Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych
23 czerwca 2022
Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.
Jest to prosty i skuteczny w czasie protokół izolowania i koncentrowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mezenchymalnych komórek macierzystych. Technika ta jest łatwa do zastosowania w większości laboratoriów, ponieważ jest to waga stołowa i wymaga jedynie prostych przyrządów do operacji. Aby wyizolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, zalecamy hodowlę komórek na dużą skalę, aby uzyskać co najmniej sto milionów komórek.
Chociaż brzmi to prosto, niektóre krytyczne kroki tej techniki są lepiej poinformowane dzięki wizualnej demonstracji. Mamy nadzieję, że naukowcy będą mogli wyciągnąć wnioski z naszego doświadczenia i pewnie opanować umiejętności. Nasz doktorant, Mr.Chan, Hong Hao, poprowadzi Cię przez nasze doświadczenie w izolacji i charakterystyce małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mezenchymalnych komórek macierzystych.
Na początek odwiruj kondycjonowaną pożywkę o masie 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórek. Zbierz i przefiltruj supernatant przez filtr 0,22 mikrometra, aby usunąć cząstki większe niż 220 nanometrów. Napełniono odśrodkową jednostkę filtracyjną 30 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami o średnicy 0,2 mikrometra.
Następnie odwirować filtr odśrodkowy o masie 3,500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wylać roztwór do kubka z roztworem filtratu. Dodaj 70 mililitrów przefiltrowanego, kondycjonowanego medium do filtra odśrodkowego i odwiruj urządzenie w temperaturze 3 500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Wylać roztwór do kubka z roztworem filtratu. Dodać 30 mililitrów przefiltrowanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i odwirować urządzenie przy 3 500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zainstalować kubek na koncentrat na jednostce filtrującej i odwirować przy 1 000 g przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać oczyszczone małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe.
Przefiltruj małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra. Przenieś próbki do nowych probówek i przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy. Aby rozpocząć analizę śledzenia nanocząstek, należy rozcieńczyć izolowane małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny w przefiltrowanym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami do 20 do 100 cząstek na ramkę.
Wprowadzić jeden mililitr rozcieńczonej próbki do komory anty-A za pomocą jednorazowych strzykawek o pojemności jednego mililitra. Ustaw odpowiednio ustawienia pomiaru. Dostosuj poziom kamery do poziomu 14.
Dla każdego pomiaru kliknij standardowy pomiar i odpowiednio ustaw rozcieńczenie. Następnie kliknij Przechwyć, Uruchom kamerę i ustaw Poziom kamery na 14, aby wyświetlić małe pojazdy elektryczne. Aby zainicjować pomiar, kliknij przycisk Utwórz, a następnie kliknij przycisk Uruchom skrypt i wybierz lokalizację, w której pliki mają zostać zapisane.
Wprowadź niezbędne szczegóły próbki i kliknij przycisk OK. Kliknij ustawienie OK, aby kontynuować skrypt, a następnie kliknij przycisk OK, aby rozpocząć pomiar. Po zarejestrowaniu pomiaru przeanalizuj wyniki z progiem wykrywania wynoszącym pięć, aby uwzględnić od 10 do 100 czerwonych krzyżyków na klatkę. A liczba niebieskich krzyżyków jest ograniczona do pięciu.
Kliknij przycisk Ustawienia OK, aby kontynuować skrypt i rozpocząć analizę. Kliknij przycisk OK w powiadomieniu o zakończeniu skryptu i wyeksportuj, aby wyeksportować dane do ustawionej lokalizacji. Poddać lizie ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z pępowiny, małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe za pomocą lodowatego buforu do testu radioimmunoprecypitacji i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Zebrać supernatant po odwirowaniu w temperaturze 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Określ ilościowo białko za pomocą testu BCA. Zmontuj odpowiednio ustawiony zestaw do elektroforezy żelowej i wykonuj elektroforezę żelową pod napięciem 90 woltów, aż białko dotrze do końca żelu do układania.
Zmień napięcie na 200 woltów, aby oddzielić białka do końca żelu rozdzielczego. Wykonać transfer półsuchy w celu przeniesienia białek z żelu do membrany z polifluorku winylidenu pod napięciem 15 woltów przez jedną godzinę. Zablokuj błonę PVDF 3% albuminą surowicy bydlęcej w soli fizjologicznej buforowanej trisem 0,1% Tween 20 na jedną godzinę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
Inkubować błonę PVDF z pierwszorzędowymi przeciwciałami w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc przy ciągłym wstrząsaniu. Następnego dnia przemyj membranę PVDF pięć razy i po pięć minut TBST i dalej inkubuj z przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę z mieszaniem w temperaturze pokojowej. Ponownie przemyj membranę PVDF pięciokrotnym TBST i zwizualizuj membranę w obrazie ze sprzężonym ładunkiem przy użyciu chemiluminescencyjnego odczynnika detekcyjnego.
Przeanalizuj poziom ekspresji białek za pomocą oprogramowania ImageJ. Najpierw otwórz plik obrazu w ImageJ. Popraw jakość obrazu, dostosowując jasność i kontrast
.Dostosuj obraz, aż plamy będą wyraźnie widoczne. Kliknij przycisk Zastosuj i zapisz obrazy w formacie TIFF. W przypadku analizy opartej na transmisyjnym mikroskopie elektronowym należy rozcieńczyć jedną część próbki małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny czterema częściami przefiltrowanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do całkowitej objętości 10 mikrolitrów i inkubować na siatce miedzianej pokrytej węglem przez 15 minut.
Usuń nadmiar próbki za pomocą chusteczki laboratoryjnej i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez trzy minuty. Inkubować 10 mikrolitrów 1% roztworu kwasu fosfowolframowego, aby zabarwić próbkę przez trzy minuty. Usunąć nadmiar 1% roztworu kwasu fosfowolframowego za pomocą chusteczki laboratoryjnej i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez trzy minuty, aby zobrazować pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z pępowiny Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mają tryb wielkości cząstek 53 nanometrów, podczas gdy inne znaczące szczyty wielkości cząstek wynosiły 96 i 115 nanometrów. Stężenie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych MSC pochodzących z ludzkiej pępowiny mierzone za pomocą NTA wynosiło 7,75 razy od 10 do 10 cząstek na mililitr. Stężenie białka w małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych MSC pochodzących z ludzkiej pępowiny mierzone testem BCA wynosiło około 80 mikrogramów na mililitr.
W analizie western blotting małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe MSC pochodzące z ludzkiej pępowiny wykazywały dodatnie prążki dla markerów egzosomalnych CD9, CD81 i TSG101, ale były ujemne dla GRP94. Izolowane małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe MSC pochodzące z ludzkiej pępowiny zwizualizowano w ramach TEM w celu określenia ich wielkości i morfologii. Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z pępowiny Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe o wielkości około 100 nanometrów wykazywały dwuwarstwową strukturę błony przypominającą miseczkę.
Dzięki pomyślnemu opracowaniu protokołu możemy teraz odkryć potencjał terapeutyczny małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje prostą i efektywną pod względem czasu metodę izolacji małych dodatkowkomórkowych wezykuł (sEVs) z ludzkich komórek macierzystych mezenchymalnych pochodzących z pępowiny (hUC-MSCs). Badanie wykorzystuje proste techniki łazienkowe, które można łatwo zaadaptować w różnych warunkach laboratoryjnych, umożliwiając skuteczną charakteryzację wielkości, stężenia białka i morfologii sEVs.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Izolacja dodatkowkomórkowych wezykuł
- Biologia komórek macierzystych
- Mezenchymalne komórki macierzyste
Tło
- Rozumienie małych dodatkowkomórkowych wezykuł jest kluczowe dla oceny ich biologicznych ról.
- hUC-MSCs są obiecującym źródłem takich wezykuł ze względu na ich właściwości regeneracyjne.
- Konwencjonalne metody izolacji sEVs często wymagają złożonej infrastruktury i mogą nie być dostępne dla wszystkich laboratoriów.
Stosowane metody
- Centrifugacji łazienkowej do wstępnego oddzielania
- Analizy śledzenia nanocząstek (NTA) do charakteryzacji wielkości wezykuł
- Western blot i mikroskopii elektronowej transmisyjnej do oceny zawartości białka i morfologii
Główne wyniki
- Średnia wielkość cząstek izolowanych sEVs wynosiła 53 nm, z wyraźnymi szczytami na 96 i 115 nm.
- Stężenie białka izolowanych sEVs wynosiło około 80 µg/mL, jak określono za pomocą testu BCA na białko.
- Potwierdza skuteczność protokołu w generowaniu wysokiej jakości sEVs dla dalszych zastosowań.
Wnioski
- Badanie przedstawia wykonalny i przystosowany protokół do izolacji sEVs z hUC-MSCs.
- To podejście umożliwia dalsze badania nad funkcjonalnymi rolami sEVs w różnych kontekstach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and characterization of small extracellular vesicles (sEVs) from human mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) is critical for advancing discovery-stage regenerative medicine and cell therapy research. This benchtop filtration protocol enables scalable, reproducible sEV preparation, supporting robust target validation and downstream translational studies. The method's accessibility and quantitative outputs facilitate portfolio-wide adoption and cross-program comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of sEV-mediated signaling pathways in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by providing standardized sEV preparations for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in sEV-associated biomarker discovery and pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, well-characterized sEV samples for assay development and compound screening.
- Standardizes input material for quantitative readouts in downstream bioassays.
- Improves scalability and throughput compared to ultracentrifugation-based isolation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with MISEV 2018 criteria, supporting translational continuity and regulatory expectations.
- Enables consistent sEV characterization for preclinical model studies and biomarker alignment.
- Reduces biological variability, enhancing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This benchtop filtration method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, providing a standardized workflow for sEV isolation, quantification, and characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating functionally relevant sEVs.
- Screening: Provides assay-ready, quantitatively defined sEV samples for reproducible screening campaigns.
- Analytics: Enables nanoparticle tracking analysis, BCA protein quantification, and marker validation by western blot and TEM.
- Translational Research: Ensures continuity of sEV quality and characterization from early discovery through preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable protocol suitable for diverse R&D programs and cross-team standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in sEV research.
- Operational Value: Streamlines sEV isolation with accessible instrumentation and robust reproducibility.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by standardizing sEV workflows.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of sEV-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, filtration, and vesicle characterization techniques.
- Needs access to benchtop centrifuges, nanoparticle tracking analyzers, and western blot/TEM infrastructure.
- Demands cross-team agreement on sEV characterization standards and quantitative thresholds.
- Adaptable to various stem cell sources and conditioned media with protocol optimization.
- Yield and purity may vary with input cell number and filtration parameters, requiring empirical adjustment.
