Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do utrwalania, barwienia immunologicznego i sekcji zarodków w celu wykrycia wyspecjalizowanych filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami w rozwijających się tkankach myszy.

Korzystając z tego protokołu, możemy uwidocznić cytonemy w utrwalonej tkance myszy w całym zarodku za pomocą standardowej mikroskopii świetlnej. Korzystając z tej techniki, możemy sondować endogenne białka sygnałowe, które przemieszczają się wzdłuż cytonemów, zamiast polegać na genetycznie zmodyfikowanych modelach mysich, które wykorzystują białka znakowane fluorescencyjnie. Podczas korzystania z tego protokołu ważne jest, aby delikatnie obchodzić się z skrawkami tkanek w celu optymalnego zachowania cytonemu.

Tę procedurę zademonstrują Miriam Dillard, główna badaczka w mojej grupie, oraz Christina Daly, doktorantka z St. Jude. Na początek użyj nożyczek preparacyjnych i kleszczy, aby wykonać nacięcie w kształcie litery Y w jamie otrzewnej. Wyciąć macicę zawierającą zarodek E 9,5.

Wypreparuj zarodki w kompletnym pożywce wzrostowej DMEM. Użyj kleszczy, aby usunąć SAC żółtka, łożysko i otaczające błony. Wypłucz izolowane zarodki w HBSS, aby usunąć wszelkie pozostałości tkanki owodniowej i krwi.

Następnie przygotuj utrwalacz, dodając paraformaldehyd do HBSS do stężenia roboczego 4% paraformaldehydu. Dodaj jeden mililitr tego roztworu do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Umieść zarodki w indywidualnych studzienkach.

Inkubuj zarodki przez 45 minut, delikatnie mieszając na kołysce. Po inkubacji usunąć utrwalacz i myć zarodki trzykrotnie, przez 30 minut w PBS z dodatkiem wapnia, magnezu i 0,1% Tritonu. Następnie inkubować zarodki w roztworze blokującym, delikatnie mieszając dwukrotnie, po jednej godzinie każdy.

Po drugiej inkubacji wypłukać zarodki świeżym roztworem blokującym. W międzyczasie należy przygotować roztwór przeciwciał pierwszorzędowych, rozcieńczając przeciwciała w uzupełnionym PBS. Po zakończeniu płukania usuń roztwór blokujący i dodaj jeden mililitr roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do każdej studzienki.

Inkubuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym obracaniem przez trzy dni. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyj zarodki uzupełnionym PBS pięć razy przez godzinę na bujaku z prędkością 20 obr./min. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu przeciwciał wtórnych do każdej studzienki.

Inkubuj płytkę, delikatnie kołysząc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez trzy dni. Usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i umyć zarodki trzykrotnie przez 30 minut w uzupełnionym PBS. Przygotować 4% wagowo niskotopnienia agarozy w PBS z wapniem i magnezem.

Jednocześnie umieść 12-dołkową płytkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 55 stopni Celsjusza i dodaj trzy mililitry agarozy do każdej studzienki. Następnie umieść płytkę na blacie stołu i przenieś zarodki do pojedynczych dołków za pomocą perforowanej łyżki. Użyj końcówek pipet, aby delikatnie osadzić i ustawić zarodek tak, aby był wyśrodkowany w roztworze.

Po ustawieniu zarodków umieść płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 10 minut w celu zestalenia. Następnie za pomocą skalpela usuń cały blok agarozy ze studzienki. Wytnij prostokątny blok wokół zarodka, pozostawiając około 0,3 centymetra bloku z każdej strony.

Pozostaw dodatkową długość bloku wzdłuż ogonowego końca zarodka. Aby zamontować zarodek na wibratomie, najpierw przyłóż pasek taśmy do uchwytu na próbkę. Ustaw zarodek w pozycji pionowej w górnej części bloku i przyklej blok agarozy do taśmy, tak aby ostrze wygenerowało sekcje osiowe w sekwencji od przodu do tyłu.

Następnie napełnij komorę wibratomu zimnym HBSS, aby całkowicie zanurzyć próbkę, a następnie otocz komorę lodem. Ustaw parametry na wibratomie i wykonaj seryjne cięcie osiowe zarodka. Za pomocą kleszczy przenieś poszczególne sekcje do osobnego naczynia wypełnionego HBSS.

Pamiętaj, aby używać kleszczy do trzymania tylko agarozy, aby uniknąć uszkodzenia tkanek i zniszczenia cytonemu. Aby wykonać barwienie F-aktyną, usuń HBSS i inkubuj skrawki przez 40 minut z roztworem ActinRed i DAPI w uzupełnionym PBS. Po inkubacji przemyć skrawki trzykrotnie przez 20 minut w uzupełnionym PBS.

Za pomocą markera hydrofobowego narysuj barierę wokół krawędzi naładowanego szkiełka mikroskopowego i dodaj niewielką objętość HBSS do obszaru wypełnienia. Następnie użyj kleszczy, aby przenieść sekcje na zjeżdżalnię. Usuń nadmiar agarozy za pomocą kleszczy.

Po przeniesieniu wszystkich skrawków na szkiełko należy usunąć nadmiar płynu, pipetując i używając rogu chusteczki chłonnej. Następnie dodaj kilka kropel podłoża montażowego do szkiełka. Zamontuj szkiełko nakrywkowe, delikatnie umieszczając je na szkiełku.

W celu analizy należy wykonać obrazowanie skrawków tkanek dla co najmniej trzech zarodków na genotyp pod mikroskopem konfokalnym lub dowolnym mikroskopem o wysokiej rozdzielczości. Prawidłowo zorientowane sekcje przygotowane przy użyciu tego protokołu są pokazane tutaj. W porównaniu z cięciem wibratomicznym, kriostat nie zachowywał rozszerzeń komórkowych.

Wykryto kilka fragmentów błony GFP-dodatnich między komórkami struny grzbietowej i cewy nerwowej oraz między sąsiednimi komórkami cewy nerwowej w sekcjach kriostatu. Jednak barwienie F-aktyną rozszerzeń komórkowych w komórkach mezenchymalnych otaczających cewę nerwową było upośledzone w sekcjach kriostatu. Cięcie wibratomem zapewniło minimalne uszkodzenie całego zarodka i poszczególnych odcinków tkanek.

Optymalnie obsługiwane sekcje pozwoliły na wykrycie ctionemów pomiędzy sąsiadująco zlokalizowanymi komórkami nabłonka nerwowego płytki podłogowej a komórkami mezenchymalnymi. Zagięte lub wygięte odcinki były widoczne przez dużą separację między struną grzbietową a brzuszną płytką dna cewy nerwowej. I utrata przedłużeń błony komórkowej migrujących między komórkami nabłonka.

Skrawki barwione F-aktyną i DAPI miały spójne odstępy między komórkami mezenchymalnymi i ctionemami otaczającymi cewę nerwową i strunę grzbietową. Niewielkie zniekształcenia sekcji mogły spowodować fragmentację rozszerzeń na bazie aktyny i tworzenie się dużych szczelin między komórkami, co podkreśla potrzebę delikatnego obchodzenia się z nimi. Po przecięciu zarodka konieczne jest zminimalizowanie zginania lub fałdowania skrawków tkanki.

aby zapobiec pękaniu cytonemu. Korzystając z tej techniki, możemy bezpośrednio wizualizować, w jaki sposób cząsteczki sygnałowe, takie jak morfogeny, są rozprowadzane w tkankach. Daje nam to nowy wgląd w to, jak tkanki i narządy są wzorcowane.