Wykrywanie Candidatus Liberibacter asiaticus do stosowania w terenie za pomocą amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a
December 23rd, 2022
W tej pracy opracowano szybką, czułą i przenośną metodę wykrywania Candidatus Liberibacter asiaticus, opartą na amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a.
Huang long bing, w skrócie HLB. Jest to wyniszczająca choroba cytrusów na całym świecie. W krajach najbardziej produkujących cytrusy, takich jak Chiny i USA, HLB jest wywoływany przez bakterie Candidatus Liberibacter asiaticus, ograniczone do łyka, w skrócie CLas.
Wczesne wykrycie CLa było ważne dla hodowców, ułatwiało wczesną interwencję i zapobiegało rozprzestrzenianiu się choroby. Dlatego opracowaliśmy nową metodę szybkiej i przenośnej diagnostyki HLB, łączącą się z amplifikacją polimerazy rekombinazy i systemem CRISPR-Cas12a. Nazwaliśmy go CLas-DETECTR.
Czułość naszej platformy jest znacznie wyższa niż PCR. Co więcej, wykazuje podobny wynik w przypadku qPCR, gdy użyto próbek liści. W porównaniu z konwencjonalnymi detekcjami CLas, nasza metoda może być zakończona w 90 minut i działa w warunkach izotermicznych.
Wynik można również zobrazować za pomocą ręcznego urządzenia do wykrywania fluorescencyjnego w terenie. CLas-DETECTR składa się z czterech etapów: przygotowania roztworu, całkowitej izolacji cytrusowego DNA, izotermicznej amplifikacji DNA oraz wyników wizualizacji. Schemat testu CLas-DETECTR jest zilustrowany tutaj.
Bufor A, roztwór B i roztwór C przygotowuje się zgodnie z opisem w protokole. Aby zaoszczędzić czas i sprawić, by metoda ta nadawała się do terenowego wykrywania CLas, zastosowano podejście oparte na glikolu polietylenowym E. coli w celu uzyskania surowych ekstraktów roślinnych do amplifikacji DNA. W narzędziu używane są liście cytrusowe.
Odbij kilka kawałków krążków liściowych od liścia. Włóż krążki liściowe do 1,5-mililitrowej tubki Eppendorfa. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu A do probówki.
Zmiel ręcznie krążki liściowe na gładką masę za pomocą plastikowego pręta. Pozostaw rurkę w spokoju na 10 minut. Supernatant jest następnie stosowany do amplifikacji DNA.
W celu izotermicznej amplifikacji DNA dodać jeden mikrolitr supernatantu z kroku 2.3 i jeden mikrolitr octanu magnezu do roztworu B i dobrze wymieszać. W laboratorium inkubuj je w prostym inkubatorze pod kątem 37 stopni przez 15 minut. Aby zobrazować wyniki, dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny z kroku 3.2 do roztworu C i dobrze wymieszaj.
Inkubuj je w inkubatorze 37 stopni przez 60 minut. Załóż gogle i obserwuj zielony sygnał fluorescencyjny za pomocą ręcznego urządzenia do wykrywania fluorescencji. Aby przetestować specyficzność CLas-DETECTR, pierwsze czyste kolonie Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.
Do ekstrakcji ich genomowego DNA użyto cytrów, które jest patogenem raka cytrusów oraz szczepu Burkholderia stabilis 1440 wyizolowanego w naszym laboratorium. Następnie te trzy bakterie genomowe DNA i CLas-dodatnie DNA genomowe Newhalla zostały poddane testowi CLas-DETECTR. Aby przetestować czułość CLas-DETECTR, wykryto serię rozcieńczeń fragmentów DNA CLas za pomocą PCR, CLas-DETECTR i qPCR, jak opisano w protokole Po teście swoistości i czułości zastosowano metodę CLas-DETECTR w celu wykrycia obecności CLas w terenie.
Próbki liści pobrane z drzewa słodkiej pomarańczy Newhall uprawianego w szkółce zasobów plazmy zarodkowej na terenie kampusu Gannan Normal University w Jiangxi w Chinach. Zastosowano również qPCR, przekonującą metodę wykrywania CLas zwykle stosowaną w laboratorium. Próbki liści z drzewa Newhall zakażonego i niezakażonego HLB, w którym potwierdzono obecność CLas w naszym laboratorium, poddano testowi CLas-DETECTR.
Sygnał zielonej fluorescencji został przechwycony w próbce zakażonej HLB, ale nie w próbce niezakażonej HLB i kontroli negatywnej. Określiliśmy swoistość CLas-DETECTR za pomocą kwasów nukleinowych ekstrahowanych z innych bakterii. W teście CLas-DETECTR tylko gDNA wyekstrahowane z CLas-dodatnich liści Newhalla wykazywało zielone sygnały fluorescencyjne.
gDNA wyekstrahowane z Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri i Burkholderia stabilis szczep 1440 nie miało takiego charakteru, co oznacza, że CLas-DETECTR może wykrywać CLas specyficznie. Przetestowaliśmy również czułość CLas-DETECTR przy użyciu serii rozcieńczeń DNA CLas, wymienionych w protokole.
PCR może wykryć 201 kopii na megalitr. Z drugiej strony, CLas-DETECTR może wykryć 2,01 kopii na megalitr, co sugeruje jego dostępność jako czułej diagnostyki pola. qPCR może wykryć 0,201 kopii na megalitr, a wartość Ct jest wyższa niż 36.
Tak więc CLas-DETECTR jest o dwa rzędy wielkości bardziej czuły niż tradycyjny PCR i o jeden rząd wielkości mniej czuły niż qPCR, gdy zastosowano rozcieńczone CLas specyficzne amplikony. Na koniec ponownie zbadano wykonalność CLas-DETECTR dla próbek terenowych i porównano jego czułość z qPCR. Widzimy to w liczbach.
Widzimy, że wartość Ct jest wyższa niż 36, gdy stężenie CLas jest mniejsze niż 0,2 kopii na megalitr, co jest bardzo niskim stężeniem. Spośród 15 próbek, wartość Ct w próbkach 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 i 14 wykrytych za pomocą qPCR była mniejsza niż 36. Zaobserwowano wyraźne zielone sygnały fluorescencji.
Z drugiej strony, gdy wartość Ct próbek 6, 7, 9, 12 i 15 wykrytych za pomocą qPCR nie była określona, nie zaobserwowano żadnych sygnałów zielonej fluorescencji. Ponadto zaobserwowano słabe zielone sygnały fluorescencyjne, gdy wartość CT próbki 5 i 11 wykrytej za pomocą qPCR była wyższa niż 36. Wyniki sugerują, że nasza platforma jest szybkim, solidnym i czułym narzędziem do diagnozowania HLB w terenie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie dotyczy potrzeby szybkiego i dokładnego wykrywania Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), czynnika wywołującego Huanglongbing (HLB) u roślin cytrusowych. Nowa metoda, określana jako CLas-DETECTR, łączy amplifikację rekombinazową polimerazy z technologią CRISPR-Cas12a, umożliwiając przenośne i wrażliwe testowanie w terenie.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Patologia roślin
- Diagnostyka w rolnictwie
- Genetyka mikroorganizmów
Tło
- Huanglongbing (HLB) poważnie odbija się na produkcji cytrusów na całym świecie.
- Wczesne wykrywanie CLas jest kluczowe dla zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby.
- Obecne metody, takie jak PCR, mają ograniczenia, wymagające ulepszeń pod kątem przydatności w terenie.
Stosowane metody
- Amplifikacja rekombinazowa polimerazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a
- Do testów wykorzystano próbki liści cytrusowych z terenu.
- Technologia wykrywania fluorescencyjnego do wizualyzacji wyników.
Główne wyniki
- CLas-DETECTR wykazało znacznie wyższą czułość niż standardowa PCR.
- Swoiste fluorescencje obserwowano wyłącznie w próbkach dodatnich na CLas.
- Metoda może dać wyniki w ciągu 90 minut w warunkach izotermicznych.
Wnioski
- Badanie wykazuje, że CLas-DETECTR jest efektywnym i wrażliwym narzędziem diagnostycznym do wykrywania HLB.
- Ta metoda może ułatwić terminowe interwencje w zarządzaniu chorobami cytrusów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid, field-deployable detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) addresses a critical bottleneck in agricultural pathogen surveillance, enabling earlier intervention and containment of Huanglongbing (HLB) outbreaks. The integration of recombinase polymerase amplification with CRISPR-Cas12a delivers high sensitivity and specificity, supporting confident decision-making at the point of need. This diagnostic advancement enhances predictive confidence and operational agility for disease management pipelines in agri-biotech portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid hypothesis testing for pathogen presence in plant systems.
- Supports functional validation of detection targets through CRISPR-based specificity.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing CLas from other citrus pathogens.
- Improves predictive confidence for early-stage intervention strategies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated plant DNA extracts for downstream diagnostic workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative fluorescence readouts.
- Enables scalable, field-ready screening without laboratory PCR infrastructure.
- Supports reliable evaluation of sample status for rapid triage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns diagnostic outputs with disease-relevant field conditions for translational continuity.
- Bridges laboratory assay performance with real-world sample variability.
- Reduces risk in advancing detection platforms toward broader agricultural deployment.
- Provides mechanistic de-risking by confirming target specificity in complex matrices.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through field validation, supporting workflows from hypothesis testing to actionable diagnostics in agricultural biotechnology.
- Discovery Biology: Confirms pathogen presence and specificity using CRISPR-Cas12a-mediated detection.
- Screening: Offers rapid, reproducible, and quantitative fluorescence outputs for sample triage.
- Analytics: Provides sensitivity thresholds and comparative performance data versus PCR and qPCR.
- Translational Research: Demonstrates continuity from laboratory validation to field deployment in citrus samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a portable, reusable diagnostic platform adaptable to other plant pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in pathogen detection.
- Operational Value: Enables standardized, rapid, and field-deployable diagnostics without complex instrumentation.
- Strategic Value: Supports timely go/no-go decisions for disease management and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of diagnostic and intervention strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid extraction and isothermal amplification techniques.
- Needs access to handheld fluorescence detection devices for field visualization.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and assay execution.
- Adaptable to various plant matrices with protocol optimization.
- Limited by the need for CRISPR-Cas12a reagents and fluorescence-compatible infrastructure.
