Name: Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj potok obliczeniowy NuMorph do analizy obrazów mózgów myszy z mikroskopii świetlnej. Metoda umożliwia wykrywanie jąder komórkowych i klasyfikację neuronów w całym mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH (R01MH121433, R01MH118349 i R01MH120125 do JLS oraz R01NS110791 do GW) oraz Fundację Nadziei. Dziękujemy Pablo Arielowi z Laboratorium Usług Mikroskopowych za pomoc w obrazowaniu próbek. Laboratorium Usług Mikroskopowych na Wydziale Patologii i Medycyny Laboratoryjnej jest częściowo wspierane przez Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 dla University of North Carolina (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Neuroscience Microscopy Core jest wspierany przez grant P30 NS045892. Badania opisane w tej publikacji były częściowo wspierane przez North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

<ol><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+Three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Hägerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+system%3A+studying+embryonic+development+with+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-optical+sectioning+tomography+to+obtain+a+high-resolution+atlas+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain.</a> Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).</li>
<li>Stoner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patches+of+disorganization+in+the+neocortex+of+children+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patches of disorganization in the neocortex of children with autism.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDISCO%3A+A+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing.</a> Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84(2021).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>Budday, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+gray+and+white+matter+brain+tissue+by+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).</li>
<li>Johnson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+morphologic+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+magnetic+resonance+histology%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology.</a> NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).</li>
<li>Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+scaling+rules+for+rodent+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cellular scaling rules for rodent brains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).</li>
<li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+tissue+clearing+for+whole-organ+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).</li>
<li>Fürth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+framework+for+whole-brain+maps+at+cellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).</li>
<li>Chandrashekhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CloudReg%3A+automatic+terabyte-scale+cross-modal+brain+volume+registration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration.</a> Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).</li>
<li>Krupa, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NuMorph%3A+Tools+for+cortical+cellular+phenotyping+in+tissue-cleared+whole-brain+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images.</a> Cell Reports. 37 (2), 109802(2021).</li>
<li>Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+neurodegenerative+disease+-+Alzheimer%27s+anatomical+and+amyloid+plaque+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging.</a> Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).</li>
<li>Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSL%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">FSL.</a> NeuroImage. 62, 782-790 (2012).</li>
<li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).</li>
<li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation%3A+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).</li>
<li>iDISCO method. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://idisco.info/">https://idisco.info/</a> (2022).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UltraMicroscope+II+-+A+User+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22University+of+North+Carolina+at+Chapel+Hill%22%5BJournal%5D)">UltraMicroscope II - A User Guide.</a> University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).</li>
<li>Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/anaconda/">https://docs.anaconda.com/anaconda/</a> (2022).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Communications. 8, 14836(2017).</li>
<li>Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elastix%3A+a+toolbox+for+intensity-based+medical+image+registration%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).</li>
<li>Lowe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sift-the+scale+invariant+feature+transform%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal%22%5BJournal%5D)">Sift-the scale invariant feature transform.</a> International Journal. 2 (91-110), 2(2004).</li>
<li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+image+analysis+and+anatomical+atlas+3D+generation+using+MagellanMapper%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper.</a> Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Velíšek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under+the+%28Light%29+sheet+after+the+iDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Currents+%2F+American+Epilepsy+Society%22%5BJournal%5D)">Under the (Light) sheet after the iDISCO.</a> Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).</li>
<li>ITK-SNAP home. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php">http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php</a> (2022).</li>
<li>Young, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+optimizing+3D+atlases+from+2D+data+with+application+to+the+developing+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain.</a> eLife. 10, (2021).</li>
<li>Yun, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+immunostaining+of+organ-scale+tissues+for+scalable+proteomic+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Silvestri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+autofocus+for+quantitative+volumetric+microscopy+of+whole+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains.</a> Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).</li>
<li>Frasconi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+automated+identification+of+mouse+brain+cells+in+confocal+light+sheet+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images.</a> Bioinformatics. 30 (17), 587(2014).</li>
<li>Kruskal, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+shortest+spanning+subtree+of+a+graph+and+the+traveling+salesman+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Mathematical+Society.+American+Mathematical+Society%22%5BJournal%5D)">On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem.</a> Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allen+mouse+brain+common+coordinate+framework%3A+A+3D+reference+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas.</a> Cell. 181, 936-953 (2020).</li>
<li>Borland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentor%3A+a+tool+for+manual+refinement+of+3D+microscopy+annotations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 260(2021).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Metody oczyszczania tkanek są przydatnymi technikami pomiaru organizacji komórkowej 3D mózgu. W literaturze opisano wiele metod oczyszczania tkanek, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia 6,7,8,9. Możliwości narzędzi obliczeniowych do analizy typów komórek na obrazach oczyszczonych z tkanek są stosunkowo ograniczone. Inne dostępne narzędzia zostały wdrożone w celu zmniejszenia rzadkich ...

Obrazowanie całego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki jest ważnym wyzwaniem w neurobiologii. Obrazy mózgu o rozdzielczości komórkowej pozwalają na szczegółową analizę i mapowanie obwodów mózgowych na poziomie systemu oraz tego, jak obwody te są zakłócane przez genetyczne lub środowiskowe czynniki ryzyka zaburzeń neuropsychiatrycznych, zachowania komórkowe w rozwijających się zarodkach, a także obwody neuronalne w mózgu dorosłego1,2,3. Istnieje wiele metod histologicznych, które pozwalają na uzyskanie obrazów zrekonstruowanego mózgu 3D w wysokiej rozdzielczości; jednak techniki te wymagają drogiego, specjalistycznego sprzętu, mogą nie być kompatybilne z immunoznakowaniem, a dwuwymiarowy (2D) charakter niektórych metod może prowadzić do uszkodzenia tkanek i ścinania podczas sekcji4,5.
Ostatnie osiągnięcia dostarczyły alternatywnego podejścia do obrazowania całych mózgów, które nie wymaga cięcia tkanek; polegają one na użyciu oczyszczania tkanek w celu uczynienia mózgów przezroczystymi. Przezroczystość osiąga się w większości metod oczyszczania tkanek zarówno poprzez usuwanie lipidów, ponieważ są one głównym źródłem rozpraszania światła, jak i dopasowanie współczynnika załamania światła (RI) obiektu do RI roztworu zanurzeniowego próbki podczas obrazowania. Światło może następnie przejść przez granicę między materiałami bez rozpraszania6,7,8,9.
Metody oczyszczania tkanek, takie jak iDISCO+, są często łączone z szybkim obrazowaniem 3D za pomocą mikroskopii wzbudzenia pojedynczych fotonów, takich jak LSFM6,7,10. W przezroczystych tkankach znakowanych fluoroforem, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego są wycinane przez wzbudzenie cienką płaszczyzną światła11. Główną zaletą LSFM jest to, że pojedyncza sekcja optyczna jest oświetlana na raz, a cała fluorescencja cząsteczek w tej sekcji jest wzbudzana, co minimalizuje fotowybielanie. Co więcej, obrazowanie całego wycinka optycznego umożliwia wykrywanie tego wzbudzonego wycinka za pomocą kamery, zwiększając prędkość w stosunku do skanowania punktowego12. LSFM nieniszcząco wytwarza dobrze zarejestrowane przekroje optyczne, które nadają się do rekonstrukcji 3D.
Podczas gdy metoda iDISCO+ pozwala na niedrogie usunięcie tkanek w ciągu ~3 tygodni, etapy odwodnienia w protokole mogą prowadzić do kurczenia się tkanek i potencjalnej zmiany morfologii próbki, wpływając w ten sposób na pomiary objętościowe6,10. Dodanie wtórnej metody obrazowania, takiej jak rezonans magnetyczny, która ma być stosowana przed procedurą oczyszczania tkanek, może zmierzyć stopień skurczu wywołanego oczyszczaniem tkanki w próbce. Podczas etapów odwodnienia różnice we właściwościach mechanicznych między istotą szarą i białą mogą prowadzić do niejednorodnych deformacji materii mózgowej, co skutkuje odmiennymi deformacjami objętości wywołanymi oczyszczaniem tkanek między próbkami typu dzikiego i zmutowanego i może zakłócać interpretacje różnic objętościowych w tych próbkach<klasa SUP="xref">10,<klasa SUP="xref">13. MRI wykonuje się poprzez najpierw perfuzję zwierzęcia środkiem kontrastowym (np. gadolinem), a następnie inkubację wyekstrahowanej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania w roztworze immersyjnym (np. fomblinie) przed obrazowaniem14. MRI jest kompatybilny z oczyszczaniem tkanek i wykonywaniem LSFM na tej samej próbce.
LSFM jest często używany do tworzenia wielkoskalowych obrazów mikroskopowych do jakościowej wizualizacji tkanki mózgowej będącej przedmiotem zainteresowania, a nie do ilościowej oceny struktury mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Bez oceny ilościowej trudno jest wykazać różnice strukturalne wynikające z urazów genetycznych lub środowiskowych. Wraz z poprawą technologii oczyszczania tkanek i obrazowania, a także zmniejszeniem kosztów przechowywania i mocy obliczeniowej, ilościowe określanie lokalizacji typów komórek w tkance będącej przedmiotem zainteresowania staje się coraz bardziej dostępne, co pozwala większej liczbie badaczy na uwzględnienie tych danych w swoich badaniach.
Z ponad 100 milionami komórek w mózgu myszy15 i sesjami obrazowania całego mózgu, które mogą generować terabajty danych, istnieje zwiększone zapotrzebowanie na zaawansowane narzędzia do analizy obrazów, które pozwalają na dokładne określenie ilościowe cech na obrazach, takich jak komórki. Istnieje wiele metod segmentacji dla obrazów wyczyszczonych tkankowo, które stosują progi intensywności barwienia jądrowego i filtrują obiekty o predefiniowanych kształtach, rozmiarach lub gęstościach10,16,17,18. Jednak niedokładne interpretacje wyników mogą wynikać z różnic w parametrach, takich jak rozmiar komórki, kontrast obrazu i intensywność etykietowania. W tym artykule opisano nasz ustalony protokół ilościowego oznaczania jąder komórkowych w mózgu myszy. Najpierw szczegółowo opisujemy kroki pobierania tkanek z mózgu myszy P4, a następnie protokół oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego zoptymalizowany na podstawie publicznie dostępnej metody iDISCO+10. Po drugie, opisujemy akwizycję obrazu za pomocą rezonansu magnetycznego i mikroskopii arkuszowej, w tym parametry używane do przechwytywania obrazów. Na koniec opisujemy i demonstrujemy NuMorph19, zestaw narzędzi do analizy obrazu opracowanych przez naszą grupę, które umożliwiają kwantyfikację specyficzną dla typu komórki po oczyszczeniu tkanki, znakowaniu immunologicznym za pomocą markerów jądrowych i obrazowaniu obszarów z adnotacjami za pomocą arkusza świetlnego.

<table><tbody><tr><td>Skaner MRI Bruker 9,4 T/30 cm</td><td>Bruker Biospec</td><td></td><td>System rezonansu magnetycznego zwierząt z otworem poziomym</td></tr><tr><td>Eter dibenzylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher-Scientific</td><td>ICN19605590</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EVO 860 4TB zewnętrzny dysk SSD</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fomblin Y</td><td>Speciality Fluids Company</td><td>YL-VAC-25-6</td><td>perfluoropolieterowy środek</td></tr><tr><td>kontrastowy gadolinu (ProHance)</td><td>Bracco Diagnostics</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>gadolinowy środek kontrastowy (ProHance)</td><td>Bracco Diagnostics</td><td>0270-1111-03</td><td></td></tr><tr><td>Karta graficzna GeForce GTX 1080 Ti 11GB EVGA</td><td></td><td>08G-P4-6286-KR</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td>Rozpuszczona w H2O do 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru, 30%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazów</td> <td>mikroskopu ImSpector Pro</td><td>LaVision BioTec</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do segmentacji</td> <td>ITK Snap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher-Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>MVPLAPO 2x/0.5 NA Obiektyw</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, proszek, 95% (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>rozpuszczony w 1x PBS do 4%</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem 10x (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>Rozcieńczony do 1x w H2O</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>Rozpuszczony w H2O do 10%</td></tr> <tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol typ NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NP40S-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher-Scientific</td><td>BP337 500</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikroskop II Mikroskop arkuszowy światła</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xeon Procesor E5-2690 v4</td><td>Intel</td><td>E5-2690</td><td></td></tr><tr><td>Zyla sCMOS</td><td>Kamera ior</td><td></td><td>Komplementarna kamera półprzewodnikowa z tlenkiem metalu</td></tr> <tr><td><silny>Przeciwciało< / silny></td><td></td><td></td><td><silny>Stężenie robocze< / silny></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11369</td><td>(1:50)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11077</td><td>(1:200)</td></tr><tr><td>Szczur anty-Ctip2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td>(1:400)</td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td> <td>królika anty-Brn2</td><td>12137</td><td>(1:100)</td></tr><tr><td>To-Pro 3 (TP3)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>T3605</td><td>(1:400)</td></tr></tbody></table>

obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Oczyszczanie tkanek, a następnie mikroskopia świetlna (LSFM) umożliwia obrazowanie nienaruszonej struktury mózgu w rozdzielczości komórkowej, umożliwiając ilościową analizę zmian strukturalnych spowodowanych zaburzeniami genetycznymi lub środowiskowymi. Obrazowanie całego mózgu skutkuje dokładniejszą kwantyfikacją komórek i badaniem różnic specyficznych dla regionu, które mogą zostać pominięte w przypadku powszechnie stosowanej mikroskopii fizycznie wyciętej tkanki. Użycie mikroskopii arkuszowej światła do obrazowania oczyszczonych mózgów znacznie zwiększa szybkość akwizycji w porównaniu z mikroskopią konfokalną. Chociaż obrazy te generują bardzo duże ilości danych strukturalnych mózgu, większość narzędzi obliczeniowych, które przeprowadzają kwantyfikację cech na obrazach oczyszczonej tkanki, ogranicza się do zliczania rzadkich populacji komórek, a nie wszystkich jąder.
Tutaj demonstrujemy NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), grupę narzędzi analitycznych, do ilościowego oznaczania wszystkich jąder i markerów jądrowych w opisanych regionach mózgu myszy po urodzeniu w 4. dniu (P4) po oczyszczeniu i zobrazowaniu pod mikroskopem świetlnym. Opisujemy obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) w celu pomiaru objętości mózgu przed skurczem spowodowanym etapami odwodnienia oczyszczania tkanek, oczyszczania tkanek metodą iDISCO+, w tym znakowania immunologicznego, a następnie mikroskopii świetlnej przy użyciu dostępnej na rynku platformy do obrazowania mózgów myszy w rozdzielczości komórkowej. Następnie demonstrujemy ten potok analizy obrazu za pomocą NuMorph, który służy do korygowania różnic intensywności, łączenia kafelków obrazu, wyrównywania wielu kanałów, liczenia jąder i opisywania regionów mózgu poprzez rejestrację w publicznie dostępnych atlasach.
Zaprojektowaliśmy to podejście, korzystając z publicznie dostępnych protokołów i oprogramowania, umożliwiając każdemu badaczowi dysponującemu niezbędnym mikroskopem i zasobami obliczeniowymi wykonywanie tych technik. Te narzędzia do oczyszczania, obrazowania i obliczeń tkanek umożliwiają pomiar i kwantyfikację trójwymiarowej (3D) organizacji typów komórek w korze mózgowej i powinny być szeroko stosowane w każdym projekcie badania myszy typu dzikiego/nokautowego.

Ponieważ protokół iDISCO+ powoduje znaczny skurcz tkanek, który jest łatwo zauważalny gołym okiem (Rysunek 2B), do tego schematu dodaliśmy etap obrazowania MRI przed klarowaniem tkanek, aby ilościowo ocenić skurcz wywołany procesem klarowania. Procedura rozpoczyna się od usunięcia z obrazu MR tkanek innych niż mózg (Rysunek 2C). Następnie zastosowano transformację sztywną (3 kąty translacji i 3 kąty rotacji), aby dopasować obraz MR do obrazu z mikroskopu z arkus...

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Przy około 100 milionach komórek w mózgu myszy i rozmiarach obrazów o rozdzielczości komórkowej całego mózgu zbliżających się do skali terabajtów, potrzebne są zaawansowane narzędzia do analizy obrazu, aby dokładnie określić ilościowo komórki. Nasz potok obliczeniowy może wstępnie przetwarzać obrazy i określać ilościowo jądra w korze myszy, zachowując rozsądny kompromis między dokładnością wykrywania komórek, czasem obrazowania i zasobami obliczeniowymi. Procedurę zademonstrują Felix Kyere i Ian Curtin, doktoranci z mojego laboratorium.Aby rozpocząć, zamontuj próbkę w uchwycie o odpowiednim rozmiarze próbki, tak aby próbka była zorientowana z wymiarem z na głębokość nie większą niż 5.2 milimetra ze względu na znamionową odległość roboczą mikroskopu UltraMicroscope II. Następnie włóż uchwyt do kołyski na próbkę tak, aby śruba uchwytu była ustawiona pod kątem 45 stopni do wsporników kołyski. Następnie umieść kołyskę w takiej pozycji, aby próbka była zorientowana prostopadle do ścieżki światła.Następnie ustaw korpus zoomu w mikroskopie na powiększenie 4x lub większe, co daje 0,75 mikrometra na piksel. W oprogramowaniu Inspector Pro wybierz pojedynczy arkusz świetlny o numerycznej wartości przysłony około 0,08. Aby zapewnić zachowanie rozdzielczości osiowej na całej szerokości obrazu, wybierz opcję Horizontal Dynamic Focus (Dynamiczne ogniskowanie w poziomie) i zastosuj zalecaną liczbę kroków w zależności od długości fali lasera.Następnie dostosuj precyzyjną ostrość dla każdego kanału w odniesieniu do kanału rejestracji i moc lasera na kanał w odniesieniu do właściwości kanału. Następnie dostosuj szerokość jasnego arkusza do około 50%, aby zapewnić optymalne rozłożenie mocy arkusza w wymiarze y dla wielkości próbki. Następnie ustaw liczbę kafelków w stosunku do rozmiaru próbki z zalecanym nakładaniem się 15% między kafelkami i przechwytuj obrazy dla każdego kanału sekwencyjnie dla każdego stosu w danej pozycji kafelka.Najpierw pobierz i zainstaluj menedżera środowiska Conda dla narzędzi do przetwarzania obrazów Linux i NuMorph. W wierszu polecenia uruchom polecenie matlab i NM_setup. m z NuMorph, aby pobrać i zainstalować pakiety oprogramowania do analizy obrazu potrzebne do analizy.Następnie określ nazwy próbek, katalogi wejściowe i wyjściowe, informacje o kanałach i parametry obrazowania arkusza świetlnego, edytując plik NM_samples.m. Aby dostosować intensywność, w NMp_template ustaw intensywność dopasowania na wartość true i use_processed_images jako false podczas pracy z nowym zestawem obrazów. Następnie ustaw save_images i save_samples jako true.Następnie ustaw cieniowanie płytek na podstawowe, aby zastosować korekcję cieniowania przy użyciu algorytmu podstawowego, lub ręczne, aby zastosować korekcję cieniowania płytek przy użyciu pomiarów z UltraMicroscope II przy określonych szerokościach arkusza światła. Aby wyrównać kanał obrazu, w NMp_template ustaw channel_alignment na true, a kanał alignment_method na translację lub elastyczne. Następnie ustaw wartość sift_refinement na wartość true i wartość nakładania się na 0,15, aby dopasować nakładanie się kafelków podczas obrazowania.Aby uruchomić kroki przetwarzania wstępnego w programie MATLAB, określ nazwę próbki i ustaw konfigurację na NM_config próbki procesu. Następnie uruchom dowolny z kroków przetwarzania wstępnego, określając ścieg konfiguracji NM_process podczas określania etapu przy użyciu intensywności, wyrównania lub ściegu, a następnie sprawdź katalog wyjściowy dla plików wyjściowych dla każdego z etapów. Zacznij od obrazu atlasu 3D i powiązanego obrazu adnotacji, który przypisuje każdy woksel do określonej struktury.Wyrównaj zarówno obraz atlasu, jak i plik adnotacji, aby upewnić się, że są prawidłowo dopasowane we właściwej orientacji. Po wyrównaniu przetwórz pliki w NuMorph, aby określić dane wejściowe zgodnie z opisem w manuskrypcie, wykonując polecenie. W NMa_template ustaw resample_images na wartość true i resample_resolution tak, aby pasowała do atlasu.Następnie określ numer kanału, który ma zostać ponownie próbkowany za pomocą resample_channels. Następnie ustaw register_images na true, określ atlas_file pasujący do pliku w katalogu Atlas i ustaw registration_parameters jako domyślne. Następnie ustaw save_registered_images na wartość true.W przypadku wykrywania jąder, zliczania i klasyfikacji komórek ustaw zarówno count_nuclei, jak i classify_cells jako true. Następnie ustaw count_method na 3dunet i min_intensity zdefiniować minimalny próg intensywności dla wykrywanych obiektów. Następnie ustaw classify_method na próg, który jest oparty na nienadzorowanej intensywności fluorescencji w pozycjach środka ciężkości, lub SVM, który modeluje nadzorowany liniowy klasyfikator maszynowy wektora nośnego.Aby wykonać kroki analizy w programie MATLAB, określ nazwę próbki i ustaw konfigurację na NM_config analizować próbkę. Następnie uruchom dowolny z kroków analizy, określając etap konfiguracji, określając etap konfiguracji NM_analyze jednocześnie określając etap przy użyciu polecenia resample, register, count lub classify i sprawdź katalog wyjściowy dla plików wyjściowych dla każdego z etapów. W NMe_template ustaw wartość update na wartość true i compare_structures_by na dowolny indeks.Następnie ustaw plik szablonu i tabelę struktury, która określa wszystkie możliwe indeksy struktury i struktury do oceny, określając jednocześnie zliczanie komórek i klasyfikację typów komórek. Oczyszczanie tkanek za pomocą protokołu iDISCO+ i markerów jąder specyficznych dla warstwy neuronalnej zaowocowało jasno zdefiniowanymi grupami komórek neuronów górnej i dolnej warstwy w izokorze. Zliczanie komórek przy użyciu NuMorph zależało od udanych etapów przetwarzania wstępnego, w tym regulacji intensywności, wyrównania kanałów i zszywania.Jednak błędy na etapach przetwarzania wstępnego mogą skutkować nieprawidłowym łączeniem, prowadzącym do nieprawidłowego wyrównania i zszywania, a tym samym powstaniem obrazów z ostrym i nieostrym wzorcem. Aby policzyć jądra z określonych regionów mózgu, zszyte obrazy zostaną oznaczone adnotacjami za pomocą Atlasu, co pozwoli na nałożenie adnotacji na obszary mózgu. Centroidy jąder wykryto za pomocą wytrenowanego modelu 3D U-Net w NuMorph z około 12 milionami całkowitych jąder, które były TO-PRO-3-dodatnie w izokorze z około 2,6 milionami jąder dwudodatnich w mózgu i 1,6 miliona jąder CTIP2-dodatnich.Wykryto odpowiednio około 3,7 i 2,9 miliona TO-PRO-3-dodatnich jąder całkowitych w zwojach podstawy i korze allokorowej hipokampa. Jednak dwudodatnie komórki mózgu wykryte w tych dwóch regionach mózgu były znikome i tylko około 1,5 na mniej niż milion komórek CTIP2-dodatnich wykryto w zwojach podstawy i allokorze hipokampa. Przeprowadzaj wizualne kontrole jakości podczas pozyskiwania, aby osiągnąć dobrą segmentację.I prawidłowo skonfiguruj środowisko Conda, aby upewnić się, że nie wystąpią żadne błędy w dalszej analizie. Oprócz zliczania komórek, proces ten pozwala na integrację z innymi narzędziami do segmentacji, które mierzą rozmiar i kształt komórek, które można następnie porównać między grupami genotypów. Dzięki naszemu potokowi możemy określić, jak zmienia się anatomia mózgu w rozdzielczości komórkowej, co prowadzi do identyfikacji typów komórek i regionów mózgu ważnych dla ryzyka choroby.

whole-brain-single-cell-imaging-analysis-intact-neonatal-mouse-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu klarowaniu organu przed obrazowaniem, jednak nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę klarowania optycznego z dehydratacją opartą na etanolu oraz klarowaniem za pomocą mieszaniny alkoholu benzylowego i benzojanu benzylowego, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.

Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Prezentujemy protokół obrazowania in vivo dwufotonowego do obrazowania kory mózgowej noworodków myszy. Metoda ta jest odpowiednia do analizy dynamiki rozwojowej neuronów korowych, mechanizmów molekularnych kontrolujących dynamikę neuronów oraz zmian w dynamice neuronów w modelach chorób.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie neuronów korowych u nowonarodzonych myszy

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

To badanie opisuje etapy uzyskiwania obrazów mózgów noworodków myszy w wysokiej rozdzielczości poprzez połączenie mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) i środka kontrastowego w próbkach ex vivo. Opisujemy podstawowe analizy morfometryczne w celu ilościowego określenia wielkości i kształtu mózgu na tych obrazach.

Obrazowanie mikro-CT i analiza morfometryczna mózgów noworodków myszy

Podstawowe obszary czuciowe w korze nowej wykazują unikalne spontaniczne działania podczas rozwoju. W tym artykule opisano, jak wizualizować aktywność poszczególnych neuronów i podstawowych obszarów czuciowych w celu analizy synchronicznych działań specyficznych dla danego obszaru u noworodków myszy in vivo.

Wizualizacja in vivo spontanicznej aktywności w korze czuciowej noworodków myszy w rozdzielczości pojedynczego neuronu

Poznaj potok obliczeniowy NuMorph do analizy obrazów mózgów myszy z mikroskopii świetlnej. Metoda umożliwia wykrywanie jąder komórkowych i klasyfikację neuronów w całym mózgu.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Przeglądaj więcej filmów