Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Protokół ten przedstawia najniższe koszty i najniższe technologicznie metody serwowania starzenia się w eleganach morskich. Wpływowy organizm modelowy w biologii starzenia się. Największą zaletą tych metod jest łatwość wdrożenia, przy użyciu taniego sprzętu i materiałów.

Dzięki temu będą one dostępne dla każdego badacza, niezależnie od doświadczenia i dostępnych funduszy. Jak pokazują stare badania nad starzeniem się, istnieje naturalna zmienność zdrowia w populacjach. Dlatego tak ważne jest, aby eksperymenty były przeprowadzane na zdrowych, dobrze odżywionych i ściśle zsynchronizowanych zwierzętach.

Aby zapewnić niepełnosprawność rozrywającą: Rozpocznij przygotowanie jednolitrowej pożywki do hodowli nicieni lub płytki ślimakowej NGM. Dodaj 2,5 grama tonu pep, 3,0 grama chlorku sodu i 20 gramów świdra do jednolitrowej kolby z mieszadłem i dodaj wodę destylowaną do końcowej objętości 970 mililitrów. Wysterylizuj roztwór ślimaka NGM w litrowej kolbie za pomocą standardowego sterylizatora w autoklawie lub pożywce.

I pozwól roztworowi mieszać, aż ostygnie do 60 do 75 stopni Celsjusza. Gdy roztwór ostygnie, podgrzej kąpiel perełkową do 65 do 70 stopni Celsjusza. Gdy roztwór ślimaka NGM ostygnie do 60 do 75 stopni Celsjusza.

Dodaj płynne dodatki i pozostaw roztwór do całkowitego wymieszania przez pięć minut. Następnie zanurz kolbę w kąpieli perełkowej w temperaturze od 65 do 70 stopni Celsjusza, aby zapobiec krzepnięciu podłoża podczas nalewania do płytki. Odmierzyć pipetą od dziewięciu do 11 mililitrów roztworu do każdej płytki o pojemności 60 mililitrów.

Po zakończeniu umieść pipetę z powrotem w podgrzanym roztworze, aby utrzymać temperaturę i zapobiec zastyganiu mediów w pipecie. Powtórz procedurę dla wszystkich płytek i pozwól płytkom NGM a zestalać się przez noc. Po zestaleniu użyj ich do wysiewu płytek z bakteriami lub przechowuj je w szczelnych pojemnikach do trzech miesięcy w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zsynchronizować robaki poprzez bielenie.

Zbierz nicienie, wylewając niewielką ilość roztworu M9 na płytkę zawierającą robaki, nie przepełniając szalki Petriego. Następnie delikatnie zamieszaj roztwór M nine, aby usunąć robaki z bakteryjnych trawników. Następnie zbierz dorosłe robaki grawitacyjne do 15-mililitrowej probówki za pomocą pipety serologicznej.

Unikanie przebijania ślimaka końcówką pipety. Osadzać zwierzęta przez środek przez 30 sekund w temperaturze 1100 razy G i odessać supernatant. Dodaj pięć mililitrów świeżo przygotowanego roztworu wybielającego do granulki robaków i sprawdzaj robaki pod mikroskopem preparacyjnym co kilka minut wraz z przerywanym, energicznym potrząsaniem, aż wszystkie dorosłe ciała robaków zostaną rozpuszczone i w mieszance pozostaną tylko jaja.

Następnie otul jaja, obracając mieszankę wybielacza do jaj przez 30 sekund w temperaturze 1100 razy G i odessaj roztwór wybielający. Następnie umyj jaja w granulkach, dodając do 15 mililitrów roztworu M9 i odwracając probówkę cztery lub pięć razy, aby rozproszyć jaja i roztwór. Ponownie odwiruj probówkę przez 30 sekund przy 1100 razy G, aby ogranulować jaja i zassać roztwór M9.

Wykonaj pranie cztery razy, aby usunąć wybielacz z mieszanki jajecznej. Po czwartym płukaniu odsysać roztwór M9 od 100 mikrolitrów do dwóch mililitrów, w zależności od całkowitej liczby wybielonych robaków. Dokładnie wstrząśnij jajami, aby rozbić grudki i upewnić się, że jaja są całkowicie zawieszone w roztworze M9.

Alternatywnie, zwierzęta można zatrzymać w celu ściślejszej synchronizacji czasowej, dodając od 10 do 12 mililitrów roztworu M9 do osadu jaj w 15-mililitrowej probówce kronikowej. Pozwól robakom obracać się w rotatorze do 24 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby uzyskać przybliżone stężenie jaja lub L one, odpipetować cztery mikrolitry mieszanki jajecznej na płytce NGM osadzonej z bakteriami.

Następnie policz i oblicz jaja obecne na mikrolitr pożywki. Powtórz liczenie trzy lub cztery razy, aby poprawić przybliżenie, w oparciu o płytkę przybliżającą, odpowiednią liczbę jaj lub L jedno zatrzymane zwierzęta na płytce ślimaka NGM wysiane wybranymi bakteriami. Do pomiaru zachowania lokomotywy robaków poprzez młócenie.

Przenieś niewielką liczbę dorosłych robaków pierwszego dnia z płytki ślimaka NGM na 10 do 20 mikrolitrów roztworu M9 pod lunetą sekcyjną. Następnie skup się na jednym robaku na raz i policz, ile razy próbka przełącza się z formacji wklęsłej na wypukłą w ciągu 15 sekund. Użyj licznika ręcznego i timera i powtórz procedurę dla 10 do 15 robaków.

Starzej robaki do pożądanego wieku i powtarzaj pomiary młócenia we wszystkich pożądanych wiekach. Jak pokazano na wizualizacji, starsze robaki miotają się ze znacznie wolniejszymi prędkościami. Do pomiarów ilości i płodności.

W przypadku 10 do 15 robaków Caenorhabditis elegans, wyodrębnij L cztery robaki na osobnej płytce ślimakowej NGM wysianej wybranymi bakteriami. Pozwól zwierzętom rosnąć przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza i upewnij się, że nowo wysiana partia talerzy jest gotowa na następny dzień. Aby zmierzyć ilość jaj składanych przez Caenorhabditis elegans, przenieś dorosłe robaki do świeżego ostrza ślimaka NGM wysianego tymi zrabowanymi bakteriami co 12 do 24 godzin przez siedem do ośmiu dni lub do momentu, gdy jaja przestaną być widoczne, i policz liczbę jaj złożonych na płytkach.

Aby zmierzyć wielkość czerwiu Caenorhabditis elegans, należy przenieść dorosłe robaki na świeżą płytkę ślimakową NGM wysianą bakteriami co 12 do 24 godzin lub siedem do ośmiu dni lub do momentu, gdy potomstwo przestanie być widoczne. Przechowuj wszystkie talerze zawierające jajka w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Dwa dni po przeniesieniu robaków.

Policz rozwinięte potomstwo na talerzu. Policz wszystkie żywe i rozwijające się robaki w stadium L cztery lub wcześniej, aby upewnić się, że pokolenie F dwa nie zakłóca wyników. Usuń wszystkie robaki z talerza podczas ich liczenia.

Utrzymuj płytki przez dodatkowy jeden do dwóch dni przed ponownym nacięciem, aby upewnić się, że żadne zwierzęta z opóźnionym wykluciem lub rozwojem nie zostaną pominięte. Wpływ metody sterylizacji na długość życia dzikich nicieni typu N2 wykazał, że zmiany w długości życia robaków hodowanych na płytkach ślimaka NGM były podobne do zmian w długości życia robaków hodowanych na płytkach ślimaka NGM FUDR lub czterech zmutowanych zwierząt BN2 GLP hodowanych na płytkach ślimaka NGM. Krótkotrwałe zwierzę HSF z jednym nokdaunem wykazało znaczny spadek długości życia we wszystkich warunkach.

Stwierdzono znaczny spadek liczby złożonych jaj i wielkości lęgu u zwierząt HSF w stosunku do ekspresji w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego. Niektóre zwierzęta z nadekspresją HSF wykazywały pełną bezpłodność, co wskazuje, że zdrowie reprodukcyjne może być odwrotnie skorelowane z długowiecznością. Wskaźnik młócenia zapewnił wiarygodną metodę pomiaru zdrowia podczas starzenia się, mierzoną znacznym spadkiem młócenia u starych zwierząt w porównaniu z młodymi.

Przeżywalność na stres jest wiarygodnym testem do pomiaru zdrowia organizmu, Tunikamycyna, która powoduje stres siateczkowa, skutkowała skróceniem długości życia niezależnie od stężenia w porównaniu z kontrolą DMSO. Wysoki poziom parakwatu znacznie skrócił żywotność, podczas gdy niskie stężenie parakwatu wydłużyło życie ze względu na działanie hormetyczne. W testach tolerancji termicznej nadmierna ekspresja HSF zwiększyła tolerancję termiczną przy 37 stopniach Celsjusza dla wszystkich eksperymentów dotyczących długości życia i starzenia.

Należy pamiętać, że techniki sterylizacji mogą mieć plejotropowy wpływ na zdrowie organizmu, co wpływa na wyniki. Istnieje wiele dodatkowych i uzupełniających podejść do pomiaru rozpiętości zdrowia, jeśli dostępny jest sprzęt i infrastruktura, w tym pomiary transkrypcji, agregacji białek translacyjnych, organelli, morfologii i funkcji metabolicznych.