Name: Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia komórkowego B16-F10 eksprymujących Flt3L. Ta metoda umożliwia badanie interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami odpornościowymi in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Stephenowi Schoenbergerowi za dostarczenie komórek B16-Flt3L oraz personelowi zakładu LJI do cytometrii zwierzęcej i przepływowej za doskonałe wsparcie.

Wszystkie myszy użyte w badaniu były utrzymywane i trzymane w wiwarium Instytutu Immunologii La Jolla (LJI) w określonych warunkach wolnych od patogenów, z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością. Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono na samicach myszy C57BL/6 w wieku 8-14 tygodni zgodnie z wytycznymi i protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Opieki nad Zwierzętami LJI.
1. Przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych do implantacji
<ol>
	<li>Hodowla komórek czerniaka B16-F10 w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco firmy Iscove (IMDM) zawierającej 10% inaktywowanego termicznie FBS, 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 1 mM aminokwasów endogennych MEM i po 100 U/ml penicyliny i streptomycyny. Utrzymuj linię komórkową w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .</li>
	<li>Wysiewaj 1,5-2 x 106 komórek B16-F10 w kolbie 175T i hoduj przez 2 dni. Zbieraj komórki, gdy są zlewające się w 75%-80%.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć kolbę raz PBS. Odessać PBS i dodać 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA, a następnie ostro postukać w krawędź kolby hodowlanej.</li>
	<li>Dodać 15 ml pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę-EDTA i wlać zawartość kolby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Umyj powierzchnię naczynia 10 ml PBS i wlej do tej samej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 200 x g. Odrzucić supernatant i rozbić osad komórkowy, stukając palcem w dno probówki.</li>
	<li>Dodać zimne 10 ml PBS i delikatnie odpipetować zawiesinę komórek, a następnie ręcznie policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Przed wstrzyknięciem należy trzymać komórki na lodzie.</li>
</ol>
2. Implantacja guza
<ol>
	<li>Myszy należy znieczulić gazem za pomocą 5% izofluranu przy natężeniu przepływu gazu 1,0 l na minutę w dygestorium. Zmień natężenie przepływu na dawkę podtrzymującą 2% izofluranu, gdy myszy są w pełni znieczulone. W przypadku tego protokołu znieczulenie zostało przeprowadzone przez lekarza weterynarii zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt.</li>
	<li>Ogolić włosy na lewym boku myszy i wysterylizować miejsce wstrzyknięcia za pomocą chusteczek nasączonych alkoholem. Śródskórnie (i.d.) wszczepić komórki nowotworowe B16-F10 w 5 x 105 komórek w 50 μL zimnego PBS w lewym boku za pomocą igły 30 G. 
	UWAGA: Dawka wszczepionych komórek nowotworowych B16-F10 może wymagać dostosowania w zakresie 0,5-5 x 105 komórek w celu pomyślnego rozwoju guza.</li>
	<li>Po implantacji należy mierzyć długość i szerokość guza trzy razy w tygodniu za pomocą elektronicznej suwmiarki cyfrowej. Oblicz objętość guza (mm3) za pomocą wzoru: 
	Objętość guza (mm3) = szerokość2 × długość × 0,5 
	Leczyć myszy szczepionką przeciwnowotworową, gdy guzy osiągną rozmiar ≥2 mm. 
	UWAGA: Guzy zwykle można zmierzyć w 3 dniu po implantacji 5 x 105 komórek nowotworowych. Szybsze tempo wzrostu guza B16-F10 zaobserwowano u samców myszy C57BL/6, Rag1-/- lub Rag2-/-γc-/-. Podobna obserwacja została opisana w innych badaniach8. Zaleca się utrzymanie stałej płci myszy. Należy jednak pamiętać, że NIH kładzie nacisk na płeć jako ważną zmienną biologiczną w badaniach biomedycznych.</li>
</ol>
3. Przygotowanie szczepionki i wstrzyknięcie komórek B16-F10 (B16-Flt3L) wykazujących ekspresję Flt3L
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki B16-Flt3L w DMEM zawierające 8% inaktywowanego termicznie FBS, 2 mM glutaminy i po 100 U/ml penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2.</li>
	<li>Wysiewać 1 x 106 komórek B16-Flt3L w kolbie 175T i hodować przez 2 dni. Zbierz komórki, gdy są zlewające się w 75%-80%, jak opisano w krokach od 1.3 do 1.6 i zawieś w 1 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Naświetlanie ogniw dawką promieniowania gamma 150 Gy za pomocą promiennika rentgenowskiego o napięciu 160 kV i ustawieniu parametrów 25 mA. Policz i sprawdź żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym przed wstrzyknięciem.</li>
	<li>Myszy należy znieczulić gazem zgodnie z wcześniejszym opisem i wysterylizować miejsce wstrzyknięcia za pomocą chusteczek nasączonych alkoholem. Śródskórnie wstrzyknąć myszom 1 x 106 napromieniowanych komórek B16-Flt3L w 50 μl zimnego PBS na tym samym boku, co pierwotna implantacja guza, ~ 1 cm od miejsca guza pierwotnego w dniach 3, 6 i 9 po początkowej implantacji komórek.</li>
	<li>Oznacz miejsca wstrzyknięcia szczepionki kolorowym pisakiem, aby odróżnić ją od guza pierwotnego. 
	UWAGA: Jeśli początkowo wszczepia się 0,5 x 105 komórek B16-F10, zaleca się przeprowadzenie leczenia szczepionką w dniach 8, 11 i 14.</li>
</ol>
4. Izolacja komórek odpornościowych wewnątrz nowotworu
<ol>
	<li>Ofiarować myszy za pomocą CO2 i zwichnięcia szyjki macicy w okapie wyciągowym pod koniec eksperymentu (w 15 dniu po implantacji guza; <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Chirurgicznie usuń guz ze skórą z każdej myszy i umieść go na 24-dołkowej płytce z 1 ml 10% pożywki FBS/RPMI-1640. Osusz guzy ręcznikiem papierowym przed ważeniem.</li>
	<li>Pokrój guzy na małe kawałki. Dodać 2 ml buforu wytrawiającego (100 μg/ml TL Liberazy i 200 μg/ml DNazy I w pożywce RPMI-1640) i inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj 10 ml 10% pożywki FBS/RPMI-1640, aby zatrzymać trawienie. Przenieść komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml i użyć tłoka strzykawki o pojemności 1 ml do rozdrobnienia tkanki na sitku do komórek o wielkości 40 μm.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 5 ml pożywki o 40% gradiencie gęstości w PBS, rozcieńczonej do stężenia 1x).</li>
	<li>Powoli dodawać zawiesinę komórkową na 5 ml pożywki o 80% specyficznej dla gradientu gęstości zawierającej PBS. Odwirować komórki przy 325 x g z niskim ustawieniem hamulca przez 23 minuty w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie zebrać warstwę leukocytów na granicy między 40% a 80% pożywką specyficzną dla gradientu gęstości i przepuścić ją przez sitko do komórek 40 μm. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Inkubować osad w 2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodać 10 ml 10% pożywki FBS/RPMI-1640, aby ugasić bufor do lizy RBC.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml 10% pożywki FBS/RPMI-1640 i policzyć całkowitą liczbę komórek przed użyciem do dalszej analizy. 
	UWAGA: Zbierz śledzionę lub dLN jako kontrolę dla strategii bramkowania podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Postępuj zgodnie z opisaną powyżej metodą izolacji komórek z następującymi zmianami: Użyj tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, aby zmielić tkankę na filtrze siatkowym 70 μm. Umyj tkankę 10% pożywką FBS/RPMI-1640, aby uzyskać zawiesiny jednokomórkowe. Lizuj RBC zgodnie z opisem.</li>
</ol>
5. Analiza cytometrii przepływowej
UWAGA: Komórki pobrane z warstwy leukocytów zawierają komórki odpornościowe i komórki nowotworowe. Zalecane są dwa niezależne panele barwiące.
<ol>
	<li>Barwienie powierzchni
	<ol>
		<li>Przenieś komórki do 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V. Przemyć komórki PBS i wybarwić je barwnikiem żywotności komórek (50-100 μl/dołek) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wybarwić markery powierzchniowe mieszanymi przeciwciałami (szczegółowe rozcieńczenie znajduje się w tabeli materiałów) w buforze FACS (1% FBS i 0,05% NaN3 w PBS) przez 30 minut na lodzie (50-100 μL/studzienkę).</li>
		<li>Odwirować komórki o sile 500 x g przez 5 minut i dwukrotnie przemyć je buforem FACS.</li>
		<li>Utrwalić komórki za pomocą buforu do utrwalania komórek (50-100 μl / studzienka) przez 35 minut na lodzie. Odwirować komórki o stężeniu 500 x g przez 5 minut i dwukrotnie przepłukać je buforem FACS.</li>
		<li>Przechowywać próbki w buforze FACS (150-200 μl/probówkę) w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem. Pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego. W przypadku populacji komórek DC i T postępuj zgodnie ze strategiami bramkowania podanymi w Rysunek 2B i <silna klasa="xfig">Rysunek 3A. 
		UWAGA: Do barwienia mieloidalnych DC zaleca się inkubację FC-blokera (szczurzy anty-mysz CD16/CD32) przez 15 minut na lodzie przed inkubacją przeciwciał powierzchniowych (krok 5.1.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza cytokin po restymulacji ex vivo
	<ol>
		<li>Umieść komórki w kompletnym pożywce (RPMI-1640 uzupełniony 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7,2-7,6, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i streptomycyny, 50 μM 2-merkaptoetanolu i 2 mM L-glutaminy) i stymulować 50 ng/ml PMA plus 1 μM jonomycyny w obecności inhibitora transportu białek przez 4 godziny w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .</li>
		<li>Wykonaj barwienie powierzchni dla markerów powierzchniowych zgodnie z powyższym opisem w kroku 5.1.</li>
		<li>Dodać roztwór permeabilizacyjny (50-100 μl/studzienkę) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu barwienia wewnątrzkomórkowego. Inkubować komórki z przeciwciałami specyficznymi dla cytokin lub białek jądrowych w roztworze przepuszczalnym (50-100 μl/basenik) przez 60 minut na lodzie lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować komórki o sile 500 x g przez 5 minut i dwukrotnie przemyć je buforem FACS. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem. Pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego. 
		UWAGA: W razie potrzeby może być konieczne dostosowanie rozcieńczenia przeciwciał w celu uzyskania optymalnego barwienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+advances+in+cancer+immunotherapy%3A+understanding+the+characteristics+of+tumor-infiltrating+immune+cells+and+their+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications.</a> Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+cytotoxic+lymphocytes+kill+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells.</a> Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).</li>
<li>Maraskovsky, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+increase+in+the+numbers+of+functionally+mature+dendritic+cells+in+Flt3+ligand-treated+mice%3A+multiple+dendritic+cell+subpopulations+identified%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified.</a> Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).</li>
<li>Talmadge, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral%2C+injection+of+adenoviral+Flt3+ligand+has+therapeutic+activity+in+association+with+increased+intratumoral+levels+of+T+cells+but+not+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells.</a> Blood. 104 (11), 5280(2004).</li>
<li>Curran, M. A., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vaccines+expressing+flt3+ligand+synergize+with+ctla-4+blockade+to+reject+preimplanted+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors.</a> American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).</li>
<li>Simon, S. R., Ershler, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+influences+on+growth+of+B16+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).</li>
<li>Broz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+tumor+myeloid+compartment+reveals+rare+activating+antigen-presenting+cells+critical+for+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity.</a> Cancer Cell. 26 (6), 938(2014).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+activation+of+CD103%28%2B%29+dendritic+cell+progenitors+at+the+tumor+site+enhances+tumor+responses+to+therapeutic+PD-L1+and+BRAF+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li>
<li>Liu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+Treg-intrinsic+CTLA4-PKCeta+signaling+pathway+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+Cancer%22%5BJournal%5D)">Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792(2021).</li>
<li>Kong, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-eta+controls+CTLA-4-mediated+regulatory+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function.</a> Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół oparty jest na badaniu przeprowadzonym przez grupę Allison. Wykazali, że połączenie szczepionki B16-Flt3L z blokadą CTLA-4 wykazało synergiczny wpływ na wskaźnik przeżycia i wzrost guza, podczas gdy u myszy otrzymującychsamą szczepionkę B16-Flt3L lub leczenie przeciwciałami anty-CTLA-4 nie zaobserwowano zmniejszenia wzrostu nowotworu7. Ostatnie badania ujawniły nowy szlak sygnałowy CTLA4-PKCη inherentny Treg, który odgrywa ważną obowiązkową rolę w regulacji zależnej od konta...

Immunoterapia nowotworów została uznana za obiecującą strategię terapeutyczną opartą na mniej toksycznych skutkach ubocznych i trwalszych reakcjach. Opracowano kilka rodzajów immunoterapii, w tym terapie wirusami onkolitycznymi, szczepionki przeciwnowotworowe, terapie cytokinowe, przeciwciała monoklonalne, adoptywny transfer komórek (komórki CAR-T lub CAR-NK) oraz blokadę immunologicznego punktu kontrolnego1.
Dla szczepionek przeciwnowotworowych istnieją różne formy szczepionek terapeutycznych, takie jak szczepionki oparte na całych komórkach, szczepionki białkowe lub peptydowe oraz szczepionki RNA lub DNA. Szczepienie opiera się na zdolności komórek prezentujących antygen (APC) do przetwarzania antygenów nowotworowych, w tym antygenów specyficznych dla nowotworu, i prezentowania ich w formie immunogennej limfocytom T. Komórki dendrytyczne (DC) są znane jako najsilniejsze APC i uważa się, że odgrywają ważną rolę w odporności przeciwnowotworowej2,3. Komórki te pobierają i przetwarzają antygeny nowotworowe, a następnie migrują do drenujących węzłów chłonnych (dLN) w celu przygotowania i aktywacji specyficznych dla nowotworu komórek efektorowych T (Teff) poprzez zaangażowanie receptora komórek T (TCR) i cząsteczek kostymulujących. Powoduje to różnicowanie i ekspansję cytotoksycznych limfocytów T specyficznych dla nowotworu (CTL), które infiltrują guz i zabijają komórki nowotworowe4. W związku z tym aktywacja i dojrzewanie DC stanowią atrakcyjne strategie stymulowania odporności na antygeny nowotworowe.
Flt3L jest znany z promowania dojrzewania i ekspansji funkcjonalnie dojrzałych DC, które wyrażają białka MHC klasy II, CD11c, DEC205 i CD865. Wykazano, że doguzowe, ale nie dożylne, podawanie wektora adenowirusowego zawierającego gen Flt3L (Adv-Flt3L) promuje immunologiczną aktywność terapeutyczną przeciwko nowotworom ortrotopowym6. Flt3L jest również stosowany w szczepionkach opartych na komórkach nowotworowych składających się z napromieniowanych komórek B16-F10 o stabilnej ekspresji transdukowanego retrowirusowo Flt3L jako sposób na zwiększenie krzyżowej prezentacji antygenów nowotworowych przez DC, a tym samym zwiększenie odpowiedzi przeciwnowotworowych. Opisany tutaj protokół szczepienia przeciw nowotworom B16-Flt3L opiera się na badaniu opublikowanym przez grupę dr Jamesa Allisona 7. W tym artykule poinformowali, że szczepionka B16-Flt3L w połączeniu z blokadą CTLA-4 synergistycznie indukowała odrzucenie ustalonego czerniaka, co skutkowało zwiększeniem przeżycia.
Celem tego protokołu jest dostarczenie przedklinicznego modelu immunoterapii czerniaka. Tutaj opisano szczegółowe procedury przygotowania i wszczepienia szczepionek przeciwnowotworowych oraz jak analizować skład i funkcję wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych z guza litego.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10% inaktywowany termicznie FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02&nbsp;</td><td>Działka# 209018</td></tr><tr><td>Igła 30G</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka dolna w kształcie litery V</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3926.500</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa B16 eksprymująca ligand kinazy tyrozynowej 3 podobny do FMS (B16-Flt3L)</td><td>Prezent dr Stephena Schoenbergera, LJI&nbsp;</td><td></td><td>CDNA Flt3L sklonowano do wektora retrowirusowego pMG-Lyt2, jak w odniesieniu 5, Rysunek uzupełniający 1</td></tr><tr><td>Linie komórkowe B16-F10 Wirówka</td><td>ATCC</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>5810R</td><td>Bufor</td> utrwalający Eppendorf <td></td><td></td></tr><tr><td>Cytofix&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB554655</td><td>Bufor do utrwalania komórek (4,2% PFA)&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw Cytofix/Cytoperm&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Zestaw roztworów do utrwalania/permeabilizacji</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium&nbsp; (DMEM)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczna suwmiarka cyfrowa</td><td>Fisherbrand</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo&nbsp;</td><td>Analiza danych cytometru Tree</td> <td>Star</td><td></td> Flow</tr><tr><td>GolgiStop (inhibitor transportu białek)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>rozcieńczenie 1:1500</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycyna</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s zmodyfikowany Dulbecco" s medium (IMDM)</td><td>Cytometry Thermo Fisher</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>LSR-II&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cytometr przepływowy</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>penicylina i streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GE17-0891-02</td> gradient <td>gęstości specyficzny dla medium</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący czerwone krwinki Hybri-Max płyn Sigma</td><td></td><td>R7757-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 średni</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RS2000 Naświetlacz</td> rentgenowski <td>Rad Source Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td> <td>soduGibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Sitko sterylne 40 &mu; m</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitko do komórek 70 &mu; m</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>TL Liberase</td><td>Roche</td><td>477530</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do naprawy żywotności Zombie Aqua</td><td>Przeciwciała BioLegend</td><td>423101</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mCD45</td><td>BioLegend</td><td>103135</td><td>Klon: 30-F11 Fluorofor: BV570 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td></td> Anty-mCD3&epsilon;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioLegend</td><td>100327</td><td>Klon: 145-2C11 Fluorofor: PerCP-Cy5.5 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Anty-mCD8</td><td>BioLegend</td><td>100730 100724</td><td>Klon: 53-6,7 Fluorofor: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Anty-mCD4</td><td>BioLegend</td><td>100414</td><td>Klon: GK1,5 Fluorofor: APC-Cy7 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Anty-mFoxp3</td><td>Thermo Fisher Scientific 11577382</td><td></td><td>Klon: FJK-16s Fluorofor: FITC Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Anty-m/hGzmB</td><td>BioLegend</td><td>372208</td><td>Klon: QA16A02 Fluorofor: PE Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Anty-mIFNg</td><td>BioLegend</td><td>505826</td><td>Klon: XMG1.2 Fluorofor: PE-Cy7 Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Anty-mCD19</td><td>BioLegend</td><td>115543</td><td>Klon: 6D5 Fluorofor: BV785 Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Anty-mGr1</td><td>BioLegend</td><td>108423</td><td>Klon: RB6-8C5 Fluorofor: APC/Cy7 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Anty-mCD11b</td><td>BioLegend</td><td>101223</td><td>Klon: M1/70 Fluorofor: Pacyficzny niebieski Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Anty-mF4/80</td><td>BioLegend</td><td>123114</td><td>Klon: BM8 Fluorofor: PECy7 Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Anty-mCD11c</td><td>BioLegend</td><td>117328</td><td>Klon: N418 Fluorofor: PerCP Cy5,5 Rozcieńczenie: 1:100</td></tr><tr><td>Anty-mMHCII</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td>Klon: M5/114.15.2 Fluorofor: AF700 Rozcieńczenie: 1:400</td></tr><tr><td>Anty-mCD103</td><td>BioLegend</td><td>121410</td><td>Klon: 2E7 Fluorofor: Alexa Fluor 647 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>Anty-mCD86</td><td>BioLegend</td><td>105007</td><td>Klon: GL-1 Fluorofor: PE Rozcieńczenie: 1:200</td></tr><tr><td>FC-bloker (szczurzy anty-mysz CD16/CD32)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>Klon: 2.4G2 Rozcieńczenie: 1:200</td></tr></tbody></table>

eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Experimental Melanoma Immunotherapy Model Using Tumor Vaccination with a Hematopoietic Cytokine

Ligand kinazy tyrozynowej 3 podobny do FMS (Flt3L) jest cytokiną krwiotwórczą, która wspomaga przeżycie i różnicowanie komórek dendrytycznych (DC). Jest stosowany w szczepionkach przeciwnowotworowych w celu aktywacji odporności wrodzonej i wzmocnienia odpowiedzi przeciwnowotworowych. Protokół ten przedstawia model terapeutyczny z wykorzystaniem komórkowej szczepionki przeciwnowotworowej składającej się z komórek czerniaka B16-F10 wykazujących ekspresję Flt3L wraz z analizą fenotypową i funkcjonalną komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza (TME). Opisano procedury przygotowania hodowlanych komórek nowotworowych, implantacji guza, napromieniania komórek, pomiaru wielkości guza, wewnątrznowotworowej izolacji komórek odpornościowych i analizy cytometrii przepływowej. Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie przedklinicznego modelu immunoterapii guzów litych oraz platformy badawczej do badania związku między komórkami nowotworowymi a infiltrującymi komórkami odpornościowymi. Opisany tutaj protokół immunoterapii można łączyć z innymi metodami terapeutycznymi, takimi jak blokada immunologicznych punktów kontrolnych (przeciwciała anty-CTLA-4, anty-PD-1, anty-PD-L1) lub chemioterapia w celu poprawy efektu terapeutycznego czerniaka w przypadku raka.

Widoczna czarna kropka z zaimplantowanych komórek B16-F10 jest zazwyczaj obserwowana na powierzchni skóry około 3 dni po implantacji guza. Myszy są poddawane leczeniu szczepionką przeciwnowotworową w 3., 6. i 9. dniu po tym, jak guzek nowotworowy osiągnie rozmiar ≥2 mm. Zaobserwowano istotne zahamowanie wzrostu guza w grupie myszy zaszczepionych około 2 tygodnie po implantacji guza (Rysunek 1). Na koniec eksperymentu wyizolowano komórki odpornościowe z wnętrza guza i przeanalizowano ich licz...

Protokół przedstawia model immunoterapii nowotworów za pomocą komórkowego szczepienia guza z ekspresją Flt3L czerniaka B16-F10. Protokół ten demonstruje procedury, w tym przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych, implantację guza, napromienianie komórek, pomiar wzrostu guza, izolację wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych i analizę cytometrii przepływowej.

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) is a hematopoietic cytokine that promotes the survival and differentiation of dendritic cells (DCs). It has been ...

Protokół ten zapewnia kliniczny model immunoterapii guzów litych oraz platformę badawczą do badania związku między komórkami nowotworowymi a infiltrującymi komórkami odpornościowymi. Ta komórkowa szczepionka przeciwnowotworowa jest wygodna, prosta w użyciu i może być łączona z innymi metodami terapeutycznymi, takimi jak blokada punktów kontrolnych, w celu uzyskania efektu addytywnego lub synergistycznego, który może skutkować silniejszą i wyższą odpornością nowotworową. W zademonstrowaniu procedury pomoże Ann Balancio, technik badawczy z mojego laboratorium.Na początek posadź komórki czerniaka B16-F10 w IMDM, zawierające 10% nieaktywnego ciepła FBS, 2 milimolowe glutaminy, 1 milimolowy pirogronian sodu, 1 milimolowy MEM endogenne aminokwasy i 100 jednostek na mililitr penicyliny i streptomycyny. Utrzymuj linię komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą 5% dwutlenku węgla. Wysiewaj i zbieraj komórki B16-F10 zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.Usunąć pożywkę hodowlaną i przemyć kolby raz PBS. Odessać PBS i dodać 5 mililitrów 0,25% trypsyny-EDTA, a następnie ostro postukać w krawędź kolby hodowlanej. Dodać 15 mililitrów pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę-EDTA i wlać zawartość kolby do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Umyj powierzchnię naczynia 10 mililitrami PBS i wlej do tej samej 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować komórki przez 5 minut przy 200 RCF. Odrzucić supernatant i rozbić osad komórkowy, stukając palcem w dno probówki.Dodaj zimne 10 mililitrów PBS i delikatnie odpipetuj zawiesinę komórek. Następnie ręcznie policz komórki za pomocą hemocytometru. Przed wstrzyknięciem należy trzymać komórki na lodzie.Śródskórnie wszczepić 500 000 komórek komórek nowotworowych B16-F10 w 50 mikrolitrach zimnego PBS w lewym boku, za pomocą igły o rozmiarze 30. Dawka wszczepionych komórek nowotworowych B16-F10 może wymagać dostosowania w zakresie od 50 000 do 500 000 komórek w celu pomyślnego rozwoju guza. Po wdrożeniu należy mierzyć długość i szerokość guza trzy razy w tygodniu za pomocą elektronicznej suwmiarki cyfrowej.Oblicz objętość guza i potraktuj myszy szczepionką przeciwnowotworową, gdy guzy osiągną rozmiar dwóch milimetrów, jak opisano w rękopisie tekstu. Za pomocą promiennika rentgenowskiego ustawionego na 160 kilowoltów i 25 miliamperów naświetlaj komórki 150 szarymi dawkami promieni gamma. Policz i sprawdź żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym przed wstrzyknięciem.Śródskórnie wstrzyknąć myszom 1 milion napromieniowanych komórek B16-Flt3L w 50 mikrolitrach zimnego PBS na tym samym boku, co oryginalna implantacja guza. Około jednego centymetra od miejsca guza pierwotnego w 3, 6 i 9 dniu po początkowej implantacji komórek. Oznacz miejsca wstrzyknięcia szczepionki kolorowym pisakiem, aby odróżnić je od guza pierwotnego.Jeśli początkowo wszczepiono 50 000 komórek B16-F10, zaleca się przeprowadzenie leczenia szczepionkowego w 8, 11 i 14 dniu. Chirurgicznie usunięto guz ze skórą z każdej uśpionej myszy i umieszczono go na 24-dołkowej płytce z 1 mililitrem 10% pożywki FBS RPMI 1640. Pokrój guzy na małe kawałki w dwóch mililitrach buforu wytrawiającego i inkubuj przez 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Dodaj 10 mililitrów pożywki 10% FBS RPMI 1640, aby zatrzymać trawienie. Przenieś komórki do sitka o średnicy 40 mikrometrów za pomocą 25-mililitrowej pipety serologicznej. Następnie użyj tłoka jednomililitrowej strzykawki, aby zmielić tkanki.Odwirować komórki w temperaturze 500 RCF przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zawiesić osad w 5 mililitrach pożywki o gradientzie gęstości 40% w PBS rozcieńczonym do stężenia 1x. Powoli dodawać zawiesinę komórkową na wierzch 5 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości 80% zawierającej PBS.Odwirować do komórek przy 325 RCF z niskim ustawieniem hamulca przez 23 minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ostrożnie zbierz warstwę leukocytów na granicy między pożywką o gradiencie gęstości 40% i 80% i przepuść ją przez sitko o gęstości 40 mikrometrów. Odwirować komórki w temperaturze 500 RCF przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Inkubować osad w dwóch mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodaj 10 mililitrów 10% pożywki FBS RPMI 1640, aby ugasić bufor do lizy RBC. Odwirować komórki w temperaturze 400 RCF przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Ponownie zawieś ogniwa w 0,5 mililitra 10% pożywki FBS RPMI 1640 i policz całkowitą liczbę ogniw przed użyciem do dalszej analizy. Zbierz śledzionę lub drenujące węzły chłonne jako kontrolę strategii bramkowania podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Postępuj zgodnie z metodą izolacji komórek opisaną w manuskrypcie tekstowym.Widoczna kropka wszczepionych komórek B16-F10 była zwykle obserwowana na powierzchni skóry około trzech dni po implantacji guza. Myszy leczono szczepionką przeciwnowotworową trzy, sześć i dziewięć dni po tym, jak guzek guza osiągnął lub przekroczył rozmiar dwóch milimetrów. Znaczne zmniejszenie wzrostu guza zaobserwowano w grupie zaszczepionych myszy około dwóch tygodni po implantacji guza.Komórki pobrane z warstwy leukocytów zawierały wiele komórek nowotworowych, co utrudniało łatwe określenie populacji limfocytów. W związku z tym splenocyty stosowano równolegle, do prawidłowego bramkowania wewnątrznowotworowych podzbiorów komórek odpornościowych w analizie cytometrii przepływowej. Strategie bramkowania CD103 dodatniego, CD11C dodatniego DC, CD8 dodatniego, CD4 dodatniego i Treg zostały wykreślone wraz z macierzą kompensacji.Przedstawiono również reprezentatywne dane dotyczące pozyskanych kont i częstości występowania każdej populacji. Wewnątrznowotworowy CD103 dodatni, CD11C dodatni DC od szczepionych myszy, wykazywał znacznie podwyższoną ekspresję liganda kostymulującego CD86. Zaszczepione myszy wykazywały również wzrost naciekających nowotwór komórek CD8 dodatnich i CD4-dodatnich, Foxp3-ujemnych, a także CD8-dodatnich granzymów B i interferonu gamma CTL.Zachowaj odpowiednią odległość między guzem pierwotnym a szczepionką przeciwnowotworową. Ta fizyczna separacja ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć potencjalnego zespolenia między dwoma implantami nowotworowymi.

experimental-melanoma-immunotherapy-model-using-tumor-vaccination

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie komórki czerniaka pochodzenia ludzkiego są wszczepiane podskórnie w obszar boczny myszy z obniżoną odpornością. Model PDX umożliwia przedkliniczne badanie komórek czerniaka, które lepiej oddaje niejednorodność guza i agresywność czerniaka obserwowane w warunkach in vivo.

Modelowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta: technika generowania mysich modeli czerniaka

Ten film demonstruje test szczepienia nowotworów na bazie komórek. Mysz, której śródskórnie wstrzyknięto komórki czerniaka B16-F10 w celu powstania guza, jest szczepiona komórkami B16-F10 wydzielającymi cytokinę Flt3L w pobliżu rozwiniętego guza. Wydzielany Flt3L ze szczepionki wspomaga dojrzewanie i proliferację komórek dendrytycznych, które następnie prezentują antygeny nowotworowe limfocytom T w węzłach chłonnych, wywołując ukierunkowaną przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną.

Implantacja guza i wstrzyknięcie szczepionki przeciwnowotworowej w modelu mysim

Oceniane na syngenetycznych immunokompetentnych gospodarzach, szczepionka z komórek dendrytycznych (DC) na bazie nowotworowych komórek macierzystych (CSC) wykazała znacznie wyższą odporność przeciwnowotworową niż tradycyjne szczepionki DC pulsujące z heterogenicznymi komórkami nowotworowymi.

Opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego

Profilaktyczne i terapeutyczne szczepienia często nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej z powodu tygodniowego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, a w konsekwencji słabego zaangażowania komórek odpornościowych. Poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, tzw. wstrzyknięcie dolimfatyczne, można znacznie poprawić skuteczność szczepionki i zmniejszyć dawki szczepionki.

Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Urządzenie lub płytka do transimmunizacji (TI) i związane z nim protokoły zostały opracowane w celu odtworzenia kluczowych cech pozaustrojowej fotochemoterapii (ECP), w warunkach eksperymentalnych, pozwalając na produkcję fizjologicznie aktywowanych, przestrajalnych komórek dendrytycznych (DC) do immunoterapii raka.

Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Modele ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) bardziej solidnie rekapitulują molekularne i biologiczne cechy czerniaka i są bardziej predykcyjne dla odpowiedzi na terapię w porównaniu do tradycyjnych testów opartych na hodowli tkanek plastycznych. W tym miejscu opisujemy nasz standardowy protokół operacyjny do tworzenia nowych modeli PDX oraz charakteryzacji/eksperymentowania z istniejącymi modelami PDX.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Tutaj prezentujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem poprzez hodowlę oddzielonych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek czerniaka. Organoidy te wiernie odwzorowują specyficzne dla pacjenta nowotwory in vitro, oferując innowacyjne podejście do badania mechanizmów immunosupresyjnych nowotworów, badań przesiewowych leków, mechanizmów oporności na leki i podejść do nadzoru nad rakiem.

Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Wraz ze wzrostem zainteresowania immunoterapią wnętrznowrzodową, wybór modeli nowotworów, które są dostępne i praktyczne, jest niezbędny. Guzy podskórne są łatwe do ustanowienia, ale trudne do wizualizowania i manipulowania. W tym protokole opisujemy metody generowania guzów śródskórnych, które zapewniają lepszą widoczność i dostępność.

Wszczepienie nowotworu śródskórnego jako solidny model badań nad immunoterapią guzów mysich wewnątrzguzikowych

Poznaj model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia komórkowego B16-F10 eksprymujących Flt3L. Ta metoda umożliwia badanie interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami odpornościowymi in vivo.

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Przeglądaj więcej filmów