Name: Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę utrwalania i barwienia zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu przy użyciu mikroskopii świetlnej. Technika umożliwia wizualizację endogennych białek sygnałowych w cytonemach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obrazy zostały uzyskane za pomocą mikroskopów utrzymywanych przez Cell and Molecular Biology Imaging Core w St. Jude Children's Research Hospital. Szczepy myszy uzyskano z JAX. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health grant R35GM122546 (SKO) oraz przez ALSAC z St. Jude Children's Research Hospital.

Ten protokół jest zgodny z zatwierdzonymi wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz St. Jude Children's Research Hospital. Wszystkie szczepy zostały skrzyżowane wstecznie pięć generacji ze szczepem C57BL/6J.
1. Izolacja zarodków i barwienie całego wierzchowca
<ol>
	<li>Hoduj 6-tygodniowe samice i monitoruj obecność czopa pochwowego.</li>
	<li>Poddanie ciężarnej matki eutanazji poprzez wdychanie CO2 w komorze CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi AVMA18. Wykonaj nacięcie w kształcie litery Y w jamie otrzewnej za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy. Wyciąć macicę zawierającą zarodki E9.5 zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Rozbioruj zarodki na kompletnym pożywce wzrostowej (zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle Medium, uzupełnione nieistotnymi aminokwasami, Na-pirogronianem, L-glutaminą i 10% płodową surowicą bydlęcą). Użyj kleszczyków, aby usunąć woreczek żółtkowy, łożysko i otaczające błony. 
	UWAGA: W razie potrzeby zachowaj każdy woreczek żółtkowy do genotypowania zarodków.</li>
	<li>Wypłucz izolowane zarodki w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS), aby usunąć resztki tkanki owodniowej i krwi.</li>
	<li>Przygotuj utrwalacz. Dodaj paraformaldehyd (PFA) do HBSS, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 4% PFA. 
	UWAGA: PFA jest toksyczną substancją chemiczną, dlatego należy unikać wdychania lub bezpośredniego narażenia skóry. Przygotowanie roztworu utrwalającego odbywa się pod wyciągiem z użyciem odpowiednich środków ochrony indywidualnej w postaci rękawic i fartucha laboratoryjnego.</li>
	<li>Dodać 1 ml utrwalacza do każdego dołka 24-dołkowej płytki i umieścić każdy zarodek w osobnym dołku. Inkubować zarodki w utrwalaczu przez 45 minut, delikatnie mieszając na bujaku. 
	UWAGA: Krytyczne: Wszystkie płukania i inkubacje muszą być wykonywane z delikatnym mieszaniem (maksymalnie 20 obr./min) na kołysce lub wytrząsarce okrągłej, ponieważ nagłe obchodzenie się lub ruch zarodków zniszczy utrwalone cytonemy. Użyj pipety, aby delikatnie usunąć wszystkie roztwory.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i umyć zarodki 3 x 30 minut w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z Ca2+ i Mg2+ z dodatkiem 0,1% Trytonu.</li>
	<li>Po umyciu inkubować zarodki w roztworze blokującym (PBS z Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tritonem i 5% surowicą kozią) z delikatnym mieszaniem. Blok 2 x 1 h. Po drugiej inkubacji blokującej należy wykonać jedno szybkie płukanie zarodków świeżym roztworem blokującym.</li>
	<li>Na drugim etapie blokowania przygotuj roztwór przeciwciała pierwszorzędowego11. Rozcieńczyć przeciwciała do optymalnego stężenia w PBS za pomocą Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tween-20 i 5% surowicy koziej. 
	UWAGA: W celu lepszej wizualizacji GFP membranowego można zastosować anty-GFP kurczaka (1:250).</li>
	<li>Usuń roztwór blokujący i dodaj 1 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 4 °C z delikatnymi rotacjami przez 3 dni.</li>
	<li>Po inkubacji przeciwciał pierwotnych umyj zarodki 5 x 1 h z prędkością 20 obr./min na bujaczku w PBS z Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tween-20 i 5% surowicą kozią.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego przy użyciu wtórnych fragmentów F(ab')2 w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS z Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tween-20 i 5% surowicy koziej. 
	UWAGA: Zastosowanie fragmentów F(ab')2 znacznie zwiększa penetrację przeciwciał do próbki.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. Inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C w ciemności przez 3 dni. 
	UWAGA: Ważne: Od tego momentu zminimalizuj ekspozycję zarodka na bezpośrednie światło. Opcjonalnie: Aby zapobiec rozwojowi bakterii, dodaj 0,2% azydku sodu do roztworu przeciwciał drugorzędowych.</li>
	<li>Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciał i umyć zarodki 3 x 30 minut w PBS z Ca2 + i Mg2 +, 0,1% Tween-20 i 5% kozią surowicą. Jeśli nie wykonujesz barwienia aktyny falloidyną lub innymi barwnikami aktyny, po pierwszym myciu dodaj 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) do PBS z Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tween-20 i 5% surowicy koziej i inkubuj przez 1 godzinę, a następnie 3 x 30 min płukania, jak opisano powyżej. 
	UWAGA: W tym momencie zarodki mogą być przechowywane przez noc w temperaturze 4 °C w PBS lub HBSS w ciemności aż do etapu osadzania następnego dnia. Zaleca się jednak, aby zarodki zostały natychmiast osadzone i poddane sekcji.</li>
</ol>
2. Osadzanie, cięcie i montowanie zarodków
<ol>
	<li>Przygotować 4% w/v roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP) rozpuszczony w HBSS lub PBS z Ca2+ i Mg2+ do końcowej objętości ~ 3 ml na zarodek. Dodać odpowiednią masę agarozy LMP do HBSS lub PBS z Ca2+ i Mg2+ i podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż agaroza LMP się rozpuści. 
	UWAGA: Po rozpuszczeniu agarozy LMP należy przechowywać roztwór w kąpieli perełkowej, inkubatorze lub łaźni wodnej ustawionej na 55 °C, aby zapobiec zestaleniu się roztworu agarozy LMP.</li>
	<li>Użyj 12-dołkowej płytki jako formy do osadzania zarodków. Umieścić 12-dołkową płytkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 55 °C. Dodaj 2,5-3 ml 4% agarozy LMP do każdej studzienki, w której znajdzie się zarodek. 
	UWAGA: Chociaż można stosować inne formy, objętości płytek 12-dołkowych są optymalne do przygotowania bloku agarozy na późniejszych etapach do krojenia.</li>
	<li>Za pomocą perforowanej łyżki przenieś zarodki do indywidualnych studzienek zawierających 4% roztwór agarozy LMP (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A).
	<ol>
		<li>Przenieś 12-dołkową płytkę z wanny perełkowej na blat. Użyj końcówek pipet, aby delikatnie osadzić i ustawić zarodek tak, aby był wyśrodkowany w roztworze. Po ustawieniu zarodków należy umieścić płytkę w temperaturze -20 °C na 10 minut, aby umożliwić szybkie zestalenie bloku. 
		KRYTYCZNE: Upewnij się, że zarodek jest umieszczony w środku bloku. Zarodki, które opadają na dno lub znajdują się zbyt blisko krawędzi formy, prawdopodobnie zostaną usunięte z bloku agarozy podczas cięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń cały blok agarozy ze studzienki za pomocą skalpela i przetnij prostokątny blok wokół zarodka, pozostawiając ~0,3 cm bloku z każdej strony. Pozostaw dodatkową długość wzdłuż ogonowego końca zarodka. Po zamontowaniu na wibratomie ustaw zarodek w pozycji pionowej w górnej części bloku (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B).</li>
	<li>Przyłóż pasek taśmy do uchwytu próbki wibratomu i przyklej blok agarozy do taśmy, zorientowany tak, aby ostrze wygenerowało osiowe sekcje zarodka w sekwencji od przodu (czaszki) do tyłu.</li>
	<li>Napełnij komorę wibratomu zimnym HBSS, aby upewnić się, że próbka jest całkowicie zanurzona, a następnie otocz komorę lodem.</li>
	<li>Ustaw prędkość wibratomu na 0,2 mm/s i częstotliwość od 5 do 7 (50-70 Hz) przy grubości cięcia ustawionej na 100 μm. Wykonaj seryjne cięcie osiowe zarodka. 
	UWAGA: Do cięcia używaj niskiej prędkości. Jeśli prędkość cięcia zostanie zwiększona powyżej 0,25 mm/s, cięcie może rozerwać zarodek lub usunąć zarodek z bloku.
	<ol>
		<li>Podczas serii krojenia za pomocą kleszczyków delikatnie przełóż poszczególne sekcje do osobnego naczynia o średnicy 60 mm wypełnionego HBSS. Użyj kleszczy, aby chwycić blok, a nie tkankę, aby uniknąć uszkodzenia tkanek i zniszczenia cytonemu. 
		UWAGA: Wycinki tkanek powinny pozostać w obrębie bloku agarozowego. Jeśli tkanka wypadnie z bloku do komory wibratomowej, delikatnie przenieś, podnosząc wycinek. Nie chwytaj ani nie ściskaj chusteczki. KRYTYCZNE: Każde fałdowanie skrawków tkanek lub nagłe obchodzenie się z nimi spowoduje zniszczenie utrwalonych cytonemów w skrawkach tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli nie wykonujesz barwienia F-aktyną, przejdź do kroku 2.10.
	<ol>
		<li>Aby wykonać barwienie F-aktyną, usuń HBSS i inkubuj skrawki przez 40 minut z roztworem Actin-Red i DAPI rozcieńczonym w PBS z Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tween-20 i 5% surowicą kozią w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć sekcje 3 x 20 min w PBS z Ca2+ i Mg2+ oraz 0,1% Tween-20.</li>
	<li>Za pomocą markera hydrofobowego narysuj hydrofobową barierę wokół krawędzi naładowanego szkiełka mikroskopowego i dodaj niewielką objętość HBSS, aby wypełnić obszar.</li>
	<li>Użyj kleszczyków lub perforowanej łyżki, aby przenieść sekcje na szkiełko. 
	UWAGA: Wszelkie skrawki tkanek, które nie są otoczone agarozą, można przenieść za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Usuń nadmiar bloku agarozy za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Po przeniesieniu wszystkich sekcji na szkiełko, usuń nadmiar płynu za pomocą pipetowania i rogu chusteczki chłonnej, a następnie dodaj kilka kropli podłoża mocującego do szkiełka. Użyj wystarczającej ilości podłoża montażowego, aby pokryć cały obszar szkiełka nakrywkowego po utwardzeniu. Zamontuj szkiełko nakrywkowe, delikatnie umieszczając je na szkiełku. 
	UWAGA: Unikaj wywierania nacisku lub przeszkadzania szkiełku nakrywkowego, dopóki medium montażowe nie utwardzi się.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie skrawków tkanek pod dowolnym mikroskopem konfokalnym lub mikroskopem o wyższej rozdzielczości11. Przeanalizuj co najmniej trzy zarodki na genotyp. 
	UWAGA: Obrazy skrawków tkanek uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego TCS SP8 STED 3x, a następnie przeprowadzono dekonwolucję LIGHTNING.</li>
</ol>

<ol><li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Diffusion in embryogenesis.</a> Nature. 225 (5231), 420-422 (1970).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+freely+diffusible+form+of+Sonic+hedgehog+mediates+long-range+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling.</a> Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).</li>
<li>Yu, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+extracellular+diffusion+creates+the+Dpp+morphogen+gradient+of+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc.</a> Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).</li>
<li>Ribes, V., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+and+interpreting+graded+Sonic+Hedgehog+signaling+during+vertebrate+neural+tube+patterning%3A+the+role+of+negative+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014(2009).</li>
<li>Le Dréau, G., Martí, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+of+the+neural+tube%3A+a+tale+of+three+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals.</a> Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).</li>
<li>Kornberg, T. B., Guha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+morphogen+gradients%3A+a+problem+of+dispersion+and+containment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 17 (4), 264-271 (2007).</li>
<li>Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes%3A+cellular+processes+that+project+to+the+principal+signaling+center+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs.</a> Cell. 97 (5), 599-607 (1999).</li>
<li>Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+filopodia+direct+long-range+transport+of+SHH+during+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning.</a> Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).</li>
<li>Bischoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+are+required+for+the+establishment+of+a+normal+Hedgehog+morphogen+gradient+in+Drosophila+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia.</a> Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).</li>
<li>Hall, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme+delivery+of+sonic+hedgehog+from+ligand-producing+cells+requires+Myosin+10+and+a+dispatched-BOC%2FCDON+co-receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex.</a> eLife. 10, 61432(2021).</li>
<li>Huang, H., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+must+express+components+of+the+planar+cell+polarity+system+and+extracellular+matrix+to+support+cytonemes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes.</a> eLife. 5, 18979(2016).</li>
<li>Brunt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vangl2+promotes+the+formation+of+long+cytonemes+to+enable+distant+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/β-catenin signaling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2058(2021).</li>
<li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624(2014).</li>
<li>Mattes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2FPCP+controls+spreading+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signals+by+cytonemes+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Wnt/PCP controls spreading of Wnt/β-catenin signals by cytonemes in vertebrates.</a> eLife. 7, 36953(2018).</li>
<li>Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fixation+method+to+preserve+cultured+cell+cytonemes+facilitates+mechanistic+interrogation+of+morphogen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport.</a> Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).</li>
<li>Hall, E. T., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserve+cultured+cell+cytonemes+through+a+modified+electron+microscopy+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation.</a> Bio-protocol. 8 (13), (2018).</li>
<li>American Veterinary Medical Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals%5BTitle%5D)+AND+%22American+Veterinary+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">AVMA guidelines for the euthanasia of animals.</a> American Veterinary Medical Association. , (2020).</li>
<li>Harfe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-528 (2004).</li>
<li>Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord-derived+Shh+concentrates+in+close+association+with+the+apically+positioned+basal+body+in+neural+target+cells+and+forms+a+dynamic+gradient+during+neural+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning.</a> Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBacallao%2C+R+%22Handbook+Of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook Of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Springer US. 368-380 (2006).</li>
<li>Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+glutaraldehyde+fixation.+A+new+procedure+based+on+the+Schiff-quenching+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method.</a> Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+tissue+clearing+%28PACT%29%3A+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence%2C+histology%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+fluorescent+imaging+in+scattering+specimens+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Protokół ten został opracowany w celu zachowania delikatnych cytonemów w skrawkach tkanki embrionalnej do mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości. Do tej pory wizualizacja cytonemów w tkankach różnych organizmów modelowych opierała się w dużej mierze na ektopowej ekspresji białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą obrazowania żywych tkanek. Niestety, stosowanie znakowanego fluorescencyjnie obrazowania na żywo rzadko sprzyja analizie białek o endogennej ekspresji, może wprowadzać ograniczenia czasowe i wymaga specjalistycznych etapów obrazowania i mikroskopów. Opisana tutaj metoda barwienia i cięcia zachowuje cytonemy i inne rozszerzenia komórkowe, aby umożliwić immunohistochemię w celu ostatecznego wykrycia białek o ekspresji endogennej. Technologia ta umożliwi uzyskanie nowych informacji na temat tego, w jaki sposób morfogeny są transportowane przez różne tkanki in vivo , i rozszerzy zakres systemów modelowych, w których można badać cytonemy.
Protokół ten wykorzystuje barwienie całościowe i grube przekroje wibratomowe, co pozwala uniknąć stosowania roztworu równoważącego, takiego jak glicerol lub roztworów krioprotekcyjnych, takich jak sacharoza. Ma na celu zminimalizowanie obsługi tkanek podciętych, aby umożliwić maksymalne zachowanie rozszerzeń komórkowych. Zmniejszone obchodzenie się z tkanką po przekroju zapewniło konsekwentnie lepsze wyniki w ogólnym zachowaniu cytonemu. Tak więc sekcja zarodka jest jednym z ostatnich etapów przed obrazowaniem.
MEM-fix, technika utrwalania opracowana w celu zachowania cytonemów hodowanych komórek, składa się z połączenia aldehydu glutarowego i PFA, które pozwala na lepsze zachowanie 3D wrodzonej architektury komórek porównywalnej z ich żywymi wymiarami16,17. Niestety, MEM-fix nie był przydatny do utrwalania zarodków, ponieważ aldehyd glutarowy może ulegać autofluorescencji i poważnie ogranicza penetrację przeciwciał i wiązanie epitopów w komórkach ze względu na wysoką aktywność sieciowania białek22,23. W związku z tym zoptymalizowano protokoły sekcji po utrwaleniu PFA, aby umożliwić zachowanie rozszerzeń komórkowych w tkance embrionalnej. Chociaż PFA może zachowywać rozszerzenia podobne do cytonemu w tkance embrionalnej, analizę obrazu należy przeprowadzać z ostrożnością. PFA może powodować częściowe odwodnienie pojedynczych komórek i tkanek, co prowadzi do niewielkiego zmniejszenia objętości i tworzenia się małych przestrzeni zewnątrzkomórkowych w utrwalonej tkance.
Protokół ten pozwala uniknąć dodatkowych etapów nasycania sacharozy w celu krioprotekcji i oczyszczania tkanek, ponieważ roztwory sacharozy lub glicerolu mogą powodować niewielkie ponowne nasycenie tkanki24. Powstały niewielki obrzęk może zniszczyć stałe rozszerzenia komórkowe i cytonemy migrujące między komórkami i przez tkanki. Było to widoczne przy porównaniu grubościennych wibratomów z kriostatami. Chociaż zwiększenie grubości tkanki poprawiło zachowanie nienaruszonych cytonemów, skrawki kriostatu ponownie nasycone sacharozą konsekwentnie miały mniejszą częstość występowania wykrywalnych cytonemów.
Optymalizacja tego protokołu wykazała, że skrawki o grubości 100 μm były najlepsze dla zapewnienia zachowania nienaruszonych cytonemów. Cieńsze skrawki są zwykle używane do obrazowania, ponieważ większość mikroskopów konfokalnych jest w stanie obrazować tylko w wystarczającej rozdzielczości, aby uwidocznić rozszerzenia komórkowe na głębokość ~20-40 μm bez usuwania25. Jednak siły mechaniczne i zniekształcenia wywierane na komórki embrionalne z ostrza podczas cięcia cienkich odcinków niszczą cytonemy. Grubsze sekcje pozwalają na uzyskanie większego obszaru głębokości w przekroju, przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonych wyciągów w tkance. Dodatkowo zastosowanie grubszych odcinków pozwala na łatwość obsługi, aby zapobiec nadmiernemu fałdowaniu lub wyboczeniu skrawków tkanki.
Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem maksymalnego zachowania cytonemów w tkance zarodków myszy E8-10,5. Minimalna manipulacja tkanką po przekroju zapewniła konsekwentną poprawę ogólnego zachowania cytonemu. Jest prawdopodobne, że konieczna będzie dalsza optymalizacja, aby dostosować technikę do późniejszych etapów rozwoju i wycinków tkanek dorosłych ze względu na zwiększony rozmiar i złożoność tkanki. Będzie to wymagało cięcia, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego. Taka tkanka może wymagać dodatkowych etapów oczyszczania i dostosowania obchodzenia się z tkanką podczas sekcjonowania, aby zachować rozszerzenia podobne do cytonemu. Te dodatkowe kroki będą musiały zostać rozważone i podjęte w odniesieniu do przyszłych zastosowań tego protokołu.

Rozwój embrionalny jest zarządzany poprzez skoordynowaną aktywację szlaków sygnałowych morfogenu. Morfignogeny to małe, wydzielane białka, które są podzielone na rodziny Sonic Hedgehog (SHH), transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) / białka morfogennego kości (BMP), miejsca integracji związanego ze skrzydłami (WNT) oraz rodzin fibroblastów i naskórkowego czynnika wzrostu (FGF / EGF). Morgeny są wytwarzane i uwalniane z komórkowych centrów organizacyjnych podczas rozwoju tkanek i ustanawiają gradienty sygnałowe w organizujących się polach komórek, aby informować o morfogenezie tkanek1,2,3,4,5. Jedną z reprezentacji gradientów morfogenu znajduje się w rozwijającym się układzie nerwowym, w którym przypuszczalny ośrodkowy układ nerwowy jest wzorowany na aktywacji szlaku morfogenu. Ta tkanka, określana jako cewa nerwowa, składa się z przeciwstawnych gradientów SHH wydzielanych przez najbardziej brzuszną strunę grzbietową i płytkę podłogową oraz WNT / BMP wydzielanych z grzbietowej płyty dachowej, w celu ukształtowania odrębnych neuronowych regionów progenitorowych6. Cewa nerwowa jest powszechnie używana do badania integralności gradientu morfogenu w badaniach rozwojowych.
Tworzenie gradientu morfogenu opiera się na ścisłej regulacji dyspersji sygnału7. Jednym z mechanizmów komórkowych, dzięki któremu tak się dzieje, jest tworzenie długich filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami, które ułatwiają bezpośrednie dostarczanie morfogenów z komórek wytwarzających sygnał do określonych populacji komórek docelowych. Zaobserwowano, że cytonemy rozciągają się na setki mikrometrów, aby osadzić morfogeny na błonach komórkowych odbierających sygnały8,9. Zakłócenie transportu morfogenu za pośrednictwem cytonemu prowadzi do anomalii rozwojowych zarówno u much, jak i kręgowców, podkreślając ich znaczenie podczas tworzenia wzorców tkankowych10,11,12,13,14.
Do tej pory cytonemy zostały udokumentowane w modelach Drosophila, piskląt i danio pręgowanego, ale obrazowanie struktur w rozwijających się zarodkach ssaków pozostaje wyzwaniem8,9,15. Przeszkodą w skutecznym obrazowaniu cytonemów w złożonych tkankach ssaków in situ jest ich cienka i delikatna natura, która sprawia, że są one podatne na uszkodzenia konwencjonalnymi metodami utrwalania8. Wcześniej opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokoły dla modyfikowanego utrwalacza mikroskopii elektronowej (MEM-fix) w celu zachowania cytonemów w hodowanych komórkach i umożliwienia ich badania za pomocą mikroskopii konfokalnej16,17.
Użycie techniki MEM-fix pozwoliło na identyfikację niektórych cząsteczek zaangażowanych w tworzenie i funkcjonowanie cytonemu indukowanego przez SHH11,16,17. Jednak potwierdzenie tych odkryć w fizjologicznie istotnym kontekście wzorca cewy nerwowej wymagało opracowania nowych technik utrwalania i obrazowania tkanki embrionalnej myszy. Przedstawiono tutaj protokół mocowania zarodków myszy w sposób, który zachowuje integralność cytonemu i umożliwia barwienie immunologiczne, a następnie cięcie tkanki embrionalnej do analizy konfokalnej. Protokół ten został opracowany przy użyciu zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) na uwięzi błonowej do znakowania rozszerzeń błony z komórek wytwarzających SHH w rozwijającej się cewie neuronowej. Wdrożenie tego protokołu odpowie na pytania bez odpowiedzi dotyczące rozpowszechnienia i znaczenia cytonemów w rozwijających się systemach ssaków.

<table><tbody><tr><td>płytka 12-dołkowa; Hodowla komórek młopakowych poddana zabiegowi&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>150628 (Fisher Scientific 12-565-321)</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa, okrągła Nunc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>talerz 60 mm&nbsp;</td><td>Corning, Falcon</td><td>353004 (Fisher Scientific 08772F)</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki chłonne (Professional Kimtech Science Kimwipes)</td><td>Kimberly-Clark KIMTECH</td><td>34155 (Fisher Scientific 06666A)</td><td></td></tr><tr><td>Actin Red 555 ReadyProbes Odczynnik&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>R37112</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch Lab Inc</td><td>703-546-155</td><td>1:1,000 stężenie robocze</td></tr><tr><td>Bead Bath 6L 230V</td><td>Lab Armor</td><td>Pozycja #12L048 (Mfr. Model #74220-706)</td><td>ustawiony na 55 & deg; C</td></tr><tr><td>kurczak anty-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>SKU GFP-1020</td><td>1:250 stężenie robocze</td></tr><tr><td>komora CO2 z</td><td></td><td></td><td>pleksiglasu podłączona do linii emitującej CO2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowo-skaningowy</td> mikroskop <td>Leica Microsystems</td><td>model: Leica TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Solution (1 mg / ml)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne (Vannas Scissors)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, wysoka glukoza, bez glutaminy</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa Eppendorf Research Plus, 0,1-2,5 i mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa Eppendorf Research Plus, 0,5-10 &mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa Eppendorf Research Plus, 100-1 000 &mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta jednokanałowa Eppendorf Research Plus, 20-200 &mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel z piór #10</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Nr katalogowy NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, certyfikowana, Stany Zjednoczone</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze precyzyjne Fisherbrand Fine Point</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Taśma etykietująca Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>15-954</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, 16%, bez metanolu, Ultra Pure EM Grade</td><td>Polysciences</td><td>18814-10</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Długopis do pap z hydrofobową barierą ImmEdge&nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X) z LIGHTNING</td><td>Oprogramowanie Leica Microsystems</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia - UltraPure</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC 17 BIS Perforowana łyżka</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td></td><td></td>1037018</tr><tr><td>Nośniki montażowe (ProLong Diamond Antifade Mountant)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>P36961&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mysz: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+)</td><td>Szczep laboratoryjny Jackson</td><td>#:008466</td><td></td></tr><tr><td>Mysz: B6. Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre)</td><td>Mysz Jackson Laboratory</td><td>Strain #:005622</td><td></td></tr><tr><td>: C57BL/6J (B6)</td><td>Mysz Jackson Laboratory</td><td>Strain #:000664</td><td></td></tr><tr><td>: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdPomidor,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG)</td><td>Szczep laboratoryjny Jackson</td><td>#:007576</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079)</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Ca2+ + Mg2+&nbsp;</td>Probówki do mikrowirówek <td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Premium: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki SHARP Precision Barrier, bardzo długie do P-10 i Eppendorf 10 &micro; L</td><td>Denville Scientific</td><td>P1096-FR</td><td></td></tr><tr><td>SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-1000 i Eppendorf 1,000, 1,250 i mikro; L</td><td>Denville Scientific</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-20 i Eppendorf 20 & L</td><td>Denville Scientific</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-200 i Eppendorf 200 &micro; L</td><td>Denville Scientific</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM) (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr> Szkiełka mikroskopowe <tr><td>Super Glue</td><td>Gorilla</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe TPP, pojemność 15 mL, polipropylen</td><td>TPP Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe TPP, pojemność 50 mL, polipropylen</td><td>TPP Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa, polietylen</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z135003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vari-Mix Platform Rocker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-047-113Q</td><td>ustawiony na 20 obr./min</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosytems</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr></tbody></table>

utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis

Rozwojowe wzorce tkanek i porozwojowa homeostaza tkanek zależą od kontrolowanego dostarczania sygnałów komórkowych zwanych morfogenami. Morfogany działają w sposób zależny od stężenia i czasu, aby określić odrębne programy transkrypcyjne, które instruują i wzmacniają los komórki. Jednym z mechanizmów, dzięki którym zapewnione są odpowiednie progi sygnalizacji morfogenu, jest dostarczanie białek sygnałowych przez wyspecjalizowane filopodia zwane cytonemami. Cytonemy są bardzo cienkie (≤200 nm średnicy) i mogą osiągać długości kilkuset mikronów, co sprawia, że ich zachowanie do analizy obrazu o stałym obrazie jest trudne. W artykule opisano udoskonaloną metodę delikatnego obchodzenia się z zarodkami myszy w celu utrwalenia, barwienia immunologicznego i grubego cięcia, aby umożliwić wizualizację cytonemów przy użyciu standardowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do wizualizacji cytonemów, które łączą różne przedziały sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju cewy nerwowej myszy. Technikę tę można również dostosować do wykrywania cytonemów w różnych typach tkanek, aby ułatwić badanie sygnalizacji rozwojowej w niespotykanej dotąd rozdzielczości.

Do osadzania i zawieszenia kilku zarodków w krótkim czasie idealne okazało się zastosowanie większej formy w postaci płytki 12-dołkowej z 2,5-3 mL roztworu agarozy na dołek (Rycina 1A). Nadmiar powierzchni pozwala na prawidłową orientację podczas wycinania bloku agarozy do sekcjonowania. Podczas wycinania bloku agarozy ważne jest, aby pozostawić nadmiar agarozy wzdłuż dna bloku, w miejscu, w którym zostanie on przyklejony taśmą do uchwytu szkiełek. Zarodek powinien znajdować się w górnej połowie bloku (Rycina 1B). Jednakże dolna sekcja nie powinna być zbyt duża, ponieważ nadmierna grubość bloku zwiększa ryzyko zmiany kąta cięcia w momencie wbijania ostrza w blok podczas sekcjonowania. Przykłady prawidłowo zorientowanych przekrojów przedstawiono na (Rycina 1C,D).
Podczas opracowywania niniejszego protokołu porównano krojenie w wibratomie z krojeniem w kriotomie. Krojenie tkanek w kriotomie rzadko pozwalało na zachowanie wypustek komórkowych (Rysunek 2 kriotom oraz Rysunek 3A,B wibratom). Przekroje kriotomowe umożliwiły wykrycie niektórych fragmentów błony dodatnich względem GFP pomiędzy komórkami notochordu i rurki neuralnej (Rysunek 2A grot strzałki) oraz pomiędzy sąsiadującymi komórkami rurki neuralnej (Rysunek 2B,B' groty strzałek). Jednak barwienie F-aktyny wypustek komórkowych w silnie nitkowatych komórkach mezenchymalnych otaczających rurkę neuralną było zaburzone w przekrojach kriotomowych (Rysunek 2C,C' strzałka, w porównaniu do Rysunku 3C,D). Wyniki uzyskane za pomocą kriotomu wskazują, że po zastosowaniu tej metody pozostają jedynie niektóre ślady przerwanych wypustek komórkowych. Z tego powodu krojenie w wibratomie jest preferowane, aby efektywnie zachować te delikatne wypustki do późniejszych analiz.
Minimalne naruszenie całego embrionu oraz poszczególnych przekrojów tkanek jest niezbędne dla wysokiej jakości obrazowania wypustek komórkowych. Przekroje tkanek, które uległy jakimkolwiek zagięciom lub wypiętrzeniom, będą widoczne poprzez brak notochordu lub dużą przerwę (&gt;30 µm) między notochordem a brzuszna płytką dna rurki nerwowej (Rysunek 3B). Zazwyczaj towarzyszy temu utrata komórek mezenchymalnych, które normalnie otaczają rurkę nerwą (Rysunek 3A, strzałka). Uszkodzone przekroje spowodują również utratę widocznych wypustek błony komórkowej migrujących między komórkami nabłonkowymi (Rysunek 3B w porównaniu do Rysunku 3A, groty strzałek). Nawet niewielkie zniekształcenia przekrojów mogą spowodować fragmentację wypustek opartych na aktynie i powstanie dużych przerw między komórkami (Rysunek 3D, groty strzałek, w porównaniu do dobrze zachowanego Rysunku 3C), co podkreśla konieczność delikatnego obchodzenia się z próbkami na wszystkich etapach.
<img alt="Etapy rozwoju zarodka: naczynie hodowlane, preparat do przekroju, mikroskopia fluorescencyjna, barwienie tkanek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przykład zabarwionego, zatopionego i pociętego na sekcje zarodka E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG. (A) Pojedynczy zarodek w płytce 12-dołkowej, zatopiony w 4% agarozie LMP. (B) Przykład prawidłowo zorientowanego zarodka w bloku agarozy dociętym do rozmiaru odpowiedniego do montażu w wibrotomie. Nadmiar bloku agarozy znajduje się u dołu. (C) Obraz w polu jasnym przekroju zarodka o grubości 100 µm zatopionego w agarozie LMP. (D) Obrazowanie immunofluorescencyjne przekroju po usunięciu agarozy. mGFP (zielony) zabarwione przeciwciałem anty-GFP reprezentuje komórki wykazujące ekspresję Shh- w tkance, podczas gdy inne linie komórkowe wykazują ekspresję membranowego Tomato (czerwony), DAPI w kolorze niebieskim. Rura nerwowa (nawias) i notochorda mGFP-dodatnia (strzałka) są wyraźnie widoczne. Paski skali = 1 cm (A), 5 mm (B) i 100 µm (C,D). Skróty: LMP = niska temperatura topnienia; mGFP = membranowe zielone białko fluorescencyjne; Shh = Sonic Hedgehog; DAPI = 4',6-diamidyno-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii wielofotonowej, mGFP, F-aktyna, DAPI, analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład płyty dna rurki neuralnej i notochordu w przekroju kriostatycznym z fragmentacją wypustek błoniastych. (A) Przekrój o grubości 20 µm zarodka E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG19,20,21 barwiony na GFP (zielony), F-aktynę (czerwony) i DAPI (niebieski). Punkty mGFP są widoczne pomiędzy notochordem a płytą dna (grot strzałki) oraz (B,B') migrujące pomiędzy sąsiednimi komórkami rurki neuralnej. (C,C') Barwienie na F-aktynę nie wykazało wyraźnych cytonem na komórkach mezenchymalnych otaczających rurkę neuralną (strzałka). Paski skali = 20 µm. Skróty: mGFP = błoniasty zielony białko fluorescencyjne; Shh = Sonic Hedgehog; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost neuronów, wizualizacja mGFP; obrazy z mikroskopii konfokalnej, F-aktyna, analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykłady optymalnych i suboptymalnych przekrojów tkankowych wykonanych wibratomem oraz barwienia płytki dna rurki nerwowej, notochordu i komórek otaczających. Przykłady przekrojów poddanych delikatnej obróbce (A,C) w porównaniu do (B) złożonego przekroju tkankowego oraz (D) przekroju poddanego niewłaściwej obróbce z zarodka Shh-Cre; Rosa26 mTmG oraz ShhGFP/+ 19,20,21. Przekroje poddane optymalnej obróbce umożliwiają wykrycie cytonemów pomiędzy sąsiadującymi komórkami nabłonka neuronalnego płytki dna (A, groty strzałek). Powinny być widoczne sąsiedni rurkę nerwową notochord (A, wykazujący ekspresję mGFP) oraz komórki mezenchymalne (A, strzałka). (C,D) Przekroje barwione na F-aktynę i DAPI powinny wykazywać jednorodne rozmieszczenie komórek mezenchymalnych oraz cytonemów opartych na F-aktynie (strzałki) otaczających rurkę nerwową i notochord (C). Każde niewielkie złożenie lub uszkodzenie przekrojów może spowodować powstanie luk i przerwanie fragmentów F-aktyny (D, groty strzałek). Paski skali = 10 µm. Skróty: mGFP = błonowe zielone białko fluorescencyjne; Shh = Sonic Hedgehog; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do utrwalania, barwienia immunologicznego i sekcji zarodków w celu wykrycia wyspecjalizowanych filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami w rozwijających się tkankach myszy.

Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Developmental tissue patterning and postdevelopmental tissue homeostasis depend upon controlled delivery of cellular signals called morphogens. Morphogens ...

Korzystając z tego protokołu, możemy uwidocznić cytonemy w utrwalonej tkance myszy w całym zarodku za pomocą standardowej mikroskopii świetlnej. Korzystając z tej techniki, możemy sondować endogenne białka sygnałowe, które przemieszczają się wzdłuż cytonemów, zamiast polegać na genetycznie zmodyfikowanych modelach mysich, które wykorzystują białka znakowane fluorescencyjnie. Podczas korzystania z tego protokołu ważne jest, aby delikatnie obchodzić się z skrawkami tkanek w celu optymalnego zachowania cytonemu.Tę procedurę zademonstrują Miriam Dillard, główna badaczka w mojej grupie, oraz Christina Daly, doktorantka z St. Jude. Na początek użyj nożyczek preparacyjnych i kleszczy, aby wykonać nacięcie w kształcie litery Y w jamie otrzewnej. Wyciąć macicę zawierającą zarodek E 9,5.Wypreparuj zarodki w kompletnym pożywce wzrostowej DMEM. Użyj kleszczy, aby usunąć SAC żółtka, łożysko i otaczające błony. Wypłucz izolowane zarodki w HBSS, aby usunąć wszelkie pozostałości tkanki owodniowej i krwi.Następnie przygotuj utrwalacz, dodając paraformaldehyd do HBSS do stężenia roboczego 4% paraformaldehydu. Dodaj jeden mililitr tego roztworu do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Umieść zarodki w indywidualnych studzienkach.Inkubuj zarodki przez 45 minut, delikatnie mieszając na kołysce. Po inkubacji usunąć utrwalacz i myć zarodki trzykrotnie, przez 30 minut w PBS z dodatkiem wapnia, magnezu i 0,1% Tritonu. Następnie inkubować zarodki w roztworze blokującym, delikatnie mieszając dwukrotnie, po jednej godzinie każdy.Po drugiej inkubacji wypłukać zarodki świeżym roztworem blokującym. W międzyczasie należy przygotować roztwór przeciwciał pierwszorzędowych, rozcieńczając przeciwciała w uzupełnionym PBS. Po zakończeniu płukania usuń roztwór blokujący i dodaj jeden mililitr roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do każdej studzienki.Inkubuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym obracaniem przez trzy dni. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyj zarodki uzupełnionym PBS pięć razy przez godzinę na bujaku z prędkością 20 obr./min. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu przeciwciał wtórnych do każdej studzienki.Inkubuj płytkę, delikatnie kołysząc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez trzy dni. Usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i umyć zarodki trzykrotnie przez 30 minut w uzupełnionym PBS. Przygotować 4% wagowo niskotopnienia agarozy w PBS z wapniem i magnezem.Jednocześnie umieść 12-dołkową płytkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 55 stopni Celsjusza i dodaj trzy mililitry agarozy do każdej studzienki. Następnie umieść płytkę na blacie stołu i przenieś zarodki do pojedynczych dołków za pomocą perforowanej łyżki. Użyj końcówek pipet, aby delikatnie osadzić i ustawić zarodek tak, aby był wyśrodkowany w roztworze.Po ustawieniu zarodków umieść płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 10 minut w celu zestalenia. Następnie za pomocą skalpela usuń cały blok agarozy ze studzienki. Wytnij prostokątny blok wokół zarodka, pozostawiając około 0,3 centymetra bloku z każdej strony.Pozostaw dodatkową długość bloku wzdłuż ogonowego końca zarodka. Aby zamontować zarodek na wibratomie, najpierw przyłóż pasek taśmy do uchwytu na próbkę. Ustaw zarodek w pozycji pionowej w górnej części bloku i przyklej blok agarozy do taśmy, tak aby ostrze wygenerowało sekcje osiowe w sekwencji od przodu do tyłu.Następnie napełnij komorę wibratomu zimnym HBSS, aby całkowicie zanurzyć próbkę, a następnie otocz komorę lodem. Ustaw parametry na wibratomie i wykonaj seryjne cięcie osiowe zarodka. Za pomocą kleszczy przenieś poszczególne sekcje do osobnego naczynia wypełnionego HBSS.Pamiętaj, aby używać kleszczy do trzymania tylko agarozy, aby uniknąć uszkodzenia tkanek i zniszczenia cytonemu. Aby wykonać barwienie F-aktyną, usuń HBSS i inkubuj skrawki przez 40 minut z roztworem ActinRed i DAPI w uzupełnionym PBS. Po inkubacji przemyć skrawki trzykrotnie przez 20 minut w uzupełnionym PBS.Za pomocą markera hydrofobowego narysuj barierę wokół krawędzi naładowanego szkiełka mikroskopowego i dodaj niewielką objętość HBSS do obszaru wypełnienia. Następnie użyj kleszczy, aby przenieść sekcje na zjeżdżalnię. Usuń nadmiar agarozy za pomocą kleszczy.Po przeniesieniu wszystkich skrawków na szkiełko należy usunąć nadmiar płynu, pipetując i używając rogu chusteczki chłonnej. Następnie dodaj kilka kropel podłoża montażowego do szkiełka. Zamontuj szkiełko nakrywkowe, delikatnie umieszczając je na szkiełku.W celu analizy należy wykonać obrazowanie skrawków tkanek dla co najmniej trzech zarodków na genotyp pod mikroskopem konfokalnym lub dowolnym mikroskopem o wysokiej rozdzielczości. Prawidłowo zorientowane sekcje przygotowane przy użyciu tego protokołu są pokazane tutaj. W porównaniu z cięciem wibratomicznym, kriostat nie zachowywał rozszerzeń komórkowych.Wykryto kilka fragmentów błony GFP-dodatnich między komórkami struny grzbietowej i cewy nerwowej oraz między sąsiednimi komórkami cewy nerwowej w sekcjach kriostatu. Jednak barwienie F-aktyną rozszerzeń komórkowych w komórkach mezenchymalnych otaczających cewę nerwową było upośledzone w sekcjach kriostatu. Cięcie wibratomem zapewniło minimalne uszkodzenie całego zarodka i poszczególnych odcinków tkanek.Optymalnie obsługiwane sekcje pozwoliły na wykrycie ctionemów pomiędzy sąsiadująco zlokalizowanymi komórkami nabłonka nerwowego płytki podłogowej a komórkami mezenchymalnymi. Zagięte lub wygięte odcinki były widoczne przez dużą separację między struną grzbietową a brzuszną płytką dna cewy nerwowej. I utrata przedłużeń błony komórkowej migrujących między komórkami nabłonka.Skrawki barwione F-aktyną i DAPI miały spójne odstępy między komórkami mezenchymalnymi i ctionemami otaczającymi cewę nerwową i strunę grzbietową. Niewielkie zniekształcenia sekcji mogły spowodować fragmentację rozszerzeń na bazie aktyny i tworzenie się dużych szczelin między komórkami, co podkreśla potrzebę delikatnego obchodzenia się z nimi. Po przecięciu zarodka konieczne jest zminimalizowanie zginania lub fałdowania skrawków tkanki.aby zapobiec pękaniu cytonemu. Korzystając z tej techniki, możemy bezpośrednio wizualizować, w jaki sposób cząsteczki sygnałowe, takie jak morfogeny, są rozprowadzane w tkankach. Daje nam to nowy wgląd w to, jak tkanki i narządy są wzorcowane.

fixation-of-embryonic-mouse-tissue-for-cytoneme-analysis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Celem tego raportu jest opisanie protokołu do solidnego immunohistochemicznego wykrywania markerów epigenetycznych, 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

Węzeł i płytka struny grzbietowej są przejściowymi organizatorami sygnalizacji w rozwoju mysich embrionów, które można wizualizować za pomocą kilku technik. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wykonać dwie techniki badania ich struktury i morfogenezy: 1) skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM); i 2) immunofluorescencja całej góry (WMIF).

Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół do wykrywania i ilościowego określania poziomów białek podczas morfogenezy/patogenezy twarzoczaszki poprzez barwienie immunologiczne na przykładzie tkanek twarzoczaszki myszy. Ponadto opisano metodę przygotowania i kriosekcji nieodwapnionych tkanek twardych od młodych myszy w celu barwienia immunologicznego.

Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne tkanek twarzoczaszki myszy i kości nieodwapnionej

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Aby przeanalizować profile ekspresji genów sercowych podczas rozwoju serca danio pręgowanego, należy wyekstrahować całkowite RNA z izolowanych serc. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania funkcjonalnych/bijących serc poprzez szybką ręczną sekcję z zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania mRNA specyficznego dla serca.

Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej

Poznaj metodę utrwalania i barwienia zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu przy użyciu mikroskopii świetlnej. Technika umożliwia wizualizację endogennych białek sygnałowych w cytonemach.

Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Przeglądaj więcej filmów