Name: Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj rekonstrukcję zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości biofizycznych białek. Ta wszechstronna metoda pozwala analizować wpływ geometrii błony na organizację zespołów białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) Grant nr R01 GM-130934 oraz National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. i K.S.C. były częściowo wspierane przez grant z Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych w ramach nagrody T32 GM119999.

<ol><li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).</li>
<li>Parthasarathy, R., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curvature+and+spatial+organization+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Curvature and spatial organization in biological membranes.</a> Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).</li>
<li>Mao, Y., Baum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tug+of+war-The+influence+of+opposing+physical+forces+on+epithelial+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology.</a> Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).</li>
<li>Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+organization+in+mixed+lipid+membranes+driven+by+intrinsic+curvature+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).</li>
<li>Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ArfGAP1+responds+to+membrane+curvature+through+the+folding+of+a+lipid+packing+sensor+motif%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif.</a> The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).</li>
<li>Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+lateral+diffusion+of+dipalmitoylphosphatidylcholine+adsorbed+on+silica+beads+in+the+absence+and+presence+of+melittin%3A+A+31P+two-dimensional+exchange+solid-state+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study.</a> Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).</li>
<li>Fu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+nanoparticle+supported+lipid+bilayers+for+the+structural+study+of+membrane+geometry-sensitive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).</li>
<li>Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sub-nanometre+view+of+how+membrane+curvature+and+composition+modulate+lipid+packing+and+protein+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment.</a> Nature Communications. 5 (1), 4916(2014).</li>
<li>Gill, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+geometry-driven+localization+of+a+small+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).</li>
<li>Pan, J., Dalzini, A., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+and+phosphatidylethanolamine+lipids+exert+opposite+effects+on+membrane+modulations+caused+by+the+M2+amphipathic+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).</li>
<li>Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+nanoscale+hindrances+on+the+relationship+between+lipid+packing+and+diffusion+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).</li>
<li>Lee, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity+and+positive+feedback+enable+enzyme+kinetics+at+the+membrane+to+sense+reaction+size%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118(2021).</li>
<li>Ferhan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoplasmonic+sensing+architectures+for+decoding+membrane+curvature-dependent+biomacromolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions.</a> Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).</li>
<li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature Communications. 10 (1), 420(2019).</li>
<li>Lou, H. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+curvature+underlies+actin+reorganization+in+response+to+nanoscale+surface+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
<li>Bridges, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+assemblies+form+by+diffusion-driven+annealing+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).</li>
<li>Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amphipathic+helix+enables+septins+to+sense+micrometer-scale+membrane+curvature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature.</a> Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).</li>
<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+steps+of+supported+bilayer+formation+probed+by+single+vesicle+fluorescence+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
<li>Lobato-Márquez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+into+bacterial+entrapment+by+septin+cage+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution.</a> Nature Communications. 12 (1), 4511(2021).</li>
<li>Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+septin+cortex+at+the+yeast+mother-bud+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The septin cortex at the yeast mother-bud neck.</a> Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).</li>
<li>Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+dynamic+remodelling+of+the+septin+cytoskeleton+during+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle.</a> Nature Communications. 5, 1-10 (2014).</li>
<li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li>
<li>Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+septin+assemblies+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers.</a> Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).</li>
<li>Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+size+analysis+by+dynamic%2Fstatic+light+scattering+upon+size+exclusion-%2Ffield+flow-fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoscience+and+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29(2012).</li>
<li>Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+one-step+PEG-silane+passivation+of+glass+surfaces+for+single-molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).</li>
<li>Woods, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+governing+septin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties governing septin assembly.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Cannon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+duplication+of+a+septin+provides+a+developmentally-regulated+filament+length+control+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLOS One. 11 (7), 0158457(2016).</li>
<li>Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution%3A+Influence+of+surface+chemistry%2C+vesicle+size%2C+temperature%2C+and+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).</li>
<li>Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+phospholipid+bilayers+on+molecular+surfaces%3A+Role+of+surface+charge+density+and+electrostatic+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).</li>
<li>Andrews, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+lipid+bilayers+%28SLBs%29+from+buffers+containing+low+concentrations+of+group+I+chloride+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts.</a> Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).</li>
<li>Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+NaCl+and+KCl+on+phosphatidylcholine+and+phosphatidylethanolamine+lipid+membranes%3A+Insight+from+atomic-scale+simulations+for+understanding+salt-induced+effects+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).</li>
<li>Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Błony komórkowe przybierają wiele różnych kształtów, krzywizn i właściwości fizykochemicznych. W celu zbadania maszynerii w skali nanometrowej, za pomocą której komórki budują zespoły w skali mikrometrowej, konieczne jest zaprojektowanie minimalnych systemów rekonstytucji mimetyki błonowej. Protokół ten przedstawia techniki, które precyzyjnie kontrolują zarówno krzywiznę, jak i skład membrany, umożliwiając jednocześnie użytkownikowi łatwe wykonywanie ilościowych pomiarów fluorescencji przy użyciu powszechnie dostępnych t...

Kształty komórek i wiele ich wewnętrznych kompartmentów są zależne od otaczających je błon lipidowych. Membrany to lepkosprężyste struktury, które mogą ulegać deformacji poprzez interakcje z białkami, sortowanie lipidów oraz działanie sił wewnętrznych i zewnętrznych w celu generowania różnorodnych kształtów1,2,3,4. Kształty te są często opisywane w kategoriach krzywizny membrany. Komórki wykorzystują różnorodny zestaw białek zdolnych do preferencyjnego gromadzenia się lub "wyczuwania" określonych krzywizn błony, aby zapewnić określoną czasoprzestrzenną kontrolę nad procesami, w tym transportem komórkowym, cytokinezą i migracją5,6. Dynamika maszynerii komórkowej na błonie jest szczególnie trudna do zaobserwowania ze względu na trudności w zrównoważeniu czasu i rozdzielczości przestrzennej ze zdrowiem komórki. Chociaż techniki superrozdzielczości mogą zapewnić szczegółowy obraz takich konstrukcji, wymagają one długotrwałych przejęć, które nie są dostosowane do ram czasowych montażu/demontażu w przypadku większości maszyn. Ponadto złożoność molekularna tych zespołów w ich naturalnym środowisku oraz mnogość ról, jakie może odgrywać pojedynczy składnik, sprawiają, że systemy minimalnej rekonstytucji są cennym narzędziem do badania zdolności funkcjonalnych cząsteczek.
Minimalny mimetyk błony został opracowany do badania właściwości błony i interakcji białko-błona na zewnątrz komórki. Mimetyki błonowe różnią się od wolnostojących dwuwarstw lipidowych, takich jak liposomy lub gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe, do wspieranych dwuwarstw lipidowych (SLB)7,8,9,10. SLB to błony biomimetyczne zakotwiczone w leżącym pod spodem podparciu, zwykle wykonane ze szkła, miki lub krzemionki11,12. Można użyć różnych geometrii, w tym powierzchni płaskich, kul, prętów, a nawet pofałdowanych lub mikrowzorów podłoży, aby jednocześnie badać interakcje białko-błona zarówno na wklęsłych, jak i wypukłych krzywiznach13,14,15,16,17,18. Tworzenie dwuwarstw rozpoczyna się od adsorpcji pęcherzyków na powierzchni hydrofilowej, po której następuje fuzja i pęknięcie, tworząc ciągłą dwuwarstwę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)19. Dwuwarstwy są szczególnie podatne na mikroskopię świetlną i elektronową, zapewniając zarówno lepszą rozdzielczość czasową, jak i przestrzenną niż często osiągalna w komórkach. Zakrzywione SLB stanowią szczególnie atrakcyjny środek do badania wrażliwości krzywizny białka przy braku znacznej deformacji błony, co pozwala na rozróżnienie między wykrywaniem krzywizny a indukcją krzywizny, które często są niemożliwe do rozdzielenia w systemach wolnostojących.
Septyny to klasa białek cytoszkieletu tworzących włókna, dobrze znana ze swojej zdolności do gromadzenia się na dodatnio zakrzywionych błonach6,18,20. W trakcie cyklu komórkowego u drożdży septyny łączą się w pierścień i muszą się przegrupować, tworząc struktury klepsydry i podwójnego pierścienia związane odpowiednio z pojawianiem się pąków i cytokinezą21. Podczas gdy piękna praca została wykonana przy użyciu mikroskopii elektronowej z repliką platyny do obserwacji architektury septyny na różnych etapach cyklu komórkowego22, obserwowanie składania septyny w czasie za pomocą mikroskopii świetlnej w drożdżach spotkało się z ograniczoną rozdzielczością przestrzenną. Wcześniejsze prace nad septynami przy użyciu monowarstw lipidowych uwidocznionych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) były w stanie odtworzyć kilka interesujących struktur septynowych, takich jak pierścienie, wiązki i gazy23. Jednak techniki EM są również ograniczone pod względem rozdzielczości czasowej, w przeciwieństwie do mikroskopii fluorescencyjnej. Aby lepiej określić parametry kinetyczne wieloskalowego procesu składania septyny, zwróciliśmy się do wspieranej mimetyki membranowej, w której można dokładnie kontrolować geometrię membrany, warunki próbki i modalność obrazowania.
Opisane tutaj protokoły wykorzystują płaskie lub zakrzywione SLB, oczyszczone białko i kombinację technik mikroskopowych. Ilościowa fluorescencyjna mikroskopia konfokalna i mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM) wykorzystano do pomiaru zarówno masowego wiązania białek na różnych krzywiznach błony, jak i do pomiaru kinetyki wiązania pojedynczych cząsteczek. Co więcej, protokół ten został dostosowany do stosowania w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) do badania ultrastruktury białek na różnych krzywiznach błony. Chociaż protokoły te koncentrują się na cytoszkielecie septyny, protokoły można łatwo modyfikować w celu zbadania wrażliwości na krzywiznę dowolnego białka, które czytelnik uzna za interesujące. Ponadto osoby pracujące w dziedzinach takich jak endocytoza lub transport pęcherzykowy mogą uznać te techniki za przydatne do badania zależnych od krzywizny zespołów kompleksów wielobiałkowych.

<table><tbody><tr><td>Probówki do PCR 0,2 ml z płaską nakrętką, naturalne</td><td>Probówki o</td> niskiej przyczepności Watson <td>137-211C(EX)</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>Beta merkaptoetanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4612-25G</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe do produkcji szkiełek nakrywkowych PEGylowanych</td><td>Thermo Scientific</td><td>152450</td><td>Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Szkło osłonowe 24x50 #1.5</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Egg Liss Rhodamine PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810146</td><td></td></tr><tr><td>EMS Aldehyd glutarowy wodny 25%, klasa EM</td><td>VWR</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>EMS Bufor kakodylanu sodu</td><td>VWR</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-223EA</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Heksametyldisilazan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>VWR</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza 4000cp</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M052-100G</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe z mikroszkła do dwuwarstw płaskich</td><td>Matsunami</td><td>Wycofane</td><td>z produkcji 22x22</td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niefunkcjonalizowane mikrosfery krzemionkowe</td><td>Bangs Laboratories, Inc.</td><td>Zależy od rozmiaru: SS0200*-SS0500*</td><td>Krzemionka w zawiesinie wodnej</td></tr><tr><td>Klej optyczny</td><td>Norland Thorlabs</td><td>NOA 68</td><td>Elastyczny klej do szkła lub tworzyw sztucznych</td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>Millipore Sigma</td><td>20816-12-0</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia</td><td>plazmy Wytrawianie plazmowe</td><td>PE-25</td><td>Napięcie: 120V, 60Hz. Prąd: 15 AMPERÓW</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>VWR</td><td>0395-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Okrągła szklana szklana, #1.5 12mm&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>64-0712</td><td></td></tr><tr><td>Wanna Sonicator</td><td>Branson</td><td>1510R-MT</td><td>Myjka ultradźwiękowa Branson. 50-60 Hz. Moc wyjściowa: 70W</td></tr><tr><td>Soy PI</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840044</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>Spektrolina</td> lampy<td>UV</td><td>ENF-260C</td><td>115 V, 60 Hz, 0,20 AMPS</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna z mikrofibry WhatmanGlass</td><td>VWR</td><td>28455-030</td><td>Średnica 42,5 mm, klasa GF/C</td></tr></tbody></table>

rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Większość komórek może wykrywać i zmieniać swój kształt, aby przeprowadzać podstawowe procesy komórkowe. U wielu eukariontów cytoszkielet septynowy jest integralnym elementem koordynującym zmiany kształtu, takie jak cytokineza, spolaryzowany wzrost i migracja. Septyny to białka tworzące włókna, które łączą się, tworząc różne struktury wyższego rzędu i, w wielu przypadkach, znajdują się w różnych obszarach błony plazmatycznej, w szczególności w regionach o dodatniej krzywiźnie w skali mikronów. Monitorowanie procesu składania septyny in vivo jest utrudnione ze względu na ograniczenia mikroskopii świetlnej w komórkach, a także złożoność interakcji zarówno z błonami, jak i elementami cytoszkieletu, co utrudnia ilościowe określenie dynamiki septyny w organizmach żywych. Na szczęście w ciągu ostatniej dekady nastąpił znaczny postęp w rekonstrukcji cytoszkieletu septyny w systemie bezkomórkowym w celu przeanalizowania mechanizmów kontrolujących składanie septyny w wysokich rozdzielczościach przestrzennych i czasowych. Podstawowe etapy składania septyny obejmują asocjację heterooligomerów septyny i dysocjację z membraną, polimeryzację we włókna oraz tworzenie struktur wyższego rzędu poprzez interakcje między włóknami. W tym miejscu przedstawiamy trzy metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe. Metody te mogą być stosowane do określania parametrów biofizycznych septyn na różnych etapach składania: jako pojedyncze oktamery wiążące błonę, jako włókna i jako zespoły włókien. Używamy tych parametrów w połączeniu z pomiarami próbkowania krzywizny i adsorpcji preferencyjnej, aby zrozumieć, jak działa wykrywanie krzywizny w różnych skalach długości i czasu.

Po przygotowaniu każdej SLB septyny lub białko zainteresowania można inkubować z odpowiednim podłożem i obrazować za pomocą TIRFM, mikroskopii konfokalnej lub SEM. Przedstawione tutaj wyniki uzyskano przy użyciu septyn rekombinowanych, ekspresowanych i oczyszczonych z E. coli17. Wykorzystując TIRFM na płaskich SLB, można określić długość filamentów i ich elastyczność, zmierzyć współczynniki dyfuzji oraz obserwować proces składania w czasie28,<sup class="...

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Protokół ten poprowadzi osoby pracujące nad białkami wiążącymi błonę w celu określenia, w jaki sposób kształt błony odgrywa rolę w organizacji zespołów białek. Podstawową zaletą tej techniki jest jej wszechstronność w zakresie rodzaju białka, składu błony i geometrii błony. Pozwala również na zbadanie, w jaki sposób dwuwarstwa lipidowa może zmieniać właściwości powiązanych białek.Aby zidentyfikować dobrą błonę do eksperymentu, sugerujemy ustalenie listy kontrolnej, która może obejmować szybkość dyfuzji lipidów, ruchliwość białka będącego przedmiotem zainteresowania oraz to, czy do powierzchni przyklejone są liposomy niepęknięte lub stopione liposomy. Aby rozpocząć czyszczenie plazmowe szkiełek, należy przepłukać czyszczalnię plazmową przez pięć minut tlenem, aby usunąć powietrze z przewodów i komory. Ułóż suche szkiełka nakrywkowe w ceramicznej kołysce.Podczas przedmuchiwania rozpylaj gaz obojętny na szkiełka z mikro pokrywy, aby usunąć kurz i cząstki stałe. Umieść kołyskę z tyłu komory plazmowej tak, aby szkiełka nakrywkowe były równoległe do dłuższej krawędzi komory. Uruchom myjkę plazmową na 15 minut z tlenem o maksymalnej mocy.W celu przygotowania komory odetnij nakrętkę tuż po

reconstitution-septin-assembly-at-membranes-to-study-biophysical

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy procedurę badania organizacji septyny na dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym in vitro przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Planarny dwuwarstwowy test lipidowy: oparta na mikroskopii technika in vitro do badania składania septyny na mimikach błon biologicznych

Ten film opisuje technikę badania składania białek septyny na mikrosferach pokrytych dwuwarstwami lipidowymi. Technika ta pomaga w zrozumieniu zależnych od krzywizny zespołów białek na zakrzywionych powierzchniach.

Test dwuwarstwowy lipidów ze sferycznym wsparciem: technika obserwacji składania się septyny na mikrosferach

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Montaż i ustawienie wrzeciona mitotycznego zależy od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne i sieciery. Tutaj przedstawiamy nasze ostatnio opracowane metody, w których geometryczne uwięzienie sferycznych kropelek emulsji jest wykorzystywane do odtworzenia od dołu do góry podstawowych wrzecion mitotycznych.

Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Rekonstrukcja in vitro białek cytoszkieletu jest kluczowym narzędziem do zrozumienia podstawowych właściwości funkcjonalnych tych białek. W niniejszej pracy opisano protokół oczyszczania i oceny jakości rekombinowanych kompleksów septynowych, które odgrywają kluczową rolę w podziale i migracji komórek.

Oczyszczanie i kontrola jakości rekombinowanych kompleksów septynowych do rekonstytucji bezkomórkowej

Septyny to białka cytoszkieletu. Oddziałują z błonami lipidowymi i mogą wykrywać, ale także generować krzywiznę błony w skali mikronów. W tym protokole opisujemy oddolne metodologie in vitro do analizy deformacji błony, wrażliwego na krzywiznę wiązania septyny i ultrastruktury włókien septyny.

Oddolne metody in vitro do oznaczania organizacji ultrastrukturalnej, kształtowania błony i zachowania wrażliwości na krzywiznę septyn

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Bacillus anthracis jest obowiązkowym patogenem śmiertelnego wąglika wziewnego, więc badania nad jego genami i białkami są ściśle regulowane. Alternatywnym podejściem jest badanie genów ortologicznych. Opisujemy badania biofizykochemiczne ortologa B. anthracis w B. cereus, bc1531, wymagające minimalnego sprzętu doświadczalnego i pozbawione poważnych obaw dotyczących bezpieczeństwa.

Rekombinowana ekspresja, krystalizacja i badania biofizyczne pirofosforylazy nukleotydowej konserwowanej przez Bacillus, BcMazG

W tej metodzie prezentujemy procedury biochemiczne do szybkiej i efektywnej izolacji pośrednich białek filamentowych (IF) z wielu tkanek myszy. Izolowane IFs mogą być wykorzystywane do badania zmian w modyfikacjach potranslacyjnych za pomocą spektrometrii mas i innych testów biochemicznych.

Izolacja pośrednich białek filamentowych z wielu tkanek myszy w celu zbadania modyfikacji potranslacyjnych związanych ze starzeniem się

Poznaj rekonstrukcję zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości biofizycznych białek. Ta wszechstronna metoda pozwala analizować wpływ geometrii błony na organizację zespołów białkowych.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Przeglądaj więcej filmów