In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy
6 lipca 2022
Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.
Rola mikrogleju w hipokampie nie jest jeszcze w pełni poznana. Protokół ten może bezpośrednio obrazować, w jaki sposób mikroglej kontaktuje się z neuronami i reguluje je. Obrazowanie in vivo spoczynkowego mikrogleju i neuronów w hipokampie było bardzo trudne.
Ta metoda może rozwiązać ten problem. Aby wszczepić okienko obserwacyjne, należy wykonać trzymilimetrowy okrągły rowek na czaszce za pomocą stempla skórnego, zapewniając wyrównanie rowka z wcześniej zaznaczonym obszarem. Kiedy stempel skórny dotrze do najbardziej wewnętrznej warstwy czaszki przed dotknięciem leżącej pod spodem opony twardej, delikatnie unieś centralną wyspę kostną za pomocą igły o rozmiarze 30.
Następnie ostrożnie usuń oponę twardą za pomocą zbieracza opony twardej. Odessać pia, naczynia pial i tkankę korową z powierzchni. Utrzymuj jednorodną głębokość odsłoniętej powierzchni tkanki na całej długości okna czaszki i stopniowo pogłębiaj aspirację, aż włókna torebki zewnętrznej zostaną odsłonięte.
Po umieszczeniu końcówki ssącej na torebce zewnętrznej w pobliżu komory bocznej na rostrobocznym końcu okna czaszki, należy usunąć warstwę powierzchniową torebki zewnętrznej biegnącą w kierunku ogoniastym do kierunku ostrobocznego. Następnie usuń wewnętrzną warstwę biegnącą w kierunku przyśrodkowo-bocznym. Potwierdzić usunięcie całej torebki zewnętrznej, sprawdzając pełne odsłonięcie powierzchni pęcherzyka moczowego i spoidła grzbietowego hipokampa.
Po upewnieniu się, że krwawienie całkowicie ustąpiło, wypełnij otwór sterylnym roztworem soli fizjologicznej do poziomu powierzchni czaszki. Następnie włóż metalową rurkę ze szklanym dnem pionowo do otworu, zasysając nadmiar wody przelewającej się z boków rurki, aż szklane dno lekko dociśnie do pęcherzyka i częściowo spłaszczy leżący pod spodem CA1. Za pomocą cementu z żywicy dentystycznej przymocuj ściankę wprowadzonej rurki do otaczającej czaszki.
Umieść mysz w urządzeniu przytrzymującym głowę pod soczewką obiektywu mikroskopu dwufotonowego i na zmotoryzowanym stoliku skanującym XY. Następnie wypełnij przestrzeń między szklanym dnem a soczewką obiektywu wodą, nie tworząc pęcherzyków powietrza. Dostosuj ostrość do CA1 pod kierunkiem fluorescencji emitowanej przez miąższ mózgu i światła odbitego od krawędzi metalowej rurki pod ciągłym oświetleniem przez laser impulsowy.
Dostosuj kąt nachylenia głowicy myszy, przechylając urządzenie przytrzymujące głowicę tak, aby szklane dno było równoległe do płaszczyzny obrazowania. Następnie wyreguluj kołnierz korekcyjny obiektywu, aby osiągnąć najwyższą rozdzielczość na głębokości struktury docelowej w CA1. Następnie potwierdź, że komórki fluorescencyjne w warstwie molekularnej zakrętu zębatego lub DG na głębokości 500 mikrometrów od szklanego dna są obrazowane w całym polu widzenia.
Tylko w przypadku udanej operacji sygnały DG mogą być natychmiast wykryte. Hoduj mysz pooperacyjną w indywidualnym pomieszczeniu przez kilka tygodni. Umieść znieczuloną mysz pod mikroskopem dwufotonowym.
Wykonaj obrazowanie hipokampa. Sprawdź, czy jakość i intensywność obrazów wykonanych po zmniejszeniu obrzęku pooperacyjnego są lepsze lub porównywalne z tymi wykonanymi w dniu operacji. Upewnij się, że mikroglej odzyskał swoją rozgałęzioną morfologię.
Następnie wykonaj obrazowanie in vivo na warstwie zainteresowania w CA1. Mikroglej u myszy CX3CR1-GFP schwytanych natychmiast po operacji nie wykazywał wyraźnej aktywacji. Po udanej operacji bez indukcji obrzęku, dwufotonowe głębokości obrazowania przekroczyły całe warstwy CA1 i sięgnęły 500 mikrometrów od powierzchni operacyjnej.
Mikroglej w fazie przewlekłej trwającej ponad trzy tygodnie po operacji wykazywał wyższą intensywność i rozdzielczość fluorescencyjną oraz bardziej jednorodną dystrybucję ze względu na zmniejszony obrzęk i stan zapalny. Mikroglej we wszystkich warstwach przywrócił już swoją rozgałęzioną morfologię i wykazywał nieruchome ciała komórkowe oraz wysoce modalne procesy. Obrazy w wysokiej rozdzielczości z całego CA1 były dostarczane przez kilka miesięcy.
Sygnały z fluorescencyjnego mikrogleju pomagają zidentyfikować warstwy hipokampa. Mikroglej w zębole miał wydłużone ciała komórkowe i procesy rozciągające się wzdłuż dróg aksonalnych. Mikroglej w warstwie piramidalnej można odróżnić po mniejszej gęstości ich procesów.
Granicę między CA1 a DG można było rozpoznać po grubych naczyniach krwionośnych biegnących wzdłuż granicy, które były lepiej rozpoznawane przez znakowanie naczyń sulforodaminą 101. Jako przykład zastosowania, jednocześnie zobrazowano mikroglej GFP dodatni i neurony piramidowe oznaczone tdTomato. Znakowanie neuronalne pomogło zrozumieć dokładne struktury warstw CA1.
Najważniejszą kwestią jest zmniejszenie uszkodzeń chirurgicznych. Unikaj uszkodzenia tkanek przez aspirację. Wywieraj delikatny nacisk podczas wkładania szklanego dna i unikaj dotykania powierzchni mózgu przez cement dentystyczny.
Takie podejście pomoże określić rolę mikrogleju w hipokampie. Na przykład, jak mikroglej oddziałuje z neuronami, jak bierze udział w uczeniu się i jak kontroluje choroby mózgu.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę przewlekłego obrazowania in vivo spoczynkowej mikroglei w obszarze CA1 hipokampa myszy z wykorzystaniem podejścia chirurgicznego i mikroskopii dwufotonowej. Analizie poddano sposób, w jaki mikrogleja oddziałuje z neuronami, oraz jej rolę w procesach mózgowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Neuroobrazowanie
Wstęp
- Funkcje mikrogleju w hipokampie nie są w pełni poznane.
- Obrazowanie in vivo spoczynkowej mikroglei i neuronów stanowiło znaczące wyzwanie.
- Niniejszy protokół ma na celu wypełnienie zidentyfikowanej luki w obrazowaniu mikrogleju.
Cel badania
- Opracowanie metody obserwacji zachowania mikrogleju oraz jego oddziaływania z neuronami.
- Zminimalizowanie obrażeń chirurgicznych podczas procesu obserwacji.
- Zapewnienie wglądu w rolę mikrogleju w procesach uczenia się oraz w zaburzeniach mózgu.
Zastosowane metody
- Do obrazowania wykorzystano mikroskopię dwufotonową.
- Przewlekłe obrazowanie in vivo koncentrowało się na obszarze CA1 hipokampa myszy.
- Metoda obejmowała precyzyjne techniki chirurgiczne w celu zminimalizowania uszkodzeń tkanki.
- W celu zapewnienia dostępu optycznego i stabilności zastosowano metalowe rurki z szklanym dnem.
- Po operacji monitorowano rekonwalescencję myszy, a obrazowanie przeprowadzono kilka tygodni później.
Główne wyniki
- Mikrogleja odzyskała rozgałęzioną morfologię i wypustki po zabiegu chirurgicznym.
- Zwiększona rozdzielczość obrazowania umożliwiła szczegółową obserwację zachowania mikrogleju.
- W poszczególnych warstwach hipokampa zidentyfikowano różne morfologie mikrogleju.
- Interakcje neuronalne badano za pomocą podwójnego obrazowania mikrogleju znakowanego GFP oraz neuronów piramidalnych znakowanych tdTomato.
Wnioski
- Metoda ta umożliwia długoterminową obserwację dynamiki mikrogleju in vivo.
- Wyniki wspierają zrozumienie oddziaływań między mikroglejem a neuronami w kontekście uczenia się i chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Przewlekłe obrazowanie dwufotonowe in vivo mikrogleju w hipokampie myszy umożliwia bezpośrednią, podłużną obserwację oddziaływań między mikroglejem a neuronami w regionie mózgu istotnym dla przebiegu chorób. Możliwość ta wspiera analizę mechanistyczną w celu minimalizacji ryzyka oraz walidację celów terapeutycznych w ramach portfeli badań nad neurozapaleniem i neurodegeneracją. Wysokorozdzielcze, małoinwazyjne obrazowanie poszczególnych warstw hipokampa zwiększa pewność predykcyjną w programach wczesnego odkrywania leków oraz w badaniach z zakresu neuronauki translacyjnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację dynamiki wypustek mikrogleju oraz kontaktów z neuronami in situ.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez korelację morfologii mikrogleju ze stanami neuronalnymi.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku hipotez terapeutycznych ukierunkowanych na mikroglej.
- Zapewnia rozdzielczość przestrzenną i czasową niezbędną do wyjaśnienia zaangażowania szlaków w obwodach hipokampa.
Przesiew i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowaną platformę in vivo do ilościowego określania odpowiedzi mikrogleju na związki kandydackie.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania w celu standaryzacji testów.
- Umożliwia przesiewowe badanie interwencji wpływających na oddziaływania mikroglej-neuron w natywnym kontekście tkankowym.
- Wspiera skalowalność w badaniach podłużnych oraz porównawczą analizę warunków eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami chorobowymi istotnymi dla badań nad neurodegeneracją i neuroinflamacją.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki śledzeniu zachowania mikrogleju w czasie.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalne odczyty in vivo.
- Dostarcza translacyjnych informacji na temat biomarkerów poprzez korelację fenotypów obrazowych z progresją choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda obrazowania integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania przedkliniczne, łącząc studia mechanistyczne z walidacją translacyjną w procesach badawczych z zakresu neurobiologii.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących roli mikrogleju w przebudowie synaptycznej i regulacji neuronalnej.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych obrazowych do oceny związków w żywej tkance.
- Analityka: Umożliwia pomiar morfologii mikrogleju, ruchliwości wypustek oraz interakcji międzykomórkowych w warstwach hipokampa.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do modeli chorób i rozwój biomarkerów w badaniach podłużnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę obrazowania in vivo, którą można dostosować do wielu celów i interwencji neurobiologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neuroimmunologicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w obrazowaniu chronicznym i zwiększa odtwarzalność badań.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczanie wysokotreściowych danych podłużnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów dotyczących neurozapalenia i neurodegeneracji z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii, mikroskopii dwufotonowej oraz pracy ze zwierzętami.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej infrastruktury obrazowania oraz możliwości znakowania fluorescencyjnego.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów chirurgicznych i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych obszarów mózgu lub modeli chorób może wymagać optymalizacji protokołu.
- Przejściowy stan zapalny po operacji ogranicza możliwość natychmiastowego obrazowania i wymaga okresów rekonwalescencji w celu uzyskania optymalnej jakości danych.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Implantation of the Observation Window
2:34
Two‐Photon Microscopy Immediately After Surgery for Quality Check
3:55
In Vivo Chronic Two‐Photon Imaging of Microglia Using CX3CR1‐GFP Mice
4:29
Results: In Vivo Imaging of Microglia in CX3CR1‐GFP Mice
6:20
Conclusion
