Name: In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę przewlekłego dwufotonowego obrazowania mikrogleju w hipokampie myszy. Technika umożliwia obserwację interakcji mikrogleju z neuronami w warunkach in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować M. Kondo i M. Matsuzaki za użyczenie nam obiektywu XLPLN25XSVMP. Praca ta była wspierana finansowo przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) przez Grant-in-Aid for JSPS Research Fellow (18J21331 do R.K.) oraz Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 do S.O.), przez Japońską Agencję Badań i Rozwoju Medycznego (JP19gm1310003 i JP17gm5010003 dla S.O.) oraz od Japońskiej Agencji Nauki i Technologii przez Moonshot R&D (JPMJMS2024 do H.M.).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z zasadami Komitetu Etyki Zwierząt i Komitetu Bezpieczeństwa Eksperymentów z Rekombinacją Genetycznej na Uniwersytecie Tokijskim. W eksperymentach wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy CX3CR1-GFP w wieku 2-4 miesięcy. Ze względu na bezpieczeństwo eksperymentatorów i utrzymanie sterylnych warunków, wszystkie procedury były wykonywane w białych fartuchach, maskach i sterylnych rękawiczkach. Wszystkie narzędzia zostały wysterylizowane przed użyciem. 
1. Przygotowanie instrumentów i zwierząt
<ol>
	<li>Zamontuj metalową rurkę ze szklanym dnem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Nałóż niewielką kroplę kleju optycznego utwardzanego promieniami UV na jeden koniec wykonanej na zamówienie rurki ze stali nierdzewnej (średnica zewnętrzna 3,0 mm, średnica wewnętrzna 2,8 mm, wysokość 1,7 mm). Rozprowadź klej równomiernie na okrągłej krawędzi tuby. 
		UWAGA: Należy użyć wystarczającej ilości kleju, aby pokryć całą krawędź tuby.</li>
		<li>Umieść okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (o średnicy 3,0 mm, grubości 0,15 ± 0,02 mm) do pokrytego klejem końca metalowej rurki i lekko dociśnij szkiełko nakrywkowe do tuby, tak aby szczelina między rurką a szkłem została wypełniona klejem. Następnie dostosuj położenie szkła tak, aby pasowało do zewnętrznej krawędzi metalowej rurki.</li>
		<li>Naświetlić szkło światłem UV przez wystarczająco długi czas, aby utwardzić klej. 
		UWAGA: Upewnij się, że szklanka i rurka są całkowicie przymocowane. Jeśli adhezja jest niewystarczająca, szkło może odpaść po operacji, co spowoduje nieudane obrazowanie lub wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).</li>
		<li>Zdezynfekuj zmontowaną metalową rurkę ze szklanym dnem 70% etanolem i umyj sterylną solą fizjologiczną, aby usunąć zanieczyszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora na sucho.</li>
	<li>Przygotuj myszy do operacji implantacji okiennej. 
	UWAGA: Myszy powinny być w odpowiednim wieku. Zaleca się, aby były one genetycznie modyfikowane w celu ekspresji białek fluorescencyjnych w CA1 i zakręcie zębatym (DG). Punkty te są bardziej szczegółowo wyjaśnione w sekcji Dyskusja.</li>
</ol>
2. Znieczulenie i unieruchomienie głowy
<ol>
	<li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy-ksylazyny (100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny). Meloksykam (2 mg/kg) należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym w celu znieczulenia przedoperacyjnego. Potwierdź zanik reakcji na bolesne bodźce, takie jak szczypanie ogona, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia. Dodaj połowę dawki ketaminy-ksylazyny za każdym razem, gdy znieczulenie ustąpi podczas zabiegu, zwykle 1 godzinę po pierwszym podaniu i co 30 minut po nim. Użyj poduszki grzewczej pod ciałem, aby zapewnić wsparcie termiczne i nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu. 
	UWAGA: Wybór znieczulenia do zabiegu chirurgicznego jest niezbędny. Ten punkt jest szczegółowo omówiony w sekcji Dyskusja.</li>
	<li>Nałóż krem do depilacji, aby usunąć włosy ze skóry głowy. Zdezynfekuj skórę głowy kilka razy okrężnymi ruchami za pomocą peelingu powidonowo-jodowego, a następnie alkoholem. Umieść mysz na platformie operacyjnej przygotowanej ze sterylną wodoodporną podkładką i nałóż sterylne serwety, aby zabezpieczyć pole operacyjne. Następnie należy przeciąć i usunąć skórę głowy okrężnie za pomocą skalpela, tak aby kości ciemieniowe i potyliczne były całkowicie odsłonięte po stronie operacyjnej.</li>
	<li>Usuń podskórną tkankę łączną, pocierając ją bawełnianym wacikiem, jednocześnie nakładając sterylną sól fizjologiczną w celu usunięcia krwawienia. Delikatnie zeskrobać powierzchnię czaszki miniaturowym nożem z okrągłą końcówką, aby usunąć okostną, co pomaga wzmocnić przyczepność między cementem a kością (patrz krok 2.6).</li>
	<li>Nałóż materiał do trawienia zębów na całą powierzchnię, odczekaj kilkadziesiąt sekund i spłucz wystarczającą ilością sterylnego soli fizjologicznej.</li>
	<li>Za pomocą wodoodpornego tuszu zaznacz obszar kości do usunięcia (okrągły obszar o średnicy 3,0 mm, wyśrodkowany około 2,5 mm z tyłu i 2,5 mm z boku bregmy). Po znakowaniu dokładnie osusz powierzchnię czaszki. 
	UWAGA: Pozycja kraniotomii zależy od wielkości hipokampa i powinna być zoptymalizowana dla różnych grup wiekowych. Przydatne wskaźniki dotyczące pozycji kraniotomii zostaną przedstawione poniżej (patrz krok 3.4.5, UWAGA).</li>
	<li>Przymocuj prostokątną aluminiową płytkę o grubości 1,0 mm i z otworem o średnicy 5,0 mm pośrodku do czaszki za pomocą cementu z żywicy dentystycznej zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyrównaj otwór w środku płytki z okrągłym obszarem zaznaczonym długopisem (patrz krok 2.5) tak, aby aluminiowa płytka była równoległa do zaznaczonej powierzchni czaszki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Upewnij się, że cement szczelnie uszczelnia wszystkie szczeliny między płytką a kością. Odczekaj około 5 minut, aż cement wystarczająco stwardnieje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mysz na urządzeniu trzymającym głowę z regulatorami kąta za pomocą dołączonej płytki.</li>
</ol>
3. Implantacja okna obserwacyjnego
UWAGA: Następujące zabiegi chirurgiczne powinny być wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym.
<ol>
	<li>Wykonaj okrągły rowek na czaszce za pomocą stempla skórnego o średnicy 3.0 mm. Wyrównaj okrągły rowek i obszar zaznaczony długopisem w kroku 2.5. Przekręć stempel skórny z delikatnym naciskiem, aby głębokość rowka stopniowo się zwiększała. Często sprawdzaj, czy głębokość rowka jest stała na całym obwodzie.</li>
	<li>Gdy stempel skórny dotrze do najbardziej wewnętrznej warstwy czaszki, przed dotknięciem leżącej poniżej opony twardej, delikatnie unieś centralną wyspę kostną za pomocą igły 30 G. 
	UWAGA: Niewielki wyciek cieczy z dna rowka wskazuje, że rowek znajduje się blisko opony twardej.</li>
	<li>Usuń oponę twardą za pomocą selektora opony twardej. 
	UWAGA: Całkowite usunięcie opony twardej w oknie czaszki jest konieczne i będzie wymagało starannego wycięcia pozostałej opony twardej na obwodzie za pomocą cienkich kleszczy.</li>
	<li>Delikatnie odessać tkankę, aby odsłonić zębodoł hipokampa, za pomocą igieł 23 G lub 25 G podłączonych do aspiratora. 
	UWAGA: Ten krok jest najbardziej krytyczny dla pomyślnego obrazowania. Kluczowe kwestie techniczne dotyczące aspiracji tkanek są szczegółowo opisane w sekcji Dyskusja.
	<ol>
		<li>Odessać naczynia pia i pial.</li>
		<li>Odessać tkankę korową z powierzchni. Utrzymuj jednorodną głębokość odsłoniętej powierzchni tkanki na całej długości okna czaszki. Stopniowo pogłębiaj aspirację, aż do odsłonięcia włókien kapsułki zewnętrznej.</li>
		<li>Ostrożnie przyłóż końcówkę ssącą do torebki zewnętrznej w pobliżu komory bocznej (LV) znajdującej się na rostrobocznym końcu okna czaszki. Usuń warstwę powierzchniową torebki zewnętrznej biegnącą w kierunku ogoniastym do rostrolateralnego, a następnie warstwę wewnętrzną biegnącą w kierunku przyśrodkowo-bocznym. 
		UWAGA: Zewnętrzną kapsułę w pobliżu lewej wysokości można łatwo usunąć z leżącej poniżej konstrukcji.</li>
		<li>Potwierdzić usunięcie całej torebki zewnętrznej, sprawdzając pełne odsłonięcie powierzchni pęcherzyka i spoidła grzbietowego hipokampa (DHC). 
		UWAGA: DHC obejmuje przyczynowo-przyśrodkową część CA1. Wyrostek zębodynowy i DHC można odróżnić od kapsułki zewnętrznej po ich orientacji włókien. Mianowicie, włókna w zębole i DHC biegną w kierunku rostroprzyśrodkowym do ogoniastego i można je odróżnić od włókien w torebce zewnętrznej. Wyrostek zębodynowy i DHC są ściśle przymocowane do CA1 i nie powinny być uszkodzone. Wszystkie fragmenty torebki zewnętrznej należy usunąć, ponieważ wszelkie pozostałe fragmenty zapobiegną bezpośredniemu kontaktowi szkiełka nakrywkowego ze szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Upewnij się, że krwawienie dokładnie się zatrzymało i wypełnij otwór sterylnym roztworem soli fizjologicznej do poziomu powierzchni czaszki. 
		UWAGA: Pole widzenia w tym miejscu pomaga ocenić, czy otwór znajduje się w odpowiednim położeniu dla określonego wieku myszy. Idealnie byłoby, gdyby zębodół zębodołowy i leżący pod nim CA1 zajmowały większość obszaru centralnego. Część DHC jest widoczna w obszarze ogoniastym. Otwór LV jest wykrywalny na krawędzi ostrobocznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włóż metalową rurkę ze szklanym dnem (patrz krok 1.1) pionowo do otworu, jednocześnie zasysając nadmiar wody, która przelewa się z boków rurki, aż szklane dno lekko dociśnie do pęcherzyka i częściowo spłaszczy leżący pod spodem CA1. 
	UWAGA: To ciśnienie należy odpowiednio wyregulować. Jeśli jest zbyt mocny, CA1 zostanie uszkodzony. Jeśli jest zbyt słaby, aberracja sferyczna spowodowana krzywizną CA1 pogorszy rozdzielczość obrazowania w głębokich strukturach.</li>
	<li>Używając cementu z żywicy dentystycznej, przymocuj ściankę włożonej rurki do otaczającej czaszki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Upewnij się, że cały obwód jest szczelnie uszczelniony i że nie ma wycieku powietrza lub płynu mózgowo-rdzeniowego. Odczekaj około 5 minut, aż cement stwardnieje. 
	UWAGA: Jeśli cement zostanie umieszczony, gdy jego lepkość jest niska, może przedostać się do miąższu mózgu przez szczelinę między rurką a czaszką i uszkodzić mózg. Dlatego cement należy nakładać po rozpoczęciu polimeryzacji, co zwiększa lepkość i zmniejsza przeciek przez szczelinę.</li>
	<li>Umyj całą płytkę, czaszkę i wnętrze probówki sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć zanieczyszczenia.</li>
</ol>
4. Mikroskopia dwufotonowa bezpośrednio po operacji w celu sprawdzenia jakości operacji
<ol>
	<li>Umieść mysz w urządzeniu trzymającym głowę pod soczewką obiektywu mikroskopu dwufotonowego i na zmotoryzowanym stoliku skanującym XY. Użyj poduszki grzewczej do wsparcia termicznego. Monitoruj i dostosuj głębokość znieczulenia zgodnie z opisem w kroku 2.1, ponieważ kontrola jakości może potrwać do 30 minut. 
	UWAGA: Zalecana jest soczewka obiektywowa zanurzająca się w wodzie o odległości roboczej (WD) większej niż 3 mm i dużej przysłonie numerycznej (NA). Kołnierz korekcyjny soczewki obiektywu może poprawić rozdzielczość, kompensując niedopasowanie współczynnika załamania światła między szkłem a biomateriałami.</li>
	<li>Wypełnij przestrzeń między szkłem a soczewką obiektywu wodą, zwracając szczególną uwagę, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby rozszerz obszar metalowej płytki za pomocą folii z tworzywa sztucznego, która zatrzymuje więcej wody, aby pokryć całą przednią soczewkę obiektywu.</li>
	<li>Włącz femtosekundowy laser impulsowy o długości fali 920 nm w celu wzbudzenia sond fluorescencyjnych wyrażonych w mózgu i uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu.</li>
	<li>Dostosuj ostrość do CA1 za pomocą zmotoryzowanego stolika i zmotoryzowanego systemu ustawiania ostrości. Ustaw strukturę docelową pod kierunkiem fluorescencji emitowanej przez miąższ mózgu i światła odbitego od krawędzi metalowej rurki pod ciągłym oświetleniem lasera impulsowego.</li>
	<li>Zmierz głębokość miąższu mózgu dotykającego szklanego dna, regulując ostrość za pomocą zmotoryzowanego systemu ustawiania ostrości. Porównaj głębokości w różnych miejscach poziomych, aby ocenić wyrównanie szklanego dna i płaszczyzny obrazowania.
	<ol>
		<li>Dostosuj kąt nachylenia głowicy myszy, przechylając urządzenie przytrzymujące głowicę, aż szklane dno zostanie ustawione tak, aby było równoległe do płaszczyzny obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj kołnierz korekcyjny obiektywu, aby uzyskać najwyższą rozdzielczość na głębokości struktury docelowej w CA1.</li>
	<li>Upewnij się, że komórki fluorescencyjne w warstwie molekularnej (ML) górnej łopatki DG na głębokości 500 μm od szklanego dna mogą być obrazowane w całym polu widzenia. 
	UWAGA: Ten krok jest ważny w ocenie jakości operacji. Jeśli CA1 jest uszkodzony, ogniskowy obrzęk mózgu uniemożliwia wykrycie fluorescencji na głębokości większej niż 200 μm od powierzchni. Tylko wtedy, gdy nie ma uszkodzenia CA1, a krzywizna warstw CA1 jest odpowiednio spłaszczona przez leżące nad nią szkiełko nakrywkowe, sygnały DG mogą być wykryte natychmiast po operacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-D). Sekcja "Reprezentatywne wyniki" umożliwia proste określenie granicy między CA1 a DG.</li>
</ol>
5. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Zassaj wodę do wnętrza rurki i przykryj ją plastikową uszczelką, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń.</li>
	<li>Utrzymuj mysz w cieple i poczekaj na powrót do zdrowia po znieczuleniu.</li>
	<li>Meloksykam (2 mg/kg) należy podawać podskórnie co 24 godziny, dopóki mysz wykazuje zachowania związane z bólem.</li>
	<li>Hoduj mysz pooperacyjną w indywidualnym pomieszczeniu przez kilka tygodni.</li>
</ol>
6. Przewlekłe obrazowanie dwufotonowe mikrogleju in vivo przy użyciu myszy CX3CR1-GFP
<ol>
	<li>Po indukcji znieczulenia umyj wnętrze metalowej rurki sterylną solą fizjologiczną, aby usunąć zanieczyszczenia. Upewnij się, że biały pęcherzyk hipokampa jest widoczny przez szkło (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A) i nie ma żadnych komplikacji, takich jak krwawienie pooperacyjne.</li>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem dwufotonowym, wykonując kroki od 4.1 do 4.6.</li>
	<li>Sprawdź jakość i intensywność obrazów uzyskanych przez wzbudzenie dwufotonowe hipokampa (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Upewnij się, że zdjęcia wykonane po zmniejszeniu obrzęku pooperacyjnego są porównywalne lub lepsze niż te wykonane w dniu operacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, patrz krok 4.5). 
	UWAGA: Pogorszenie obrazu wskazuje na obecność uszkodzenia tkanek wewnątrz mózgu.</li>
	<li>Upewnij się, że mikroglej odzyskał już swoją rozgałęzioną morfologię (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). 
	UWAGA: Dane obrazowe mikrogleju wskazują, że potrzeba co najmniej 3-4 tygodni, aby mikroglej powrócił do stanu podstawowego.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie in vivo w dowolnych warstwach CA1 dla określonego celu eksperymentu.</li>
</ol>

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and disease.</a> Annual Review of Physiology. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+actively+surveying+and+shaping+neuronal+circuit+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+dynamic+mediators+of+synapse+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity.</a> Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Nakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+permit+climbing+fiber+elimination+by+promoting+GABAergic+inhibition+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum.</a> Nature Communications. 9 (1), 2830(2018).</li>
<li>Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+impact+of+microglial+distribution+on+dynamics+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines.</a> The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+changes+of+spine+dynamics+and+microglia+after+transient+peripheral+immune+response+triggered+by+LPS+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo.</a> Molecular Brain. 4 (1), 27(2011).</li>
<li>Benninger, R. K. P., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), 1000527(2010).</li>
<li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+contact+induces+synapse+formation+in+developing+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex.</a> Nature Communications. 7, 12540(2016).</li>
<li>Akiyoshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+enhance+synapse+activity+to+promote+local+network+synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization.</a> eNeuro. 5 (5), 0088(2018).</li>
<li>Favuzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-receptive+microglia+selectively+sculpt+developing+inhibitory+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits.</a> Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li>
<li>Isshiki, M., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cranial+window+types+for+in+vivo+two-photon+imaging+of+brain+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures.</a> Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).</li>
<li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).</li>
<li>De Biase, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+cues+establish+and+maintain+region-specific+phenotypes+of+basal+ganglia+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia.</a> Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).</li>
<li>Ayata, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+brain+region-specific+microglia+clearance+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).</li>
<li>Böttcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).</li>
<li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+heterogeneity+of+mouse+and+human+microglia+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution.</a> Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+mediate+forgetting+via+complement-dependent+synaptic+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination.</a> Science. 367 (6478), 688-694 (2020).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+dendritic+spines+in+the+hippocampus+reveals+structural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Schmid, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+somatostatin-positive+interneurons+associated+with+memory+deficits+in+an+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model.</a> Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).</li>
<li>Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).</li>
<li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li>
<li>Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transient+prevalence+across+the+dendritic+arbour+predicts+place+field+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties.</a> Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).</li>
<li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+consolidation+of+ensemble+neural+plasticity+patterns+in+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li>
<li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li>
<li>Lovett-Barron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+inhibition+in+the+hippocampus+supports+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning.</a> Science. 343 (6173), 857-863 (2014).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Parkhurst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Merlini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Gi-dependent+dynamics+regulate+brain+network+hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability.</a> Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).</li>
<li>Sarlus, H., Heneka, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2018).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie pozostaje w konflikcie interesów.

Metoda ta obejmuje skomplikowane zabiegi chirurgiczne, ale może zapewnić obrazy o wysokiej rozdzielczości na całym CA1 przez dłuższy czas, jeśli zostanie odpowiednio przygotowana. Eksperymenty na kilku myszach potwierdziły, że jakość obrazu w przewlekłej fazie pooperacyjnej jest lepsza niż w przypadku ostrego obrazowania pooperacyjnego. Lepsza jakość obrazu utrzymywała się przez ponad 2 miesiące. Najczęstszą przyczyną niepowodzenia jest niezamierzone uszkodzenie CA1 podczas operacji, które jest identyfikowane podczas pooperacyjnej kontroli jakości (patrz krok 4). Może to być spowodowane bezpośrednim uszkodzeniem przez aspirację, wysuszeniem mózgu, nadmiernym naciskiem szkła lub toksycznością cementu dentystycznego na ostatnim etapie. Inną przyczyną niepowodzenia jest krwawienie pooperacyjne, które można potwierdzić przez okienko ze szklanym dnem w ciągu 1 tygodnia po zabiegu (patrz krok 6.1). Przeczytaj uważnie protokół i podejmij wszelkie środki ostrożności, aby uniknąć takich problemów.
Nawet przy obecnej konfiguracji mikroskopu dwufotonowego z detektorami GaAsP w laboratorium, próba zobrazowania grzbietowego CA1 przez korę powoduje znaczną utratę rozdzielczości z powodu niebagatelnego rozpraszania światła. Dlatego, aby uzyskać rozdzielczość wystarczającą do obserwacji ruchu procesów mikrogleju lub tworzenia się kolców dendrytycznych neuronów w CA1, usunięcie części leżącej nad nim kory jest nieuniknione, tak jak w obecnej metodzie. Jedynym alternatywnym sposobem na zmniejszenie zakresu usuwania kory mózgowej przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości obrazu jest osadzenie soczewki przekaźnikowej, takiej jak soczewka z gradientowym współczynnikiem załamania światła (GRIN). W tym podejściu soczewka GRIN została umieszczona w rurce prowadzącej wszczepionej bezpośrednio nad CA1 w celu przewlekłego obrazowania CA128,29. Zewnętrzna średnica rurki prowadzącej wynosiła 1,8 mm, czyli mniej niż 3,0 mm urządzenia w tym artykule, przy jednoczesnym wytwarzaniu wysokiej rozdzielczości (NA; 0,82) porównywalnej z systemem tutaj (efektywna NA; 0,88). Jednak podejście wykorzystujące soczewkę GRIN ma wąskie pole widzenia do obserwacji w wysokiej rozdzielczości i krótką głębokość obrazowania ograniczoną przez WD soczewki GRIN. Dlatego obrazowanie wszystkich warstw hipokampa w szerokim polu widzenia z wysoką rozdzielczością jest szczególną zaletą metody opisanej w tym artykule.
Ograniczeniem tej procedury jest to, że częściowe usunięcie kory i stan zapalny mogą mieć pewien szkodliwy wpływ na hipokamp. Ponieważ jednak usunięta kora nie ma bezpośredniego wpływu na hipokamp, kora śródwęchowa nie jest uszkodzona, a sam hipokamp nie jest bezpośrednio uszkodzony, ogólna ocena jest taka, że funkcjonalne upośledzenie hipokampa nie jest znaczące. Kilka wcześniejszych badań potwierdziło, że funkcje hipokampa, w tym uczenie się i pamięć, są zachowane po implantacji okna hipokampa 25,26,27,30,31,32,33,34. W związku z tym oczekuje się, że opisane tutaj podejście do obrazowania wiernie odnotuje funkcje hipokampa po wystarczającym okresie pooperacyjnym.
Przyszłe kierunki badań opartych na tej technice obrazowania mogą obejmować przycinanie synaps wykrywane przez jednoczesne obrazowanie mikrogleju ineuronów5, interakcję mikrogleju związaną z uczeniem się z synapsami35, ruchliwość mikrogleju regulowaną przez aktywność neuronalną hipokampa36 oraz reakcje mikrogleju na zapalenie obwodowe lub uszkodzenie tkanek7. Metoda ta pomoże również wyjaśnić postęp chorób neurodegeneracyjnych. Na przykład w chorobie Alzheimera (AD) β amyloidowe i białka tau gromadzą się równolegle ze śmiercią komórek neuronalnych i zanikiem hipokampa, co prowadzi do dysfunkcji poznawczych; Doniesiono, że mikroglej jest zaangażowany w ten proces37,38. Przewlekłe obrazowanie in vivo mikrogleju i neuronów przy użyciu mysich modeli AD umożliwi nam monitorowanie korelacji między funkcjami mikrogleju a patologią neuronalną w hipokampie mysich modeli AD.
Niniejsza praca koncentruje się na obrazowaniu mikrogleju, ale ta sama procedura obrazowania ma zastosowanie do innych typów komórek neuronalnych i glejowych w CA1. Ponadto protokół ogranicza się do obrazowania znieczulonych myszy, ale technikę można również rozszerzyć o monitorowanie mikrogleju hipokampa u obudzonych myszy. Artefakty ruchu wywołane oddychaniem, biciem serca i ruchami ciała, zwłaszcza w głębokich warstwach hipokampa z dala od szklanego okna, mogą istnieć w eksperymentach z przebudzonymi myszami. W związku z tym może być wymagany odpowiedni system korekcji ruchu w celu uchwycenia morfologii i dynamiki mikrogleju.
Dyskusja na temat protokołu Zaleca się wybór myszy w odpowiednim wieku i z odpowiednimi modyfikacjami genetycznymi do ekspresji sond fluorescencyjnych o swoistości czasowej i przestrzennej (patrz krok 1.3). Myszy w wieku 1 miesiąca mogą być wykorzystywane do eksperymentów, ale myszy starsze niż 2 miesiące są łatwiejsze w obsłudze, dzięki większym rozmiarom ciała i odporności na stres chirurgiczny. Ponadto torebka zewnętrzna i pęcherzyk hipokampa są trudniejsze do oddzielenia u młodszych myszy. Dlatego usunięcie zewnętrznej torebki u młodych myszy wymaga umiejętności chirurgicznych (patrz kroki 3.4.3-4). Ocena operacji i późniejsze obrazowanie będą prostsze w przypadku myszy z ekspresją białek fluorescencyjnych w sposób powtarzalny i jednolity w CA1 i DG (patrz krok 4.7). Dlatego we wstępnych próbach chirurgii zaleca się użycie myszy transgenicznych ze słabo znakowanymi neuronami, takich jak myszy Thy1-YFP lub Thy1-GFP39, lub myszy z znakowanym mikroglejem, takich jak myszy CX3CR1-GFP24.
Dla powodzenia operacji ważny jest wybór znieczulenia (patrz krok 2.1). Różne rodzaje znieczulenia mogą powodować różne stopnie śródoperacyjnego obrzęku mózgu, co wpływa na trudność operacji, względne położenie wszczepionej metalowej rurki i stopień ucisku mózgu przez szklane okienko. Czynniki te mogą również wpływać na przeżycie neuronów hipokampa po operacji.
W procesie aspiracji do odsłonięcia hipokampa (patrz krok 3.4) należy zwrócić uwagę na następujące punkty, aby zminimalizować uszkodzenia mózgu i zapewnić skuteczne obrazowanie. Stale dostarczaj sterylną sól fizjologiczną na powierzchnię tkanki, umieszczając ujście z boku okna czaszki. Zapobiegaj wystawieniu powierzchni tkanki na działanie powietrza podczas aspiracji. Podstawową zasadą aspiracji tkanek jest usunięcie powierzchni tkanki poprzez przepływ cieczy do końcówki ssącej. Należy unikać bezpośredniego kontaktu końcówki ssącej z tkanką. Dostosuj podciśnienie przyłożone do rury ssącej na minimum. Odsysaj tkankę krok po kroku i upewnij się, że krwawienie jest kontrolowane na każdym kroku. Gdy krwawienie się przedłuża, należy poczekać, aż krwawienie ustanie samoistnie. Utrzymuj aspirację z niewielkiej odległości od miejsca krwawienia przy stałym przepływie sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Odessać tkankę, aby utworzyć cylindryczną przestrzeń, której rozmiar pasuje do metalowej rurki ze szklanym dnem (patrz krok 1.1). Wybierz igły 23 G do zasysania grubych naczynek lub dużych fragmentów tkanek oraz igły 25 G do zasysania małych resztek tkanek.

Mikroglej to jedyne komórki odpornościowe i makrofagi tkankowe rezydujące w mózgu. Oprócz funkcji komórek odpornościowych, takich jak szybka reakcja na stan zapalny, wykazano, że odgrywają one różne role fizjologiczne w utrzymaniu i przebudowie obwodów nerwowych, takich jak przycinanie synaptyczne, regulacja plastyczności synaptycznej i kontrola aktywności neuronów1,2,3,4,5. Fizjologiczne interakcje między mikroglejem a neuronami cieszą się coraz większym zainteresowaniem zarówno w rozwoju obwodów neuronalnych, jak i w neurobiologii chorób. Analiza fizjologii mikrogleju in vivo wymaga metod obserwacji mikrogleju bez uszkodzenia tkanek i reakcji zapalnych. Jednak mikroglej jest wrażliwy na stany zapalne i radykalnie zmienia swoje kształty i funkcje w odpowiedzi na uszkodzenie tkanek6,7.
Obrazowanie dwufotonowe in vivo jest idealnym narzędziem do uchwycenia fizjologicznej dynamiki mikrogleju8. Początkowe zastosowania obrazowania dwufotonowego in vivo ujawniły dynamiczny ruch procesów mikrogleju do nadzoru środowiskowego w korze dorosłej myszy 9,10. Poniższe badania obrazowania dwufotonowego jeszcze bardziej rozszerzyły monitorowanie mikrogleju in vivo w celu analizy funkcjonalnych i strukturalnych interakcji z neuronami5,11,12,13,14. Jednak głębokość obrazowania w konwencjonalnej mikroskopii dwufotonowej została ograniczona do mniej niż 1 mm od powierzchni mózgu15,16. To ograniczenie wyjaśnia niedobór wcześniejszych badań opisujących zachowanie mikrogleju w głębokich obszarach mózgu, takich jak hipokamp.
Ostatnie badania sekwencjonowania RNA wykazały znaczną regionalną heterogeniczność mikrogleju, co zwiększa możliwość istnienia odrębnych ról funkcjonalnych17,18,19,20,21. W związku z tym konieczne jest rejestrowanie interakcji mikrogleju z neuronami w różnych obszarach mózgu, ale trudności techniczne utrudniają takie badania. W szczególności stwierdzono, że aktywny udział mikrogleju w przebudowie synaps ma kluczowe znaczenie dla rozwoju sieci neuronowej hipokampa i jej funkcji związanych z pamięcią22,23. Nie są jednak dostępne skuteczne metody obserwacji niekwestionowanego mikrogleju hipokampa in vivo.
Ten protokół wyjaśnia procedury przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w CA1 grzbietowego hipokampa przy użyciu precyzyjnie kontrolowanych technik chirurgicznych. Obrazowanie dwufotonowe obszaru CA1 u myszy CX3CR1-GFP (CX3CR1+/GFP), które wyrażają GFP w microglia24, umożliwiło obserwację rozgałęzionego mikrogleju we wszystkich warstwach CA1 z wystarczającą rozdzielczością. Protokół zawiera kilka wskazówek dotyczących udanego implantacji okna obserwacyjnego i odpowiednich warunków obrazowania. Ponadto jako przykład zastosowania przedstawiono jednoczesną wizualizację neuronów piramidowych i mikrogleju w CA1. Omówiono również zalety, ograniczenia i potencjał tej techniki.

<table><tbody><tr><td>igły 23 G</td><td>NIPRO</td><td>02-166</td><td>Końcówki ssące do aspiracji.</td></tr><tr><td>igły 25 G</td><td>NIPRO</td><td>02-167</td><td>Końcówki ssące do aspiracji.</td></tr><tr><td>Stemple skórne 3 mm (DermaPunch)Maruho</td><td></td> <td>213001610</td><td>Narzędzia do kraniotomii.</td></tr><tr><td>Igły 30 G</td><td>Dentronics</td><td>Igła jednorazowa nr 30</td><td>Narzędzia do kraniotomii.</td></tr><tr><td>Femtosekundowy laser impulsowy</td><td>Spectra-Physics</td><td>MaiTai Deep See</td><td>A Ti:Sapphire laser używany na długości fali 920 nm.</td></tr><tr><td>Mikroskop dwufotonowy</td><td>Nikon</td><td>A1R MP+</td><td>Microscope do obrazowania CA1.</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td><td>Penn Vector Core</td><td></td><td>AAV do znakowania neuronów.</td></tr><tr><td>AAV1-hSyn-Cre</td><td>Penn Vector Core</td><td></td><td>AAV do znakowania neuronów.</td></tr><tr><td>Soczewka obiektywowa do obrazowania dwufotonowego</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XSVMP</td><td>25-krotny obiektyw o dużej odległości roboczej, dużej aperturze numerycznej i kołnierzu korekcyjnym</td></tr><tr><td>Aspiratory</td><td>Shin-ei Industries</td><td>KS-500</td><td>Narzędzia do aspiracji.</td></tr><tr><td>Płyty aluminiowe</td><td>Narishige</td><td>CP-1</td><td>Płytki wykonane z aluminium do mocowania głowy.</td></tr><tr><td>Chemiczny krem do depilacji</td><td>YANAGIYA</td><td></td><td>Krem do depilacji wokół pola operacyjnego.</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe okrągłe</td><td>Matsunami Glass</td><td>3&phi; Nr 1</td><td>Szkiełka nakrywkowe przyklejone do rur ze stali nierdzewnej.</td></tr><tr><td>Myszy CX3CR1-GFP</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>008451</td><td>Myszy transgeniczne do obrazowania mikrogleju.</td></tr><tr><td>Cylindryczne rurki ze stali nierdzewnej</td><td>MORISHITA</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>rurki metalowe do implantacji. Średnica zewnętrzna 3,0 mm, średnica wewnętrzna 2,8 mm, wysokość 1,7 mm.</td></tr><tr><td>Materiał do trawienia zębów</td><td>Sun Medical</td><td>204610461</td><td>Służy do wytrawiania kości czaszki.</td></tr><tr><td>Cement z żywicy dentystycznej (Super-Bond C& B)</td> <td>Sun Medical</td><td>204610555</td><td>Cement dentystyczny.</td></tr><tr><td>Zbieracze opony twardej (Micro Points)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10063-15</td><td>Narzędzia do usuwania opony twardej.</td></tr><tr><td>Drobne kleszcze (Dumont #5)</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11252-20</td><td>Narzędzia chirurgiczne.</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Bio Research Center</td><td>PRI13-3374</td><td>Służy do dezynfekcji miejsca operowanego.</td></tr><tr><td>Urządzenie do trzymania głowy</td><td>Narishige</td><td>MAG-2</td><td>Urządzenie do trzymania głowy myszy z regulatorami kąta</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Bio Research Center</td><td>BWT-100A i HB-10</td><td>Narzędzia zapewniające wsparcie termiczne myszy podczas operacji.</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>ALA Scientific</td><td>HEATINGPAD-1 i Hot-1</td><td>Tools zapewniające termiczne wsparcie myszy na urządzeniu trzymającym głowę.</td></tr><tr><td>Ketamina (Ketalar)</td><td>Daiichi Sankyo Company</td><td>S9-001665</td><td>Znieczulenie podczas operacji.</td></tr><tr><td>Meloksykam</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>M1959</td><td>Analgezja podczas operacji.</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Sato Pharmaceutical</td><td></td><td>Stosowana w celu zapobiegania suchości oczu podczas zabiegu chirurgicznego.</td></tr><tr><td>Roztwór peelingujący powidonu i jodu</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td>2612701Q1137</td><td>Służy do dezynfekcji miejsca operowanego.</td></tr><tr><td>Noże miniaturowe z okrągłymi końcówkami</td><td>Surgistar</td><td>4769</td><td>Narzędzia chirurgiczne.</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS</td><td>450-098-67</td><td>Jednorazowe narzędzie chirurgiczne.</td></tr><tr><td>Mikroskopy stereoskopowe</td><td>Leica Microsystems</td><td>S8 APO</td><td>Mikroskopy do chirurgii.</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna</td><td>Fabryka Farmaceutyczna Otsuka</td><td>3311401A2026</td><td>Roztwór myjący podczas operacji.</td></tr><tr><td>Sterylna wodoodporna podkładka</td><td>AS ONE</td><td>8-5945-01</td><td>Platforma chirurgiczna.</td></tr><tr><td>Sulforodamina 101</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7635</td><td>Barwnik do obrazowania naczyń krwionośnych in vivo.</td></tr><tr><td>Serweta chirurgiczna</td><td>Medline Industries</td><td>MP-0606F6T</td><td>Perforowana serweta do operacji.</td></tr><tr><td>Światło UV</td><td>Toshiba</td><td>GL15</td><td>Służy do utwardzania klejów.</td></tr><tr><td>Kleje optyczne utwardzane promieniami UV</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>Kleje do klejenia szkiełek nakrywkowych do rur ze stali nierdzewnej.</td></tr><tr><td>Ksylazyna (Celactal 2%)</td><td>Znieczulenie</td> <td>Bayera</td><td></td> podczas zabiegu.</tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Mikroglej, jedyne komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, aktywnie uczestniczą w utrzymaniu obwodów nerwowych poprzez modyfikację synaps i pobudliwości neuronów. Ostatnie badania ujawniły zróżnicowaną ekspresję genów i funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w różnych regionach mózgu. Unikalne funkcje sieci neuronowej hipokampa w uczeniu się i pamięci mogą być związane z aktywną rolą mikrogleju w przebudowie synaps. Jednak reakcje zapalne wywołane zabiegami chirurgicznymi były problematyczne w dwufotonowej analizie mikroskopowej mikrogleju hipokampa. W tym miejscu przedstawiono metodę, która umożliwia przewlekłą obserwację mikrogleju we wszystkich warstwach hipokampa CA1 przez okno obrazowania. Metoda ta pozwala na analizę zmian morfologicznych w procesach mikrogleju przez okres dłuższy niż 1 miesiąc. Długotrwałe obrazowanie spoczynkowego mikrogleju w wysokiej rozdzielczości wymaga minimalnie inwazyjnych zabiegów chirurgicznych, odpowiedniego doboru obiektywu i zoptymalizowanych technik obrazowania. Przemijająca reakcja zapalna mikrogleju hipokampa może uniemożliwić obrazowanie bezpośrednio po operacji, ale mikroglej przywraca swoją spokojną morfologię w ciągu kilku tygodni. Co więcej, obrazowanie neuronów jednocześnie z mikroglejem pozwala nam analizować interakcje wielu typów komórek w hipokampie. Technika ta może dostarczyć istotnych informacji na temat funkcji mikrogleju w hipokampie.

Dzięki zastosowaniu tej techniki można prowadzić chroniczną obserwację rozgałęzionych i spoczynkowych mikroglejów we wszystkich warstwach grzbietowej części obszaru CA1, w tym w stratum oriens (SO), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) oraz stratum lacunosum-moleculare (SLM), szczególnie 3-4 tygodnie po operacji, gdy ustępuje stan zapalny. Jeśli zabieg chirurgiczny zostanie przeprowadzony prawidłowo, obrazowanie może być wykonywane nawet przez kilka miesięcy po operacji. Niniejsza sekcja zawiera trzy zagadnienia przydatne przy ocenie obrazowania intravitalnego. Po pierwsze, przedstawiono przykładowe obrazy bezpośrednio po operacji oraz w fazie chronicznej, które służą jako referencje dla prawidłowych procedur chirurgicznych i obrazowania. Po drugie, opisano charakterystyczną morfologię mikroglejów, ich intensywność fluorescencji oraz rozmieszczenie naczyń krwionośnych w konkretnych warstwach hipokampa, co ma pomóc czytelnikowi w oszacowaniu głębokości obrazowania, od alveus aż po zakręt zębaty (DG). Po trzecie, przedstawiono przykład zastosowania obrazowania jednoczesnego neuronów i mikroglejów.
Reprezentatywne obrazy mikrogleju u myszy CX3CR1-GFP bezpośrednio po operacji przedstawiono na Rysunku 2. Jeśli nie występuje wyraźne uszkodzenie obszaru CA1, a krzywizna warstw CA1 jest odpowiednio spłaszczona przez nakładające ją szkiełko podstawowe, głębokość obrazowania mikrogleju metodą dwufotonową przekracza całe warstwy CA1 i sięga 500 µm od powierzchni chirurgicznej, gdzie znajduje się ML lub warstwa komórek ziarnistych (GCL) zakrętu zębatego (DG) (Rysunek 2A; patrz krok 4.7 oraz Rysunek 4E). Mikroglej jest nieco mniej rozgałęziony, zwłaszcza w warstwie blisko powierzchni chirurgicznej, w porównaniu z mikroglejem w nienaruszonym hipokampie. Niemniej jednak nie wykazuje on wyraźnej aktywacji, co sugeruje prawidłowe przeprowadzenie procedur chirurgicznych (Rysunek 2B). Z drugiej strony, obrzęk w obszarze CA1 wywołany uszkodzeniem tkanki ograniczy głębokość obrazowania do 200 µm (Rysunek 2C). Uszkodzenie tkanki indukuje również nieprawidłową aktywację mikrogleju, taką jak gromadzenie się wybrzuszeń wypustek w stronę wolnej powierzchni tkanki (Rysunek 2D; por. górny obraz na Rysunku 2B). Są to oznaki nieprawidłowo przeprowadzonej operacji.
Reprezentatywne obrazy mikrogleju w fazie przewlekłej, ponad 3 tygodnie po operacji, przedstawiono na Rysunku 3. Mikroglej można ponownie obrazować poza obszarem CA1, obejmując głębsze warstwy DG, z wyższą intensywnością fluorescencji i rozdzielczością oraz z bardziej jednorodnym rozkładem (patrz krok 6.3, Rysunek 3B). Jakość obrazowania jest lepsza niż bezpośrednio po operacji (Rysunek 2A). Różnica ta może wynikać z zmniejszenia obrzęku i stanu zapalnego. Mikroglej we wszystkich warstwach odzyskał już swoją rozgałęzioną morfologię (Rysunek 3C), która różni się od wyglądu pooperacyjnego (Rysunek 2B). Obrazowanie time-lapse mikrogleju w obszarze CA1 wykazuje nieruchome ciała komórkowe i wysoce mobilne wypustki służące do nadzoru (Wideo 1-2). Ich mobilne zachowanie jest podobne do opisanej we wcześniejszym raporcie dynamiki wypustek mikrogleju w korze mózgowej9.
Identyfikacja obrazowanych warstw hipokampa na podstawie rozkładu i głębokości ciał komórek neuronalnych jest prosta przy użyciu myszy wykazujących ekspresję sond fluorescencyjnych w neuronach hipokampa25,26,27. Bez pomocy informacji pozycyjnych o ciałach komórek neuronów, sygnały pochodzące wyłącznie z fluorescencyjnej mikroglej dają pewne wskazówki do identyfikacji warstw hipokampa (Rysunek 3B). Mikroglej w alveus posiada wydłużone ciała komórkowe i wypustki, które mają tendencję do rozciągania się wzdłuż pęczków aksonalnych (Rysunek 4A). Mikroglej w innych warstwach można odróżnić po okrągłych ciałach komórkowych i wypustkach promieniujących bez preferowanych kierunków. Mikroglej w SP znajduje się pomiędzy gęsto upakowanymi neuronami piramidalnymi i można go odróżnić po niższej gęstości wypustek mikroglejalnych. Warstwy powyżej i poniżej SP są identyfikowane odpowiednio jako SO i SR (Rysunek 4B). Nie jest możliwe odróżnienie SR od SLM wyłącznie na podstawie właściwości mikrogleju. Granicę między CA1 a DG rozpoznaje się po grubych naczyniach krwionośnych biegnących wzdłuż tej krawędzi (Rysunek 4C). Naczynia te można lepiej zidentyfikować poprzez znakowanie barwnikami takimi jak sulforodamina 101 (SR101; 5 mM, 4 µL/g masy ciała) wstrzykiwanymi dootrzewnowo (Rysunek 4D). Sygnał fluorescencji z mikrogleju gwałtownie spada w DG w porównaniu do nadkładającego się obszaru CA1, prawdopodobnie ze względu na różnicę w współczynniku załamania światła tych struktur. Ta przerwa w intensywności fluorescencji może również pomóc w określeniu granicy między DG a CA1. Jako przykład zastosowania pokazano jednoczesne obrazowanie mikrogleju GFP-dodatniego i neuronów piramidalnych znakowanych tdTomato (Rysunek 4E). W tym eksperymencie myszy CX3CR1-GFP otrzymały wstrzyknięcie wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) w celu ekspresji tdTomato w neuronach piramidalnych hipokampa. Znakowanie neuronów pomoże w zrozumieniu dokładnej struktury warstw CA1.
<img alt="Schematy ustawienia implantu chirurgicznego z cementem dentystycznym, rurką ze stali nierdzewnej i czaszką do badań neurologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematy implantacji okna obserwacyjnego. (A) Przekrój poprzeczny zmontowanej metalowej rurki z szklanym dnem. Okrągła szklana lamella przylega do jednego końca cylindrycznej rurki ze stali nierdzewnej. (B) Przekrój poprzeczny płytki aluminiowej przymocowanej do czaszki. Płytka powinna być równoległa do oznaczonej powierzchni czaszki, aby nie kolidować z obiektywem soczewki, umieszczonym blisko płytki w celu ustawienia ostrości. (C) Przekrój poprzeczny implantowanej rurki. Szklane dno powinno ściśle przylegać do alveus hippocampi, aby delikatnie docisnąć i spłaszczyć powierzchnię obszaru CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat rozkładu neuronów, mikroskopia GFP, przekroje mózgu, warstwy CA1 i DG, analiza w dniu POD 0." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obrazowanie in vivo mikrogleju u myszy CX3CR1-GFP bezpośrednio po operacji. (A) Reprezentatywna rekonstrukcja 3D z obrazowania in vivo obszaru CA1 u myszy CX3CR1-GFP w 0. dniu po operacji (POD 0) (szerokość: 511 µm, wysokość: 511 µm, głębokość: 550 µm). Fluorescencyjny mikroglej w ML obszaru DG na głębokości 500 µm od szklanego dna może być obrazowany przez cały obszar CA1. (B) Typowe wypełnione GFP komórki mikrogleju uzyskane w (A) przedstawiono jako projekcje maksymalnej intensywności (MIPs) stosów obrazów o grubości 20 µm na głębokościach 100, 300 i 520 µm od szklanego dna. Morfologia mikrogleju jest wykrywalna od powierzchownej części CA1 do ML obszaru DG, choć z widoczną pogorszeniem jakości obrazu w DG. Mikroglej, szczególnie w warstwie bliskiej powierzchni operacyjnej, jest mniej rozgałęziony, lecz nie wykazuje wyraźnej aktywacji. Paski skali, 50 µm. (C) Reprezentatywna rekonstrukcja obrazu 3D chirurgicznie uszkodzonego obszaru CA1. Dane pozyskano od myszy CX3CR1-GFP w dniu POD 0 (szerokość: 399 µm, wysokość: 399 µm, głębokość: 450 µm). Fluorescencja mikrogleju jest wykrywalna tylko do głębokości 200 µm, w przeciwieństwie do nieuszkodzonego CA1 (A), gdzie fluorescencyjny mikroglej wykryto na głębokości 500 µm. (D) Typowy obraz nieprawidłowo aktywowanego mikrogleju w (C). MIP stosów obrazów GFP o grubości 20 µm na głębokości 60 µm pokazuje wypukłe wypustki mikrogleju rozciągające się w stronę chirurgicznie odsłoniętej powierzchni tkanki. Ogólna morfologia mikrogleju różni się od obrazu przedstawionego w (B). Pasek skali, 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza obszarów mózgu; obrazy hipokampa; dane z mikroskopii; GFP z etykietą; badanie neuroanatomiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: In vivo obrazowanie mikrogleju u myszy CX3CR1-GFP w fazie przewlekłej. (A) Reprezentatywny wygląd wszczepionego okienka w prawym grzbietowym obszarze CA1 w fazie przewlekłej. Przez szklane dno wyraźnie widoczne są białe włókna *alveus* bez obecności krwawienia pooperacyjnego. W obszarze kaudomedialnym oraz na brzegu rostrolateralnym częściowo widoczne są odpowiednio DHC i LV. Pasek skali, 1 mm. (B) Reprezentatywna rekonstrukcja 3D z in vivo przewlekłe obrazowanie obszaru CA1 u myszy CX3CR1-GFP w 24. dobie pooperacyjnej (szerokość: 511 µm, wysokość: 511 µm, głębokość: 670 µm). W porównaniu z obrazami wykonanymi bezpośrednio po operacji (Rysunek 2A), mikroglej wykazuje bardziej jednorodny rozkład i może być wyraźniej obserwowany w głębszych warstwach zakrętu zębatego (DG) ze względu na zmniejszenie obrzęku i stanu zapalnego. (C) Typowe obrazy mikrogleju z (B) z całkowicie przywróconą morfologią rozgałęzioną są przedstawione jako MIPy stosów obrazów GFP z 20 µm grubość na głębokościach 100, 280 i 500 µm z powierzchni chirurgicznej. Paski skali, 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa traktów aksonalnych hipokampa z GFP i SR101, obrazowanie sieci neuronalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wskazówki do identyfikacji poszczególnych warstw hipokampa podczas obrazowania in vivo oraz przykład zastosowania tej metody. (A) Typowy obraz mikrogleju w alveusie myszy CX3CR1-GFP w fazie przewlekłej. Ciała komórek mikrogleju i wypustki rozciągające się wzdłuż traktów aksonalnych przedstawiono w MIP stosów obrazów GFP o grubości 10 µm na głębokości 15 µm. Pasek skali, 50 µm. (B) Reprezentatywne obrazy mikrogleju w SO, SP i SR w fazie przewlekłej przedstawione jako MIP stosów obrazów GFP o grubości 5 µm. Lokalna gęstość wypustek mikrogleju jest niższa w SP niż w sąsiednich SO lub SR ze względu na gęsto upakowane neurony piramidalne w SP. Paski skali, 100 µm. (C) Grube naczynia krwionośne biegnące wzdłuż granicy między CA1 a DG można rozpoznać jedynie dzięki fluorescencji mikrogleju. Przedstawiono średnią projekcję intensywności mozaikowych stosów obrazów GFP o grubości 90 µm w fazie przewlekłej na głębokości około 500 µm. Brak sygnału GFP odpowiada grubym naczyniom. Pasek skali, 500 µm. (D) (Góra) Obraz tego samego pola widzenia co w C po domięśniowym wtryśnięciu SR101. Pasek skali, 500 µm. (Dół) Rekonstrukcja 3D obrazów mozaikowych po wstrzyknięciu SR101 (szerokość: 2,60 mm, wysokość: 1,73 mm, głębokość: 0,69 mm). Grube naczynia biegnące wzdłuż granicy między CA1 a DG można łatwo rozpoznać po wewnątrznaczyniowej fluorescencji SR101. (E) (Lewo) Rekonstrukcja 3D CA1 i DG (szerokość: 255 µm, wysokość: 255 µm, głębokość: 730 µm) oraz (prawo) MIP fluorescencji GFP i tdTomato w SP wykonany ze stosów obrazów o grubości 20 µm. Na 1 tydzień przed operacją do hipokampa myszy CX3CR1-GFP wstrzyknięto 1,5 µL mieszaniny AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5,0 x 1012 vg/mL) i AAV1-hSyn-Cre (1,0 x 109 vg/mL), aby rzadko oznakować neurony. Obrazowanie przeprowadzono w dniu 0 po operacji (POD 0). SP i GCL są łatwo rozpoznawalne po położeniu ciał komórek neuronalnych. Pasek skali, 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo 1: Obrazowanie time-lapse mikrogleju w SO w fazie przewlekłej. MIP stosów obrazów GFP o grubości 20 µm w obrazowaniu time-lapse mikrogleju w SO, animowany w taki sposób, że 28 min odtwarza się w 1 s. Pasek skali, 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo 2: Obrazowanie time-lapse mikrogleju SR w fazie chronicznej. Projekcja maksymalnej intensywności (MIP) stosów obrazów GFP o grubości 20 µm w obrazowaniu time-lapse mikrogleju SR, z animacją w tempie 28 min na 1 s. Pasek skali, 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video2.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Rola mikrogleju w hipokampie nie jest jeszcze w pełni poznana. Protokół ten może bezpośrednio obrazować, w jaki sposób mikroglej kontaktuje się z neuronami i reguluje je. Obrazowanie in vivo spoczynkowego mikrogleju i neuronów w hipokampie było bardzo trudne.Ta metoda może rozwiązać ten problem. Aby wszczepić okienko obserwacyjne, należy wykonać trzymilimetrowy okrągły rowek na czaszce za pomocą stempla skórnego, zapewniając wyrównanie rowka z wcześniej zaznaczonym obszarem. Kiedy stempel skórny dotrze do najbardziej wewnętrznej warstwy czaszki przed dotknięciem leżącej pod spodem opony twardej, delikatnie unieś centralną wyspę kostną za pomocą igły o rozmiarze 30.Następnie ostrożnie usuń oponę twardą za pomocą zbieracza opony twardej. Odessać pia, naczynia pial i tkankę korową z powierzchni. Utrzymuj jednorodną głębokość odsłoniętej powierzchni tkanki na całej długości okna czaszki i stopniowo pogłębiaj aspirację, aż włókna torebki zewnętrznej zostaną odsłonięte.Po umieszczeniu końcówki ssącej na torebce zewnętrznej w pobliżu komory bocznej na rostrobocznym końcu okna czaszki, należy usunąć warstwę powierzchniową torebki zewnętrznej biegnącą w kierunku ogoniastym do kierunku ostrobocznego. Następnie usuń wewnętrzną warstwę biegnącą w kierunku przyśrodkowo-bocznym. Potwierdzić usunięcie całej torebki zewnętrznej, sprawdzając pełne odsłonięcie powierzchni pęcherzyka moczowego i spoidła grzbietowego hipokampa.Po upewnieniu się, że krwawienie całkowicie ustąpiło, wypełnij otwór sterylnym roztworem soli fizjologicznej do poziomu powierzchni czaszki. Następnie włóż metalową rurkę ze szklanym dnem pionowo do otworu, zasysając nadmiar wody przelewającej się z boków rurki, aż szklane dno lekko dociśnie do pęcherzyka i częściowo spłaszczy leżący pod spodem CA1. Za pomocą cementu z żywicy dentystycznej przymocuj ściankę wprowadzonej rurki do otaczającej czaszki.Umieść mysz w urządzeniu przytrzymującym głowę pod soczewką obiektywu mikroskopu dwufotonowego i na zmotoryzowanym stoliku skanującym XY. Następnie wypełnij przestrzeń między szklanym dnem a soczewką obiektywu wodą, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Dostosuj ostrość do CA1 pod kierunkiem fluorescencji emitowanej przez miąższ mózgu i światła odbitego od krawędzi metalowej rurki pod ciągłym oświetleniem przez laser impulsowy.Dostosuj kąt nachylenia głowicy myszy, przechylając urządzenie przytrzymujące głowicę tak, aby szklane dno było równoległe do płaszczyzny obrazowania. Następnie wyreguluj kołnierz korekcyjny obiektywu, aby osiągnąć najwyższą rozdzielczość na głębokości struktury docelowej w CA1. Następnie potwierdź, że komórki fluorescencyjne w warstwie molekularnej zakrętu zębatego lub DG na głębokości 500 mikrometrów od szklanego dna są obrazowane w całym polu widzenia.Tylko w przypadku udanej operacji sygnały DG mogą być natychmiast wykryte. Hoduj mysz pooperacyjną w indywidualnym pomieszczeniu przez kilka tygodni. Umieść znieczuloną mysz pod mikroskopem dwufotonowym.Wykonaj obrazowanie hipokampa. Sprawdź, czy jakość i intensywność obrazów wykonanych po zmniejszeniu obrzęku pooperacyjnego są lepsze lub porównywalne z tymi wykonanymi w dniu operacji. Upewnij się, że mikroglej odzyskał swoją rozgałęzioną morfologię.Następnie wykonaj obrazowanie in vivo na warstwie zainteresowania w CA1. Mikroglej u myszy CX3CR1-GFP schwytanych natychmiast po operacji nie wykazywał wyraźnej aktywacji. Po udanej operacji bez indukcji obrzęku, dwufotonowe głębokości obrazowania przekroczyły całe warstwy CA1 i sięgnęły 500 mikrometrów od powierzchni operacyjnej.Mikroglej w fazie przewlekłej trwającej ponad trzy tygodnie po operacji wykazywał wyższą intensywność i rozdzielczość fluorescencyjną oraz bardziej jednorodną dystrybucję ze względu na zmniejszony obrzęk i stan zapalny. Mikroglej we wszystkich warstwach przywrócił już swoją rozgałęzioną morfologię i wykazywał nieruchome ciała komórkowe oraz wysoce modalne procesy. Obrazy w wysokiej rozdzielczości z całego CA1 były dostarczane przez kilka miesięcy.Sygnały z fluorescencyjnego mikrogleju pomagają zidentyfikować warstwy hipokampa. Mikroglej w zębole miał wydłużone ciała komórkowe i procesy rozciągające się wzdłuż dróg aksonalnych. Mikroglej w warstwie piramidalnej można odróżnić po mniejszej gęstości ich procesów.Granicę między CA1 a DG można było rozpoznać po grubych naczyniach krwionośnych biegnących wzdłuż granicy, które były lepiej rozpoznawane przez znakowanie naczyń sulforodaminą 101. Jako przykład zastosowania, jednocześnie zobrazowano mikroglej GFP dodatni i neurony piramidowe oznaczone tdTomato. Znakowanie neuronalne pomogło zrozumieć dokładne struktury warstw CA1.Najważniejszą kwestią jest zmniejszenie uszkodzeń chirurgicznych. Unikaj uszkodzenia tkanek przez aspirację. Wywieraj delikatny nacisk podczas wkładania szklanego dna i unikaj dotykania powierzchni mózgu przez cement dentystyczny.Takie podejście pomoże określić rolę mikrogleju w hipokampie. Na przykład, jak mikroglej oddziałuje z neuronami, jak bierze udział w uczeniu się i jak kontroluje choroby mózgu.

in-vivo-chronic-two-photon-imaging-microglia-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Źródło: Ulivi, A. F., et. al. Podłużne dwufotonowe obrazowanie grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy. J. Vis. exp. (2019) Ten film pokazuje podłużne obrazowanie dwufotonowe znakowanych fluorescencyjnie neuronów piramidowych u żywej myszy,  prezentacja preparatu, wyrównania kaniuli oraz obrazowania dendrytów i kolców dendrytycznych w celu zbadania struktury neuronalnej w regionie CA1 hipokampa.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe znakowanych fluorescencyjnie neuronów w żywym hipokampie myszy 

Source: Nishimura, C.  Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego wirusem HIV. J. Vis. Exp. (2016). Ten film pokazuje wizualizację in vivo naczyń włosowatych kory mózgowej myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Przedstawiono w nim etapy wstrzykiwania barwnika fluorescencyjnego znieczulonej myszy z cienkim oknem korowym czaszki, przygotowywania zestawu do obrazowania i uzyskiwania szczegółowych obrazów struktur...

 Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania in vivo mikrokrążenia mózgu myszy 

Źródło: Kamei, R., et al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)Film przedstawia proces konfiguracji i obrazowania do mikroskopii dwufotonowej in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie CA1 (Cornu ammonis 1) i zakręcie zębatym, zapewniając optymalne wyrównanie optyczne i ocenę integralności strukturalnej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo dynamiki mikrogleju w hipokampie myszy

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne.  Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Poznaj metodę przewlekłego dwufotonowego obrazowania mikrogleju w hipokampie myszy. Technika umożliwia obserwację interakcji mikrogleju z neuronami w warunkach in vivo.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Przeglądaj więcej filmów