Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Przy około 100 milionach komórek w mózgu myszy i rozmiarach obrazów o rozdzielczości komórkowej całego mózgu zbliżających się do skali terabajtów, potrzebne są zaawansowane narzędzia do analizy obrazu, aby dokładnie określić ilościowo komórki. Nasz potok obliczeniowy może wstępnie przetwarzać obrazy i określać ilościowo jądra w korze myszy, zachowując rozsądny kompromis między dokładnością wykrywania komórek, czasem obrazowania i zasobami obliczeniowymi. Procedurę zademonstrują Felix Kyere i Ian Curtin, doktoranci z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć, zamontuj próbkę w uchwycie o odpowiednim rozmiarze próbki, tak aby próbka była zorientowana z wymiarem z na głębokość nie większą niż 5.2 milimetra ze względu na znamionową odległość roboczą mikroskopu UltraMicroscope II. Następnie włóż uchwyt do kołyski na próbkę tak, aby śruba uchwytu była ustawiona pod kątem 45 stopni do wsporników kołyski. Następnie umieść kołyskę w takiej pozycji, aby próbka była zorientowana prostopadle do ścieżki światła.

Następnie ustaw korpus zoomu w mikroskopie na powiększenie 4x lub większe, co daje 0,75 mikrometra na piksel. W oprogramowaniu Inspector Pro wybierz pojedynczy arkusz świetlny o numerycznej wartości przysłony około 0,08. Aby zapewnić zachowanie rozdzielczości osiowej na całej szerokości obrazu, wybierz opcję Horizontal Dynamic Focus (Dynamiczne ogniskowanie w poziomie) i zastosuj zalecaną liczbę kroków w zależności od długości fali lasera.

Następnie dostosuj precyzyjną ostrość dla każdego kanału w odniesieniu do kanału rejestracji i moc lasera na kanał w odniesieniu do właściwości kanału. Następnie dostosuj szerokość jasnego arkusza do około 50%, aby zapewnić optymalne rozłożenie mocy arkusza w wymiarze y dla wielkości próbki. Następnie ustaw liczbę kafelków w stosunku do rozmiaru próbki z zalecanym nakładaniem się 15% między kafelkami i przechwytuj obrazy dla każdego kanału sekwencyjnie dla każdego stosu w danej pozycji kafelka

Najpierw pobierz i zainstaluj menedżera środowiska Conda dla narzędzi do przetwarzania obrazów Linux i NuMorph. W wierszu polecenia uruchom polecenie matlab i NM_setup. m z NuMorph, aby pobrać i zainstalować pakiety oprogramowania do analizy obrazu potrzebne do analizy.

Następnie określ nazwy próbek, katalogi wejściowe i wyjściowe, informacje o kanałach i parametry obrazowania arkusza świetlnego, edytując plik NM_samples.m. Aby dostosować intensywność, w NMp_template ustaw intensywność dopasowania na wartość true i use_processed_images jako false podczas pracy z nowym zestawem obrazów. Następnie ustaw save_images i save_samples jako true.

Następnie ustaw cieniowanie płytek na podstawowe, aby zastosować korekcję cieniowania przy użyciu algorytmu podstawowego, lub ręczne, aby zastosować korekcję cieniowania płytek przy użyciu pomiarów z UltraMicroscope II przy określonych szerokościach arkusza światła. Aby wyrównać kanał obrazu, w NMp_template ustaw channel_alignment na true, a kanał alignment_method na translację lub elastyczne. Następnie ustaw wartość sift_refinement na wartość true i wartość nakładania się na 0,15, aby dopasować nakładanie się kafelków podczas obrazowania.

Aby uruchomić kroki przetwarzania wstępnego w programie MATLAB, określ nazwę próbki i ustaw konfigurację na NM_config próbki procesu. Następnie uruchom dowolny z kroków przetwarzania wstępnego, określając ścieg konfiguracji NM_process podczas określania etapu przy użyciu intensywności, wyrównania lub ściegu, a następnie sprawdź katalog wyjściowy dla plików wyjściowych dla każdego z etapów. Zacznij od obrazu atlasu 3D i powiązanego obrazu adnotacji, który przypisuje każdy woksel do określonej struktury.

Wyrównaj zarówno obraz atlasu, jak i plik adnotacji, aby upewnić się, że są prawidłowo dopasowane we właściwej orientacji. Po wyrównaniu przetwórz pliki w NuMorph, aby określić dane wejściowe zgodnie z opisem w manuskrypcie, wykonując polecenie. W NMa_template ustaw resample_images na wartość true i resample_resolution tak, aby pasowała do atlasu.

Następnie określ numer kanału, który ma zostać ponownie próbkowany za pomocą resample_channels. Następnie ustaw register_images na true, określ atlas_file pasujący do pliku w katalogu Atlas i ustaw registration_parameters jako domyślne. Następnie ustaw save_registered_images na wartość true.

W przypadku wykrywania jąder, zliczania i klasyfikacji komórek ustaw zarówno count_nuclei, jak i classify_cells jako true. Następnie ustaw count_method na 3dunet i min_intensity zdefiniować minimalny próg intensywności dla wykrywanych obiektów. Następnie ustaw classify_method na próg, który jest oparty na nienadzorowanej intensywności fluorescencji w pozycjach środka ciężkości, lub SVM, który modeluje nadzorowany liniowy klasyfikator maszynowy wektora nośnego.

Aby wykonać kroki analizy w programie MATLAB, określ nazwę próbki i ustaw konfigurację na NM_config analizować próbkę. Następnie uruchom dowolny z kroków analizy, określając etap konfiguracji, określając etap konfiguracji NM_analyze jednocześnie określając etap przy użyciu polecenia resample, register, count lub classify i sprawdź katalog wyjściowy dla plików wyjściowych dla każdego z etapów. W NMe_template ustaw wartość update na wartość true i compare_structures_by na dowolny indeks.

Następnie ustaw plik szablonu i tabelę struktury, która określa wszystkie możliwe indeksy struktury i struktury do oceny, określając jednocześnie zliczanie komórek i klasyfikację typów komórek. Oczyszczanie tkanek za pomocą protokołu iDISCO+ i markerów jąder specyficznych dla warstwy neuronalnej zaowocowało jasno zdefiniowanymi grupami komórek neuronów górnej i dolnej warstwy w izokorze. Zliczanie komórek przy użyciu NuMorph zależało od udanych etapów przetwarzania wstępnego, w tym regulacji intensywności, wyrównania kanałów i zszywania.

Jednak błędy na etapach przetwarzania wstępnego mogą skutkować nieprawidłowym łączeniem, prowadzącym do nieprawidłowego wyrównania i zszywania, a tym samym powstaniem obrazów z ostrym i nieostrym wzorcem. Aby policzyć jądra z określonych regionów mózgu, zszyte obrazy zostaną oznaczone adnotacjami za pomocą Atlasu, co pozwoli na nałożenie adnotacji na obszary mózgu. Centroidy jąder wykryto za pomocą wytrenowanego modelu 3D U-Net w NuMorph z około 12 milionami całkowitych jąder, które były TO-PRO-3-dodatnie w izokorze z około 2,6 milionami jąder dwudodatnich w mózgu i 1,6 miliona jąder CTIP2-dodatnich.

Wykryto odpowiednio około 3,7 i 2,9 miliona TO-PRO-3-dodatnich jąder całkowitych w zwojach podstawy i korze allokorowej hipokampa. Jednak dwudodatnie komórki mózgu wykryte w tych dwóch regionach mózgu były znikome i tylko około 1,5 na mniej niż milion komórek CTIP2-dodatnich wykryto w zwojach podstawy i allokorze hipokampa. Przeprowadzaj wizualne kontrole jakości podczas pozyskiwania, aby osiągnąć dobrą segmentację.

I prawidłowo skonfiguruj środowisko Conda, aby upewnić się, że nie wystąpią żadne błędy w dalszej analizie. Oprócz zliczania komórek, proces ten pozwala na integrację z innymi narzędziami do segmentacji, które mierzą rozmiar i kształt komórek, które można następnie porównać między grupami genotypów. Dzięki naszemu potokowi możemy określić, jak zmienia się anatomia mózgu w rozdzielczości komórkowej, co prowadzi do identyfikacji typów komórek i regionów mózgu ważnych dla ryzyka choroby.