Pobieranie i decelularyzacja kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora opartego na perfuzji ex vivo do unaczynionej allotransplantacji kompozytowej

Stworzyliśmy mały model zwierzęcy do decelularyzacji kończyny. Jest to przydatne do ułatwienia badań typu proof of concept nad de i recelularyzacją unaczynionych tkanek kompozytowych. Schematy immunosupresji są jednym z głównych ograniczeń w unaczynionej allotransplantacji złożonej.

Immunogenność tkanek można zmniejszyć za pomocą decelularyzacji. Na początek wykonaj nacięcie skóry za pomocą ostrza chirurgicznego numer 10 wzdłuż więzadła pachwinowego, przesuwając się z kierunku bocznego do przyśrodkowego, jednocześnie przytrzymując otaczającą skórę kleszczami Adson. Kiedy leżący pod spodem tłuszcz zostanie odsłonięty, użyj sekcji, aby ostrożnie przeciąć tłuszcz i zlokalizować górne naczynia nadbrzusza.

Za pomocą mikronożyczek wypreparuj proksymalnie i odsłoń leżący pod spodem nerw udowy, tętnicę i żyłę na poziomie więzadła pachwinowego. Pod mikroskopem preparacyjnym zidentyfikuj naczynia udowe i wypreparuj tętnicę i żyłę proksymalnie za pomocą cienkich kleszczy, aby uzyskać wystarczającą długość od punktów rozwidlenia sieci tętniczej. Następnie podwiązaj osobno żyłę udową i tętnicę za pomocą szwów 6-0.

Następnie należy przeprowadzić rozwarstwienie obwodowe wokół pozostałej części kończyny tylnej bez naruszania podwiązanych naczyń udowych i przeciąć kość udową w połowie długości za pomocą noża do kości. Aby w pełni odizolować kończynę tylną, należy przeciąć podwiązane naczynia udowe dystalnie do ligatur za pomocą mikronożyczek i kanulować tętnicę udową za pomocą angiocewnika o rozmiarze 24 pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie przepłukać heparynizowaną solą fizjologiczną, aż do uzyskania wyraźnego odpływu z żyły udowej.

Zabezpiecz kaniulę, zawiązując jeden szew wokół naczynia kaniulowanego w drugim szwie dystalnie wokół samej kaniuli, upewniając się, że kaniula jest umieszczona proksymalnie, aby zapobiec blokowaniu punktów rozwidlenia. Następnie zanurz pozyskane kończyny tylne i PBS do czasu decelularyzacji. Aby zbudować bioreaktor, umieść wysterylizowaną komorę i przykręć trzy jednorazowe trójdrogowe zawory odcinające na liniach wlotowych, wylotowych i uzupełniających, upewniając się, że kran portu napełniania jest zaślepiony na pozostałych dwóch portach, aby zapobiec wyciekom.

Przymocuj wcześniej wykonane rurki silikonowe do kranów na przewodach wlotowych i wylotowych. Następnie podłącz rurki perystaltyczne do rurek silikonowych. Po zabezpieczeniu kasety na rurce perystaltycznej umieść ją na pompie perystaltycznej.

Następnie podłącz jedną z silikonowych rurek do końca rurki perystaltycznej przewodu wylotowego od powyższego kroku. Z drugiej strony podłączyć pipetę serologiczną o pojemności jednego mililitra i ponownie zawiesić końcówkę dołączoną pipetą serologiczną do kolby zbiornika na odpady. Następnie zawiesić koniec rurki przymocowanej do pipety serologicznej w zbiorniku detergentu i natychmiast uszczelnić otwór kolby zbiornika detergentu parafilmem.

Dodaj 0,25% SDS z litrowego szklanego słoika do komory bioreaktora na połowie poziomu. Następnie weź pobraną tylną kończynę za pomocą kleszczy Adson i ostrożnie zawieś ją w komorze bioreaktora. Używając dwóch par kleszczy Adson, poprowadź kaniulowaną część kończyny tylnej do linii wlotowej, trzymając kaniulę jedną parą kleszczy.

Użyj drugiej pary kleszczyków, aby skręcić i przymocować przewód dopływowy do kaniuli. Po zabezpieczeniu dodaj więcej 0,25% SDS z litrowego szklanego słoika, aby w razie potrzeby całkowicie zanurzyć kończynę, upewniając się, że otwór wylotowy jest również zanurzony w zbiorniku bioreaktora i utrzymany jest stały odpływ. Następnie przymocuj jednorazowy filtr strzykawkowy do otworu wentylacyjnego w pokrywie komory bioreaktora i zabezpiecz pokrywę bioreaktora, upewniając się, że komora jest uszczelniona ze wszystkich stron.

Aby usunąć powietrze z rurki i zalać obwód perfuzyjny, użyj nowej jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów, aby pobrać detergent ze zbiornika detergentu za pomocą trójdrożnego zaworu odcinającego na przewodzie dolotowym. Po pobraniu użyj tego samego płynu, aby włożyć go do trójdrogowego kranu na przewodzie wylotowym. Następnie dociśnij i zabezpiecz kasety z rurką do pompy perystaltycznej.

Następnie włącz pompę perystaltyczną za pomocą przycisku zasilania. Na ekranie pompy perystaltycznej przejdź do drugiej zakładki za pomocą strzałki, aby ustawić szybkość perfuzji dla pierwszego kanału z wejściowym natężeniem przepływu jako trybem dostarczania i ustawić szybkość perfuzji na jeden mililitr na minutę, upewniając się, że kierunek przepływu jest prawidłowy zgodnie z konfiguracją aparatury. Skalibruj pompę perystaltyczną, aby upewnić się, że ilość płynu dostarczanego przez przewód dolotowy i/lub pobieranego z przewodu wylotowego przepływa równomiernie między nimi, upewniając się, że średnica wewnętrzna przewodu jest ustawiona na 1.85 milimetra.

Rozpocznij decelularyzację za pomocą perfuzji maszynowej z prędkością jednego mililitra na minutę zarówno dla linii wlotowej, jak i wylotowej, naciskając przycisk zasilania na klawiaturze. Monitoruj i upewnij się, że przepływ jest i trwa zarówno na przewodach wlotowych, jak i wylotowych. Używając 1 litra 0,25% STS, w razie potrzeby uzupełnij zbiornik bioreaktora przez port uzupełniania.

Następnie poszukaj białego, półprzezroczystego wyglądu tkanki, który pojawi się do piątego dnia, wskazując na decelularyzację tylnych kończyn szczura. Po potwierdzeniu decelularyzacji należy wymienić zbiornik detergentu na PBS i 1% zbiornik antybiotykowo-przeciwgrzybiczy i uszczelnić otwór kolby parafilmem. Rozpocznij PBS i 1% perfuzję antybiotykowo-przeciwgrzybiczą od jednego mililitra na minutę i kontynuuj przez dwa dni.

Zastąp PBS i 1% zbiornik antybiotykowo-przeciwgrzybiczy 200 mililitrami 0,1% kwasu pasożytniczego, 4% zbiornikiem etanolu i rozpocznij perfuzję z prędkością jednego mililitra na minutę przez dwie godziny. Pod szafką bezpieczeństwa biologicznego odłącz tylną kończynę od przewodu wlotowego za pomocą dwóch par sterylnych kleszczy Adson, z których jedna para kleszczy skręca przewód wlotowy, a druga przytrzymuje kaniulę, upewniając się, że kaniula nie jest ciągnięta, aby zapobiec dekaniulacji. Przechowuj kończynę w szklanym słoiku o pojemności 500 mililitrów zawierającym PBS i 1% Antybiotyk-Antybiotyk w temperaturze 4 stopni Celsjusza do dalszego użycia.

Zarówno pozbawiona komórek tętnica i żyła udowa wykazywały utratę zawartości jądrowej we wszystkich warstwach i otaczającej tkance łącznej, biorąc pod uwagę brak jąder barwionych na niebiesko, które w przeciwnym razie byłyby obecne w naczyniach natywnych. Osłonka wewnętrzna środkowa i przydanka zarówno żyły udowej, jak i tętnic były utrzymywane w naczyniach pozbawionych komórek. Nerw udowy wykazywał zachowanie struktury tkankowej, w tym endoneurium.

Kość wykazała ogólną retencję strukturalną z utratą barwionych jąder osteocytów oraz z otaczających warstw śródkostnej i okostnej po decelularyzacji. Skóra wykazywała ubytek komórek z naskórka i skóry właściwej. Skóra właściwa wykazywała zatrzymane włókna kolagenowe podobne do natywnej tkanki skórnej.

Wreszcie, widok poprzeczny mięśni szkieletowych wykazał utratę jąder znajdujących się na obrzeżach endomysium. Zawartość miofibryli pozostała zachowana w odpowiednich pęczkach po decelularyzacji. Przeprowadzono również kwantyfikację DNA za pomocą PicoGreen, w której zawartość DNA została znacznie zmniejszona w naczyniach udowych, nerwach, skórze, mięśniach i kościach.

Zgodnie z tym protokołem, pozbawioną komórek kończynę można dalej scharakteryzować. Obejmuje to badanie macierzy zewnątrzkomórkowej zarówno przy użyciu metod histologicznych, jak i biochemicznych oraz ocenę naczyń krwionośnych za pomocą obrazowania. Pozbawiona komórek łodyga może być również rekomórkowana przy użyciu komórek specyficznych dla tkanki.