Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych
28 lipca 2022
Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.
Protokół ten poprowadzi osoby pracujące nad białkami wiążącymi błonę w celu określenia, w jaki sposób kształt błony odgrywa rolę w organizacji zespołów białek. Podstawową zaletą tej techniki jest jej wszechstronność w zakresie rodzaju białka, składu błony i geometrii błony. Pozwala również na zbadanie, w jaki sposób dwuwarstwa lipidowa może zmieniać właściwości powiązanych białek.
Aby zidentyfikować dobrą błonę do eksperymentu, sugerujemy ustalenie listy kontrolnej, która może obejmować szybkość dyfuzji lipidów, ruchliwość białka będącego przedmiotem zainteresowania oraz to, czy do powierzchni przyklejone są liposomy niepęknięte lub stopione liposomy. Aby rozpocząć czyszczenie plazmowe szkiełek, należy przepłukać czyszczalnię plazmową przez pięć minut tlenem, aby usunąć powietrze z przewodów i komory. Ułóż suche szkiełka nakrywkowe w ceramicznej kołysce.
Podczas przedmuchiwania rozpylaj gaz obojętny na szkiełka z mikro pokrywy, aby usunąć kurz i cząstki stałe. Umieść kołyskę z tyłu komory plazmowej tak, aby szkiełka nakrywkowe były równoległe do dłuższej krawędzi komory. Uruchom myjkę plazmową na 15 minut z tlenem o maksymalnej mocy.
W celu przygotowania komory odetnij nakrętkę tuż pod oszronioną częścią 0,2 mililitrowej probówki do PCR. Pomaluj krawędź probówki do PCR klejem aktywowanym promieniami UV, omijając wnętrze probówki. Delikatnie umieść klej w tubie PCR na środku oczyszczonego plazmowo szkiełka nakrywkowego, a następnie umieść komorę w świetle UV o dużej długości fali na pięć do siedmiu minut, aby utwardzić klej.
Aby utworzyć dwuwarstwę, dodaj odczynniki do studzienki. Delikatnie potrząśnij komorami z boku na bok, aby zakłócić pracę SUV-ów, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji przepłukać dwuwarstwę sześciokrotnie 150 mikrolitrami SLBB przez pipetowanie w celu zmycia nadmiaru lipidów, a następnie przepłukać dwuwarstwę sześciokrotnie 150 mikrolitrami buforu reakcyjnego przed inkubacją z septynami.
Na ostatnim etapie płukania usuń bufor reakcyjny, pozostawiając w studzience 75 mikrolitrów. Dodać 25 mikrolitrów septyn rozcieńczonych w SSB i zobrazować za pomocą mikroskopii TIRF. Najpierw wiruj butelkę zawierającą mikrosfery krzemionki przez 15 sekund, następnie zanurz się w sonikacji przez minutę i ponownie wiruj przez 15 sekund, aby rozbić wszelkie skupiska.
Wymieszaj kulki z SLBB i 10 mikrolitrami pięciu milimolowych SUV-ów w probówce do mikrowirówek o niskiej przyczepności. Inkubuj mieszaninę lipidów perełkowych przez godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce, aby zapobiec sedymentacji. W międzyczasie rozmrozić pegylowane szkiełko nakrywkowe i przyklej do niego wyciętą 0,2 mililitrową probówkę PCR.
Po inkubacji odwirować kulki przez 30 sekund w wyznaczonym RCF. Po pierwszym wirowaniu usunąć 50 mikrolitrów supernatantu, następnie dodać 200 mikrolitrów PRB i wymieszać energicznie pipetując. W następnych rundach usuń 200 mikrolitrów PRB i dodaj kolejne 200 mikrolitrów po drugim i trzecim wirowaniu oraz dodaj 220 mikrolitrów PRB po czwartym wirowaniu.
Jeśli wykonujesz test konkurencji z wieloma rozmiarami kulek, przygotuj reakcję, mieszając równe objętości każdego rozmiaru kulki i rozcieńczając 29 mikrolitrów tej mieszaniny kulek 721 mikrolitrami buforu reakcyjnego, a następnie dodaj 75 mikrolitrów rozcieńczonych kulek i 25 mikrolitrów białka rozcieńczonego w SSB do studzienek i wymieszaj. W przypadku pomiaru septyn w stanie ustalonym, inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez godzinę, a następnie zobrazuj za pomocą TIRF lub mikroskopii konfokalnej. Mikrofotografie TIRF płaskich SLB inkubowanych z septynami, pokazane na zielono, wykazały jednorodny rozkład białek.
SLB wykonane ze słabo oczyszczonych szklanych szkiełek nakrywkowych wykazywały lub przerwy w dwuwarstwie w obszarach o niskiej septynie. Niepęknięte i rurkowate liposomy mogą gromadzić się na powierzchni, jeśli używane są stare liposomy lub jeśli mycie nie jest rygorystyczne. Na mikrofotografiach mikrosfer pokrytych lipidami uwidocznionych za pomocą rodaminy PE wykazano płynne osadzanie się dwuwarstwowe.
Kuliste podpory były równomiernie pokryte membraną i było kilka skupisk koralików. Niedostateczne wypłukanie nadmiaru lipidów spowodowało nierówną powłokę błony, co zaobserwowano w grudkach lipidów, a niewłaściwe obchodzenie się z nim spowodowało powstania luk w dwuwarstwie. Niewystarczające wymieszanie kulek powodowało zbrylanie się, co nie jest idealne do pomiaru całkowitego wchłaniania białka.
Korzystając z przedstawionych tutaj podpartych dwuwarstw lipidowych, można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji, cytometria masowa błon i szybka mikroskopia sił atomowych w celu zbadania różnej dynamiki białko-białko lub białko-błona.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół instruuje badaczy, w jaki sposób kształt błony wpływa na organizację kompleksów białkowych, ze szczególnym uwzględnieniem białek wiążących błony. Podkreśla on wszechstronność tej techniki w odniesieniu do różnych typów białek i geometrii błon.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biofizyka
Wstęp
- Rekonstytucja bezkomórkowa jest niezbędna do zrozumienia procesu montażu cytoszkieletu.
- Ostatnie postępy usprawniły badanie dynamiki septyn.
- Różne konteksty błonowe mogą wpływać na montaż białek.
- Skład i geometria błony są kluczowe dla projektu eksperymentalnego.
Cel badania
- Określenie wpływu kształtu błony na montaż białek.
- Opracowanie listy kontrolnej w celu wyboru odpowiednich błon do eksperymentów.
- Zbadanie, w jaki sposób dwuwarstwy lipidowe wpływają na właściwości powiązanych z nimi białek.
Zastosowane metody
- Ocena szybkości dyfuzji lipidów.
- Ocena mobilności białek.
- Czyszczenie szkiełek w osoczu plazmy w celu optymalnego przygotowania powierzchni.
- Wykorzystanie różnych geometrii błon w eksperymentach.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano kluczowe czynniki przy wyborze membran w badaniach nad białkami.
- Wykazano wszechstronność techniki w różnych kontekstach.
- Pokazano, w jaki sposób kształt membrany wpływa na organizację białek.
- Przedstawiono spostrzeżenia dotyczące oddziaływań dwuwarstwy lipidowej z białkami.
Wnioski
- Kształt błony jest krytycznym czynnikiem w organizacji montażu białek.
- Protokół oferuje elastyczne podejście dla różnych konfiguracji eksperymentalnych.
- Zrozumienie tej dynamiki może usprawnić badania w dziedzinie biologii komórki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rekonstytucja montażu septyn w błonach umożliwia precyzyjną analizę dynamiki białek cytoszkieletu, pokonując ograniczenia obrazowania in vivo oraz złożoność komórkową. Podejście to zapewnia badaniom z zakresu biofarmaceutyki R&Zespoły dysponujące ilościowymi, wysokorozdzielczymi wglądami w oddziaływania białkowo-błonowe, kluczowe dla regulacji kształtu komórek oraz mechanistycznego ograniczania ryzyka. Takie możliwości wspierają pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania i ułatwiają dostosowane do ryzyka opracowywanie celów cytoszkieletowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach biofarmaceutycznych&D
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę oddziaływań septyn z błonami oraz mechanizmów ich składania.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez izolację wpływu krzywizny błony na organizację białek.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie ścieżek składania i parametrów biofizycznych.
- Zapewnia pewność prognostyczną przy ustalaniu priorytetów dla celów cytoszkieletowych w procesie odkrywania leków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy błonowe do powtarzalnych testów montażu białek.
- Umożliwia standaryzację ilościowych odczytów, takich jak adsorpcja białek i detekcja krzywizny.
- Wspiera skalowalne formaty testów z wykorzystaniem płaskich, sferycznych i prętowych geometrii błon.
- Ułatwia rzetelną ocenę wpływu związków na dynamikę montażu septyn.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje parametry montażu in vitro do funkcji cytoszkieletu istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od odkrycia mechanistycznego do walidacji w modelu przedklinicznym.
- Umożliwia podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie właściwości biofizycznych z wynikami funkcjonalnymi.
- Wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów dla strategii modulacji cytoszkieletu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta platforma rekonstrukcji błonowej łączy wczesne etapy odkryć, opracowywanie testów oraz badania translacyjne, umożliwiając kontrolowaną, ilościową analizę montażu septyn w różnych kontekstach błonowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wykrywania krzywizny błony oraz mechanizmów składania.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do porównywania oddziaływań białko-błona.
- Analityka: Dostarcza pomiary o wysokiej rozdzielczości w zakresie adsorpcji, dyfuzji i stanów składania.
- Badania translacyjne: Łączy dane dotyczące składania in vitro z funkcjami cytoszkieletu istotnymi dla chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wszechstronną platformę możliwą do adaptacji do wielu systemów białkowych i błonowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów cytoszkieletowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury analiz białek błonowych w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie mechanizmów montażu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów cytoszkieletowych i modulatorów montażu z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biofizyki błon oraz analizy montażu białek.
- Wymaga dostępu do zaawansowanych platform obrazowania, takich jak mikroskopia TIRF i konfokalna.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów przygotowania i czyszczenia błon.
- Możliwość dostosowania do różnych typów białek i geometrii błon poprzez optymalizację protokołu.
- Zależne od ilościowej analizy stanów adsorpcji, dyfuzji i montażu.
