Name: Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji dynamicznej aktyny i mikrotubul za pomocą mikroskopii TIRF. Technika umożliwia jednoczesną obserwację obu polimerów oraz badanie właściwości białek regulacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jestem wdzięczny Marcowi Ridilli (Repair Biotechnologies) i Brianowi Haarerowi (SUNY Upstate) za pomocne komentarze na temat tego protokołu. Prace te były wspierane przez Narodowe Instytuty Zdrowia (GM133485).

1. Mycie szkiełek nakrywkowych
UWAGA: Przemyć szkiełka nakrywki (24 mm x 60 mm, #1.5) zgodnie z opisem Smith i wsp., 201328.
<ol>
	<li>Umieścić szkiełka nakrywkowe w plastikowym pojemniku do transportu preparatów.</li>
	<li>Zanurzać szkiełka nakrywkowe sekwencyjnie w następujących roztworach i poddać sonikacji przez 30-60 min, płucząc 10 razy w ddH2O pomiędzy każdym roztworem: ddH2O z jedną kroplą płynu do mycia naczyń; 0.1 M KOH. Przechowywać szkiełka nakrywkowe w 100% etanolu do 6 miesięcy. 
	UWAGA: Nie dotykać szklanych powierzchni nieosłoniętymi palcami. Należy używać pęsety.</li>
</ol>
2. Powlekanie oczyszczonych szkiełek cover-slip (24 mm x 60 mm, #1.5) silanem mPEG oraz biotiną-PEG-silanem
UWAGA: W niniejszym protokole wykorzystano system biotyna-streptawidyna do pozycjonowania aktyny i mikrotubul w płaszczyźnie obrazowania TIRF. Można zastosować inne powłoki i systemy (np. przeciwciała, poli-L-lizynę, miozynę NEM itp.).
<ol>
	<li>Odmrozić alikwoty proszków PEG-silane oraz biotin-PEG-silane.</li>
	<li>Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić proszki PEG w 80% etanolu (pH 2,0), aby przygotować roztwory zapasowe do powlekania o stężeniu 10 mg/mL mPEG-silane oraz 2-4 mg/mL biotin-PEG-silane. 
	UWAGA: Proszki PEG często wydają się rozpuszczone, lecz w skali mikroskopowej może być inaczej. Prawidłowe resuspensowanie trwa ok. 1-2 min przy ciągłym pipetowaniu. Zaleca się dodatkowe 10-krotne pipetowanie po zauważeniu rozpuszczenia proszku. 
	OSTROŻNIE: Podczas przygotowywania 80% etanolu (pH 2,0) należy używać rękawic, aby chronić skórę przed stężonym HCl.</li>
	<li>Za pomocą pęsety wyjąć czystą szkiełko zakrywkowe (24 mm x 60 mm, #1.5) z przechowywanego etanolu. Osuszyć strumieniem azotu i umieścić w czystej szalce Petriego.</li>
	<li>Powlec szkiełka zakrywkowe 100 µL roztworu do powlekania: mieszaniny 2 mg/mL mPEG-silane (MW 2,000) oraz 0,04 mg/mL biotin-PEG-silane (MW 3,400) w 80% etanolu (pH 2,0). 
	UWAGA: W przypadku powlekania rzadkiego (zalecane) należy użyć 2 mg/mL mPEG-silane i 0,04 mg/mL biotin-PEG-silane. W przypadku powlekania gęstego należy użyć 2 mg/mL mPEG-silane oraz 4 mg/mL biotin-PEG-silane.</li>
	<li>Inkubować szkiełka zakrywkowe w temperaturze 70 °C przez co najmniej 18 h lub do momentu użycia. 
	UWAGA: Powleczone szkiełka zakrywkowe ulegają degradacji, jeśli są przechowywane w 70 °C przez więcej niż 2 tygodnie.</li>
</ol>
3. Montaż komór przepływowych do obrazowania
<ol>
	<li>Odetnij 12 pasków dwustronnej taśmy o długości 24 mm. Usuń zabezpieczenie z jednej strony taśmy i przytwierdź kawałki taśmy obok sześciu rowków znajdujących się w czystej komorze obrazowania. 
	UWAGA: Taśma musi być płasko przyklejona dla prawidłowego montażu, w przeciwnym razie komory obrazowania będą przeciekać. Należy ostrożnie usuwać zabezpieczenie taśmy, aby uniknąć powstania wybrzuszeń. Zaleca się przesunięcie oklejonych komór po czystej powierzchni w celu wygładzenia styków taśmy z komorą.</li>
	<li>Usuń drugie zabezpieczenie taśmy, aby odsłonić jej klejącą stronę wzdłuż każdego rowka komory. Połóż komorę stroną z taśmą do góry na czystej powierzchni.</li>
	<li>Wymieszaj żywicę epoksydową i utwardzacz w stosunku 1:1 (lub zgodnie z instrukcją producenta) w małej łódzce ważnej.</li>
	<li>Używając końcówki do pipety P1000, nanieś kroplę zmieszanej żywicy epoksydowej pomiędzy paskami taśmy na końcu każdego rowka komory obrazowania (czerwona strzałka; Rycina 1A). Połóż komorę stroną z taśmą i żywicą epoksydową do góry na czystej powierzchni.</li>
	<li>Wyjmij powleczone szkiełko nakrywkowe z inkubatora w temperaturze 70 °C. Przepłucz powleczone i niepowleczone powierzchnie szkiełek nakrywkowych wodą ddH2O sześć razy, osusz przefiltrowanym azotem, a następnie przymocuj do komory obrazowania stroną powleczoną w stronę taśmy.</li>
	<li>Używając końcówki do pipety P200 lub P1000, wywrzyj nacisk na styk taśmy ze szkłem, aby zapewnić szczelne połączenie między taśmą a szkiełkiem nakrywkowym. 
	UWAGA: Przy prawidłowym uszczelnieniu taśma dwustronna staje się półprzezroczysta. Komory obrazowania z niewystarczającym kontaktem taśmy z komorą będą przeciekać.</li>
	<li>Inkubuj zmontowane komory w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5-10 min, aby żywica epoksydowa w pełni uszczelniła wgłębienia komory przed użyciem. Komory perfuzyjne tracą ważność w ciągu 12-18 h od montażu. 
	UWAGA: W zależności od rozmieszczenia taśmy i grubości użytej taśmy dwustronnej, zmontowana komora będzie miała objętość końcową 20-50 µL.</li>
</ol>
4. Kondycjonowanie komór perfuzyjnych
<ol>
	<li>Użyć pompy perfuzyjnej (przepływ ustawiony na 500 µL/min), aby sekwencyjnie wymieniać roztwory kondycjonujące w komorze perfuzyjnej w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przepuścić 50 µL 1% BSA w celu przygotowania komory obrazowania. Usunąć nadmiar buforu z rezerwuaru złącza Luer lock.</li>
		<li>Przepuścić 50 µL streptawidyny o stężeniu 0,005 mg/mL. Inkubować przez 1-2 min w temperaturze pokojowej. Usunąć nadmiar buforu z rezerwuaru.</li>
		<li>Przepuścić 50 µL 1% BSA w celu zablokowania nieswoistego wiązania. Inkubować przez 10-30 s. Usunąć nadmiar buforu z rezerwuaru.</li>
		<li>Przepuścić 50 µL ciepłego (37 °C) 1x buforu TIRF (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glukozy, 0,25% (v/v) metylocelulozy (4,000 cp)). 
		UWAGA: Nie usuwać nadmiaru buforu z rezerwuaru. Zapobiega to wyschnięciu komory, co mogłoby wprowadzić pęcherzyki powietrza do układu.</li>
		<li>Opcjonalnie: Przepuścić 50 µL stabilizowanych29 i 50% biotynilowanych zarodków mikrotubul rozcieńczonych w 1x buforze TIRF. 
		UWAGA: Odpowiednie rozcieńczenie musi zostać określone empirycznie i może wykazywać zmienność między partiami. Jako punkty wyjścia zaleca się protokoły z27,29. Rozcieńczenie dające 10-30 zarodków na pole widzenia sprawdza się dobrze w tej konfiguracji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie mikroskopu
UWAGA: Reakcje biochemiczne z udziałem dynamicznych filamentów aktynowych i mikrotubul są wizualizowane/przeprowadzane przy użyciu odwróconego mikroskopu TIRF (całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencyjnego) wyposażonego w lasery półprzewodnikowe o mocy 120-150 mW, obiektyw TIRF z imersją olejową 63x z korekcją temperatury oraz kamerę EMCCD. Białka w tym przykładzie są wizualizowane przy następujących długościach fal: 488 nm (mikrotubule) i 647 nm (aktyna).
<ol>
	<li>Ustaw urządzenie grzewcze stolika/obiektywu tak, aby utrzymywało temperaturę 35-37 °C przez co najmniej 30 min przed obrazowaniem pierwszej reakcji biochemicznej.</li>
	<li>Ustaw parametry akwizycji obrazu w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Ustaw interwał akwizycji na co 5 s przez 15-20 min.</li>
		<li>Ustaw ekspozycję laserów 488 i 647 na 50-100 ms przy mocy 5%-10%. Ustaw odpowiedni kąt TIRF dla mikroskopu. 
		UWAGA: Niezależnie od konfiguracji mikroskopu, najprostszym sposobem ustawienia mocy lasera, ekspozycji i kąta TIRF jest dokonywanie korekt na obrazach pojedynczego polimeru (patrz 5.2.2.1 i 5.2.2.2 poniżej). Użytkownikom zdecydowanie zaleca się stosowanie najniższej mocy lasera i ustawień ekspozycji, które wciąż umożliwiają detekcję.
		<ol>
			<li>Dostosuj reakcję polimeryzacji (Rycina 1C), aby zainicjować montaż filamentów aktynowych, i wykonaj akwizycję obrazów przy 647 nm. Wprowadź odpowiednie korekty.</li>
			<li>Dostosuj reakcję polimeryzacji w drugiej przygotowanej studni perfuzyjnej, aby zainicjować montaż mikrotubul (Rycina 1C), i wizualizuj przy 488 nm. Wprowadź odpowiednie korekty.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych białek
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór zapasowy tubuliny znakowanej fluorescencyjnie.
	<ol>
		<li>Oznaczenie stężenia domowej, nieznakowanej tubuliny poprzez spektrofotometria przy Abs280w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Kuweta zerująca spektrofotometru z 1xBRB80 bez dodatku GTP.</li>
			<li>Oblicz stężenie tubuliny, korzystając z wyznaczonego współczynnika ekstynkcji wynoszącego 115 000 M⁻¹cm⁻¹-1 cm-1 oraz następujący wzór: 
			<img alt="Wzór na obliczanie stężenia tubuliny; Abs280 podzielone przez współczynnik ekstynkcji; równanie naukowe." src="/files/ftp_upload/64074/64074eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
		</ol>
		</li>
		<li>Resuspend komercyjnie dostępną liofilizowaną tubulinę 488 znakowaną lizyną do 10 µM (1 mg/ml; 100% stężenia nominalnego) z 20 µL 1x BRB80 bez GTP.</li>
		<li>Rozmrozić 7.2 µL alikwot z 100 µM nieoznaczona odzyskana tubulina29 w lodzie. 
		UWAGA: Odzyskana tubulina jest kluczowa dla prawidłowego montażu mikrotubul in vitro ponieważ usuwa niezdolne do polimeryzacji dimery powstające w zamrożonych zapasach białka29,30.</li>
		<li>Połączyć 3 µL z 10 µM tubuliny 488 z 7.2 µL alikwot z 100 µM nieznakowana tubulina, nie wcześniej niż 15 min przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór zapasu aktyny znakowanej fluorescencyjnie.
	<ol>
		<li>W przypadku białek otrzymanych metodą domową należy wyznaczyć stężenie oraz procentową zawartość aktyny względem całkowitej ilości białka. poprzez spektrofotometria Abs290 oraz Abs650w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Zeroowanie spektrofotometru z buforem G.</li>
			<li>Oblicz stężenie nieznakowanej aktyny, korzystając z wyznaczonego współczynnika ekstynkcji wynoszącego 25 974 M⁻¹cm⁻¹-1 cm-1 oraz następujący wzór: 
			<img alt="Wzór na stężenie aktyny, Abs290/współczynnik ekstynkcji, pomoc obliczeniowa do analizy molekularnej." src="/files/ftp_upload/64074/64074eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"></li>
			<li>Oblicz stężenie aktyny znakowanej Alexa-647 w lizynie, wykorzystując współczynnik ekstynkcji nieznakowanej aktyny, czynnik korekcyjny fluorescencji wynoszący 0,03 oraz poniższy wzór: 
			[aktyna znakowana Alexa-647], µM = (Abs290 - <img alt="Równanie fluorometryczne do korekty absorpcji; wzór wykorzystuje współczynnik ekstynkcji, Abs650." src="/files/ftp_upload/64074/64074eq03.jpg" style="opacity: 0.9; margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"></li>
			<li>Oblicz procent znakowania aktyny Alexa-647, używając wyznaczonej wartości ε dla Alexa-647 wynoszącej 239 000 M⁻¹cm⁻¹-1 cm-1w następujący sposób: 
			% znakowania aktyny Alexa-647 = (Abs290 - (<img alt="Wzór na absorbancję dla stężenia białka; równanie znakowania aktyny; analiza biochemiczna." src="/files/ftp_upload/64074/64074eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 4"></li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozmrozić jedną 2 µL alikwot 3 µM 100% znakowana biotyną aktyna (znakowanie w resztach lizyny). Rozcieńczyć 10-krotnie poprzez dodanie 18 µL buforu G.</li>
		<li>Połączyć 3 µL rozcieńczonej biotynylowanej aktyny, odpowiednie objętości nieznakowanej i znakowanej aktyny (powyżej), tak aby końcowa mieszanina była 12.5 µM aktyna całkowita z 10%–30% znacznikiem fluorescencyjnym. 
		UWAGA: Stężenie fluorescencyjnych monomerów aktyny (końcowe) przekraczające 30% może pogorszyć rozdzielczość obrazowania, ponieważ filamenty stają się trudne do odróżnienia od tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszaniny reakcyjne (Rycina 1C).
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę cytoszkieletu (probówka A), łącząc 2 µL z 12.5 µM wymieszać roztwór aktyny (6.2.3) z roztworem tubuliny (6.1.4) nie wcześniej niż 15 minut przed obrazowaniem. Przechowywać w lodzie do momentu użycia.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną białek (probówka B), łącząc wszystkie pozostałe komponenty eksperymentalne i białka, w tym: bufor TIRF 2x, środek przeciw wybielaniu, nukleotydy, bufory oraz białka akcesoryjne. Przykład przedstawiono w Rycina 1C. 
		UWAGA: Końcowe rozcieńczenie pozwala uzyskać 1x bufor TIRF zawierający ATP, GTP oraz siłę jonową w przybliżonym zakresie fizjologicznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować osobno probówkę A i probówkę B w temperaturze 37 °C przez 30–60 s. Aby rozpocząć reakcję, wymieszać i dodać zawartość probówki B do probówki A (poniżej).</li>
</ol>
7. Obrazowanie dynamiki aktyny i mikrotubul
<ol>
	<li>Przygotuj dożośnią studnię perfuzyjną (Ryc. 1B; krok 4 powyżej).</li>
	<li>Zainicjuj jednoczesny montaż aktyny i mikrotubul, dodając zawartość probówki B (mieszanina reakcyjna) do probówki A (mieszanina cytoszkieletu) (Ryc. 1C).</li>
	<li>przepuść 50 µL reakcji zawierającej 1x bufor TIRF uzupełniony o 15 µM wolnej tubuliny, 1 mM GTP i 0,5 µM monomerów aktyny oraz odpowiednie objętości kontroli buforowych.</li>
	<li>Nagraj film w trybie time-lapse, używając oprogramowania mikroskopu, wykonując akwizycję co 5 s przez 15-20 min. 
	UWAGA: Inicjacja dynamiki aktyny i mikrotubul następuje w ciągu 2-5 min (Ryc. 2). Dłuższe opóźnienia wskazują na problemy z kontrolą temperatury lub problemy z koncentracją białek w mieszaninie reakcyjnej.</li>
	<li>Przygotuj nową studnię perfuzyjną (krok 4) i zastąp objętość buforu badanym białkiem (białkami) regulacyjnym (np. Tau) oraz kontrolami buforowymi (Ryc. 1C). Wykonaj akwizycję zgodnie z opisem w kroku 7 (powyżej), aby ocenić białka regulacyjne pod kątem pojawiających się funkcji aktynowo-mikrotubularnych.</li>
</ol>
8. Przetwarzanie i analiza obrazów za pomocą oprogramowania FIJI31
<ol>
	<li>Otwórz zapisane filmy TIRF i wyświetl je jako obraz kompozytowy.</li>
	<li>Analiza dynamiki mikrotubul (Rysunek 3A), w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wygeneruj maksymalną projekcję Z w czasie z menu stosów obrazów.</li>
		<li>Zsynchronizuj okno projekcji Z z oryginalnym filmem TIRF z Analiza&gt; Narzędzia&gt; Synchronizacja okien menu</li>
		<li>Za pomocą narzędzia do rysowania linii prostych narysuj linię wzdłuż wybranego mikrotubuli na obrazie z projekcją czasową.
		<ol>
			<li>Otwórz menedżera obszarów zainteresowania (ROI) z menu analizy (Analizuj&gt; Narzędzia&gt; Menedżer ROI).</li>
			<li>Zapisz położenia poszczególnych mikrotubul, naciskając klawisz „t”. Powtórz tę czynność dla wszystkich wybranych mikrotubul.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykreśl kymografy wybranych linii, używając „/”, lub uruchom makro multi-kymo, które generuje wideo i kymograf dla każdego mikrotubuli w menedżerze ROI31.
		<ol>
			<li>Dodaj zarówno długość (µm) oraz paski skali czasu (min) do kymografów z Analizuj&gt; Narzędzia&gt; Skale obrazu menu</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pomiar prędkości wzrostu mikrotubul na podstawie nachyleń kymografów (Rycina 3A, 1-2; nachylenie czarnych linii).</li>
		<li>Policz dynamiczne zdarzenia mikrotubularne (katastrofę lub odrost) na podstawie wygenerowanego kymografu lub przy użyciu dostępnych makr analitycznych5,8,18,25Czerwone linie przerywane w Rycina 3A, 1-2 reprezentują zdarzenia katastrofy/szybkiego rozpadu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza dynamiki aktyny (Rysunek 3B), w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Pomiar nukleacji aktyny należy przeprowadzić w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Policz liczbę filamentów aktynowych obecnych w polu widzenia 100 s po rozpoczęciu reakcji i wyraź wynik w przeliczeniu na powierzchnię (liczba filamentów na µm2).</li>
			<li>Zarejestruj i zapisz dane w menedżerze ROI (ROI manager), zgodnie z krokiem 8.2.3.1 opisanym powyżej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pomiar szybkości elongacji filamentów aktynowych (Rycina 3B), w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Narysuj linię wzdłuż wybranego filamentu aktynowego, korzystając z narzędzia linii segmentowej.</li>
			<li>Dodaj linię do managera ROI, zgodnie z krokiem 8.2.3.1 powyżej.</li>
			<li>Powtórz czynność zgodnie z linią (dodając każdy pomiar do menedżera ROI) dla co najmniej czterech klatek filmu. 
			UWAGA: Zaleca się pomiar od siedmiu do ośmiu następujących po sobie klatek, jednak w niektórych warunkach polimeryzacja aktyny przebiega zbyt wolno, by była wykrywalna przy zastosowaniu danej konfiguracji obiektywu i mikroskopu. W takim przypadku pomiary można przeprowadzać w regularnych odstępach czasu, pomijając kolejne klatki (np. co piątą klatkę).</li>
			<li>Nanieś zmierzone wartości długości na wykres w funkcji czasu. Nachylenie wygenerowanej linii stanowi szybkość elongacji aktyny wyrażoną w mikrometrach na sekundę (µm/s).</li>
			<li>Podaj końcowe obliczone szybkości w jednostkach s⁻¹-1 µM-1 stosując współczynnik korekcyjny wynoszący 370 podjednostek, aby uwzględnić liczbę monomerów aktyny w mikrometrze filamentu32.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wykonaj analizę korelacyjną dla obszarów równoległego powiązania aktyny i mikrotubul (Rycina 3C), w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Za pomocą narzędzia do rysowania linii prostych narysuj linię wzdłuż wybranego mikrotubuli w konkretnym punkcie czasowym (np. 300 s po rozpoczęciu reakcji).
		<ol>
			<li>Dodaj linię do menedżera ROI, zgodnie z krokiem 8.2.3.1 powyżej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykreśl intensywność fluorescencji wzdłuż linii w każdym kanale.
		<ol>
			<li>Wybierz każdy kanał za pomocą suwaka obrazu i wykreśl intensywności wzdłuż linii, używając polecenia „command k”.</li>
			<li>Zapisz lub wyeksportuj wartości, klikając przycisk „list” w oknie wyjściowym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyraź zdarzenia sprzęgania aktyny z mikrotubulami jako stosunek (aktyna nakładająca się na mikrotubule) z poszczególnych zdarzeń lub jako liczbę zdarzeń w danym polu widzenia w określonym punkcie czasowym (Rycina 3C).</li>
		<li>Alternatywa: Użycie oprogramowania do wyznaczenia procentowej zakładki obu kanałów5,12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Zastosowanie mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji oczyszczonych białek było owocnym i przekonującym podejściem do analizy unikalnych mechanizmów regulacji cytoszkieletu 5,23,24,25,26,27,35. W porównaniu z tradycyjnymi testami biochemicznymi, reakcje TIRF wymagają bardzo małych objętości (50-100 μl), a ilościowe pomiary dynamiki cytoszkieletu można uzyskać z pojedynczego testu. Większość badań dynamiki cytoszkieletu koncentruje się na pojedynczym układzie polimerowym (tj. Filamentach aktynowych lub mikrotubulach), dlatego szczegółowe pomiary przesłuchów lub pojawiających się zachowań między filamentami aktyny a mikrotubulami, zwykle obserwowanych w komórkach, pozostały nieuchwytne i trudne do podsumowania w probówce. Aby rozwiązać ten problem, w protokole opisano jednowłóknowy system mikroskopowy TIRF, który umożliwia bezpośrednią wizualizację dynamicznych polimerów aktyny i mikrotubul w tej samej reakcji biochemicznej. W związku z tym metoda ta wykracza poza tradycyjne testy, które podsumowują dynamiczne zachowanie samych filamentów aktynowych lub mikrotubul. Technikę tę przeprowadzono również z Tau jako przykładem tego, jak zmienia się kilka właściwości dynamicznych w obecności czynnika sprzęgającego cytoszkieletu. Protokół ten może być stosowany z dodatkowymi białkami, o których wiadomo lub podejrzewa się, że koordynują dynamikę aktyny lub mikrotubul, w tym (ale nie wyłącznie) MACF, GAS, forminy i inne. Wreszcie, podane przykładowe analizy mogą być wykorzystane jako przewodnik do ilościowego określenia danych uzyskanych za pomocą tego protokołu.
"Zobaczyć znaczy uwierzyć" to przekonujący powód, dla którego warto wykonywać testy oparte na mikroskopii. Należy jednak zachować ostrożność przy wykonywaniu i interpretacji eksperymentów mikroskopowych TIRF. Jednym z głównych wyzwań związanych z testami współskładania cytoszkieletu jest to, że wiele powszechnie stosowanych warunków obrazowania nie jest kompatybilnych z każdym polimerem. Mikrotubule i aktyna zazwyczaj mają różne wymagania dotyczące bufora, temperatury, soli, nukleotydów i stężenia do polimeryzacji. Aktyna, tubulina, białka regulatorowe będące przedmiotem zainteresowania i wykorzystywane w tym protokole są wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania. Dlatego ostrożne obchodzenie się z białkami i jest konieczne, aby pomyślnie wykonać ten protokół. Aby złagodzić wiele z tych problemów, zdecydowanie zaleca się stosowanie świeżo przetworzonej tubuliny (zamrożonej na <6 tygodnia) oraz wstępne usuwanie zamrożonych/ponownie zawieszonych aktyn za pomocą ultrawirowania. Rozważania te odnoszą się również do niezliczonych białek regulatorowych, które mają być oceniane za pomocą tej procedury, a które mogą być wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania lub stężenie soli buforowych 5,11,36.
Niestety, nie ma jednego uniwersalnego bufora bez eksperymentalnych kompromisów. Aby zapewnić większą objętość białkom o niższym stężeniu, ATP i GTP mogą być zawarte w 2x roztworze buforowym TIRF (ryc. 1C). Ponieważ jednak nukleotydy te są niezwykle wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania, nie jest to zalecane. Zastosowane tutaj związki wychwytujące tlen (tj. Katalaza i oksydaza glukozowa) są niezbędne do wizualizacji białek przez długi czas (od minut do godzin), ale wiadomo, że ograniczają polimeryzację mikrotubul przy wysokich stężeniach5. W związku z tymi rozważaniami dotyczącymi bufora, ograniczeniem tego protokołu jest to, że niektóre kanoniczne białka regulatorowe związane z mikrotubulami mogą wymagać mniej lub więcej soli do podsumowania funkcji znalezionych w komórkach lub testów przy użyciu samych mikrotubul (bez aktyny). Zmiana charakteru lub stężenia soli w celu rozwiązania tych problemów prawdopodobnie wpłynie na szybkość polimeryzacji włókien aktynowych i/lub parametry dynamiki mikrotubul. Pomiary wielu parametrów opisowych (minimalnie, zarodkowanie, szybkość wydłużania i stabilność) (ryc. 3) są wymagane w celu potwierdzenia sukcesu protokołu lub jawnego udokumentowania wpływu określonych lub białek regulatorowych. Na przykład zbyt duża polimeryzacja filamentu aktynowego może w ciągu kilku sekund przesłonić zdarzenia sprzężenia aktyny-mikrotubul. W związku z tym dostrojenie warunków eksperymentalnych poprzez obniżenie ogólnego stężenia aktyny lub włączenie dodatkowych białek w celu zahamowania zarodkowania aktyny (tj. profiliny) wydłuży ogólny okres, w którym można wyraźnie zobaczyć skoordynowane działania aktyny-mikrotubul. Kontrolki spełniające te wymagania wstępne i repliki techniczne (poza wieloma polami widzenia) mają kluczowe znaczenie dla użytkowników w celu generowania wiarygodnych i odtwarzalnych wyników.
Badania komórkowe dają ograniczoną możliwość obserwacji bezpośrednich zależności białko-białko lub działania kompleksów regulatorowych. W przeciwieństwie do tego, niektóre mechanizmy uzyskane z testów in vitro nie zawsze odzwierciedlają dokładne zachowania białek obserwowanych w komórkach. Ten klasyczny dylemat biochemika może zostać rozwiązany w przyszłych zastosowaniach tej techniki z określonymi modyfikacjami. Na przykład dodanie funkcjonalnych białek sprzęgających znakowanych fluorescencyjnie rozszerza tę metodę z badań pojedynczych włókien do badań pojedynczych cząsteczek. Testy mogą być dalej modyfikowane w celu wykorzystania ekstraktów komórkowych, które mogą dodać "brakujące" nieznane kluczowe czynniki wymagane do podsumowania zjawisk podobnych do komórek. Na przykład testy oparte na TIRF z wykorzystaniem ekstraktów drożdżowych lub Xenopus odtworzyły kurczliwe pierścienie aktomiozyny37, wrzeciona mitotyczne26,38, składniki aktyny lub zespołu mikrotubul39,40, a nawet dynamikę w centrosomie i kinetochorach 36,41,42,43. Co więcej, takie systemy mogą utorować drogę do sztucznych systemów komórkowych, w których obecne są lipidy lub czynniki sygnałowe 44,45,46.

Historycznie rzecz biorąc, aktyna i mikrotubule były postrzegane jako odrębne jednostki, każda z własnym zestawem białek regulatorowych, dynamicznymi zachowaniami i odrębnymi lokalizacjami komórkowymi. Liczne dowody wskazują na to, że polimery aktyny i mikrotubul angażują się w funkcjonalne mechanizmy przesłuchów, które są niezbędne do przeprowadzenia wielu procesów komórkowych, w tym migracji, pozycjonowania wrzeciona mitotycznego, transportu wewnątrzkomórkowego i morfologii komórek1,2,3,4. Różnorodne skoordynowane zachowania, które leżą u podstaw tych przykładów, zależą od skomplikowanej równowagi czynników sprzęgających, sygnałów i właściwości fizycznych. Jednak szczegóły molekularne, które leżą u podstaw tych mechanizmów, są nadal w dużej mierze nieznane, ponieważ większość badań koncentruje się na pojedynczym polimerze cytoszkieletu na raz1,2,5.
aktyna i mikrotubule nie oddziałują bezpośrednio6,7,8. Skoordynowana dynamika aktyny i mikrotubul obserwowana w komórkach jest pośredniczona przez dodatkowe czynniki. Zidentyfikowano wiele białek, o których uważa się, że regulują przesłuchy aktyna-mikrotubule, a ich aktywność jest dobrze scharakteryzowana w odniesieniu do samego polimeru cytoszkieletu1,2. Coraz więcej dowodów sugeruje, że to podejście oparte na pojedynczym polimerze ukryło podwójne funkcje niektórych białek/kompleksów, które umożliwiają sprzężenie aktyna-mikrotubula7,8,9,10,11,12,13. Eksperymenty, w których oba polimery są obecne, są rzadkie i często definiują mechanizmy z pojedynczym dynamicznym polimerem i stabilizowaną statycznie wersją drugiego6,8,9,10,11,14,15,16,17,18. W związku z tym potrzebne są metody do badania pojawiających się właściwości białek koordynujących aktynę i mikrotubule, które mogą być w pełni zrozumiane tylko w systemach eksperymentalnych wykorzystujących oba dynamiczne polimery.
Kombinacja metod bezpośredniego znakowania białek, genetycznie kodowanych znaczników powinowactwa i mikroskopii całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) została zastosowana z dużym powodzeniem w systemach rekonstytucji biomimetycznej19,20,21,22,23. Wiele schematów oddolnych nie zawiera wszystkich czynników regulujących białka w komórkach. Jednak technologia "biochemii na szkle nakrywkowym" udoskonaliła wiele mechanizmów dynamiki aktyny i mikrotubul w wysokich skalach przestrzennych i czasowych, w tym składniki wymagane do montażu lub demontażu polimeru oraz ruch białek motorycznych5,12,23,24,25,26,27. W tym miejscu opisano podejście oparte na pojedynczym włóknie minimalnym składniku do badania sprzężenia aktyna-mikrotubula in vitro. Protokół ten może być stosowany z dostępnymi na rynku lub wysoce czystymi oczyszczonymi białkami, białkami znakowanymi fluorescencyjnie, komorami perfuzyjnymi i rozszerzony na bardziej skomplikowane schematy zawierające ekstrakty komórkowe lub systemy syntetyczne. W tym przypadku dostępne na rynku białko Tau jest wykorzystywane do pokazania, jak zmienia się dynamika cytoszkieletu w obecności białka sprzęgającego aktyna-mikrotubula, ale można je zastąpić innymi przypuszczalnymi czynnikami koordynującymi aktynę-mikrotubule. Główną przewagą tego systemu nad innymi podejściami jest możliwość jednoczesnego monitorowania dynamiki wielu polimerów cytoszkieletu w jednej reakcji. Protokół ten zapewnia również użytkownikom przykłady i proste narzędzia do ilościowego określania zmian w polimerach cytoszkieletu. W ten sposób użytkownicy protokołu będą generować wiarygodne, ilościowe dane o rozdzielczości pojedynczego włókna, aby opisać mechanizmy leżące u podstaw tego, jak różne białka regulatorowe koordynują dynamikę aktyny i mikrotubul.

<table><tbody><tr><td>1% BSA (w/v)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>W tym celu (blokowanie komór TIRF), BSA jest ponownie zawieszany w ddH20 i filtrowany przez 0,22 &mikro; m filtr.</td></tr><tr><td>1 i razy; BRB80</td><td>Domowe</td><td></td><td>rury 80 mM, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 z KOH</td></tr><tr><td>10 mg/mL (1000 U) oksydaza glukozowa</td><td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td><td>G2133-50KU</td><td>W połączeniu z katalazą, porcją i przechowywać w temperaturze -80 oC do użycia</td></tr><tr><td>100 &mikro; M tubulina</td><td>Cytoskeleton Inc, Denver, CO</td><td>T240</td><td>Domowe tubuliny powinny być poddane recyklingowi przed użyciem w celu usunięcia tubuliny niekompetentnej do polimeryzacji (Hyman i in. (1992)29; Li i Moore (2020)30). Dostępne na rynku tubuliny są często zbyt rozcieńczone, aby można je było poddać recyklingowi, ale działają dobrze, jeśli są ponownie zawieszone zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje i wstępnie oczyszczone przez ultrawirowanie (278 000 &razy; g) przez 60 minut, przed użyciem.</td></tr><tr><td>100 mM ATP</td><td>Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO</td><td>A-081</td><td>Zawieszony w ddH20 (pH 7,5) i wysterylizowany filtrem.</td></tr><tr><td>100 mM GTP</td><td>Fisher Scientific AC226250010</td><td></td><td>ponownie zawieszony w 1 i razy; BRB80 (pH 6,8) i sterylizowany filtrem.</td></tr><tr><td>Lasery na ciele stałym 120-150 mW</td><td>Leica Microsystems</td><td>11889151; 11889148</td><td></td></tr><tr><td>2 mg/mL katalaza</td><td>Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO</td><td>C40-100</td><td>W połączeniu z oksydazą glukozową, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 oC do użycia</td></tr><tr><td>2 razy; Bufor TIRF</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>2 razy; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glukozy, 0,5% (v/v) metylocelulozy (4,000 cp); Uwaga: 1 &mikro; L 0,1 mln GTP i 1 &mikro; L 0,1 M ATP dodawany oddzielnie do reakcji TIRF, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.</td></tr><tr><td>24 &razy; 60 mm, #1.5 szkło nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>22-266882</td><td>Szkło nakrywkowe należy dokładnie umyć przed użyciem (Smith i in. (2014)22)</td></tr><tr><td>37 oC blok</td><td></td><td></td><td></td>grzewczy</tr><tr><td>37 oC łaźnia</td><td></td><td></td><td></td>wodna</tr><tr><td>5 mg/ml Streptawidyny (600x stock)</td><td>Avantor, Filadelfia, PA</td><td>RLS000-01</td><td>Zawieszony w Tris-HCl (pH 8,8); rozcieńczyć podwielokrotność do 1&razy; w buforze HEK w dniu użycia</td></tr><tr><td>5 min Żywica epoksydowa i utwardzacz</td><td>Loctite, Rocky Hill, CT</td><td>1365736</td><td>Połączenie żywicy i utwardzacza może trwać do 30 minut.</td></tr><tr><td>50% biotynylowane-GpCpp nasiona mikrotubul</td><td>Cytoskeleton Inc; Domowe</td> nasiona mikrotubul <td>stabilizowane T333P</td> <td>(opcjonalnie) GppCpp lub Taxol mogą bardziej efektywnie pośredniczyć w polimeryzacji mikrotubul. Taksol i GppCpp stabilizują mikrotubule na różne sposoby, które mogą wpływać na strukturę siatki mikrotubul i zdolność niektórych białek regulatorowych do wiązania się ze stabilizowaną częścią mikrotubul. Metoda wytwarzania różnych rodzajów nasion mikrotubul została opisana w Hyman et al. (1992).</td></tr><tr><td>70 oC inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka aktynowa</td><td>Domowej roboty; ten protokół</td><td></td><td>A 12,5 i mikro; Mieszanina aktyn M składająca się ze znakowanej (fluorescencyjnej i biotynylowanej) i nieznakowanej aktyny dla maksymalnie sześciu reakcji. 2 i mikro; L zapasu jest używany w końcowej reakcji TIRF. Końcowe stężenie aktyny użytej w każdej reakcji wynosi 0,5 &mikro; M (10% Alexa-647; 0,09% znakowane biotyną).</td></tr><tr><td>Odpowiednie kontrole buforowe</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Kombinacja ze wszystkich ocenianych białek</td></tr><tr><td>Biotyna-PEG-silan (MW 3,400)</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>biotyna-PEG-SIL-3400</td><td>Dozowanie do podwielokrotności 2-5 mg, wypełnienie azotem, parafilmowanie zamknięte i przechowywane w temperaturze -20 oC ze środkiem osuszającym do czasu użycia</td></tr><tr><td>Biotynylowany</td><td>aktyna Cytoskeleton Inc; Domowa</td><td>AB07</td><td>Biotyna-aktyna jest wytwarzana przez znakowanie na resztach lizyny, a zatem zakłada się, że jest co najmniej w 100% znakowana, ale różni się w zależności od różnych partii/preparatów. Optymalne stężenia biotynylowanych aktyn muszą być empirycznie określone dla poszczególnych zastosowań/projektów eksperymentalnych. Wyższe stężenia pozwalają na bardziej efektywne śledzenie, ale mogą utrudniać polimeryzację lub interakcje z białkami regulatorowymi. W tym przypadku niewielki procent (0,09% lub 900 pM) biotynylowanej aktyny jest obecny w końcowej reakcji TIRF.</td></tr><tr><td>Mydło do naczyń</td><td>Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH</td><td></td><td>Z nieznanych przyczyn niebieska wersja czyści szkiełka nakrywkowe skuteczniej niż inne dostępne kolory.</td></tr>Oprogramowanie FIJI <tr><td>do suchego lodu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td><td>Schneider i in. (2012)31.</td></tr><tr><td>Znakowany fluorescencyjnie aktynowy</td><td>cytoszkielet Inc; Domowa</td><td>AR05</td><td>Domowa aktyna znakowana fluorescencyjnie jest przechowywana w buforze G uzupełnionym 50% glicerolem w temperaturze -20 oC (Spudich i in. (1971)47; Liu i in. (2022)48). Znakowana fluorescencyjnie aktyna jest dializowana z buforem G i wstępnie oczyszczana przez ultrawirowanie przez 60 minut w 278 000 &; g przed użyciem.</td></tr><tr><td>Fluorescencyjnie znakowany cytoszkielet tubulinowy</td><td>Inc</td><td>TL488M, TLA590M, TL670M</td><td>zawieszony w 20 i mikro; L 1 i razy; BRB80 (10 i mikro; M końcowe stężenie) i wstępnie oczyszczone przez ultrawirowanie (278 000 i razy; g) przez 60 minut, przed użyciem.</td></tr><tr><td>G-buffer</td><td>Domowy</td><td></td><td>3 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM DTT, 0,2 mM ATP</td></tr><tr><td>HEK Bufor</td><td>Domowy</td><td></td><td>20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl</td></tr><tr><td>Lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiadro</td><td></td><td></td><td></td>na lód</tr><tr><td>Komory obrazowania</td><td>IBIDI, Fitchburg, WI</td><td>80666</td><td>Zamów komory bez dna, aby wykorzystać różne powłoki szkieł nakrywkowych</td></tr><tr><td>Kamera iXon Life 897 EMCCD</td><td>Andor, Belfast, Irlandia Północna</td><td>8114137</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie mikroskopowe LASX Premium</td><td>Leica Microsystems</td><td>11640611</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza (4,000 cp)</td><td>Sigma Aldrich Inc</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa mikroskopu wyposażona w moduł TIRF</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td><td></td><td></td>11889146</tr><tr><td>mPEG-silan (MW 2,000)</td><td>Laysan Bio Inc, Arab, AL</td><td>mPEG-SIL-2000</td><td>Dozowany do podwielokrotności 10-15 mg, wypełniony azotem, sparafilmowany zamknięty i przechowywany w temperaturze -20 oC ze środkiem osuszającym do czasu użycia</td></tr><tr><td>Podgrzewacz obiektywu i podgrzewana wkładka sceniczna</td><td>OKO labs, Pozzioli, Włochy</td><td>8113569</td><td>Ustaw regulator temperatury na 35-37 oC. Skorzystaj z sugestii producenta, aby uzyskać dokładną kalibrację.</td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>704504</td><td>Można zastąpić strzykawkę i rurkę.</td></tr><tr><td>Szalka Petriego, 100 x 15 mm</td><td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td><td>32-107</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy pojemnik na koperty przesuwne</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>SA-S-1L-SecureSeal o grubości 0,12 mm</td><td>Grace Biolabs, Bend, OR</td><td>620001</td><td>Zdecydowanie zaleca się dwustronną taśmę o precyzyjnych wymiarach.</td></tr><tr><td>Mały pojemnik styropianowy</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td></td><td>Ponownie wykorzystany z wysyłki</td></tr><tr><td>Mała łódź wagowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tau</td><td>Cytoszkielet Inc</td><td>TA01</td><td>W dostępnym na rynku preparacie Tau obecne są trzy izoformy Tau. Stężenie w tym protokole oznaczono z najwyższego pasma masy cząsteczkowej (14,3 &mikro; M, po ponownym zawieszeniu zgodnie z zaleceniami producenta s rekomendacje z 50 &mikro; L z ddH20).</td></tr><tr><td>Temperatura skorygowana 63 razy; Plan Apo 1.47 N.A. Zanurzeniowy obiektyw TIRF</td><td>Leica Microsystems</td><td>11506319</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina</td><td>domowej roboty; ten protokół</td><td></td><td>Zapas tubuliny składający się z 7,2 i mikro; L z recyklingu 100 &mikro; M nieznakowana tubulina i 3 &mikro; L z 10 i mikro; M ponownie zawieszona w handlu tubulina znakowana fluorescencyjnie. Na każdą reakcję stosuje się jeden bulion tubulinowy, który rozmraża się/przechowuje na lodzie. Końcowe stężenie wolnej tubuliny w każdej reakcji wynosi 15 &mikro; M (4% oznakowane). Więcej niż 15 &mikro; M tubulina będzie skutkowała hiperstabilizacją (nie dynamicznymi) mikrotubulami, podczas gdy stężenia poniżej 7,5 & mikro; Tubulina wolna M nie polimeryzuje dobrze. Wymagane jest staranne określenie stężenia białka i obchodzenia się z nim.</td></tr><tr><td>Nieznakowana aktyna (ciemna)</td><td>Cytoskeleton Inc; Domowe</td> jądra aktyny <td>AKL99</td><td>są prawie zawsze obecne w dostępnych na rynku (liofilizowanych) lub mrożonych aktynach i przyczyniają się do zmienności pomiarów ilościowych (Spudich i in. (1971)47; Liu i in. (2022)48). Aktyna z mięśni królika jest przechowywana w buforze G w temperaturze -80 oC i wstępnie oczyszczana przez ultrawirowanie przez 60 minut w temperaturze 278 000 i razy; g przed użyciem. W ciągu dnia przygotowuje się kilka roztworów podstawowych aktyny (co nie wystarcza na sześć reakcji jednocześnie&nbsp; jest zdecydowanie zalecane).</td></tr></tbody></table>

wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (tirf)

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Tradycyjnie, cytoszkielety aktyny i mikrotubul były badane jako oddzielne jednostki, ograniczone do określonych regionów lub procesów komórkowych i regulowane przez różne zestawy białek wiążących, unikalne dla każdego polimeru. Wiele badań pokazuje obecnie, że dynamika obu polimerów cytoszkieletu jest ze sobą spleciona i że ten przesłuch jest wymagany dla większości zachowań komórkowych. Zidentyfikowano już szereg białek biorących udział w interakcjach aktyna-mikrotubule (tj. Tau, MACF, GAS, forminy i inne) i są one dobrze scharakteryzowane w odniesieniu do samej aktyny lub mikrotubul. Jednak stosunkowo niewiele badań wykazało testy koordynacji aktyna-mikrotubula z dynamicznymi wersjami obu polimerów. Może to zasłaniać pojawiające się mechanizmy łączące aktynę z mikrotubulami. W tym przypadku technika rekonstytucji in vitro oparta na mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) pozwala na wizualizację dynamiki zarówno aktyny, jak i mikrotubul z jednej reakcji biochemicznej. Technika ta zachowuje dynamikę polimeryzacji filamentu aktynowego lub mikrotubul pojedynczo lub w obecności drugiego polimeru. Dostępne na rynku białko Tau służy do pokazania, jak zmieniają się zachowania aktyny-mikrotubul w obecności klasycznego białka sieciującego cytoszkielet. Metoda ta może dostarczyć wiarygodnych funkcjonalnych i mechanistycznych informacji na temat tego, w jaki sposób poszczególne białka regulatorowe koordynują dynamikę aktyny-mikrotubul z rozdzielczością pojedynczych włókien lub kompleksów wyższego rzędu.

Przy zastosowaniu opisanych powyżej warunków (Rysunek 1), polimery aktyny i mikrotubul powinny być widoczne (oraz dynamiczne) w ciągu 2 min od rozpoczęcia akwizycji obrazu (Rysunek 2). Jak w przypadku każdego protokołu opartego na biochemii, może być wymagana optymalizacja dla różnych białek regulatorowych lub partii białek. Z tych względów kąt TIRF i czasy naświetlania obrazu są ustawiane w pierwszej kolejności przy użyciu reakcji zawierających każdy polimer z osobna. Potwierdza to, że przechowywane białka są funkcjonalne i że obecna jest wystarczająca ilość znakowanego białka do detekcji. Choć nie zawsze jest to konieczne (i nie wykonano tego w niniejszym przypadku), do poprawy kontrastu obrazu (szczególnie w przypadku mikrotubul) można zastosować postprocessing filmów (np. odejmowanie tła, uśrednianie lub transformacje Fouriera)5,25,33. Bezpośrednia wizualizacja pojedynczych filamentów aktynowych i mikrotubul umożliwiana przez ten test wspiera ilościowe określenie kilku parametrów dynamicznych dla każdego z komponentów cytoszkieletu osobno lub razem, w tym parametrów polimeryzacji (np. szybkości nukleacji lub elongacji), parametrów depolimeryzacji (np. szybkości kurczenia się lub zdarzeń katastrofy) oraz współliniowości/nakładania się polimerów (Rysunek 3). Ponadto pomiary te mogą służyć jako punkt wyjścia do analizy wiązania lub wpływu ligandów regulatorowych, takich jak białko Tau (Rysunek 3). Z jednego filmu TIRF można wykonać wiele pomiarów pojedynczych filamentów aktynowych lub mikrotubul. Jednak ze względu na różnice w powłoce szkiełka podstawowego, pipetowaniu i inne czynniki, wiarygodne pomiary powinny obejmować również wiele technicznych powtórzeń reakcji/filmów.
Wiele aspektów dynamiki mikrotubul można określić na podstawie przykładowych kymografów, w tym szybkość elongacji mikrotubul, a także częstotliwość zdarzeń katastrofy i ratunku (Rysunek 3A). Wykorzystanie kymografów do pomiaru dynamiki aktyny w tym systemie nie jest tak proste, ponieważ filamenty aktynowe są bardziej poskręcane niż mikrotubule. W konsekwencji parametry dynamiki filamentów aktynowych są mierzone ręcznie, co jest czasochłonne i pracochłonne. Liczba nukleacji jest mierzona jako liczba filamentów aktynowych obecnych w tym samym punkcie czasowym dla wszystkich warunków. Liczby te znacznie różnią się w zależności od pola obrazowania TIRF, ale mogą być stosowane przy wielu powtórzeniach lub jako uzupełnienie obserwacji z innych testów polimeryzacji. Liczbę nukleacji można również zastosować dla mikrotubul, jeśli w warunkach doświadczalnych brakuje stabilizowanych zarodków mikrotubul. Szybkości elongacji filamentów aktynowych są mierzone jako długość filamentu w czasie na podstawie co najmniej czterech klatek filmu. Wartości szybkości są podawane na mikromolarny poziom aktyny z czynnikiem korekcyjnym wynoszącym 370 podjednostek, aby uwzględnić liczbę monomerów aktyny w jednym mikronie filamentu (Rysunek 3B)32. Pomiary definiujące skoordynowane zachowania aktyny i mikrotubul są mniej jednoznaczne. Niemniej jednak do pomiaru zbieżności obu polimerów zastosowano analizy korelacyjne, w tym skany liniowe (Rysunek 3C) lub oprogramowanie do analizy nakładania się obrazów5,11,34.
Dostępność danych: 
Wszystkie zestawy danych powiązane z niniejszą pracą zostały zdeponowane w Zenodo i są dostępne na uzasadnioną prośbę pod adresem: 10.5281/zenodo.6368327.
<img alt="Układ mikroskopii TIRF: panel A przedstawia montaż komory perfuzyjnej; panel B opisuje proces oświetlania; panel C szczegółowo przedstawia składniki roztworów do obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematy eksperymentalne: od montażu komory przepływowej do akwizycji obrazów.(A) Montaż komory obrazowania. Od góry do dołu: komory obrazowania IBIDI są przyklejane taśmą wzdłuż otworów perfuzyjnych (oznaczone strzałką); druga (biała) warstwa podkładu taśmy (pozostawiona na obrazie w celu lepszego zorientowania użytkownika) zostaje usunięta, a na krawędzi komory perfuzyjnej nakłada się żywicę epoksydową (strzałka). Uwaga: Aby ułatwić orientację w miejscu nakładania żywicy epoksydowej, na tym obrazie pozostawiono biały podkład. Oczyszczone i powlekane szkiełko podstawowe jest mocowane do komory obrazowania stroną powleczoną w stronę wnętrza otworu perfuzyjnego. (B) Schemat blokowy ilustrujący etapy przygotowania komór obrazowania do tworzenia wiązań biotyna-streptawidyna. (C) Przykłady reakcji wykorzystywanych do rejestracji filmów TIRF dynamicznych mikrotubul i filamentów aktynowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia polimeryzacji tubuliny i aktyny, schemat time-lapse, pokazujący efekt białka Tau, skala 25μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Sekwencje obrazów rosnących filamentów aktynowych i mikrotubul w obecności lub przy braku Tau. Montaż obrazów time-lapse z analiz TIRF zawierających 0,5 µM aktyny (10% Alexa-647-actin i 0,09% biotin-actin) oraz 15 µM wolnej tubuliny (4% HiLyte-488) przy braku (A) lub w obecności (B) 250 nM Tau. Przedstawiono czas upływający od rozpoczęcia reakcji (wymieszania probówki A i probówki B). Paski skali, 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Dynamika tubuliny i aktyny; schematy mikroskopii fluorescencyjnej; kymografy; analiza elongacji aktyny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3Przykładowe pomiary dynamiki mikrotubul i filamentów aktynowych. (A) Średnia projekcja czasowa kanału tubuliny pozwala na efektywną wizualizację całkowitej długości mikrotubul dla skanów liniowych użytych do wygenerowania wykresów kymograficznych. Czarne linie przerywane odpowiadają dwóm przykładowym kymografom dynamicznych mikrotubul przedstawionym po prawej stronie. Na każdym kymografie zaznaczono fazy wzrostu (ciągłe czarne linie) i rozpadu (różowe linie przerywane; dwie wskazane różowymi strzałkami) mikrotubul. Pasek skali czasu, 3 min. Pasek skali długości, 10 µmReakcja zawiera 0.5 µM aktyna (10% znakowanie 647) i 15 µM wolna tubulina (znakowanie 4% 488-HiLyte). Przedstawiono wyłącznie kanał tubuliny.(B) Dwa przykładowe montaże obrazów time-lapse przedstawiające aktywnie polimeryzujące pojedyncze filamenty aktyny. Szybkość elongacji oblicza się jako nachylenie wykresów długości filamentów aktyny w czasie na mikromol aktyny. W związku z tym należy zastosować współczynnik korekcyjny wynoszący dwa do 0.5 µM reakcje aktyny do porównania szybkości, zazwyczaj określanych w 1 µM stężenie aktyny. Przykłady z pięciu filamentów przedstawiono po prawej stronie. Paski skali, 10 µmReakcja zawiera 0.5 µM aktyna (10% znakowania 647) i 15 µM wolna tubulina (oznaczenie 4% 488-HiLyte). Przedstawiono tylko kanał aktyny. (C) obrazy TIRF dynamicznych mikrotubul (MT) (zielone) i filamentów aktynowych (fioletowe) polimeryzujących w obecności (środek) lub przy braku (lewo) 250 nM białka Tau. Niebieskie linie przerywane i strzałki wskazują miejsca wyznaczenia linii dla wykresów skanowania liniowego odpowiadających każdemu z warunków (poniżej każdego obrazu). Nakładanie się obszarów mikrotubul i aktyny (wykazane jako kolor czarny) może być oceniane w określonym punkcie czasowym na jednostkę powierzchni (prawo). Paski skali, 25 µmReakcje zawierają 0.5 µM aktyna (10% znakowana 647) i 15 µM wolna tubulina (znakowana 4% 488-HiLyte) z dodatkiem lub bez dodatku 250 nM Tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF) mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Pomimo wielu przykładów koordynacji, większość badań bada białka aktyny lub mikrotubul indywidualnie. Metoda ta pozwala na wizualizację obu dynamicznych polimerów w jednej reakcji. Technika ta pozwala użytkownikowi ocenić różne białka regulatorowe pod kątem właściwości emergentnych, które można było zaobserwować tylko w przypadku dynamicznych wersji aktyny i mikrotubul.Technikę tę można rozszerzyć o lipidy lub ekstrakty, aby zbliżyć się do budowy syntetycznej komórki. Zacznij od rozmrożenia porcji proszków PEG-Silane i Biotyna-PEG-Silane i rozpuszczenia proszków PEG w 80% etanolu, aby uzyskać roztwory podstawowe powłoki o stężeniu 10 miligramów na mililitr mPEG-Silane i od dwóch do czterech miligramów na mililitr Biotyna-PEG-Silan. Usuń czystą szkiełko nakrywkowe z magazynu etanolu za pomocą kleszczy.Osuszyć azotem gazowym i przechowywać na czystej szalce Petriego. Pokryj szkiełka nakrywkowe 100 mikrolitrami roztworu powlekającego i inkubuj je w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez co najmniej 18 godzin lub do momentu użycia. Wytnij 12 pasków dwustronnej taśmy dwustronnej z podwójnym podkładem na długość 24 milimetrów.Usuń jedną stronę podkładu taśmy i przymocuj kawałki taśmy przylegające do sześciu rowków znajdujących się w czystej komorze obrazowania. Usuń drugi kawałek podkładu taśmy, aby odsłonić lepką stronę taśmy wzdłuż każdego rowka komory, a następnie umieść taśmę komory stroną do góry na czystej powierzchni. Wymieszaj roztwory żywicy epoksydowej i utwardzacza jeden do jednego w małej łódce wagowej i użyj końcówki P1000, aby umieścić kroplę zmieszanej żywicy epoksydowej między paskami taśmy na końcu każdego rowka komory obrazowania.Następnie umieść komorę, taśmę lub stronę epoksydową do góry, na czystej powierzchni. Wyjąć powlekane szkiełko nakrywkowe z inkubatora o temperaturze 70 stopni Celsjusza i spłukać pokryte i niepowlekane powierzchnie szkiełek nakrywkowych wodą podwójnie destylowaną sześć razy. Osuszyć przefiltrowanym azotem gazowym, a następnie przymocować do komory obrazowania stroną z powłoką szkiełka nakrywkowego w kierunku taśmy.Użyj końcówki do pipet P200 lub P1000, aby wywrzeć nacisk na szklaną powierzchnię styku z taśmą, aby zapewnić dobre uszczelnienie między taśmą a szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować zmontowane komory w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć do 10 minut, aby żywica epoksydowa mogła całkowicie uszczelnić studzienki komory przed użyciem. Komory perfuzyjne tracą ważność w ciągu 12 do 18 godzin od montażu.Użyj pompy perfuzyjnej i sekwencyjnie wymieniaj roztwory kondycjonujące w komorze perfuzyjnej, przepływając 50 mikrolitrów 1% BSA, aby zalać komorę obrazowania. Usuń nadmiar bufora ze zbiornika mocującego blokadę przynęty. Następnie przelej 50 mikrolitrów po 0,005 miligrama na mililitr streptawidyny i inkubuj przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej.Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika. Przelej 50 mikrolitrów 1% BSA, aby zablokować niespecyficzne wiązanie i inkubować przez 10 do 30 sekund. Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika.Następnie przelej 50 mikrolitrów ciepłego buforu 1x TIRF, a następnie 50 mikrolitrów stabilizowanych i 50% biotynylowanych nasion mikrotubul rozcieńczonych w 1x buforze TIRF. Ustaw stage lub obiektyw grzewczy tak, aby utrzymywał temperaturę od 35 do 37 stopni Celsjusza przez 30 minut przed obrazowaniem pierwszej reakcji biochemicznej. Następnie ustaw interwał akwizycji co pięć sekund przez 15 do 20 minut.Następnie ustaw ekspozycje lasera 488 i 647 na 50 do 100 milisekund przy mocy od 5% do 10%, najpierw dostosowując reakcję polimeryzacji, aby zainicjować montaż filamentu aktynowego. Uzyskaj obrazy w 647 nanometrach i dokonaj odpowiednich korekt. Następnie dostosuj reakcję polimeryzacji w drugiej kondycjonowanej perfuzji, aby zainicjować montaż mikrotubul.Wizualizuj w 488 nanometrach i dokonaj odpowiednich korekt. Połączyć trzy mikrolitry 10 mikromolowej tubuliny 488 z 7,2 mikrolitrową podwielokrotnością 100 mikromolowej fluorescencyjnie nieznakowanej tubuliny nie później niż 15 minut przed użyciem. Następnie połącz trzy mikrolitry rozcieńczonej aktyny związanej z biotyną w odpowiednich objętościach fluorescencyjnie nieznakowanej i znakowanej aktyny tak, aby końcowa mieszanina wynosiła 12,5 mikromolowej całkowitej aktyny z 10% do 30% znacznikiem fluorescencyjnym.Przygotuj mieszaninę cytoszkieletu, łącząc dwa mikrolitry 12,5 mikromolowej mieszanki aktyny z mieszanką tubuliny nie później niż 15 minut przed obrazowaniem. Przechowywać na lodzie do czasu użycia. Przygotuj mieszankę reakcji białkowych, łącząc wszystkie inne eksperymentalne składniki i białka, w tym 2x bufor TIRF, anty wybielacz, nukleotydy, i białka pomocnicze.Mieszaninę cytoszkieletu i mieszaninę reakcji białkowej inkubować oddzielnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 sekund. Aby zainicjować reakcję, dodaj zawartość mieszanki reakcji białkowej do mieszanki cytoszkieletu i wymieszaj. Przepłynąć 50 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor TIRF uzupełniony 15 mikromolowymi wolnymi tubulinami, jednym milimolowym GTP, 0,5 mikromolowymi monomerami aktyny i odpowiednimi objętościami kontrolnych do komory perfuzyjnej.Nagraj film poklatkowy za pomocą oprogramowania mikroskopowego, aby rejestrować co pięć sekund przez 15 do 20 minut. Kondycjonować nową studzienkę perfuzyjną i zastąpić objętość buforu białkiem regulatorowym będącym przedmiotem zainteresowania i kontrolą buforu. Acquire w celu oceny białek regulatorowych dla pojawiających się funkcji mikrotubul aktyny.Przykładowe pomiary mikrotubul i dynamiki filamentu aktynowego pokazano na tych obrazach. Średnia projekcja czasowa kanału tubuliny skutecznie wizualizuje całkowite długości mikrotubul dla skanów liniowych używanych do generowania wykresów kimografu. Czarne przerywane linie odpowiadają dwóm przykładowym kymogramom dynamicznych mikrotubul.Fazy wzrostu i rozkładu mikrotubul są pokazane na każdym kimografie. Pokazano tutaj dwa przykładowe montaże obrazów poklatkowych przedstawiające aktywnie polimeryzujące pojedyncze filamenty aktynowe. Współczynniki wydłużenia oblicza się jako nachylenie wykresów długości włókien aktynowych w czasie na aktynę mikromolową.W związku z tym współczynnik korygujący dwa należy zastosować do reakcji aktyny 0,5 mikromolowej, aby porównać szybkości zwykle określane przy jednym stężeniu aktyny mikromolowej. Przykłady z pięciu filamentów są pokazane tutaj. Pokazano tutaj obrazy fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia lub TIRF dynamicznych mikrotubul we włóknach aktynowych polimeryzujących pod nieobecność lub w obecności 250 nanomolowych Tau.Niebieskie przerywane linie i strzałki oznaczają zużycie, dla wykresów skanowania linii została narysowana linia odpowiadająca każdemu warunkowi. Nakładanie się mikrotubul w regionach aktyny można ocenić w określonym punkcie czasowym na obszar. Białka cytoszkieletu, w szczególności aktyna, mikrotubule i ich regulatory są bardzo wrażliwe na cykle zamrażania/rozmrażania.Aby zapewnić spójność i sukces, używaj wysoce czystych i odpowiednio przechowywanych białek.

visualizing-actin-microtubule-coupling-dynamics-vitro-total-internal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

W tym filmie przeprowadzamy test ruchliwości in vitro, aby przeanalizować interakcje aktyna-miozyna. Ślizgający się ruch włókien aktynowych na unieruchomionych cząsteczkach miozyny jest wizualizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test odwróconej ruchliwości: technika in vitro do wizualizacji ruchu miozyny na unieruchomionych włóknach aktyny

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Ten protokół jest przewodnikiem do implementacji mikroskopii odbicia interferencyjnego na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym do bezznacznikowego, kontrastowego, szybkiego obrazowania mikrotubul przy użyciu testów powierzchni in vitro.

Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

Poznaj metodę wizualizacji dynamicznej aktyny i mikrotubul za pomocą mikroskopii TIRF. Technika umożliwia jednoczesną obserwację obu polimerów oraz badanie właściwości białek regulacyjnych.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Przeglądaj więcej filmów