Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Pomimo wielu przykładów koordynacji, większość badań bada białka aktyny lub mikrotubul indywidualnie. Metoda ta pozwala na wizualizację obu dynamicznych polimerów w jednej reakcji. Technika ta pozwala użytkownikowi ocenić różne białka regulatorowe pod kątem właściwości emergentnych, które można było zaobserwować tylko w przypadku dynamicznych wersji aktyny i mikrotubul.

Technikę tę można rozszerzyć o lipidy lub ekstrakty, aby zbliżyć się do budowy syntetycznej komórki. Zacznij od rozmrożenia porcji proszków PEG-Silane i Biotyna-PEG-Silane i rozpuszczenia proszków PEG w 80% etanolu, aby uzyskać roztwory podstawowe powłoki o stężeniu 10 miligramów na mililitr mPEG-Silane i od dwóch do czterech miligramów na mililitr Biotyna-PEG-Silan. Usuń czystą szkiełko nakrywkowe z magazynu etanolu za pomocą kleszczy.

Osuszyć azotem gazowym i przechowywać na czystej szalce Petriego. Pokryj szkiełka nakrywkowe 100 mikrolitrami roztworu powlekającego i inkubuj je w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez co najmniej 18 godzin lub do momentu użycia. Wytnij 12 pasków dwustronnej taśmy dwustronnej z podwójnym podkładem na długość 24 milimetrów.

Usuń jedną stronę podkładu taśmy i przymocuj kawałki taśmy przylegające do sześciu rowków znajdujących się w czystej komorze obrazowania. Usuń drugi kawałek podkładu taśmy, aby odsłonić lepką stronę taśmy wzdłuż każdego rowka komory, a następnie umieść taśmę komory stroną do góry na czystej powierzchni. Wymieszaj roztwory żywicy epoksydowej i utwardzacza jeden do jednego w małej łódce wagowej i użyj końcówki P1000, aby umieścić kroplę zmieszanej żywicy epoksydowej między paskami taśmy na końcu każdego rowka komory obrazowania.

Następnie umieść komorę, taśmę lub stronę epoksydową do góry, na czystej powierzchni. Wyjąć powlekane szkiełko nakrywkowe z inkubatora o temperaturze 70 stopni Celsjusza i spłukać pokryte i niepowlekane powierzchnie szkiełek nakrywkowych wodą podwójnie destylowaną sześć razy. Osuszyć przefiltrowanym azotem gazowym, a następnie przymocować do komory obrazowania stroną z powłoką szkiełka nakrywkowego w kierunku taśmy.

Użyj końcówki do pipet P200 lub P1000, aby wywrzeć nacisk na szklaną powierzchnię styku z taśmą, aby zapewnić dobre uszczelnienie między taśmą a szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować zmontowane komory w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć do 10 minut, aby żywica epoksydowa mogła całkowicie uszczelnić studzienki komory przed użyciem. Komory perfuzyjne tracą ważność w ciągu 12 do 18 godzin od montażu.

Użyj pompy perfuzyjnej i sekwencyjnie wymieniaj roztwory kondycjonujące w komorze perfuzyjnej, przepływając 50 mikrolitrów 1% BSA, aby zalać komorę obrazowania. Usuń nadmiar bufora ze zbiornika mocującego blokadę przynęty. Następnie przelej 50 mikrolitrów po 0,005 miligrama na mililitr streptawidyny i inkubuj przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej.

Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika. Przelej 50 mikrolitrów 1% BSA, aby zablokować niespecyficzne wiązanie i inkubować przez 10 do 30 sekund. Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika.

Następnie przelej 50 mikrolitrów ciepłego buforu 1x TIRF, a następnie 50 mikrolitrów stabilizowanych i 50% biotynylowanych nasion mikrotubul rozcieńczonych w 1x buforze TIRF. Ustaw stage lub obiektyw grzewczy tak, aby utrzymywał temperaturę od 35 do 37 stopni Celsjusza przez 30 minut przed obrazowaniem pierwszej reakcji biochemicznej. Następnie ustaw interwał akwizycji co pięć sekund przez 15 do 20 minut.

Następnie ustaw ekspozycje lasera 488 i 647 na 50 do 100 milisekund przy mocy od 5% do 10%, najpierw dostosowując reakcję polimeryzacji, aby zainicjować montaż filamentu aktynowego. Uzyskaj obrazy w 647 nanometrach i dokonaj odpowiednich korekt. Następnie dostosuj reakcję polimeryzacji w drugiej kondycjonowanej perfuzji, aby zainicjować montaż mikrotubul.

Wizualizuj w 488 nanometrach i dokonaj odpowiednich korekt. Połączyć trzy mikrolitry 10 mikromolowej tubuliny 488 z 7,2 mikrolitrową podwielokrotnością 100 mikromolowej fluorescencyjnie nieznakowanej tubuliny nie później niż 15 minut przed użyciem. Następnie połącz trzy mikrolitry rozcieńczonej aktyny związanej z biotyną w odpowiednich objętościach fluorescencyjnie nieznakowanej i znakowanej aktyny tak, aby końcowa mieszanina wynosiła 12,5 mikromolowej całkowitej aktyny z 10% do 30% znacznikiem fluorescencyjnym.

Przygotuj mieszaninę cytoszkieletu, łącząc dwa mikrolitry 12,5 mikromolowej mieszanki aktyny z mieszanką tubuliny nie później niż 15 minut przed obrazowaniem. Przechowywać na lodzie do czasu użycia. Przygotuj mieszankę reakcji białkowych, łącząc wszystkie inne eksperymentalne składniki i białka, w tym 2x bufor TIRF, anty wybielacz, nukleotydy, i białka pomocnicze.

Mieszaninę cytoszkieletu i mieszaninę reakcji białkowej inkubować oddzielnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 sekund. Aby zainicjować reakcję, dodaj zawartość mieszanki reakcji białkowej do mieszanki cytoszkieletu i wymieszaj. Przepłynąć 50 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor TIRF uzupełniony 15 mikromolowymi wolnymi tubulinami, jednym milimolowym GTP, 0,5 mikromolowymi monomerami aktyny i odpowiednimi objętościami kontrolnych do komory perfuzyjnej.

Nagraj film poklatkowy za pomocą oprogramowania mikroskopowego, aby rejestrować co pięć sekund przez 15 do 20 minut. Kondycjonować nową studzienkę perfuzyjną i zastąpić objętość buforu białkiem regulatorowym będącym przedmiotem zainteresowania i kontrolą buforu. Acquire w celu oceny białek regulatorowych dla pojawiających się funkcji mikrotubul aktyny.

Przykładowe pomiary mikrotubul i dynamiki filamentu aktynowego pokazano na tych obrazach. Średnia projekcja czasowa kanału tubuliny skutecznie wizualizuje całkowite długości mikrotubul dla skanów liniowych używanych do generowania wykresów kimografu. Czarne przerywane linie odpowiadają dwóm przykładowym kymogramom dynamicznych mikrotubul.

Fazy wzrostu i rozkładu mikrotubul są pokazane na każdym kimografie. Pokazano tutaj dwa przykładowe montaże obrazów poklatkowych przedstawiające aktywnie polimeryzujące pojedyncze filamenty aktynowe. Współczynniki wydłużenia oblicza się jako nachylenie wykresów długości włókien aktynowych w czasie na aktynę mikromolową.

W związku z tym współczynnik korygujący dwa należy zastosować do reakcji aktyny 0,5 mikromolowej, aby porównać szybkości zwykle określane przy jednym stężeniu aktyny mikromolowej. Przykłady z pięciu filamentów są pokazane tutaj. Pokazano tutaj obrazy fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia lub TIRF dynamicznych mikrotubul we włóknach aktynowych polimeryzujących pod nieobecność lub w obecności 250 nanomolowych Tau.

Niebieskie przerywane linie i strzałki oznaczają zużycie, dla wykresów skanowania linii została narysowana linia odpowiadająca każdemu warunkowi. Nakładanie się mikrotubul w regionach aktyny można ocenić w określonym punkcie czasowym na obszar. Białka cytoszkieletu, w szczególności aktyna, mikrotubule i ich regulatory są bardzo wrażliwe na cykle zamrażania/rozmrażania.

Aby zapewnić spójność i sukces, używaj wysoce czystych i odpowiednio przechowywanych białek.