Name: Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Naucz się prostej metody filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Protokół umożliwia łatwą charakteryzację wielkości i morfologii sEV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Publikacja tego filmu była wspierana przez My CytoHealth Sdn. Bhd.

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.
1. Mezenchymalne komórki macierzyste i hodowla ludzkiej pępowiny
<ol>
	<li>Hoduj hUC-MSC przy gęstości wysiewu 5 × 103/cm2 w DMEM, uzupełnionym 8% ludzkim lizatem płytkowym i 1% paciorkowcem. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Wymieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co 3 dni, aby zapewnić prawidłowy wzrost komórek.</li>
	<li>Rozwiń komórki do przejścia 5 w kolbach T175 w celu izolacji sEV. 
	UWAGA: Do zebrania wysokiej wydajności sEV potrzeba wielu kolb (wydajność wzrasta wraz z liczbą komórek).</li>
</ol>
2. Izolacja małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od hUC - MSCs
<ol>
	<li>Zastąp pożywkę hodowlaną świeżym DMEM wolnym od czerwieni fenolowej uzupełnionym 1% Pen-Strep [Pożywka kondycjonowana (CM)], gdy kultura osiągnie 70%-80% konfluencji przy pasażu 5, 
	UWAGA: Używaj tylko pożywek podstawowych; unikaj FBS i suplementu ludzkiego lizatu płytkowego, aby uniknąć zanieczyszczenia zewnętrznymi sEV.</li>
	<li>Po 24 godzinach odwirować CM przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek. Zebrać i przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 μm w celu usunięcia cząstek większych niż 220 nm.</li>
	<li>Napełnij filtr odśrodkowy 30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przefiltrowanej przez filtr 0,2 μm. Odwirować filtr odśrodkowy o masie 3 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Napełnij przefiltrowany CM do filtra odśrodkowego (maksymalna objętość każdej jednostki to 70 ml). Odwirować CM w temperaturze 3 500 × g w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Czas wirowania należy od czasu do czasu monitorować, aż roztwór dotrze do powierzchni filtra.</li>
	<li>Wylać roztwór do kubka z roztworem filtratu. Odwirować odwirować kubek filtra próbki z kubkiem na koncentrat o temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Przenieś skoncentrowany CM z powrotem do odśrodkowej jednostki filtracyjnej. Dodać 30 ml przefiltrowanego PBS do filtra odśrodkowego i odwirować urządzenie w temperaturze 3 500 × g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wylać roztwór do kubka z roztworem filtratu. Zainstalować kubek na koncentrat na jednostce filtrującej i odwirować w odwróconej temperaturze 1 000 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, aby uzyskać oczyszczone sEV.</li>
	<li>Przefiltruj sEV przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.</li>
	<li>Przenieść próbki do nowych probówek i przechowywać je w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.</li>
</ol>
3. Charakterystyka hUC-MSC-sEVs
<ol>
	<li>Analiza śledzenia nanocząstek
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć izolowane hUC-MSC-sEV w przefiltrowanym PBS do 20-100 cząstek/ramkę.</li>
		<li>Wprowadzić 1 ml rozcieńczonej próbki do komory NTA za pomocą jednorazowych strzykawek o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Ustaw odpowiednio ustawienia pomiaru: ustaw poziom kamery na poziom 14, określ próg wykrywania, aby objąć jak najwięcej cząstek, z ograniczeniem, że zliczanych jest 10-100 czerwonych krzyżyków, a liczba niebieskich krzyżyków jest ograniczona do pięciu.</li>
		<li>Dla każdego pomiaru nagraj pięć 1-minutowych filmów i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania NanoSight z progiem wykrywania wynoszącym pięć.</li>
		<li>Pomiary należy wykonać w trzech egzemplarzach dla każdej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza Western blot
	<ol>
		<li>Poddać lis hUC-MSC-sEV lodowato zimnemu buforowi do lizy testu radioimmunoprecypitacji (RIPA), inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odwirować w temperaturze 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant.</li>
		<li>Określ ilościowo białko za pomocą zestawu do oznaczania białek kwasu bicynchoninowego (BCA). Zmontuj odpowiednio zestaw do elektroforezy żelowej i wykonuj elektroforezę żelową pod napięciem 90 V, aż białko dotrze do końca żelu do układania. Zmień napięcie na 200 V, aby oddzielić białka do końca żelu rozdzielczego.</li>
		<li>Przeprowadzić transfer półsuchy w celu przeniesienia białek z żelu do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) pod napięciem 15 V przez 1 godzinę.</li>
		<li>Zablokuj błonę PVDF 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA)/solą fizjologiczną buforowaną Tris-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) przez 1 godzinę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Inkubować błonę PVDF z przeciwciałami pierwszorzędowymi w następujący sposób: mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD 9 (1:500), mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD 81 (1:500), mysie przeciwciało monoklonalne anty-GRP 94 monoklonalne anty-TSG 101 (1:500) w temperaturze 4 °C przez noc przy ciągłym wstrząsaniu.</li>
		<li>Następnego dnia przemyć membranę PVDF 5 x 5 min TBS-T i dalej inkubować z przeciwciałem drugorzędowym: mysim białkiem wiążącym IgG kappa sprzężonym z peroksydazą chrzanową (m-IgGκ BP-HRP) (1:5 000) przez 1 godzinę z mieszaniem w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ponownie umyj membranę PVDF pięciokrotnym TBS-T i zwizualizuj membranę w obrazie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) przy użyciu odczynnika do wykrywania chemiluminescencji. Przeanalizuj poziom ekspresji białek za pomocą oprogramowania ImageJ. Najpierw otwórz plik obrazu w ImageJ (Plik | Otwórz...). Popraw jakość obrazu, dostosowując jasność i kontrast (punkt menu Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast). Dostosuj obraz, aż plamy będą wyraźnie widoczne, kliknij przycisk Zastosuj, a następnie zapisz obrazy w formacie TIFF (punkt menu Plik | Zapisz jako | TIFF...).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transmisyjny mikroskop elektronowy
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć jedną część próbki hUC-MSC-sEVs czterema częściami przefiltrowanego PBS do całkowitej objętości 10 μl i inkubować na siatce miedzianej pokrytej węglem przez 15 minut.</li>
		<li>Usunąć nadmiar próbki za pomocą chusteczki laboratoryjnej i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 3 minuty.</li>
		<li>Inkubować 10 μl 1% roztworu kwasu fosfowolframowego (PTA) w celu barwienia próbki przez 3 minuty.</li>
		<li>Usuń nadmiar 1% roztworu PTA za pomocą chusteczki laboratoryjnej i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 3 minuty.</li>
		<li>Użyj próbki do obrazowania transmisyjnego mikroskopu elektronowego. 
		UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 1, aby zapoznać się z podsumowanymi krokami eksperymentu schematycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+adipose+tissue+and+placenta+in+obese+and+gestational+diabetes+mellitus+pregnancies+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 239(2017).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+alleviate+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis.</a> Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell-derived+small+extracellular+vesicles+induce+ischemic+neuroprotection+by+modulating+leukocytes+and+specifically+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils.</a> Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-derived+sEVs+enhance+patency+and+inhibit+calcification+of+synthetic+vascular+grafts+by+immunomodulation+in+a+rat+model+of+hyperlipidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia.</a> Biomaterials. 204, 13-24 (2019).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-derived+small+extracellular+vesicles+overexpressing+miR-20a+promoted+the+osteointegration+of+porous+titanium+alloy+by+enhancing+osteogenesis+via+targeting+BAMBI%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).</li>
<li>Li, F. X. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mesenchymal+stromal+cells-derived+small+extracellular+vesicles+in+diabetes+and+its+chronic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 1741(2021).</li>
<li>Jayabalan, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJayabalan%2C+N+%22Frontiers+in+Endocrinology%22">Frontiers in Endocrinology</a>. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWei%2C+Y+%22Biomaterials%22">Biomaterials</a>. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).</li>
<li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. 133, 70-81 (2017).</li>
<li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+exosome+isolation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li>
<li>Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+extracellular+vesicles%2C+their+origin%2C+composition%2C+purpose%2C+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727(2019).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+isolation+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).</li>
<li>Kırbaş, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+isolation+of+extracellular+vesicles+from+various+organic+sources+using+aqueous+two-phase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Ev, B., Ms, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+exosomes%2C+naturally-equipped+nanocarriers%2C+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).</li>
<li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+syncytiotrophoblast+microvesicles+and+exosomes+and+their+characterisation+by+multicolour+flow+cytometry+and+fluorescence+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).</li>
<li>Tan, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchtop+isolation+and+characterisation+of+small+extracellular+vesicles+from+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells.</a> Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

EV są jednym z ważnych podzbiorów sekretomu w MSC, który odgrywa kluczową rolę podczas normalnych i patologicznych procesów. Jednak w ciągu ostatniej dekady sEV o zakresie wielkości od 30 do 200 nm stały się potencjalnym narzędziem terapii bezkomórkowej. Opracowano różne techniki izolowania sEV od MSC. Jednak ultrawirowanie różnicowe, ultrafiltracja, wytrącanie na bazie polimerów, wychwytywanie powinowactwa immunologicznego i wytrącanie oparte na mikrofluidyce mają różne zalety i wady17. Żadna z t...

Według MISEV 2018, sEVs to niereplikujące się cząstki dwuwarstwowe lipidów bez funkcjonalnego jądra, o rozmiarach 30-200 nm1. SEV pochodzące z MSC zawierają ważne cząsteczki sygnałowe, które odgrywają ważną rolę w regeneracji tkanek, takie jak mikroRNA, cytokiny lub białka. Coraz częściej stają się one "gorącym punktem" badań w medycynie regeneracyjnej i terapii bezkomórkowej. Wiele badań wykazało, że sEV pochodzące z MSC są tak samo skuteczne jak MSC w leczeniu różnych schorzeń, takich jak immunomodulacja2,3,4,5, zwiększając osteogenezę6, diabetes mellitus7,8, or regenerationular regeneration9,10. Wraz z postępem badań wczesnej fazy, zwrócono uwagę na trzy główne kluczowe kwestie związane z klinicznym translacją MSCs-EV: wydajność EV, czystość EV (wolna od resztek komórkowych i innych zanieczyszczeń biologicznych, takich jak białka i cytokiny) oraz integralność dwuwarstwowej błony fosfolipidowej EV po izolacji.
Opracowano różne metody izolowania sEVs, wykorzystując gęstość, kształt, rozmiar i powierzchnię białka sEVs11. Dwie najczęstsze metody izolacji sEV to techniki oparte na ultrawirowaniu i ultrafiltracji.
Metody oparte na ultrawirowaniu są uważane za złote standardy w izolacji sEVs. Dwa rodzaje technik ultrawirowania, które są zwykle stosowane, to ultrawirowanie różnicowe i ultrawirowanie w gradiencie gęstości. Jednak metody ultrawirowania często skutkują niską wydajnością i wymagają drogiego sprzętu do ultrawirówki o dużej prędkości (100 000-200 000 × g)11. Co więcej, same techniki ultrawirowania są nieefektywne w oddzielaniu podtypów EV (sEV i dużych EV), co skutkuje zanieczyszczoną warstwą osadu11. Wreszcie, ultrawirowanie w gradiencie gęstości może być również czasochłonne i wymagać dodatkowych środków ostrożności, takich jak dodanie buforu sacharozy w celu zahamowania uszkodzeń gradientu podczas etapów przyspieszania i zwalniania12. W związku z tym ultrawirowanie zwykle prowadzi do stosunkowo niskiej wydajności i nie jest w stanie rozróżnić różnych populacji EVs13, co ogranicza jego zastosowanie do przygotowania EV na dużą skalę11.
Drugą metodą izolacji EV jest ultrafiltracja, która opiera się na filtracji rozmiarowej. Ultrafiltracja jest stosunkowo efektywna czasowo i kosztowo w porównaniu do ultrawirowania, ponieważ nie wymaga drogiego sprzętu ani długiego czasu przetwarzania14. W związku z tym ultrafiltracja wydaje się być skuteczniejszą techniką izolacji niż obie wyżej wymienione metody ultrawirowania. Wyizolowane produkty mogą być bardziej szczegółowe w oparciu o rozmiary porów i wyższą wydajność15. Jednak dodatkowa siła powstająca podczas procesu filtracji może spowodować deformację lub erupcję EVs16.
Obecny artykuł zaproponował efektywny kosztowo i czasowo protokół laboratoryjny do izolowania sEV pochodzących z MSC do dalszej analizy i celów terapeutycznych. Metoda opisana w tym artykule łączyła prostą metodę filtracji z wirowaniem laboratoryjnym w celu wyizolowania wysokowydajnych i dobrej jakości pojazdów elektrycznych z hUC-MSC do dalszej analizy, w tym analizy wielkości cząstek, oznaczania biomarkerów i obrazowania pod mikroskopem elektronowym.

<table><tbody><tr><td>40% akryloamid</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06121-95</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>95% etanol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14710-25</td><td>Środki dezynfekujące</td></tr><tr><td>Absolute Methanol</td><td>Chemiz</td><td>45081</td><td>Do aktywacji membrany PVDF (Western blot)</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7920</td><td>Enzym dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>nadsiarczan amonu</td><td>Chemiz</td><td>14475</td><td>katalizować polimeryzację żelu (Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>anty-CD 81 (B-11)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>Przeciwciało dla markera sEVs</td></tr><tr><td>anty-TSG 101 (C-2)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7964</td><td>Przeciwciało dla markera sEVs</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Nacalai Tesque</td><td>00653-31</td><td>Błona PVDF blokująca</td></tr><tr><td>błękit bromofenolowy</td><td>Nacalai Tesque</td><td>05808-61</td><td>elektroforetyczny marker kolorowy</td></tr><tr><td>Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)</td><td>Izolacja miliporowa</td><td>UFC710008</td><td>sEVs</td></tr><tr><td>ChemiLumi One L</td><td>Nacalai Tesque</td><td>7880</td><td>odczynnik do wykrywania chemiluminescencji</td></tr><tr><td>CryoStor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3124-100ML</td><td>Kriokonserwacja komórek</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>ExcelBand Enhanced 3-kolorowy marker białkowy wysokiego zakresu</td><td>SMOBIO</td><td>PM2610</td><td>Markery masy cząsteczkowej białka</td></tr><tr><td>Bardzo gruba bibuła buforowa</td><td>rezerwa bufora ATTO</td><td></td><td>(Western blot)</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>G5516</td><td>Chemikalia do western blot</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>1. baza</td><td>BIO-2085-500g</td><td>Chemikalia do buforowego (Western Blot)</td></tr> <tr><td>mysiego białka wiążącego IgG kappa sprzężonego z peroksydazą chrzanową (m-IgG&kappa; BP-HRP)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-516102</td><td>Przeciwciało wtórne (Western Blot)</td></tr> <tr><td>Ludzki Wharton' s Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) pochodzące z galaretowatości,</td> <td>Centrum Inżynierii Tkankowej i Medycyny Regeneracyjnej, Wydział Lekarski, The National University Malaysia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciała anty-CD9 (C-4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>&nbsp; sc-13118</td><td>Przeciwciało do markera sEVs</td></tr><tr><td>Nanosight NS300 wyposażony w kamerę CMOS, 20-krotną soczewkę obiektywową, moduł niebieskiego lasera (488&thinsp; nm) oraz oprogramowanie NTA v3.2</td><td>Malvern Panalytical, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02890-45</td><td>Utrwalanie próbki podczas</td></tr><tr><td>penicyliny TEM&ndash; streptomycyna</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td>Antybiotyk do pożywek</td></tr><tr><td>fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>27327-81</td><td>Hamowanie proteaz w próbkach sEVs po dodaniu buforu do lizy</td></tr><tr><td>bufora soli fizjologicznej buforowanej fosforanem</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Mycie, rozcieńczanie próbki</td></tr><tr><td>membrana z polifluorku winylidenu (PVDF) z 0,45 mm wielkość porów</td><td>ATTO</td><td></td><td>Do zatrzymywania białka podczas przenoszenia białka (Western blot)</td></tr> <tr><td>koktajl inhibitora proteazy</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25955-11</td><td>Hamuje proteazy w próbkach sEVs po dodaniu buforu do lizy</td></tr><tr><td>Test białkowy Zestaw bicinchoninate</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06385-00</td> Roztwór buforowy próbki <td>do pomiaru białka</td></tr><tr><td>z 2-ME</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30566-22</td><td>Środek redukujący do sodu western blot</td></tr><tr><td> chlorek</td><td>Nacalai Tesque</td><td>15266-64</td><td>Chemikalia do western blot</td></tr><tr><td>dodecylosiarczan sodu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31606-62</td><td>jonowy środek powierzchniowo czynny podczas elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy Tecnai G2 F20 S-TWIN</td><td>FEI, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tetrametyloetylenodiamina</td><td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td>chemikalia do przygotowania żelu</td></tr><tr><td>tris-base</td><td>1st Base</td><td>BIO-1400-500g</td><td>Chemikalia do buforu (Western Blot)</td></tr><tr><td>&nbsp; Tween 20</td><td>GeneTex</td><td>GTX30962</td><td>Chemicals do Western Blot</td></tr><tr><td>UVP (Ultra Vision Product) Kamera</td><td></td><td></td><td>CCD Kamera CCD do wykrywania sygnału Western Blot</td></tr></tbody></table>

prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells

Proces oparty na ultrawirowaniu jest uważany za powszechną metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEVs). Jednak wydajność tej metody izolacji jest stosunkowo niższa, a metody te są nieefektywne w rozdzielaniu podtypów sEV. Badanie to demonstruje prostą metodę filtracji laboratoryjnej w celu wyizolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych MSC pochodzących z ludzkiej pępowiny (hUC-MSC-sEVs), z powodzeniem oddzielonych przez ultrafiltrację od kondycjonowanego podłoża hUC-MSC. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery egzosomalne (CD9, CD81, TSG101) i morfologię izolowanych hUC-MSC-sEV scharakteryzowano odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Izolowane hUC-MSC-sEV miały wielkość 30-200 nm, przy stężeniu cząstek 7,75 ×10 10 cząstkach/ml i stężeniu białka 80 μg/ml. Zaobserwowano dodatnie prążki dla markerów egzosomalnych CD9, CD81 i TSG101. Badanie to wykazało, że hUC-MSC-sEV zostały z powodzeniem wyizolowane z pożywki kondycjonowanej hUC-MSCs, a charakterystyka wykazała, że wyizolowany produkt spełniał kryteria wymienione w Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Rysunek 2 pokazuje, że hUC-MSC-sEVs mają modę wielkości cząstek wynoszącą 53 nm, podczas gdy inne istotne piki wielkości cząstek wystąpiły przy 96 i 115 nm. Stężenie hUC-MSC-sEVs zmierzone metodą NTA wyniosło 7,75 × 1010 cząstek/mL. Stężenie białka w hUC-MSC-sEVs zmierzone testem BCA wyniosło około 80 µg/mL.
W analizie western blotting hUC-MSC-sEVs wykazały obecność prążków dla markerów egzosomalnych CD9, CD81 i TSG101, natomiast były ujemne dla GRP94 (...

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

The ultracentrifugation-based process is considered the common method for small extracellular vesicles (sEVs) isolation. However, the yield from this ...

Jest to prosty i skuteczny w czasie protokół izolowania i koncentrowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mezenchymalnych komórek macierzystych. Technika ta jest łatwa do zastosowania w większości laboratoriów, ponieważ jest to waga stołowa i wymaga jedynie prostych przyrządów do operacji. Aby wyizolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, zalecamy hodowlę komórek na dużą skalę, aby uzyskać co najmniej sto milionów komórek.Chociaż brzmi to prosto, niektóre krytyczne kroki tej techniki są lepiej poinformowane dzięki wizualnej demonstracji. Mamy nadzieję, że naukowcy będą mogli wyciągnąć wnioski z naszego doświadczenia i pewnie opanować umiejętności. Nasz doktorant, Mr.Chan, Hong Hao, poprowadzi Cię przez nasze doświadczenie w izolacji i charakterystyce małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mezenchymalnych komórek macierzystych.Na początek odwiruj kondycjonowaną pożywkę o masie 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórek. Zbierz i przefiltruj supernatant przez filtr 0,22 mikrometra, aby usunąć cząstki większe niż 220 nanometrów. Napełniono odśrodkową jednostkę filtracyjną 30 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami o średnicy 0,2 mikrometra.Następnie odwirować filtr odśrodkowy o masie 3,500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wylać roztwór do kubka z roztworem filtratu. Dodaj 70 mililitrów przefiltrowanego, kondycjonowanego medium do filtra odśrodkowego i odwiruj urządzenie w temperaturze 3 500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wylać roztwór do kubka z roztworem filtratu. Dodać 30 mililitrów przefiltrowanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i odwirować urządzenie przy 3 500 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zainstalować kubek na koncentrat na jednostce filtrującej i odwirować przy 1 000 g przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać oczyszczone małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe.Przefiltruj małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra. Przenieś próbki do nowych probówek i przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy. Aby rozpocząć analizę śledzenia nanocząstek, należy rozcieńczyć izolowane małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny w przefiltrowanym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami do 20 do 100 cząstek na ramkę.Wprowadzić jeden mililitr rozcieńczonej próbki do komory anty-A za pomocą jednorazowych strzykawek o pojemności jednego mililitra. Ustaw odpowiednio ustawienia pomiaru. Dostosuj poziom kamery do poziomu 14.Dla każdego pomiaru kliknij standardowy pomiar i odpowiednio ustaw rozcieńczenie. Następnie kliknij Przechwyć, Uruchom kamerę i ustaw Poziom kamery na 14, aby wyświetlić małe pojazdy elektryczne. Aby zainicjować pomiar, kliknij przycisk Utwórz, a następnie kliknij przycisk Uruchom skrypt i wybierz lokalizację, w której pliki mają zostać zapisane.Wprowadź niezbędne szczegóły próbki i kliknij przycisk OK. Kliknij ustawienie OK, aby kontynuować skrypt, a następnie kliknij przycisk OK, aby rozpocząć pomiar. Po zarejestrowaniu pomiaru przeanalizuj wyniki z progiem wykrywania wynoszącym pięć, aby uwzględnić od 10 do 100 czerwonych krzyżyków na klatkę. A liczba niebieskich krzyżyków jest ograniczona do pięciu.Kliknij przycisk Ustawienia OK, aby kontynuować skrypt i rozpocząć analizę. Kliknij przycisk OK w powiadomieniu o zakończeniu skryptu i wyeksportuj, aby wyeksportować dane do ustawionej lokalizacji. Poddać lizie ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z pępowiny, małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe za pomocą lodowatego buforu do testu radioimmunoprecypitacji i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zebrać supernatant po odwirowaniu w temperaturze 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Określ ilościowo białko za pomocą testu BCA. Zmontuj odpowiednio ustawiony zestaw do elektroforezy żelowej i wykonuj elektroforezę żelową pod napięciem 90 woltów, aż białko dotrze do końca żelu do układania.Zmień napięcie na 200 woltów, aby oddzielić białka do końca żelu rozdzielczego. Wykonać transfer półsuchy w celu przeniesienia białek z żelu do membrany z polifluorku winylidenu pod napięciem 15 woltów przez jedną godzinę. Zablokuj błonę PVDF 3% albuminą surowicy bydlęcej w soli fizjologicznej buforowanej trisem 0,1% Tween 20 na jedną godzinę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.Inkubować błonę PVDF z pierwszorzędowymi przeciwciałami w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc przy ciągłym wstrząsaniu. Następnego dnia przemyj membranę PVDF pięć razy i po pięć minut TBST i dalej inkubuj z przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę z mieszaniem w temperaturze pokojowej. Ponownie przemyj membranę PVDF pięciokrotnym TBST i zwizualizuj membranę w obrazie ze sprzężonym ładunkiem przy użyciu chemiluminescencyjnego odczynnika detekcyjnego.Przeanalizuj poziom ekspresji białek za pomocą oprogramowania ImageJ. Najpierw otwórz plik obrazu w ImageJ. Popraw jakość obrazu, dostosowując jasność i kontrast.Dostosuj obraz, aż plamy będą wyraźnie widoczne. Kliknij przycisk Zastosuj i zapisz obrazy w formacie TIFF. W przypadku analizy opartej na transmisyjnym mikroskopie elektronowym należy rozcieńczyć jedną część próbki małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny czterema częściami przefiltrowanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do całkowitej objętości 10 mikrolitrów i inkubować na siatce miedzianej pokrytej węglem przez 15 minut.Usuń nadmiar próbki za pomocą chusteczki laboratoryjnej i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez trzy minuty. Inkubować 10 mikrolitrów 1% roztworu kwasu fosfowolframowego, aby zabarwić próbkę przez trzy minuty. Usunąć nadmiar 1% roztworu kwasu fosfowolframowego za pomocą chusteczki laboratoryjnej i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez trzy minuty, aby zobrazować pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z pępowiny Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mają tryb wielkości cząstek 53 nanometrów, podczas gdy inne znaczące szczyty wielkości cząstek wynosiły 96 i 115 nanometrów. Stężenie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych MSC pochodzących z ludzkiej pępowiny mierzone za pomocą NTA wynosiło 7,75 razy od 10 do 10 cząstek na mililitr. Stężenie białka w małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych MSC pochodzących z ludzkiej pępowiny mierzone testem BCA wynosiło około 80 mikrogramów na mililitr.W analizie western blotting małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe MSC pochodzące z ludzkiej pępowiny wykazywały dodatnie prążki dla markerów egzosomalnych CD9, CD81 i TSG101, ale były ujemne dla GRP94. Izolowane małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe MSC pochodzące z ludzkiej pępowiny zwizualizowano w ramach TEM w celu określenia ich wielkości i morfologii. Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z pępowiny Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe o wielkości około 100 nanometrów wykazywały dwuwarstwową strukturę błony przypominającą miseczkę.Dzięki pomyślnemu opracowaniu protokołu możemy teraz odkryć potencjał terapeutyczny małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej.

a-simple-benchtop-filtration-method-to-isolate-small-extracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje technikę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ze świeżych lub zamrożonych tkanek. Wyizolowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe można wykorzystać do dalszej analizy w celu odkrycia ich znaczącej roli w patogenezie choroby.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek całych tkanek za pomocą wirowania różnicowego

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Ten protokół opisuje wszystkie procedury, od hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i pobierania supernatantu po ekstrakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą ultrawirowania.

Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Protokół ten został zaprojektowany tak, aby przyspieszyć i umożliwić skuteczną izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od mleka matki o wysokiej czystości.

Szybka izolacja pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z ludzkiego mleka matki

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Niniejszy film dokumentuje filtrację małych objętości (~1 L) biomasy mikrobowej z kolumny wody.

Filtracja małych objętości (1–3 l) próbek przybrzeżnej wody morskiej

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Naucz się prostej metody filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych. Protokół umożliwia łatwą charakteryzację wielkości i morfologii sEV.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów