Name: Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj niskokosztowe metody pomiaru długości życia i zdrowia u Caenorhabditis elegans. Protokół obejmuje synchronizację, pomiar ruchu i płodności, zapewniając dostępne narzędzia do badań nad starzeniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

G.G. jest wspierany przez T32AG052374, a R.H.S. jest wspierany przez R00AG065200 z National Institute on Aging. Dziękujemy CGC (finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) za szczepy.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Długość życia, najprościej definiowana jako czas trwania życia, jest wyraźnym zjawiskiem binarnym w większości organizmów - albo organizm żyje, albo go nie ma. Jednak długowieczność nie zawsze koreluje ze zdrowiem organizmu. Na przykład modele hormezy mitochondrialnej, w których narażenie na stres mitochondrialny dramatycznie wydłuża życie, są na ogół jednymi z najdłużej żyjących zwierząt, ale wykazują zahamowanie wzrostu i obniżoną funkcję metaboliczną37,54. Podobnie, zwierzęta z nadpobudliwymi reakcjami na stres retikulum endoplazmatycznego również wykazują pewne zachowania i fenotypy, które mogą być skorelowane z pogorszeniem stanu zdrowia, pomimo radykalnej poprawy homeostazy białek i długości życia36,49. Wreszcie, wiele paradygmatów długowieczności w organizmach modelowych, w tym zwiększona funkcja HSF-155, zwiększona funkcja XBP-156 i zmieniona sygnalizacja FoxO57, jest skorelowanych ze zwiększonym ryzykiem raka i nie można zaprzeczyć, że wydłużona długość życia nie jest korzystna, jeśli organizm jest w ciągłej walce z rakiem i innymi dolegliwościami zdrowotnymi. Dlatego długowieczność nie może być samodzielnym pomiarem w biologii starzenia się.
W związku z tym koncepcja zdrowia jest rozwijającą się dziedziną w biologii starzenia się. Długość zdrowia, luźno zdefiniowana jako okres życia, w którym jest się zdrowym, jest trudniejsza do ustalenia niż długowieczność. Jednak w przeciwieństwie do długowieczności, pojęcie "zdrowia" jest skomplikowane, ponieważ istnieje wiele różnych odczytów zdrowia organizmu: na poziomie organizmu są to funkcja/siła mięśni, funkcje neuronalne/poznawcze, zdrowie reprodukcyjne itp.; Na poziomie komórkowym występuje homeostaza białek, homeostaza lipidów, homeostaza glukozy, metabolizm itp. W 2014 roku starzejący się biolodzy definitywnie scharakteryzowali biologiczne cechy starzenia się za pomocą ustrukturyzowanej definicji, że musi to być coś, co naturalnie rozkłada się podczas starzenia się i może być eksperymentalnie zmienione tak, że eksperymentalne zaostrzenie powinno przyspieszyć starzenie się, a interwencja eksperymentalna powinna spowolnić starzenie się. Te dziewięć cech charakterystycznych starzenia się obejmuje niestabilność genomu, ścieranie telomerów, zmiany epigenetyczne, utratę homeostazy białek (proteostazę), wyczerpanie komórek macierzystych, zmienioną sygnalizację międzykomórkową, dysfunkcję mitochondriów, rozregulowane wykrywanie składników odżywczych istarzenie się komórek. Od tego czasu liczne badania dowodzą, że należy uwzględnić inne czynniki, w tym białka zewnątrzkomórkowe i fizjologię ogólnoustrojową, taką jak odporność i stan zapalny59. Ostatecznie, złożona definicja długości zdrowia wymaga, aby zdrowie organizmu było mierzone przy użyciu wielu różnych metod.
Dlatego w tym manuskrypcie przedstawiono wiele metod pomiaru różnych aspektów zdrowia przy użyciu modelu nicieni, C. elegans. Badamy zachowania lokomotoryczne za pomocą testów młócenia, zdrowie reprodukcyjne za pomocą liczby jaj i wielkości lęgu oraz wrażliwość na stres. Rzeczywiście, zachowanie lokomotoryczne jest złotym standardem w mierzeniu długości zdrowia, ponieważ organizmy wykazują znaczną utratę ruchliwości i ruchu podczas starzeniasię. Utrata zachowań lokomotorycznych może być przypisana wielu cechom starzenia się, ponieważ funkcja mięśni u C. elegans zależy od prawidłowej proteostazy60, dysfunkcji mitochondriów61 i sygnalizacji neuron-mięśnie62. Chociaż ten manuskrypt koncentruje się na jednym pomiarze zachowania lokomotorycznego, ważne jest, aby zauważyć, że istnieje wiele innych metod, w tym ruchliwość zwierząt na stałej płytce agarowej, reakcja na dotyk51 i testy chemotaksji63. Jednak metody te na ogół wymagają bardziej wyrafinowanych urządzeń rejestrujących, użycia oprogramowania do śledzenia robaków lub użycia drogich, niebezpiecznych lub lotnych chemikaliów, z których wszystkie mogą być zaporowe w niektórych warunkach badawczych.
Ponadto testy liczby jaj i wielkości czerwiu są przedstawiane jako metoda pomiaru zdrowia reprodukcyjnego i jako najprostsza metoda pomiaru podziału komórek u dorosłych robaków, ponieważ dorosłe robaki są postmitotyczne i tylko komórki rozrodcze i zarodki ulegają podziałowi komórkowemu w obrębie dorosłego robaka64. Jako miara podziału komórek, zdrowie reprodukcyjne może być istotne dla cech starzenia się starzenia się komórek i wyczerpania komórek macierzystych. Na zdrowie reprodukcyjne może mieć wpływ wiele czynników, w tym infekcja patogenna65 lub narażenie na stres49, chociaż nie ma bezpośredniej korelacji między zdrowiem reprodukcyjnym a długowiecznością. W rzeczywistości niektóre długowieczne zwierzęta wykazują znaczny spadek wielkości lęgu49, a nawet możliwe jest, że istnieje odwrotna korelacja między długowiecznością a wielkością lęgu50. Nie jest to zjawisko specyficzne dla C. elegans, ponieważ szkodliwy wpływ reprodukcji na długowieczność od dawna obserwowano u ludzi66, psów towarzyszących67 i myszy68. Mimo to podajemy liczbę jaj i wielkość lęgu jako wiarygodną i tanią metodę pomiaru zdrowia reprodukcyjnego z zastrzeżeniem, że zdrowie reprodukcyjne może nie korelować z długowiecznością lub długością zdrowia.
Wreszcie, testy przeżycia są oferowane jako pośrednia miara zdrowia organizmu. Co ważne, reakcje na stres komórkowy, w tym odpowiedź na stres termiczny69 i stres ER35, gwałtownie spadają podczas procesu starzenia się i mają bezpośrednie znaczenie dla cechy charakterystycznej starzenia sięproteostazy 70,71. W przeciwieństwie do tego, hiperaktywacja reakcji na stres może znacznie wydłużyć życie, promując odporność na stres 35,37,38. Chociaż badanie to koncentruje się na najprostszych i najtańszych metodach, istnieje wiele alternatywnych metod oznaczania odporności na stres dla termotolerancji41 i stresu oksydacyjnego66, z których każda wymaga innego zestawu sprzętu i materiałów eksploatacyjnych. Poza prostymi badaniami narażenia na czynniki stresogenne, w zależności od dostępu do sprzętu, można zastosować inne metody fizjologiczne. Na przykład analizator strumienia zewnątrzkomórkowego może monitorować funkcję mitochondriów i oddychanie komórkowe73; fluorescencyjne mikroskopy preparacyjne pozwolą na pomiary reporterów transkrypcyjnych pod kątem aktywacji reakcji na stres20; Mikroskopy złożone lub konfokalne o wysokiej rozdzielczości mogą być używane do pomiaru morfologii organelli za pomocą sond fluorescencyjnych dla mitochondriów74, retikulum endoplazmatycznego 75,76 i cytoszkieletu aktynowego77.
Jako ostatnią przestrogę dla pomiarów długowieczności, chociaż chemiczne i genetyczne metody sterylizacji robaków są oferowane w celu znacznego obniżenia kosztów, ważne jest, aby pamiętać, że obie mogą bezpośrednio wpływać na długość życia. Na przykład wcześniej donoszono, że narażenie na FUDR wpływa zarówno na długość życia, jak i tolerancję termiczną45. I chociaż sam mutant glp-4(bn2) nie ma bezpośredniego wpływu na długość życia, wzrost w temperaturze 25 °C jest łagodnym stresem cieplnym33,34, a zatem może wpływać na długość życia2. Istnieją inne metody sterylizacji C. elegans, w tym sterylność za pośrednictwem auksyny78 lub alternatywne mutanty z niedoborem plemnikówwrażliwe na temperaturę 79. Jednak wszystkie metody mają pewne zastrzeżenia i należy zachować ostrożność, aby wykorzystać jak najmniej szkodliwy test dla potrzeb naukowych każdego laboratorium. Ostatnim ograniczeniem badań długowieczności jest potencjalna zmienność, która może wystąpić z powodu małej wielkości próby lub po prostu z powodu obiektywnego błędu badacza. Można to obejść, ponieważ nowe technologie rodzą się w zautomatyzowanych technologiach wydłużania życia80, ale również w tym przypadku systemy te są kosztowne i wymagają pewnego sprzętu i umiejętności inżynieryjnych i obliczeniowych. Ostatecznie przedstawiony tutaj zbiór metod jest niezawodnym zestawem narzędzi, które można szybko dostosować i nauczyć się w prawie każdej instytucji i stanowią solidną podstawę biologii starzenia się.

Od czasu publikacji 'The genetics of Caenorhabditis elegans', jednego z najbardziej wpływowych artykułów Sydneya Brennera w 1974 roku, ten mikroskopijny robak jest uważany za wybitny system modelowy do badania tajemnic biologicznych1. W 1977 Michael R. Klass opublikował metodę pomiaru długości życia C. elegans i stworzył ten model do badania starzenia się2. Badania mające na celu zrozumienie związku między stresem a długowiecznością rozpoczęły się od zidentyfikowania pojedynczej mutacji w genie wieku 1, co spowodowało wydłużenie życia C. elegans3. Co więcej, współczesne badania zidentyfikowały inne mutacje zwiększające długość życia, które ujawniły długowieczne zmutowane robaki, które wykazują zwiększoną odporność na stres4,5,6. Dzięki swoim wielu zaletom, w tym krótkiej żywotności, łatwej konserwacji, całkowicie zsekwencjonowanemu genomowi zawierającemu homologię do około dwóch trzecich wszystkich genów powodujących choroby u ludzi, dostępności i łatwości korzystania z bibliotek interferencji RNA (RNAi) oraz fizjologicznemu podobieństwu do ludzi7,8,9, C. elegans szybko został przyjęty jako wybitny model dla biologii stresu i starzenia się.
Być może największymi zaletami C. elegans są niezwykle niskie koszty utrzymania, łatwość eksperymentowania i różnorodność narzędzi genetycznych dostępnych do badań. C. elegans są zwykle uprawiane na stałym podłożu agarowym ze źródłem pożywienia E. coli. Dwa powszechnie używane szczepy E. coli to standardowy OP50, szczep B, który jest prawdopodobnie najczęściej używany10, oraz HT115, szczep K-12, który jest używany głównie do eksperymentów RNAi11,12. Szczep HT115 K-12 jest nosicielem delecji RNazy RNAIII, mutacji, która jest niezbędna w metodach RNAi, w których wykorzystuje się plazmidy eksprymujące dsRNA odpowiadające poszczególnym genom C. elegans. Wektory żywieniowe dsRNA pozwalają na silne eliminację genów C. elegans bez konieczności skomplikowanych krzyżówek lub edycji genomu, ponieważ bakterie przenoszące te plazmidy mogą być bezpośrednio karmione nicieniami. Tysiące tych bakteryjnych wektorów RNAi istnieje w tle HT115, w tym najpopularniejsza biblioteka Vidal RNAi z >19 000 indywidualnych konstruktów RNAi13 oraz biblioteka Ahringer RNAi z 16 757 konstruktami RNAi14. Jednak diety bakteryjne OP50 i HT115 mają duże różnice w profilu metabolicznym, w tym różnice w witaminie B1215,16. Dlatego zaleca się przeprowadzanie wszystkich eksperymentów na jednym źródle bakterii, jeśli to możliwe, aby uniknąć interakcji gen-dieta, które mogą wprowadzić wiele czynników zakłócających, jak opisano wcześniej17,18,19. Ze względu na jego łatwość, zwierzęta są utrzymywane na OP50 we wszystkich opisanych tutaj warunkach eksperymentalnych, ale wszystkie eksperymenty są wykonywane na HT115, jak opisano wcześniej20. Krótko mówiąc, zwierzęta są utrzymywane w OP50 i przenoszone do HT115 po synchronizacji (po bieleniu) w celu uzyskania spójności między eksperymentami RNAi i nie-RNAi. Alternatywnie można również użyć szczepu OP50 kompetentnego do RNAi, który zawiera podobną delecję RNazy RNAIII znajdującej się w szczepie E. coli K12 HT11521.
Być może jednym z głównych ograniczeń dla eksperymentów RNAi u C. elegans jest obawa o skuteczność knockdownu. Chociaż skuteczność knockdown można zweryfikować za pomocą qPCR lub western blot, wymagają one drogiego sprzętu i odczynników oraz ograniczają się do analizy masowej. Jest to jeszcze bardziej niepokojące, biorąc pod uwagę konkretne komórki, takie jak neurony, które są oporne (mniej wrażliwe) na RNAi. Podczas gdy wydajność RNAi w określonych komórkach może być zwiększona poprzez nadekspresję SID-1, białka transbłonowego niezbędnego do wychwytu dsRNA22, jest to nadal ograniczone do specyficznych dla typu komórki wzorców ekspresji promotorów używanych do tych konstruktów, a zatem nokauty i mutacje genów są najbardziej niezawodnymi sposobami na wyczerpanie funkcji genów. Poza knockdownem za pośrednictwem RNAi, C. elegans są również wysoce podatne na edycję genomu za pomocą strategii opartych na CRISPR23,24,25 i nadekspresja konstruktów transgenicznych poprzez mikroiniekcje, z opcją integracji konstruktów transgenicznych poprzez napromieniowanie lub integrację opartą na transpozonach26,27,28,29. Metody te wymagają jednak drogiego sprzętu do mikroiniekcji, a wysoki koszt przewodników RNA lub enzymu Cas9 może uniemożliwić stosowanie tych metod w instytucjach o ograniczonych funduszach. Zamiast tego tysiące transgenicznych linii i mutantów są łatwo dostępne za kilka dolarów zarówno w Caenorhabditis Genetics Center (CGC), jak i National Bioresource Project (NBRP). NBRP oferuje izolowane mutanty dla dużej liczby genów C. elegans, w tym opublikowane, a zatem zweryfikowane zmutowane szczepy, mutanty pochodzące z projektów pilotażowych oraz mutanty, które nie zostały jeszcze scharakteryzowane. W przeciwieństwie do tego, CGC jest depozytariuszem w większości opublikowanych i uznanych linii C. elegans ze społeczności naukowej. Obie firmy wysyłają szczepy na cały świat po bardzo rozsądnych cenach i oferują szeroką gamę opcji dla osób o ograniczonej zdolności do syntezy szczepów we własnym zakresie.
Tutaj oferowana jest kolekcja wyselekcjonowanych metod, które prawdopodobnie będą najtańszymi metodami do oznaczania długości życia i zdrowia C. elegans. Wszystkie przedstawione tutaj metody wymagają taniego sprzętu i materiałów eksploatacyjnych oraz wykorzystują wyłącznie szczepy łatwo dostępne w CGC. Być może najbardziej zaporowy dla testów długowieczności i przeżycia u C. elegans jest koszt płytek z pożywkami wzrostowymi nicieni (NGM). Ponieważ C. elegans są hermafrodytami i samozapładniają, standardowe testy przeżywalności wymagają, aby dorosłe zwierzęta były stale oddalane od ich potomstwa, aby uniknąć zakażenia potomstwem. Proces ten jest nie tylko czasochłonny, ale może stać się kosztowny ze względu na konieczność użycia około 100 płytek na warunek do przeprowadzenia jednego testu żywotności. W tym przypadku dostępne są dwie alternatywy: wykorzystanie wrażliwego na temperaturę mutanta bezzarodkowego, GLP-4(bn2) lub sterylizacja chemiczna przy użyciu 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUDR). glp-4 koduje syntetazę tRNA valyl-aminoacylu, a wrażliwe na temperaturę GLP-4(bn2) są nierozrodcze w ograniczonych temperaturach z powodu zmniejszonej translacji białek30,31. FUDR to solidna metoda chemicznej sterylizacji C. elegans poprzez zapobieganie replikacji DNA, a tym samym hamowanie reprodukcji32. Chociaż FUDR może być zbyt drogi dla niektórych laboratoriów, do chemicznej sterylizacji robaków wymagana jest tylko niewielka ilość, a jego stabilność w postaci proszku może sprawić, że będzie to wykonalne dla większości grup. Wykorzystanie wrażliwego na temperaturę mutanta glp-4(bn2) jest z pewnością najtańszą opcją, ponieważ jedynym wymogiem jest inkubator do przestawienia zwierząt do restrykcyjnej temperatury 25 °C; Należy jednak zauważyć, że wzrost w temperaturze 25 °C może powodować łagodny stres cieplny33,34. Niezależnie od metody, wykorzystanie sterylnych zwierząt może znacznie obniżyć koszty materiałów eksploatacyjnych wymaganych do testów związanych z wiekiem.
Aby badać starzenie się, standardowe testy długości życia są konwencjonalne, ponieważ paradygmaty, które zmieniają długowieczność, mają bezpośredni wpływ na starzenie się. Jednak pomiary długości zdrowia i tolerancji na stres dostarczają dodatkowych informacji na temat zdrowia organizmu. W tym miejscu oferowanych jest kilka metod pomiaru długości zdrowia: 1) płodność jako miara zdrowia reprodukcyjnego; 2) liczebność lęgu jako miara zdrowia rozwojowego i żywotności wypuszczonego potomstwa; oraz 3) zachowanie lokomotoryczne jako miara funkcji i motoryki mięśni, które są bezpośrednio skorelowane ze starzeniem się. Dodatkowo oferowane są testy tolerancji na stres: przeżycie na stres ER, stres mitochondrialny/oksydacyjny oraz przeżycie stresu termicznego. Rzeczywiście, zwierzęta o zwiększonej odporności na stres ER 35,36, mitochondrialny stres37 i stres termiczny38 wykazują zwiększoną długość życia. Stres ER jest stosowany poprzez wystawienie C. elegans na działanie tunicycyny, która blokuje glikozylację sprzężoną z N i powoduje akumulację nieprawidłowo sfałdowanych białek39. Stres mitochondrialny/oksydacyjny jest indukowany przez ekspozycję na parakwat, który indukuje powstawanie ponadtlenków szczególnie w mitochondriach40. Stres cieplny jest stosowany poprzez inkubację zwierząt w temperaturze 34-37 °C33,41. Wszystkie opisane tutaj testy można wykonać przy minimalnym sprzęcie i funduszach oraz oferują różnorodne narzędzia do badania starzenia się w różnych grupach.

<table><tbody><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>do RNAi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>do płytek NGM</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>do płytek NGM</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>do płytek NGM</td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>do RNAi</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>do płytek NGM</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>rozpuszczalnik do leków</td></tr><tr><td>Bulion LB VWR</td><td></td><td>95020-778</td><td>do LB</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>do płytek NGM, M9</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>36541</td><td>do stresu oksydacyjnego/mitochondrialnego</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>do roztworu wybielacza</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>do płytek NGM</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>do</td></tr><tr><td>lunety prosektoryjnej M9 S7E Standardowy</td><td>mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>10450840</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>do płytek NGM, M9</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>do roztworu wybielacza</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>do</td></tr><tr><td>chlorowodorku tetracykliny</td> M9 <td>VWR</td><td>97061-638</td><td>do RNAi</td></tr><tr><td>Tunikamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765-50MG</td><td>do stresu ER</td></tr></tbody></table>

badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Odkrycie i rozwój Caenorhabditis elegans jako organizmu modelowego miało wpływ na biologię, szczególnie na dziedzinę starzenia. Wiele historycznych i współczesnych badań zidentyfikowało tysiące paradygmatów zmieniających długość życia, w tym mutacje genetyczne, transgeniczną ekspresję genów i hormezę, korzystną ekspozycję na stres o niskim stopniu nasilenia. Dzięki swoim licznym zaletom, w tym krótkiej żywotności, łatwej i taniej konserwacji oraz w pełni zsekwencjonowanemu genomowi z homologią do prawie dwóch trzecich wszystkich ludzkich genów, C. elegans szybko został przyjęty jako wybitny model biologii stresu i starzenia się. W tym miejscu bada się kilka znormalizowanych metod pomiaru długości życia i zdrowia, które można łatwo dostosować do prawie każdego środowiska badawczego, zwłaszcza tych o ograniczonym sprzęcie i funduszach. Przedstawiono niezwykłą użyteczność C. elegans, podkreślając zdolność do przeprowadzania potężnych analiz genetycznych w biologii starzenia się bez konieczności korzystania z rozległej infrastruktury. Na koniec omówiono ograniczenia każdej z analiz i alternatywne podejścia do rozważenia.

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Protokół ten przedstawia najniższe koszty i najniższe technologicznie metody serwowania starzenia się w eleganach morskich. Wpływowy organizm modelowy w biologii starzenia się. Największą zaletą tych metod jest łatwość wdrożenia, przy użyciu taniego sprzętu i materiałów.Dzięki temu będą one dostępne dla każdego badacza, niezależnie od doświadczenia i dostępnych funduszy. Jak pokazują stare badania nad starzeniem się, istnieje naturalna zmienność zdrowia w populacjach. Dlatego tak ważne jest, aby eksperymenty były przeprowadzane na zdrowych, dobrze odżywionych i ściśle zsynchronizowanych zwierzętach.Aby zapewnić niepełnosprawność rozrywającą: Rozpocznij przygotowanie jednolitrowej pożywki do hodowli nicieni lub płytki ślimakowej NGM. Dodaj 2,5 grama tonu pep, 3,0 grama chlorku sodu i 20 gramów świdra do jednolitrowej kolby z mieszadłem i dodaj wodę destylowaną do końcowej objętości 970 mililitrów. Wysterylizuj roztwór ślimaka NGM w litrowej kolbie za pomocą standardowego sterylizatora w autoklawie lub pożywce.I pozwól roztworowi mieszać, aż ostygnie do 60 do 75 stopni Celsjusza. Gdy roztwór ostygnie, podgrzej kąpiel perełkową do 65 do 70 stopni Celsjusza. Gdy roztwór ślimaka NGM ostygnie do 60 do 75 stopni Celsjusza.Dodaj płynne dodatki i pozostaw roztwór do całkowitego wymieszania przez pięć minut. Następnie zanurz kolbę w kąpieli perełkowej w temperaturze od 65 do 70 stopni Celsjusza, aby zapobiec krzepnięciu podłoża podczas nalewania do płytki. Odmierzyć pipetą od dziewięciu do 11 mililitrów roztworu do każdej płytki o pojemności 60 mililitrów.Po zakończeniu umieść pipetę z powrotem w podgrzanym roztworze, aby utrzymać temperaturę i zapobiec zastyganiu mediów w pipecie. Powtórz procedurę dla wszystkich płytek i pozwól płytkom NGM a zestalać się przez noc. Po zestaleniu użyj ich do wysiewu płytek z bakteriami lub przechowuj je w szczelnych pojemnikach do trzech miesięcy w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zsynchronizować robaki poprzez bielenie.Zbierz nicienie, wylewając niewielką ilość roztworu M9 na płytkę zawierającą robaki, nie przepełniając szalki Petriego. Następnie delikatnie zamieszaj roztwór M nine, aby usunąć robaki z bakteryjnych trawników. Następnie zbierz dorosłe robaki grawitacyjne do 15-mililitrowej probówki za pomocą pipety serologicznej.Unikanie przebijania ślimaka końcówką pipety. Osadzać zwierzęta przez środek przez 30 sekund w temperaturze 1100 razy G i odessać supernatant. Dodaj pięć mililitrów świeżo przygotowanego roztworu wybielającego do granulki robaków i sprawdzaj robaki pod mikroskopem preparacyjnym co kilka minut wraz z przerywanym, energicznym potrząsaniem, aż wszystkie dorosłe ciała robaków zostaną rozpuszczone i w mieszance pozostaną tylko jaja.Następnie otul jaja, obracając mieszankę wybielacza do jaj przez 30 sekund w temperaturze 1100 razy G i odessaj roztwór wybielający. Następnie umyj jaja w granulkach, dodając do 15 mililitrów roztworu M9 i odwracając probówkę cztery lub pięć razy, aby rozproszyć jaja i roztwór. Ponownie odwiruj probówkę przez 30 sekund przy 1100 razy G, aby ogranulować jaja i zassać roztwór M9.Wykonaj pranie cztery razy, aby usunąć wybielacz z mieszanki jajecznej. Po czwartym płukaniu odsysać roztwór M9 od 100 mikrolitrów do dwóch mililitrów, w zależności od całkowitej liczby wybielonych robaków. Dokładnie wstrząśnij jajami, aby rozbić grudki i upewnić się, że jaja są całkowicie zawieszone w roztworze M9.Alternatywnie, zwierzęta można zatrzymać w celu ściślejszej synchronizacji czasowej, dodając od 10 do 12 mililitrów roztworu M9 do osadu jaj w 15-mililitrowej probówce kronikowej. Pozwól robakom obracać się w rotatorze do 24 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby uzyskać przybliżone stężenie jaja lub L one, odpipetować cztery mikrolitry mieszanki jajecznej na płytce NGM osadzonej z bakteriami.Następnie policz i oblicz jaja obecne na mikrolitr pożywki. Powtórz liczenie trzy lub cztery razy, aby poprawić przybliżenie, w oparciu o płytkę przybliżającą, odpowiednią liczbę jaj lub L jedno zatrzymane zwierzęta na płytce ślimaka NGM wysiane wybranymi bakteriami. Do pomiaru zachowania lokomotywy robaków poprzez młócenie.Przenieś niewielką liczbę dorosłych robaków pierwszego dnia z płytki ślimaka NGM na 10 do 20 mikrolitrów roztworu M9 pod lunetą sekcyjną. Następnie skup się na jednym robaku na raz i policz, ile razy próbka przełącza się z formacji wklęsłej na wypukłą w ciągu 15 sekund. Użyj licznika ręcznego i timera i powtórz procedurę dla 10 do 15 robaków.Starzej robaki do pożądanego wieku i powtarzaj pomiary młócenia we wszystkich pożądanych wiekach. Jak pokazano na wizualizacji, starsze robaki miotają się ze znacznie wolniejszymi prędkościami. Do pomiarów ilości i płodności.W przypadku 10 do 15 robaków Caenorhabditis elegans, wyodrębnij L cztery robaki na osobnej płytce ślimakowej NGM wysianej wybranymi bakteriami. Pozwól zwierzętom rosnąć przez noc w temperaturze 20 stopni Celsjusza i upewnij się, że nowo wysiana partia talerzy jest gotowa na następny dzień. Aby zmierzyć ilość jaj składanych przez Caenorhabditis elegans, przenieś dorosłe robaki do świeżego ostrza ślimaka NGM wysianego tymi zrabowanymi bakteriami co 12 do 24 godzin przez siedem do ośmiu dni lub do momentu, gdy jaja przestaną być widoczne, i policz liczbę jaj złożonych na płytkach.Aby zmierzyć wielkość czerwiu Caenorhabditis elegans, należy przenieść dorosłe robaki na świeżą płytkę ślimakową NGM wysianą bakteriami co 12 do 24 godzin lub siedem do ośmiu dni lub do momentu, gdy potomstwo przestanie być widoczne. Przechowuj wszystkie talerze zawierające jajka w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Dwa dni po przeniesieniu robaków.Policz rozwinięte potomstwo na talerzu. Policz wszystkie żywe i rozwijające się robaki w stadium L cztery lub wcześniej, aby upewnić się, że pokolenie F dwa nie zakłóca wyników. Usuń wszystkie robaki z talerza podczas ich liczenia.Utrzymuj płytki przez dodatkowy jeden do dwóch dni przed ponownym nacięciem, aby upewnić się, że żadne zwierzęta z opóźnionym wykluciem lub rozwojem nie zostaną pominięte. Wpływ metody sterylizacji na długość życia dzikich nicieni typu N2 wykazał, że zmiany w długości życia robaków hodowanych na płytkach ślimaka NGM były podobne do zmian w długości życia robaków hodowanych na płytkach ślimaka NGM FUDR lub czterech zmutowanych zwierząt BN2 GLP hodowanych na płytkach ślimaka NGM. Krótkotrwałe zwierzę HSF z jednym nokdaunem wykazało znaczny spadek długości życia we wszystkich warunkach.Stwierdzono znaczny spadek liczby złożonych jaj i wielkości lęgu u zwierząt HSF w stosunku do ekspresji w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego. Niektóre zwierzęta z nadekspresją HSF wykazywały pełną bezpłodność, co wskazuje, że zdrowie reprodukcyjne może być odwrotnie skorelowane z długowiecznością. Wskaźnik młócenia zapewnił wiarygodną metodę pomiaru zdrowia podczas starzenia się, mierzoną znacznym spadkiem młócenia u starych zwierząt w porównaniu z młodymi.Przeżywalność na stres jest wiarygodnym testem do pomiaru zdrowia organizmu, Tunikamycyna, która powoduje stres siateczkowa, skutkowała skróceniem długości życia niezależnie od stężenia w porównaniu z kontrolą DMSO. Wysoki poziom parakwatu znacznie skrócił żywotność, podczas gdy niskie stężenie parakwatu wydłużyło życie ze względu na działanie hormetyczne. W testach tolerancji termicznej nadmierna ekspresja HSF zwiększyła tolerancję termiczną przy 37 stopniach Celsjusza dla wszystkich eksperymentów dotyczących długości życia i starzenia.Należy pamiętać, że techniki sterylizacji mogą mieć plejotropowy wpływ na zdrowie organizmu, co wpływa na wyniki. Istnieje wiele dodatkowych i uzupełniających podejść do pomiaru rozpiętości zdrowia, jeśli dostępny jest sprzęt i infrastruktura, w tym pomiary transkrypcji, agregacji białek translacyjnych, organelli, morfologii i funkcji metabolicznych.

surveying-low-cost-methods-to-measure-lifespan-healthspan

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na pożywkach stałych z bakteriami zneutralizowanymi za pomocą promieniowania UV.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

W niniejszym protokole przedstawiamy metodę pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych

Ten film opisuje tradycyjną, opartą na płytkach metodę pomiaru długości życia C. elegans. Przykładowy protokół mierzy długość życia robaków poddanych działaniu RNAi.

Analiza długości życia: pomiar długowieczności C. elegans

Tutaj opisujemy metodę Replica Set, podejście do ilościowego pomiaru długości życia/przeżycia i zdrowia C. elegans w sposób wysoce wydajny i solidny, umożliwiając w ten sposób badanie wielu schorzeń bez poświęcania jakości danych. Protokół ten szczegółowo opisuje strategię i udostępnia narzędzie programowe do analizy danych zestawu replik.

Metoda zestawu replik: wysokoprzepustowe podejście do ilościowego pomiaru długości życia Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w mikrofabrykowanych urządzeniach wielodołkowych. Takie podejście pozwala na monitorowanie poszczególnych zwierząt przez całe życie pod kątem różnych fenotypów związanych ze starzeniem się i zdrowiem, w tym aktywności, wielkości i kształtu ciała, geometrii ruchu i przeżycia.

Długotrwała hodowla i monitorowanie izolowanych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych w urządzeniach wielodołkowych

Platforma obrazowania "The Lifespan Machine" automatyzuje obserwację dużych populacji przez całe życie. Pokazujemy kroki wymagane do wykonania testów długości życia, odporności na stres, patogenezy i behawioralnego starzenia się. Jakość i zakres danych pozwalają naukowcom badać interwencje w procesie starzenia się pomimo obecności zmienności biologicznej i środowiskowej.

Wysokoprzepustowe testy behawioralnego starzenia się i długości życia przy użyciu maszyny Lifespan Machine

Opisujemy tani, konfigurowalny morbidostat, który umożliwia charakterystykę oporności na antybiotyki poprzez dynamiczne dostosowywanie stężenia leku. Urządzenie można zintegrować z multipleksowaną platformą mikroprzepływową. Podejście to można rozszerzyć na potrzeby laboratoryjnych badań nad opornością na antybiotyki.

Opracowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostu do adaptacyjnej ewolucji bakterii pod wpływem doboru antybiotyków

Optogenetyczna mutageneza losowa z wykorzystaniem histonów-miniSOG u C. elegans

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Poznaj niskokosztowe metody pomiaru długości życia i zdrowia u Caenorhabditis elegans. Protokół obejmuje synchronizację, pomiar ruchu i płodności, zapewniając dostępne narzędzia do badań nad starzeniem.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów