Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Protokół ten zapewnia kliniczny model immunoterapii guzów litych oraz platformę badawczą do badania związku między komórkami nowotworowymi a infiltrującymi komórkami odpornościowymi. Ta komórkowa szczepionka przeciwnowotworowa jest wygodna, prosta w użyciu i może być łączona z innymi metodami terapeutycznymi, takimi jak blokada punktów kontrolnych, w celu uzyskania efektu addytywnego lub synergistycznego, który może skutkować silniejszą i wyższą odpornością nowotworową. W zademonstrowaniu procedury pomoże Ann Balancio, technik badawczy z mojego laboratorium.

Na początek posadź komórki czerniaka B16-F10 w IMDM, zawierające 10% nieaktywnego ciepła FBS, 2 milimolowe glutaminy, 1 milimolowy pirogronian sodu, 1 milimolowy MEM endogenne aminokwasy i 100 jednostek na mililitr penicyliny i streptomycyny. Utrzymuj linię komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą 5% dwutlenku węgla. Wysiewaj i zbieraj komórki B16-F10 zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.

Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć kolby raz PBS. Odessać PBS i dodać 5 mililitrów 0,25% trypsyny-EDTA, a następnie ostro postukać w krawędź kolby hodowlanej. Dodać 15 mililitrów pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę-EDTA i wlać zawartość kolby do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Umyj powierzchnię naczynia 10 mililitrami PBS i wlej do tej samej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować komórki przez 5 minut przy 200 RCF. Odrzucić supernatant i rozbić osad komórkowy, stukając palcem w dno probówki.

Dodaj zimne 10 mililitrów PBS i delikatnie odpipetuj zawiesinę komórek. Następnie ręcznie policz komórki za pomocą hemocytometru. Przed wstrzyknięciem należy trzymać komórki na lodzie.

Śródskórnie wszczepić 500 000 komórek komórek nowotworowych B16-F10 w 50 mikrolitrach zimnego PBS w lewym boku, za pomocą igły o rozmiarze 30. Dawka wszczepionych komórek nowotworowych B16-F10 może wymagać dostosowania w zakresie od 50 000 do 500 000 komórek w celu pomyślnego rozwoju guza. Po wdrożeniu należy mierzyć długość i szerokość guza trzy razy w tygodniu za pomocą elektronicznej suwmiarki cyfrowej.

Oblicz objętość guza i potraktuj myszy szczepionką przeciwnowotworową, gdy guzy osiągną rozmiar dwóch milimetrów, jak opisano w rękopisie tekstu. Za pomocą promiennika rentgenowskiego ustawionego na 160 kilowoltów i 25 miliamperów naświetlaj komórki 150 szarymi dawkami promieni gamma. Policz i sprawdź żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym przed wstrzyknięciem.

Śródskórnie wstrzyknąć myszom 1 milion napromieniowanych komórek B16-Flt3L w 50 mikrolitrach zimnego PBS na tym samym boku, co oryginalna implantacja guza. Około jednego centymetra od miejsca guza pierwotnego w 3, 6 i 9 dniu po początkowej implantacji komórek. Oznacz miejsca wstrzyknięcia szczepionki kolorowym pisakiem, aby odróżnić je od guza pierwotnego.

Jeśli początkowo wszczepiono 50 000 komórek B16-F10, zaleca się przeprowadzenie leczenia szczepionkowego w 8, 11 i 14 dniu. Chirurgicznie usunięto guz ze skórą z każdej uśpionej myszy i umieszczono go na 24-dołkowej płytce z 1 mililitrem 10% pożywki FBS RPMI 1640. Pokrój guzy na małe kawałki w dwóch mililitrach buforu wytrawiającego i inkubuj przez 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodaj 10 mililitrów pożywki 10% FBS RPMI 1640, aby zatrzymać trawienie. Przenieś komórki do sitka o średnicy 40 mikrometrów za pomocą 25-mililitrowej pipety serologicznej. Następnie użyj tłoka jednomililitrowej strzykawki, aby zmielić tkanki.

Odwirować komórki w temperaturze 500 RCF przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zawiesić osad w 5 mililitrach pożywki o gradientzie gęstości 40% w PBS rozcieńczonym do stężenia 1x. Powoli dodawać zawiesinę komórkową na wierzch 5 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości 80% zawierającej PBS.

Odwirować do komórek przy 325 RCF z niskim ustawieniem hamulca przez 23 minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ostrożnie zbierz warstwę leukocytów na granicy między pożywką o gradiencie gęstości 40% i 80% i przepuść ją przez sitko o gęstości 40 mikrometrów. Odwirować komórki w temperaturze 500 RCF przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Inkubować osad w dwóch mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodaj 10 mililitrów 10% pożywki FBS RPMI 1640, aby ugasić bufor do lizy RBC. Odwirować komórki w temperaturze 400 RCF przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Ponownie zawieś ogniwa w 0,5 mililitra 10% pożywki FBS RPMI 1640 i policz całkowitą liczbę ogniw przed użyciem do dalszej analizy. Zbierz śledzionę lub drenujące węzły chłonne jako kontrolę strategii bramkowania podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Postępuj zgodnie z metodą izolacji komórek opisaną w manuskrypcie tekstowym.

Widoczna kropka wszczepionych komórek B16-F10 była zwykle obserwowana na powierzchni skóry około trzech dni po implantacji guza. Myszy leczono szczepionką przeciwnowotworową trzy, sześć i dziewięć dni po tym, jak guzek guza osiągnął lub przekroczył rozmiar dwóch milimetrów. Znaczne zmniejszenie wzrostu guza zaobserwowano w grupie zaszczepionych myszy około dwóch tygodni po implantacji guza.

Komórki pobrane z warstwy leukocytów zawierały wiele komórek nowotworowych, co utrudniało łatwe określenie populacji limfocytów. W związku z tym splenocyty stosowano równolegle, do prawidłowego bramkowania wewnątrznowotworowych podzbiorów komórek odpornościowych w analizie cytometrii przepływowej. Strategie bramkowania CD103 dodatniego, CD11C dodatniego DC, CD8 dodatniego, CD4 dodatniego i Treg zostały wykreślone wraz z macierzą kompensacji.

Przedstawiono również reprezentatywne dane dotyczące pozyskanych kont i częstości występowania każdej populacji. Wewnątrznowotworowy CD103 dodatni, CD11C dodatni DC od szczepionych myszy, wykazywał znacznie podwyższoną ekspresję liganda kostymulującego CD86. Zaszczepione myszy wykazywały również wzrost naciekających nowotwór komórek CD8 dodatnich i CD4-dodatnich, Foxp3-ujemnych, a także CD8-dodatnich granzymów B i interferonu gamma CTL.

Zachowaj odpowiednią odległość między guzem pierwotnym a szczepionką przeciwnowotworową. Ta fizyczna separacja ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć potencjalnego zespolenia między dwoma implantami nowotworowymi.