskopem preparacyjnym. Użyć precyzyjnej pęsety, aby ostrożnie wprowadzić kaniulę. Przepłukać solią fizjologiczną z heparyną, aż do zaobserwowania czystego wypływu z żyły udowej.</li>
	<li>Zabezpieczyć kaniulę, zawiązując jeden szew wokół kaniulowanego naczynia i drugi szew dystalnie wokół samej kaniuli. Upewnić się, że kaniula jest umieszczona proksymalnie, aby zapobiec zablokowaniu punktów rozwidlenia.</li>
	<li>Zanurzyć pobrane kończyny tylne w soli fosforanowej (PBS) do czasu przeprowadzenia decelularyzacji.</li>
</ol>
<img alt="Schemat sekcji tętnicy i żyły udowej szczura do badania anatomii naczyniowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Pozyskanie kończyny tylnej szczura. (A) Wyznaczenie nacięcia skóry na poziomie więzadła pachwinowego od strony bocznej do przyśrodkowej. (B) Widok żyły udowej oraz tętnicy udowej, które zostały wypreparowane proksymalnie w kierunku więzadła pachwinowego, oznaczonego linią przerywaną. Skróty: L = boczna; M = przyśrodkowa; FV = żyła udowa; FA = tętnica udowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
3. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>W szklanej kolbie o pojemności 6 L przygotować 5 L roztworu detergentu – 0,25% dodecylosiarczanu sodu (SDS), rozpuszczając 12,5 g proszku SDS w 5 L ultraczystej wody destylowanej. Otwór kolby zabezpieczyć parafilmem, aby zapewnić szczelność.</li>
	<li>W szklanym słoiku o pojemności 1 L osobno przygotować 1 L 0,25% roztworu SDS, rozpuszczając 2,5 g SDS w 1 L ultraczystej wody destylowanej. Dodać mieszadło magnetyczne i mieszać roztwór na mieszadle magnetycznym do całkowitego rozpuszczenia SDS.</li>
	<li>Przygotować 1 L 1x roztworu płuczącego PBS z dodatkiem 1% roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego (AA). Do kolby o pojemności 1 L wlać 990 mL roztworu 1x PBS i 10 mL AA.</li>
	<li>Osobno, w szklanym słoiku o pojemności 500 mL, ponownie przygotować roztwór 1x PBS + 1% AA, używając 495 mL roztworu 1x PBS i 5 mL AA.</li>
	<li>Przygotować 200 mL 1% roztworu kwasu nadoctowego (PAA)/4% etanolu (EtOH). Roztwór ten należy przygotować w dygestorium.</li>
</ol>
4. Konstrukcja bioreaktora i obwodu perfuzyjnego
UWAGA: Konfigurację bioreaktora i obwodu perfuzyjnego w opisanych krokach przedstawiono na Rysunku 2.
<ol>
	<li>W komorze o pojemności 500 mL (pojemniku plastikowym) wywierć trzy otwory (1/4 cala) w miejscach zaznaczonych na Rysunku 2: Port A to linia wlotowa, Port B to linia uzupełniająca, a Port C to linia wylotowa. Usuń i wyrzuć nadmiar plastiku. Spryskaj i przemyj komorę 70% etanolem.</li>
	<li>Odetnij trzy rurki silikonowe o długości 5 cm i wsuń każdą z nich do połowy w odpowiedni port komory. Na otworze Portu A skierowanym do wnętrza komory zamocuj męski konektor Luer, a na drugim końcu rurki na zewnątrz komory zamocuj żeński konektor Luer.</li>
	<li>Zamocuj żeńskie konektory Luer w Porcie B i Porcie C na końcach rurek skierowanych na zewnątrz komory.</li>
	<li>W szczelnej pokrywie pojemnika plastikowego wywierć jeden otwór na powierzchni pokrywy.</li>
	<li>Odetnij 3 cm rurki silikonowej i wsuń ją w otwór w pokrywie. Upewnij się, że około 2 cm rurki znajduje się poza pokrywą, jak pokazano na Rysunku 2.</li>
	<li>Sterylizuj zarówno komorę, jak i pokrywę wraz z rurkami.</li>
	<li>Używając nożyczek, odetnij dwie rurki silikonowe o długości 30 cm. Na jednym końcu każdej rurki zamocuj łącznik 1/16 cala do 1/8 cala.</li>
	<li>Osobno odetnij nożyczkami dwie rurki silikonowe o długości 12 cm. Na jednym końcu obu rurek zamocuj łącznik 1/16 cala do 1/8 cala. Na drugim końcu jednej rurki zamocuj męski konektor Luer, a do drugiej żeński konektor Luer.</li>
	<li>Sterylizuj cały materiał rurek z kroku 4.7 i 4.8. Do sterylizacji dołącz dwie rurki do pompy 3-stopowej (1.85 mm).</li>
	<li>Przygotuj trzy kurki trójdrożne, jeden filtr strzykawkowy, dwie pipety serologiczne 1 mL oraz jedną strzykawkę 10 mL do zestawu do decelularyzacji. Usuń filtr z pipet serologicznych 1 mL.</li>
</ol>
<img alt="Schemat konfiguracji pompy perystaltycznej do transferu płynów w eksperymentach biomedycznych; przewody i złącza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przygotowanie bioreaktora i konstrukcja obwodu perfuzyjnego. Przedstawiona aparatura obwodu perfuzyjnego, w tym (A) pompa perystaltyczna oraz (B) odpowiednie kasety dla linii wlotowej i wylotowej. (C, D) Przedstawiono również silikonowe przewody o długości 12 cm i 30 cm wraz z odpowiednimi złączami. (E) Przewód do pompy perystaltycznej (1.85 mm). Komora bioreaktora z oznakowanymi portami dla (F) dopływu, (G) portu uzupełniającego oraz (H) odpływu. (I) Pokrywa bioreaktora z portem wentylacyjnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig02large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
5. Decelularyzacja kończyn tylnych szczura
<ol>
	<li>Umieścić sterylną komorę i przykręcić trzy jednorazowe kurki trójdrożne przy liniach wlotowej, wylotowej oraz uzupełniającej. Należy upewnić się, że kurka portu uzupełniającego jest zamknięta w pozostałych dwóch portach, aby zapobiec wyciekom.</li>
	<li>Przymocować rurki przygotowane w kroku 4.8 do kurkek przy liniach wlotowej i wylotowej.</li>
	<li>Połączyć dreny pompy perystaltycznej z rurkami z poprzedniego kroku. Zamocować kasetę na drenach pompy perystaltycznej i umieścić ją w pompie perystaltycznej. Nie należy jeszcze mocować kaset z zamontowanymi drenami.</li>
	<li>Połączyć jedną rurkę z kroku 4.7 z końcem drenu pompy perystaltycznej linii wylotowej z poprzedniego kroku. Na drugim końcu połączyć pipetę serologiczną 1 mL. Końcówkę z zamocowaną pipetą serologiczną zawiesić w kolbie z rezerwuarem na odpady.</li>
	<li>Powtórzyć krok 4.7 dla linii wlotowej. Końcówkę rurki z zamocowaną pipetą serologiczną zawiesić w rezerwuarze z detergentem. Natychmiast uszczelnić otwór kolby rezerwuara z detergentem parafilmem. Przegląd obwodu decelularyzacji przedstawiono na Rysunku 3A,B.</li>
	<li>Wlać 0,25% SDS ze szklanego słoja 1 L (krok 3.2) do komory bioreaktora do poziomu połowy wysokości.</li>
	<li>Za pomocą pęsety Adsona pobrać pozyskaną kończynę tylną i ostrożnie zawiesić ją w komorze bioreaktora.</li>
	<li>Używając dwóch pęset Adsona, skierować kaniulowaną część kończyny tylnej do linii wlotowej. Trzymając kaniulę jedną pęsetą, drugą pęsetą skręcić i zabezpieczyć linię wlotową na kaniuli. Należy upewnić się, że kaniula nie jest naciągana ani skręcana, aby zapobiec jej wysunięciu.</li>
	<li>Po zabezpieczeniu dodać więcej 0,25% SDS ze szklanego słoja 1 L, aby w pełni zanurzyć kończynę, zgodnie z potrzebą. Należy upewnić się, że port wylotowy jest również zanurzony w rezerwuarze bioreaktora, aby zapewnić stały odpływ (Rysunek 3C).</li>
	<li>Zamocować jednorazowy filtr strzykawkowy do portu wentylacyjnego w pokrywie komory bioreaktora, zgodnie z krokiem 4.4 i 4.5.</li>
	<li>Zamocować pokrywę bioreaktora i upewnić się, że komora jest uszczelniona z każdej strony (Rysunek 3B).</li>
	<li>Aby usunąć powietrze z rurek i przygotować obwód perfuzyjny, użyć nowej, jednorazowej strzykawki 10 mL do pobrania detergentu z rezerwuara z detergentem za pomocą kurki trójdrożnej przy linii wlotowej.</li>
	<li>Po pobraniu wprowadzić ten sam płyn do kurki trójdrożnej przy linii wylotowej. Należy upewnić się, że detergent znajduje się w całym układzie rurek zarówno w linii wlotowej, jak i wylotowej.</li>
	<li>Docisnąć i zamocować kasety z drenami w pompie perystaltycznej. Włączyć pompę perystaltyczną przyciskiem zasilania.
	<ol>
		<li>Na ekranie pompy perystaltycznej przejść do drugiej karty za pomocą klawisza strzałki, aby ustawić szybkość perfuzji dla pierwszego kanału. Jako tryb podawania (mode of delivery) wprowadzić przepływ (flow rate) i ustawić szybkość perfuzji (perfusion rate) na 1 mL/min. Upewnić się, że kierunek przepływu jest prawidłowy zgodnie z konfiguracją aparatury. Powtórzyć czynność dla drugiego kanału.</li>
		<li>Zkalibrować pompę perystaltyczną, aby upewnić się, że ilość płynu dostarczanego linią wlotową i/lub odbieranego linią wylotową płynie ze stałą prędkością w obu przypadkach. Upewnić się, że średnica wewnętrzna rurki (tubing ID) jest ustawiona na 1,85 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocząć decelularyzację poprzez perfuzję maszynową z przepływem 1 mL/min dla obu linii wlotowej i wylotowej, naciskając przycisk zasilania (power) na klawiaturze. Monitorować i upewnić się, że przepływ jest stały i ciągły w obu liniach.</li>
	<li>Kontynuować decelularyzację i monitorować proces codziennie. W razie potrzeby uzupełniać rezerwuar bioreaktora 1 L 0,25% SDS (krok 3.2) poprzez port uzupełniający. Obserwować, aż tkanka nabierze białego, półprzezroczystego wyglądu, co powinno nastąpić do 5. dnia, wskazując na decelularyzację kończyn tylnych szczura.</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu decelularyzacji i zestawienie z systemem perfuzyjnym do przygotowania próbki tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przegląd obwodu bioreaktora do decelularyzacji perfuzyjnej kończyny tylnej szczura. (A) Schematyczny rysunek obwodu perfuzyjnego bioreaktora. Niebieskie strzałki wskazują kierunek przepływu detergentu i odpadów. (B) Przegląd obwodu decelularyzacji z bioreaktorem zawierającym kończynę tylną szczura. Zbiornik SDS (kolba po lewej) prowadzi do pompy perystaltycznej i do rurki doprowadzającej bioreaktora. Wyjście jest połączone ze zbiornikiem na odpady (kolba po prawej) poprzez pompę perystaltyczną. (C) (I) Bioreaktor zawierający kończynę tylną szczura z rurką doprowadzającą podłączoną do kaniulowanej tętnicy udowej. (II) Port uzupełniania znajdujący się w narożniku do perfuzji detergentem. (III) Rurka odpływowa zawieszona w zbiorniku z zawiesiną. Skrót: SDS = sodium dodecyl sulfate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
6. Płukanie i sterylizacja po decelularyzacji
<ol>
	<li>Po potwierdzeniu odkomórkowienia należy zastąpić zbiornik z detergentem zbiornikiem z 1x PBS + 1% AA. Otwór kolby należy uszczelnić parafilmem. Rozpocząć perfuzję 1x PBS + 1% AA z prędkością 1 mL/min i kontynuować przez 2 dni.</li>
	<li>Zbiornik z 1x PBS + 1% AA należy zastąpić zbiornikiem zawierającym 200 mL 0,1% PAA/4% EtOH i rozpocząć perfuzję z prędkością 1 mL/min przez 2 h.</li>
	<li>Odłączyć kończynę tylną od linii wlotowej, używając dwóch par sterylnych pęset Adsona – jedną parą należy skręcić linię wlotową, a drugą przytrzymać kaniulę. Należy upewnić się, że kaniula nie jest pociągana, aby zapobiec jej wysunięciu.</li>
	<li>Kończynę przechowywać w szklanym słoiku o pojemności 500 mL zawierającym 1x PBS + 1% AA w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+composite+allotransplantation%3A+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+a+human+face+graft%3A+The+matrix+of+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+skin%2Fadipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li>
<li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).</li>
<li>Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+rat+hind+limb+transplant+as+an+experimental+model+of+vascularized+composite+allotransplantation%3A+Approaches+and+advantages%5BTitle%5D)+AND+%22SAGE+Open+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages.</a> SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871(2020).</li>
<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+and+disinfection+methods+for+decellularized+matrix+materials%3A+Review%2C+consideration+and+proposal%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal.</a> Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).</li>
<li>Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+decellularized+liver+scaffolds+and+recellularized+liver+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts.</a> Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).</li>
<li>Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+generation+of+bioreactors+that+advance+extracellular+matrix+modelling+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering.</a> Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).</li>
<li>Cohen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+chimerism+within+donor+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular chimerism within donor organs.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13437(2021).</li>
<li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularised+skeletal+muscles+allow+functional+muscle+regeneration+by+promoting+host+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8398(2018).</li>
<li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+composite+tissue+as+a+bioartificial+limb+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft.</a> Biomaterials. 61, 246-256 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Tylne kończyny szczurów są przydatne jako modele eksperymentalne w VCA5. Inżynieria tkankowa rusztowań bezkomórkowych stanowi pierwszy krok w kierunku rozwiązania problemów związanych z długoterminowymi schematami immunosupresji związanymi z VCA. Zastosowanie przeszczepów kompozytowych stanowi dodatkowe wyzwanie ze względu na obecność wielu tkanek, z których każda ma unikalne właściwości funkcjonalne, immunogenne i strukturalne. Niniejszy protokół pokazuje skuteczną metodę uzyskiwania bezkomórkowy...

VCA to nowa opcja dla pacjentów wymagających skomplikowanej rekonstrukcji chirurgicznej. Urazy pourazowe lub resekcje guza powodują utratę objętości tkanki, która może być trudna do zrekonstruowania. VCA oferuje przeszczep wielu tkanek, takich jak skóra, kości, mięśnie, nerwy i naczynia krwionośne, jako przeszczep kompozytowy od dawcy do biorcy1. Pomimo swojego obiecującego charakteru, VCA jest ograniczone ze względu na długoterminowe schematy immunosupresyjne. Stosowanie takich leków przez całe życie powoduje zwiększone ryzyko infekcji oportunistycznych, nowotworów złośliwych i toksyczności dla narządów końcowych1,2,3. Aby pomóc zmniejszyć i/lub wyeliminować potrzebę immunosupresji, rusztowania inżynierii tkankowej wykorzystujące metody decelularyzacji VCA są bardzo obiecujące.
Decelularyzacja tkanek polega na zachowaniu struktury macierzy zewnątrzkomórkowej przy jednoczesnym usunięciu zawartości komórkowej i jądrowej. To bezkomórkowe rusztowanie może być ponownie zapełnione komórkami specyficznymi dla pacjenta4. Dodatkowym wyzwaniem jest jednak zachowanie sieci tkanek kompozytowych ECM. Wynika to z obecności wielu typów tkanek o różnej gęstości tkanki, architekturze i położeniu anatomicznym w rusztowaniu. Obecny protokół oferuje technikę chirurgiczną i metodę decelularyzacji kończyny tylnej szczura. Jest to model potwierdzający słuszność koncepcji zastosowania tej techniki inżynierii tkankowej do tkanek złożonych. Może to również skłonić do podjęcia dalszych wysiłków na rzecz regeneracji tkanek kompozytowych poprzez recelularyzację.

<table><tbody><tr><td>0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań USP 50 ml</td><td>Baxter Corporation</td><td>JB1308M</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Jednorazowe pipety serologiczne</td><td>VWR</td><td>75816-102</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe strzykawki</td><td></td><td></td> o pojemności 10 ml <td>Uzyskane z instytucji badawczej</td></tr><tr><td>3-kierunkowy kran</td><td></td><td></td><td>uzyskany z instytucji badawczej</td></tr><tr><td>Jednorazowe strzykawki</td><td></td><td></td> <td>5ccOtrzymywany z Instytucji Badawczej</td></tr><tr><td>70% Alkohol</td><td></td><td></td> izopropylowy <td>Otrzymywany z Instytucji Badawczej</td></tr><tr><td>Acrodisc Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; m</td><td>VWR</td><td>CA28143-310</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Adson, proste</td><td>narzędzia do precyzyjnego nauki</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik naczyniogiogeniczny 24 G 19 mm (&frac34; &rdquo;)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>38112</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x) 100 ml</td><td>Multicell</td><td>450-115-EL</td><td></td></tr><tr><td>Obcinacz do kości</td><td>Fine Science Tools</td><td>12029-12</td><td></td></tr><tr><td>Złącza do&nbsp; rurek 1/16" do 1/8"</td><td>McMasterCarr</td><td>5117K52</td><td></td></tr><tr><td>Żeński adapter Luer na kolczasty (PVDF) - 1/8" ID</td><td>McMasterCarr</td><td>51525K328</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze z mikrostępionymi końcówkami</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna Sodowa do wstrzykiwań 10 000 IU / 10 ml</td><td>LEO Pharma Inc.</td><td>006174-09</td><td></td></tr><tr><td>Męski adapter Luer na kolczasty (PVDF) - 1/8" ID</td><td>McMasterCarr</td><td>51525K322</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt mikroigłowy</td><td>WLorenz</td><td>04-4125</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>WLorenz</td><td>SP-4506</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nadoctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>269336-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna, 3-kanałowa</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-78001-68</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1x 500 ml</td><td>Żubr</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Powidonowy roztwór</td><td></td><td></td> do peelingu chirurgicznego <td>Otrzymywany z rurki pompy instytucji badawczej</td></tr><tr><td>, 3-stopniowej, rurki pompy Tygon E-LFL</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96450-40</td><td></td></tr><tr><td>, utwardzany platyną silikon</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela - #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść do skalpela - #3&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik dodecylosiarczanu sodu Stopień: Czystość: >99%, 1 kg</td><td>Szew chirurgiczny Bioshop</td><td>SDS003.1</td><td></td></tr><tr><td>#6-0</td><td>Covidien</td><td>VS889</td><td></td></tr></tbody></table>

pobieranie i decelularyzacja kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora opartego na perfuzji ex vivo do unaczynionej allotransplantacji kompozytowej

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Pacjenci z ciężkimi urazami i utratą tkanek wymagają skomplikowanej rekonstrukcji chirurgicznej. Allotransplantacja unaczynionego kompozytu (VCA) to rozwijająca się droga rekonstrukcyjna do przenoszenia wielu tkanek jako podjednostki kompozytowej. Pomimo obiecującego charakteru VCA, długoterminowe wymagania immunosupresyjne są znaczącym ograniczeniem ze względu na zwiększone ryzyko nowotworów złośliwych, toksyczności narządów końcowych i zakażeń oportunistycznych. Inżynieria tkankowa bezkomórkowych rusztowań kompozytowych jest potencjalną alternatywą w zmniejszaniu potrzeby immunosupresji. W tym artykule opisano pobieranie tylnej kończyny szczura i jej późniejszą decelularyzację za pomocą dodecylosiarczanu sodu (SDS). Przedstawiona strategia zaopatrzenia opiera się na tętnicy udowej wspólnej. Skonstruowano system bioreaktora oparty na perfuzji maszynowej, który wykorzystano do decelularyzacji ex vivo kończyny tylnej. Przeprowadzono udaną decellularizację perfuzyjną, w wyniku której kończyna tylna uzyskała biały, półprzezroczysty wygląd. Zaobserwowano nienaruszoną, przepuszczalną sieć naczyniową w całej kończynie tylnej. Analizy histologiczne wykazały usunięcie treści jądrowej i zachowanie architektury tkankowej we wszystkich przedziałach tkankowych.

Protokół pozyskiwania tkanek pozwolił na skuteczną izolację i kaniulację tętnic udowych wspólnych do kolejnych etapów perfuzji. Reprezentatywne obrazy z sekcji na Rysunku 1A,B przedstawiają miejsce nacięcia oraz odsłonięcie naczyń udowych w odpowiedniej odległości od punktów rozwidlenia. Rysunek 2 przedstawia aparaturę niezbędną do przygotowania bioreaktora i obwodu perfuzyjnego. Punkt końcowy decelularyzacji określono na podstawie białego, półp...

Opisujemy technikę chirurgiczną i proces decelularyzacji kompozytowych kończyn tylnych szczurów. Decelularyzacja odbywa się przy użyciu dodecylosiarczanu sodu o niskim stężeniu przez system perfuzji maszynowej ex vivo.

Pobieranie i decelularyzacja kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora opartego na perfuzji ex vivo do unaczynionej allotransplantacji kompozytowej

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Stworzyliśmy mały model zwierzęcy do decelularyzacji kończyny. Jest to przydatne do ułatwienia badań typu proof of concept nad de i recelularyzacją unaczynionych tkanek kompozytowych. Schematy immunosupresji są jednym z głównych ograniczeń w unaczynionej allotransplantacji złożonej.Immunogenność tkanek można zmniejszyć za pomocą decelularyzacji. Na początek wykonaj nacięcie skóry za pomocą ostrza chirurgicznego numer 10 wzdłuż więzadła pachwinowego, przesuwając się z kierunku bocznego do przyśrodkowego, jednocześnie przytrzymując otaczającą skórę kleszczami Adson. Kiedy leżący pod spodem tłuszcz zostanie odsłonięty, użyj sekcji, aby ostrożnie przeciąć tłuszcz i zlokalizować górne naczynia nadbrzusza.Za pomocą mikronożyczek wypreparuj proksymalnie i odsłoń leżący pod spodem nerw udowy, tętnicę i żyłę na poziomie więzadła pachwinowego. Pod mikroskopem preparacyjnym zidentyfikuj naczynia udowe i wypreparuj tętnicę i żyłę proksymalnie za pomocą cienkich kleszczy, aby uzyskać wystarczającą długość od punktów rozwidlenia sieci tętniczej. Następnie podwiązaj osobno żyłę udową i tętnicę za pomocą szwów 6-0.Następnie należy przeprowadzić rozwarstwienie obwodowe wokół pozostałej części kończyny tylnej bez naruszania podwiązanych naczyń udowych i przeciąć kość udową w połowie długości za pomocą noża do kości. Aby w pełni odizolować kończynę tylną, należy przeciąć podwiązane naczynia udowe dystalnie do ligatur za pomocą mikronożyczek i kanulować tętnicę udową za pomocą angiocewnika o rozmiarze 24 pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie przepłukać heparynizowaną solą fizjologiczną, aż do uzyskania wyraźnego odpływu z żyły udowej.Zabezpiecz kaniulę, zawiązując jeden szew wokół naczynia kaniulowanego w drugim szwie dystalnie wokół samej kaniuli, upewniając się, że kaniula jest umieszczona proksymalnie, aby zapobiec blokowaniu punktów rozwidlenia. Następnie zanurz pozyskane kończyny tylne i PBS do czasu decelularyzacji. Aby zbudować bioreaktor, umieść wysterylizowaną komorę i przykręć trzy jednorazowe trójdrogowe zawory odcinające na liniach wlotowych, wylotowych i uzupełniających, upewniając się, że kran portu napełniania jest zaślepiony na pozostałych dwóch portach, aby zapobiec wyciekom.Przymocuj wcześniej wykonane rurki silikonowe do kranów na przewodach wlotowych i wylotowych. Następnie podłącz rurki perystaltyczne do rurek silikonowych. Po zabezpieczeniu kasety na rurce perystaltycznej umieść ją na pompie perystaltycznej.Następnie podłącz jedną z silikonowych rurek do końca rurki perystaltycznej przewodu wylotowego od powyższego kroku. Z drugiej strony podłączyć pipetę serologiczną o pojemności jednego mililitra i ponownie zawiesić końcówkę dołączoną pipetą serologiczną do kolby zbiornika na odpady. Następnie zawiesić koniec rurki przymocowanej do pipety serologicznej w zbiorniku detergentu i natychmiast uszczelnić otwór kolby zbiornika detergentu parafilmem.Dodaj 0,25% SDS z litrowego szklanego słoika do komory bioreaktora na połowie poziomu. Następnie weź pobraną tylną kończynę za pomocą kleszczy Adson i ostrożnie zawieś ją w komorze bioreaktora. Używając dwóch par kleszczy Adson, poprowadź kaniulowaną część kończyny tylnej do linii wlotowej, trzymając kaniulę jedną parą kleszczy.Użyj drugiej pary kleszczyków, aby skręcić i przymocować przewód dopływowy do kaniuli. Po zabezpieczeniu dodaj więcej 0,25% SDS z litrowego szklanego słoika, aby w razie potrzeby całkowicie zanurzyć kończynę, upewniając się, że otwór wylotowy jest również zanurzony w zbiorniku bioreaktora i utrzymany jest stały odpływ. Następnie przymocuj jednorazowy filtr strzykawkowy do otworu wentylacyjnego w pokrywie komory bioreaktora i zabezpiecz pokrywę bioreaktora, upewniając się, że komora jest uszczelniona ze wszystkich stron.Aby usunąć powietrze z rurki i zalać obwód perfuzyjny, użyj nowej jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów, aby pobrać detergent ze zbiornika detergentu za pomocą trójdrożnego zaworu odcinającego na przewodzie dolotowym. Po pobraniu użyj tego samego płynu, aby włożyć go do trójdrogowego kranu na przewodzie wylotowym. Następnie dociśnij i zabezpiecz kasety z rurką do pompy perystaltycznej.Następnie włącz pompę perystaltyczną za pomocą przycisku zasilania. Na ekranie pompy perystaltycznej przejdź do drugiej zakładki za pomocą strzałki, aby ustawić szybkość perfuzji dla pierwszego kanału z wejściowym natężeniem przepływu jako trybem dostarczania i ustawić szybkość perfuzji na jeden mililitr na minutę, upewniając się, że kierunek przepływu jest prawidłowy zgodnie z konfiguracją aparatury. Skalibruj pompę perystaltyczną, aby upewnić się, że ilość płynu dostarczanego przez przewód dolotowy i/lub pobieranego z przewodu wylotowego przepływa równomiernie między nimi, upewniając się, że średnica wewnętrzna przewodu jest ustawiona na 1.85 milimetra.Rozpocznij decelularyzację za pomocą perfuzji maszynowej z prędkością jednego mililitra na minutę zarówno dla linii wlotowej, jak i wylotowej, naciskając przycisk zasilania na klawiaturze. Monitoruj i upewnij się, że przepływ jest i trwa zarówno na przewodach wlotowych, jak i wylotowych. Używając 1 litra 0,25% STS, w razie potrzeby uzupełnij zbiornik bioreaktora przez port uzupełniania.Następnie poszukaj białego, półprzezroczystego wyglądu tkanki, który pojawi się do piątego dnia, wskazując na decelularyzację tylnych kończyn szczura. Po potwierdzeniu decelularyzacji należy wymienić zbiornik detergentu na PBS i 1% zbiornik antybiotykowo-przeciwgrzybiczy i uszczelnić otwór kolby parafilmem. Rozpocznij PBS i 1% perfuzję antybiotykowo-przeciwgrzybiczą od jednego mililitra na minutę i kontynuuj przez dwa dni.Zastąp PBS i 1% zbiornik antybiotykowo-przeciwgrzybiczy 200 mililitrami 0,1% kwasu pasożytniczego, 4% zbiornikiem etanolu i rozpocznij perfuzję z prędkością jednego mililitra na minutę przez dwie godziny. Pod szafką bezpieczeństwa biologicznego odłącz tylną kończynę od przewodu wlotowego za pomocą dwóch par sterylnych kleszczy Adson, z których jedna para kleszczy skręca przewód wlotowy, a druga przytrzymuje kaniulę, upewniając się, że kaniula nie jest ciągnięta, aby zapobiec dekaniulacji. Przechowuj kończynę w szklanym słoiku o pojemności 500 mililitrów zawierającym PBS i 1% Antybiotyk-Antybiotyk w temperaturze 4 stopni Celsjusza do dalszego użycia.Zarówno pozbawiona komórek tętnica i żyła udowa wykazywały utratę zawartości jądrowej we wszystkich warstwach i otaczającej tkance łącznej, biorąc pod uwagę brak jąder barwionych na niebiesko, które w przeciwnym razie byłyby obecne w naczyniach natywnych. Osłonka wewnętrzna środkowa i przydanka zarówno żyły udowej, jak i tętnic były utrzymywane w naczyniach pozbawionych komórek. Nerw udowy wykazywał zachowanie struktury tkankowej, w tym endoneurium.Kość wykazała ogólną retencję strukturalną z utratą barwionych jąder osteocytów oraz z otaczających warstw śródkostnej i okostnej po decelularyzacji. Skóra wykazywała ubytek komórek z naskórka i skóry właściwej. Skóra właściwa wykazywała zatrzymane włókna kolagenowe podobne do natywnej tkanki skórnej.Wreszcie, widok poprzeczny mięśni szkieletowych wykazał utratę jąder znajdujących się na obrzeżach endomysium. Zawartość miofibryli pozostała zachowana w odpowiednich pęczkach po decelularyzacji. Przeprowadzono również kwantyfikację DNA za pomocą PicoGreen, w której zawartość DNA została znacznie zmniejszona w naczyniach udowych, nerwach, skórze, mięśniach i kościach.Zgodnie z tym protokołem, pozbawioną komórek kończynę można dalej scharakteryzować. Obejmuje to badanie macierzy zewnątrzkomórkowej zarówno przy użyciu metod histologicznych, jak i biochemicznych oraz ocenę naczyń krwionośnych za pomocą obrazowania. Pozbawiona komórek łodyga może być również rekomórkowana przy użyciu komórek specyficznych dla tkanki.

procurement-decellularization-rat-hindlimbs-using-an-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszej pracy opisujemy procedurę ortotopowego przeszczepienia kończyny tylnej szczura, która wydaje się być złotym standardem modelu in vivo w badaniach nad allotransplantacją tkanek złożonych.

Ortotopowe przeszczepianie kończyny tylnej u szczurów

Ten film opisuje przygotowanie pozbawionej komórek nerki szczura. Uzyskane bezkomórkowe rusztowanie naczyniowe może posłużyć jako obiecująca platforma do inżynierii tkankowej przeszczepów narządowych.

Przygotowanie pozbawionej komórek nerki szczura: procedura generowania bezkomórkowego unaczynionego rusztowania całego narządu z pobranej nerki szczura

Unaczynione allotransplantacje kompozytowe (VCA) stały się kliniczną rzeczywistością. Jednak szerokie zastosowanie kliniczne VCA jest ograniczone przez przewlekłą wielolekową immunosupresję. Autorzy prezentują wiarygodny i powtarzalny duży model zwierzęcy do tłumaczenia nowych strategii immunomodulacyjnych, które mogą zminimalizować lub potencjalnie wyeliminować potrzebę immunosupresji w VCA.

Zmodyfikowany heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych świń do badań nad translacyjną unaczynioną allotransplantacją kompozytową (VCA)

Ten nowatorski model do ortotopowego przeszczepu kończyn tylnych u myszy, wykorzystujący technikę mankietu bez szwów do zespolenia supermikronaczyniowego, stanowi potężne narzędzie do mechanistycznych badań immunologicznych in vivo związanych z unaczynioną allotransplantacją kompozytową (VCA).

Ortotopowy przeszczep kończyn tylnych u myszy

Unaczyniony kompozytowy przeszczep allogeniczny oferuje korzyści zmieniające życie biorcom przeszczepów, ale biologiczne przyczyny odrzucenia przeszczepu i waskulopatii pozostają słabo poznane. Przedstawiony tutaj model chirurgiczny gryzoni oferuje powtarzalny, klinicznie istotny model przeszczepu, umożliwiając naukowcom ocenę zdarzeń odrzucenia przeszczepu i potencjalnych strategii terapeutycznych zapobiegających ich wystąpieniu.

Zmodyfikowany heterotopowy model płata kostno-skórnego kończyn tylnych u szczura do translacyjnych badań nad allotransplantacją unaczynionych kompozytów

Ten protokół przedstawia solidny, powtarzalny model unaczynionego kompozytowego allotransplantu (VCA) nastawiony na jednoczesne badanie immunologii i funkcjonalnego odzyskiwania. Czas zainwestowany w skrupulatną technikę przeszczepu ortotopowego prawej kończyny tylnej w połowie uda z ręcznie szytymi zespoleniami naczyniowymi i koaaptacją neuronalną daje możliwość badania funkcjonalnej regeneracji.

Kolejny krok: ortotopowy model przeszczepu kończyn tylnych z koaaptacją neuronalną w celu maksymalizacji powrotu do sprawności u szczura

Opisujemy model heterotopowego przeszczepu serca w jamie brzusznej u szczurów, sugerując modyfikacje obecnych strategii, które prowadzą do uproszczonego podejścia chirurgicznego. Dodatkowo opisujemy nowatorski model odrzucania przeszczepu poprzez wstrzyknięcie do ucha ważnych komórek mięśnia sercowego, co pozwala na dalsze analizy immunologiczne przeszczepu u szczurów.

Model immunologiczny do heterotopowego przeszczepu komórek serca i mięśnia sercowego u szczurów

Ten protokół wprowadza metodę tworzenia rusztowania przy użyciu pozbawionych komórek nerek szczurów. Protokół obejmuje procesy decelularyzacji i recelularyzacji w celu potwierdzenia biodostępności. Decelularyzacja odbywa się przy użyciu Triton X-100 i dodecylosiarczanu sodu.

Przygotowanie bezkomórkowych rusztowań nerkowych u szczurów

Ten artykuł przedstawia częściowy protokół heterotopowego przeszczepu płata kostno-skórnego u szczurów i jego potencjalne wyniki w obserwacji średnioterminowej.

Częściowy heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych u szczurów

Protokół opisuje chirurgiczne pobieranie i późniejszą decelularyzację unaczynionych płatów świńskich poprzez perfuzję detergentu z dodecylosiarczanu sodu przez unaczynienie płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

Poznaj technikę decelularyzacji kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora z perfuzją ex vivo. Ta metoda redukuje immunogenność tkanek i ułatwia badania nad unaczynionymi przeszczepami kompozytowymi.

Pobieranie i decelularyzacja kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora opartego na perfuzji ex vivo do unaczynionej allotransplantacji kompozytowej (Wideo) | JoVE Journal

Pobieranie i decelularyzacja kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora opartego na perfuzji ex vivo do unaczynionej allotransplantacji kompozytowej

Przeglądaj więcej filmów