Name: Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj metodę oceny przepuszczalności nabłonka jelitowego w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych. Technika mikroinjekcji Dextran-FITC pozwala badać mechanizmy nieszczelnego jelita in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorowi Ianowi Glassowi i personelowi Laboratorium Badań nad Wadami Wrodzonymi na Uniwersytecie Waszyngtońskim za udostępnienie tkanek płodu. Dziękujemy również dr Michaelowi Dame'owi i dr Jasonowi Spence'owi z Laboratorium Translacyjnego Modelowania Tkanek na Uniwersytecie Michigan za ich niekończące się wsparcie i wskazówki w całym procesie.

<ol><li>Humberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preterm+birth+and+sustained+inflammation%3A+Consequences+for+the+neonate%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate.</a> Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).</li>
<li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+Model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: Model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canonical+Wnt+signals+are+essential+for+homeostasis+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium.</a> Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52483(2015).</li>
<li>Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+epithelial+enteroid+model+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).</li>
<li>Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+intestinal+enteroid%2Forganoid+lines+from+preterm+infant+and+adult+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).</li>
<li>Finkbeiner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+analysis+reveals+hallmarks+of+human+intestine+development+and+maturation+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).</li>
<li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal-derived+enterospheres+provide+insights+on+intestinal+development+and+a+novel+model+to+study+necrotizing+enterocolitis+%28NEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC).</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li>
<li>Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Research%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis.</a> F1000 Research. 8, (2019).</li>
<li>Dame, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonic+crypts+in+culture%3A+Segregation+of+immunochemical+markers+in+normal+versus+adenoma-derived%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived.</a> Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).</li>
<li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonization+stimulates+a+complex+physiological+response+in+the+immature+human+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium.</a> eLife. 6, 29132(2017).</li>
<li>Tsai, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li>
<li>Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Differentiation+of+Human+iPS+Cells+Into+Colon+Organoids+in+Serum-Free+Cell+Culture+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Technology+Networks%22%5BJournal%5D)">In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions.</a> Technology Networks. , https://www.technologynetworks.com/cell-science/white-papers/in-vitro-differentiation-of-human-ips-cells-into-colon-organoids-in-serum-free-cell-culture-328450 (2019).</li>
<li>Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+epithelial+barrier+permeability+in+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56960(2017).</li>
<li>Schoultz, I., Keita, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intestinal+Barrier+and+Current+Techniques+for+the+Assessment+of+Gut+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909(2020).</li>
<li>Kumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineage-specific+transcription+factor+CDX2+navigates+dynamic+chromatin+to+control+distinct+stages+of+intestine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development.</a> Development. 146 (5), (2019).</li>
<li>Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prenatal+gut+microbiome%3A+Are+we+colonized+with+bacteria+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Obesity%22%5BJournal%5D)">The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero.</a> Pediatric Obesity. 12, Suppl 1 3-17 (2017).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+gradient+and+instability+of+Wnt+induce+heterogeneous+growth+and+differentiation+of+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids.</a> iScience. 23 (8), 101372(2020).</li>
<li>Lueschow, S. R., McElroy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Paneth+cell%3A+The+curator+and+defender+of+the+immature+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine.</a> Frontiers in Immunology. 11, 587(2020).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59357(2019).</li>
<li>Dheer, R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+models%3A+Tools+for+studying+role+of+microbiota+in+intestinal+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Protokół ten szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów z tkanki jelitowej płodu, a także charakterystykę modelu za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i badania przepuszczalności nabłonka. Przepuszczalność enteroidów badano za pomocą techniki mikroiniekcji i seryjnych pomiarów w czasie stężenia nieszczelnego dekstranu-FITC w pożywce hodowlanej. Nowością tego protokołu jest ekspozycja wierzchołkowa, która bardziej przypomina fizjologię jelit człowieka w porównaniu z ekspozycją podstawno-boczną w pożywkach hodowlanych7. W poprzednich badaniach Hill i in. wykorzystali obrazowanie seryjne i obliczenie intensywności fluorescencji w czasie16. Ares i wsp. wystawili błonę podstawno-boczną modelu nabłonkowego na LPS, a następnie porównali komórkowy wzorzec ekspresji genów7. Dla porównania, wykorzystujemy ekspozycję wierzchołkową badanych odczynników, a następnie badamy potencjalne zmiany przepuszczalności brutto, mierząc seryjne stężenia wyciekającego dekstranu w pożywkach hodowlanych. Nasza metoda pozwala również na seryjną analizę porównawczą cytokin wytwarzanych przez komórki nabłonkowe w pożywkach hodowlanych oraz ekspresję genów poprzez pobieranie komórkowego mRNA. LPS jest powszechnie stosowany do badania uszkodzeń jelit w modelach zwierzęcych i in vitro ze względu na jego zdolność do wywoływania przepuszczalności i stanu zapalnego 7,17. Gdy LPS był testowany w tym modelu, przepuszczalność nabłonka była zróżnicowana w zależności od stężenia ekspozycji. Protokół ten można rozszerzyć w celu zbadania innych patologii chorobowych przy użyciu różnych materiałów mikroiniekcyjnych i pomiarów wyników.
Kluczowe kroki w tym protokole obejmują ustalenie enteroidów z tkanek jelitowych płodu, charakterystykę enteroidów i technikę mikroiniekcji. Rzetelność tego badania zależy od dokładnego pobierania próbek komórek. Korzystanie z anatomicznych punktów orientacyjnych i naczyń krwionośnych jest pomocne w zapewnieniu selekcji komórek jelita cienkiego. Ze względu na silny wzrost i różnicowanie komórek macierzystych jelita płodu, nie jest konieczna rozległa procedura izolacji komórek macierzystych od innych komórek nabłonka. Po ustaleniu enteroidów ważne jest, aby potwierdzić charakterystykę modelu poprzez barwienie białek i markerów komórkowych. W tym protokole enteroidy wybarwiono pod kątem enterocytów za pomocą villiny i CDX2, komórek Panetha za pomocą lizozymu oraz komórek kubkowych za pomocą mucyny, czyli wszystkich komórek znajdujących się w nabłonku jelita cienkiego 18,19,20. W przeciwieństwie do tradycyjnych pojedynczych linii komórkowych, które wykazują jeden typ komórek, enteroidy ustalają wszystkie typy komórek z jelitowych progenitorowych komórek macierzystych8. Część barwiąca tego protokołu może być modyfikowana pod kątem określonych markerów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania. Kluczowe znaczenie dla niezawodności tego protokołu ma technika mikroiniekcji. Konsystencję końcówek do mikropipet można sprawdzić, mierząc objętość na pompę za pomocą roztworu dextran-FITC i wizualizując średnicę końcówek pod mikroskopem. Ze względu na ryzyko zanieczyszczenia, ta sama mikropipeta nie może być używana do więcej niż jednej ekspozycji. Dodatkowo na kształt i wzrost enteroidów może mieć wpływ zawartość ich pożywki wzrostowej. Odkryliśmy, że enteroidy w kształcie kulistego, a nie kalafiora, stanowiły lepsze modele do mikroiniekcji. Kulisty kształt może być indukowany przez większy współczynnik Wnt w ośrodku21.
Protokół ten w dużej mierze zależy od umiejętności wykonawcy w zakresie mikroiniekcji w celu zmniejszenia różnic, zwłaszcza w pomiarach wrażliwych na czas. Różnice można zminimalizować poprzez posiadanie tego samego doświadczonego wykonawcy ze spójnymi technikami, użycie tego samego pochodzenia komórek w celu uniknięcia zmienności genetycznej, testowanie w tym samym pasażu w celu usunięcia błędu dojrzałości i hodowanie komórek w tym samym typie pożywki w celu podobnego różnicowania komórek. Składniki pożywki wzrostowej mogą indukować zróżnicowane różnicowanie komórek macierzystych in vitro , a nie w środowisku in vivo . Na przykład in vivo lizozym ulega ekspresji dopiero w 22-24 tygodniu rozwoju ciąży, kiedy tworzą się komórki Panetha i stają się funkcjonalne22. Udało nam się jednak wykryć lizozym w naszych enteroidach powstałych z 10-tygodniowych jelit płodowych. Metoda ta może ograniczyć liczbę badanych ekspozycji w tym samym czasie ze względu na wysokie umiejętności techniczne wymagane do mikroiniekcji. Wyciek dekstranu z otworu do nakłuwania mikroiniekcji może mieć wpływ na ocenę przepuszczalności. Aby zniwelować ten efekt, zaleca się trzykrotne mycie bezpośrednio po mikroiniekcji w celu usunięcia resztek dekstranu z zabiegu. Stężenie dekstranu w pożywce należy mierzyć co godzinę przez 4-6 godzin po mikroiniekcji. Eksperymenty, w których stwierdzono znaczny wzrost stężenia dekstranu w ciągu 2-4 godzin po wstrzyknięciu, powinny być wyłączone z analizy końcowej.
Ta metoda ma kilka zalet. Wymaga to niższych kosztów i mniej zasobów w porównaniu z monowarstwami pochodzącymi z enteroidów w transwell. Dodatkowo można go rozszerzyć na inne ekspozycje, takie jak żywe bakterie lub wirusy, aby zbadać początkową interakcję między drobnoustrojami jelitowymi a nabłonkiem. Zamknięte światło enteroidu może utrzymać stabilny wzrost żywych bakterii z mikrowstrzyknięciami bez zanieczyszczenia pożywki wzrostowej13. W przeciwieństwie do monowarstwy wystawionej na działanie pożywki wzrostowej i tlenu inkubacyjnego, zamknięte światło jest ciasną, odizolowaną przestrzenią. Zamknięty strumień świetlny nie pozwala na komunikację z pożywką wzrostową i zawartość tlenu w świetle, która jest niższa w czasie przy żywym wzroście bakterii13.
Wykorzystanie tkanki jelitowej płodu dokładniej oddaje nabłonek jelitowy wcześniaków w porównaniu z dorosłymi jelitowymi komórkami macierzystymi lub modelami zwierzęcymi7. Co więcej, polaryzacja enteroidów pozwala na ekspozycję i pomiary zarówno wierzchołkowe, jak i podstawno-boczne23. Enteroidy tworzą zamknięte światło o niższym stężeniu natlenienia, które bardziej naśladuje stężenie natlenienia jelit24. W przeciwieństwie do bardziej zaawansowanych technologicznie protokołów16, zastosowanie pomiarów brutto mediów pozwala na większą dostępność tej techniki. Eksperyment wykazał, że przeciek nabłonkowy może być wywołany przez wierzchołkową ekspozycję na LPS i jest zależny od stężenia. Ponieważ metoda ta bada zmiany w nieszczelnym stężeniu dekstranu, jest przydatna do wykrywania dużych zmian funkcjonalnych w ścisłych połączeniach. Zbieranie i sekwencjonowanie informacyjnego RNA odsłoniętych enteroidów oraz analiza western blot mogą uzupełniać analizę poważnych zmian funkcjonalnych. Model ten bada integralność nabłonka jelitowego w systemie, który bardzo przypomina środowisko wcześniaka, a zatem może być wykorzystany do lepszego zrozumienia wcześniaków i innych patologii chorobowych.

Wcześniaki są narażone na częste i długotrwałe stany zapalne, które narażają je na zwiększone ryzyko uszkodzenia jelit skutkującego długotrwałym kalectwem lub śmiercią1. Badania w tej dziedzinie są wyzwaniem ze względu na ograniczoną możliwość przeprowadzania eksperymentów na wrażliwych wcześniakach. Co więcej, brak odpowiednich modeli utrudnił kompleksowe badanie przedwczesnego środowiska jelitowego2. Istniejące modele in vitro i in vivo nie są w stanie w pełni odwzorować przedwczesnego środowiska jelitowego człowieka. W szczególności pojedyncze nabłonkowe linie komórkowe płodu mogą nie tworzyć ścisłych połączeń, a modele zwierzęce wykazują inne reakcje zapalne i immunologiczne niż wcześniaki. Wraz z odkryciem sygnalizacji Wnt jako głównego szlaku proliferacji i różnicowania jelitowych krypt komórek macierzystych oraz nowych tkankowych komórek macierzystych Lgr5+, organoidy pochodzące z tkanek jelitowych, takie jak enteroidy i kolonoidy, zostały ustalone jako modele in vitro3,4,5. Korzystając z tej technologii, możliwe jest tworzenie i wykorzystywanie trójwymiarowych (3D) modeli enteroidalnych, które są opracowywane z całej tkanki lub biopsji jelita w celu zbadania odpowiedzi nabłonka na środowisko jelitowe6,7.
W przeciwieństwie do typowych linii komórkowych jelit hodowanych w hodowli, enteroidy wykazują polarność ze światłem połączonym białkami o ścisłym połączeniu8. Pozwala to na ekspozycję na granicę podstawno-boczną w pożywce wzrostowej, a także na mikroiniekcję światła w celu oceny granicy wierzchołkowej. Co więcej, enteroidy wykazują podobne cechy genetyczne, fizjologiczne i immunologiczne jak ludzki nabłonek9,10. Enteroidy pochodzące z tkanek płodowych pozwalają na zbadanie roli wcześniaka w funkcjonowaniu nabłonka. Unikalne cechy enteroidów mogą bardziej przypominać środowisko jelitowe wcześniaka9. Enteroidy pochodzenia tkankowego mogą być używane do testowania integralności połączeń ścisłych jako forma jednowarstwowa lub jako struktury 3D osadzone w zestalonej mieszaninie białek błony podstawnej. W przypadku tej ostatniej formy wymagana jest technika mikroiniekcji, jeśli pożądane jest odsłonięcie wierzchołkowe. Pomiar odpowiedzi nabłonkowych w modelach enteroidalnych obejmuje ekspresję genów za pomocą sekwencjonowania RNA, biomarkery za pomocą testu immunologicznego sprzężonego z enzymami (ELISA) lub zaawansowane techniki obrazowania. Przedstawiona tutaj technika zapewnia kolejną możliwą opcję pomiaru przepuszczalności brutto za pomocą fluorometrii.
Uszkodzenie jelit u wcześniaków ma wieloczynnikową patogenezę, która obejmuje brak równowagi społeczności mikrobiologicznej jelit. Enteroidy mogą stanowić doskonałe modele do badania niektórych aspektów chorób wcześniaków jelit, takich jak martwicze zapalenie jelit, które obejmują funkcje nabłonka11. Enteroidy wykazują podobne cechy jak ludzkie jelito płodowe 10. Wystawienie enteroidów na działanie lipopolisacharydu (LPS), endotoksyny wytwarzanej przez bakterie Gram-ujemne, w pożywce hodowlanej jako ekspozycja podstawno-boczna indukuje ekspresję genów, która może prowadzić do zwiększonego stanu zapalnego i przepuszczalności jelit7. Badanie to ma na celu ocenę zmian w przepuszczalności nabłonka po ekspozycji wierzchołkowej na produkty bakteryjne, takie jak LPS. Wyniki mogą dostarczyć informacji na temat interakcji między drobnoustrojami a nabłonkiem zaangażowanych w patogenezę uszkodzenia jelit. Metoda przeznaczona do badania przepuszczalności brutto wymaga konfiguracji i umiejętności mikroiniekcji.

<table><tbody><tr><td>Amfoterycyna 250 μL/ml</td><td>Gibco</td><td>15-290-026</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CDX-2 [CDX2-88] 0,5 ml skoncentrowana mysz, IgG, monoklonalna</td><td>Biogenex</td><td>MU392A-5UC</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-klaudynowe 2 (ab53032)</td><td>abcam</td><td>ab53032</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Claudin 3 (ab15102)</td><td>abcam</td><td>ab15102</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-LYZ wytwarzane u królika</td><td>Millipore Sigma</td><td>HPA066182-100UL</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antymucynowe 2/MUC2 (F-2): sc-515032</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-515032</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Villin, klon VIL1/4107R 0,5 ml skoncentrowany królik, IgG, monoklonalny</td><td>Biogenex</td><td>NUA42-5UC</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych, CytoOne 12-dołkowe płytki niepoddane obróbce&nbsp;</td><td>USA Scientific Inc</td><td>50-754-1395</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych, CytoOne 6-dołkowe płytki niepoddane obróbce&nbsp;</td><td>USA Scientific Inc</td><td>50-754-1560</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z wiadrami z probówkami 15 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>05-413-110</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Olympus FV1200</td><td>N/A</td><td>Lub podobny mikroskop</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe, 15 ml</td><td>Falcon</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe do szkiełek mikroskopowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-DP</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele jednorazowe</td><td>Mopec</td><td>22-444-272</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dmidino-2-fenyloindolu (DAPI) (1 mg / ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS, 1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ67802K2</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(&beta;-aminoetylowy eter)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraoctowy (EGTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>E8145-10G</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny dekstran (Dextran-FITC) 4 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik</td> <td>mikropłytek FuorescenceAgilent BioTek</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna 50 mg/ml</td><td>Gibco</td><td>15-750-060</td><td></td></tr><tr><td>Szklane rurki kapilarne, borokrzemian jednobębnowy, 1x0,5mm, 6" (przecięte na pół przed pociągnięciem)</td><td>Systemy AM</td><td>626500</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) o wysokiej adsorbcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 594</td><td>Fisher Scientific</td><td>A32742</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Fisher Scientific</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH</td><td>Nie dotyczy</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (ludzkie)</td> <td>Komórka macierzysta&nbsp; Technologie</td><td>&nbsp; 06010</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy z&nbsp; Escherichia coli&nbsp; O111:B4</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matryca membrany podstawnej, bez LDEV, 10 mL&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>&nbsp; stężenie białka > 9 mg/ml najlepiej</td></tr><tr><td>Mikrokleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-820-078</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-953-1B</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne&nbsp;</td><td>Ściągacz do mikropipet M3301</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>SU-P1000</td><td>Lub podobny sprzęt</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034486</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne okludyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 71-1500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 32% roztwór wodny</td><td>ELEKTRON&nbsp; MICROSCOPY SCIENCES</td><td>RT 15714</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego, 35x10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego, 60x15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-94</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Przełącznik nożny PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, niefiltrowane, 1000 uL</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-47</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, niefiltrowane, 20 uL</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-41</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, niefiltrowane, 200 uL</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-54</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczny system PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>lub podobny system pikopompy</td></tr><tr><td>Primocin 50 mg/mL, fiolka 10x1 ml</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Stalowa płyta podstawy</td><td>World Precision Instruments</td><td>5052</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss stemi 350</td><td></td><td>Lub podobny mikroskop</td></tr><tr><td>ThermoSafe PolarPack Foam Bricks</td><td>Sonoco</td><td>03-531-53</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Ścienny dopływ powietrza</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Przeciwciało poliklonalne</td><td>Fisher Scientific</td><td>61-7300</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids

Enteroidy pochodzące z ludzkich tkanek płodowych stają się obiecującym modelem in vitro do badania urazów jelit u wcześniaków. Enteroidy wykazują polarność, składającą się ze światła z wierzchołkową obwódką, ścisłych połączeń i podstawno-bocznej warstwy zewnętrznej wystawionej na działanie pożywki wzrostowej. Konsekwencjami urazów jelit są zapalenie błony śluzowej i zwiększona przepuszczalność. Badanie przepuszczalności jelit u wrażliwych wcześniaków często nie jest wykonalne. W związku z tym do badania urazów jelit u wcześniaków potrzebny jest model jelitowy in vitro pochodzący z tkanek płodowych. Enteroidy mogą być używane do badania zmian w przepuszczalności nabłonka regulowanej przez białka połączeń ścisłych. W enteroidach jelitowe komórki macierzyste różnicują się we wszystkie typy komórek nabłonkowych i tworzą trójwymiarową strukturę na macierzy błony podstawnej wydzielanej przez komórki mięsaka myszy. W artykule opisano metody stosowane do tworzenia enteroidów z tkanki jelitowej płodu, charakterystyki białek ścisłego połączenia enteroidalnego za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego oraz badania przepuszczalności nabłonka. Ponieważ dysbioza bakteryjna z dominacją Gram-ujemnych jest znanym czynnikiem ryzyka uszkodzenia jelit, zastosowaliśmy lipopolisacharyd (LPS), endotoksynę wytwarzaną przez bakterie Gram-ujemne, w celu wywołania przepuszczalności w enteroidach. Dekstran znakowany fluoresceiną poddano mikroiniekcji do światła enteroidu, a następnie zmierzono seryjne stężenia dekstranu, które wyciekły do pożywki hodowlanej, w celu ilościowego określenia zmian przepuszczalności parakomórkowej. Eksperyment wykazał, że wierzchołkowa ekspozycja na LPS indukuje przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od stężenia. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że dominująca dysbioza Gram-ujemna przyczynia się do mechanizmu uszkodzenia jelit u wcześniaków.

Ustanowiliśmy linię komórkową enteroidów z donowanej tkanki płodowej jelita cienkiego (ileum), stosując zmodyfikowane protokoły dostarczone przez naszych współpracowników z University of Michigan Translational Tissue Modeling Laboratory12. Linia komórkowa enteroidów dała wynik negatywny w testach na zakażenie Mycoplasma. Enteroidy wybarwiły się pozytywnie na villinę, CDX2, lizozym, mucynę, klaudynę, okludynę oraz zonula-occluden 1 (Rysunek 5), co potwierdziło ich pochodzenie z nabłonka jelita cienkiego. Do enteroidów mikroiniekcyjnie podano 4 kDa dextran-FITC w stężeniu 5 mg/mL w PBS (Rysunek 6). Ekspozycje testowe stanowiło LPS w różnych stężeniach, 0,1 mg/mL i 0,5 mg/mL, zmieszane z dextran-FITC w celu ekspozycji apikalnej. Jako kontrolę pozytywną zastosowaliśmy 2 mM EGTA, dodając go do pożywki hodowlanej 4 h po mikroiniekcji dekstranu. EGTA jest chelatorem wapnia, który zwiększa przepuszczalność połączeń ścisłych. W kontrolach negatywnych mikroiniekcyjnie podano sam dextran-FITC w PBS. W przypadku ekspozycji bazolateralnej, pożywka zastępcza stosowana przy seryjnym pobieraniu pożywek hodowlanych miała to samo stężenie czynnika ekspozycyjnego (tj. 2 mM EGTA). Wyniki wskazują na wyraźny wzrost stężenia dekstranu w pożywkach hodowlanych po dodaniu EGTA w porównaniu z kontrolą negatywną (PBS). Apikalna ekspozycja na LPS wywołała wyższą przepuszczalność dekstranu, rozpoczynając się w sposób zależny od stężenia mniej więcej 8 h po ekspozycji (Rysunek 7).
<img alt="Układ do mikromanipulacji ze stereomikroskopem do precyzyjnej iniekcji komórkowej i eksperymentów z manipulacją." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Układ mikroinjektora. Układ obejmuje stereomikroskop, mikromanipulator zamontowany na statywie magnetycznym na ciężkiej stalowej płycie podstawowej, uchwyt mikropipety połączony strzykawką za pomocą trójdrożnego kurka oraz pompę pneumatyczną. Ścienne zasilanie powietrzem zapewnia ciśnienie, które jest regulowane przez pompę w celu uzyskania stałej objętości tłoczenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ mikroskopowy do badania optycznego, z platformą na preparat i oświetleniem światłowodowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Poziomy uchwyt mikropipety. Ta plastikowa platforma służy do utrzymania mikropipety po wyciągnięciu szklanej rurki kapilarnej w celu odcięcia końcówki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Szkiełko Petri z zestawem do mikroiniekcji dla eksperymentu manipulacji komórkami; igła w polu widzenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Pozycjonowanie mikropipety. Kąt 35°-45° jest optymalny do iniekcji enteroidów znajdujących się w środku szalki Petriego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres stężenia dekstranu w funkcji średniej absorbancji; regresja liniowa y=7160x-19,1; dane spektroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Krzywa wzorcowa dekstranu. Krzywa została sporządzona na podstawie absorbancji fluorescencyjnej 10 rozcieńczeń seryjnych dekstranu wykonanych w duplikacie. Dopasowano linię regresji liniowej w celu wyznaczenia równania regresji. Słupki błędów przedstawiają SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna wykazująca ekspresję białek: villin, CDX2, mucyna, lizozym, claudina, occludina." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Fluorescencyjne biomarkery enteroidów. Barwienie jąder DAPI jest niebieskie. Przedstawiono następujące biomarkery: (A) villin, (B) CDX2, (C) lizozym, (D) mucyna, (E) claudina, (F) occludina oraz (G) zonula occludens 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe struktur komórkowych; A: komórka, B: mikroenkapsulacja, C: fluorescencja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Enteroidy na różnych etapach rozwoju. (A) Enteroid w wieku 7–10 dni jest mały i posiada grubą ścianę. (B) Enteroid gotowy do mikroiniekcji, charakteryzujący się dużym rozmiarem, obecnością światła oraz cienką ścianą, oraz (C) fluorescencyjny dekstran-FITC wewnątrz enteroidu 2 dni po mikroiniekcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy stężenia dekstranu; po ekspozycji w czasie, analizowany z uwzględnieniem zmiennych EGTA, PBS, LPS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64108/64108fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Przepuszczalność dekstranu-FITC po mikroiniekcji. (A) Zmierzone poziomy dekstranu w mediach były wyższe po dodaniu EGTA w porównaniu z PBS. (B) Mikroiniekcja 0,5 mg/mL LPS wywołała większy wyciek dekstranu z lumenu enteroidu do mediów niż mikroiniekcja 0,1 mg/mL LPS, począwszy od 8 h po iniekcji. *wartość p &lt; 0,05, słupki błędów oznaczają SEM, n = 3, do obliczenia istotności zastosowano test t Studenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64108/64108fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit ...

Znaczenie tego protokołu polega na przetestowaniu dużego prawdopodobieństwa enteroidów na modelu in vitro przedwczesnego nabłonka. Główną zaletą tej techniki jest pomiar przepuszczalności z zamkniętego światła, które naśladuje środowisko świetlne jelit. Protokół ten może być wykorzystany do badania czynników, które wywołują lub łagodzą nieszczelną chorobę jelitową.Może być również stosowany do układów śródbłonka lub naczyń krwionośnych w celu zbadania warunków, które mogą indukować nieszczelność naczyniową. Ten protokół wymaga pewnej praktyki. Zalecamy przećwiczenie każdej sekcji osobno przed złożeniem całej procedury w całość.Na początek przenieś segmenty jelita na szalkę Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów kwadratowych z lodowatym PBS Dulbecco z amfoteracyną i moczyć przez 20 minut na lodzie. Za pomocą skalpela z nożyczkami pokrój segmenty jelita na trzy do pięciu milimetrowych kawałków i umieść jeden do dwóch kawałków na szalce Petriego o wymiarach 35 na 15 milimetrów kwadratowych zawierającej od 0,5 do jednego mililitra pożywki wzrostowej organoidów na lodzie. Przeciąć rurkę jelitową wzdłużnie za pomocą mikronożyczek i kleszczy do preparowania.Następnie użyj kleszczy, aby zeskrobać komórki nabłonkowe z powięzi. Usuń powięź i zakręć naczyniem, aby rozbić grudki komórek. Następnie, za pomocą końcówki do pipet o pojemności 20 mikrolitrów, przenieś komórki i pożywkę z dokładnością od pięciu do 10 mikrolitrów do mieszanki matrycy z membraną podstawną, aby uzyskać roztwór o pojemności 285 mikrolitrów.Wymieszaj komórki, pipetując matrycę membrany podstawnej na lodzie za pomocą końcówki o pojemności 200 mikrolitrów. Po wymieszaniu umieść pięć 50-mikrolitrowych pasków mieszanki matrycowej błony podstawnej komórki w jednym dołku wstępnie podgrzanej sześciodołkowej płytki umieszczonej na ciepłej cegle piankowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 10 minut, aby umożliwić polimeryzację i utwardzenie matrycy błony podstawnej.Po zestaleniu pasków matrycy dodaj dwa mililitry enteroidalnej pożywki wzrostowej do studzienki przed ponownym umieszczeniem płytki w inkubatorze. Po przeniesieniu enteroidów do studzienki z sześciodołkową lub 12-dołkową płytką, co drugi dzień należy zastąpić stare podłoże świeżymi pożywkami. A gdy enteroidy zaczną się rozwijać, przechodź przez komórki co pięć do siedmiu dni.W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego dodaj 500 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała w buforze blokującym do każdej studzienki enteroidów i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała i trzykrotnie przemyj enteroidy PBS. Po inkubacji w jednym do 400 rozcieńczonych roztworze przeciwciał drugorzędowych, a następnie inkubacji w DAPI, przemyć enteroidy trzykrotnie PBS.Aby zachować trójwymiarowe struktury enteroidów, użyj wycięć z cienkich arkuszy gumy silikonowej lub szkiełek nakrywkowych, aby stworzyć odstęp od 0,5 do jednego milimetra między dolnym szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Do montażu przemyć poplamione enteroidy 70% glicerolem. Następnie, za pomocą jednomikrolitrowej pętli inokulacyjnej lub wyciętej końcówki o pojemności 200 mikrolitrów, wyjmij enteroidy z płytki i zamontuj z glicerolem na szklanym szkiełku mikroskopowym.Przygotuj szalkę Petriego pokrytą przezroczystą folią i dodaj dwie do czterech jednomikrolitrowych kropli Dextran-FITC na folię. Za pomocą mikromanipulatora wbić końcówkę mikropipety do cieczy i nad folię pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie delikatnie pociągnąć za strzykawkę, aby wyjąć Dextran-FITC do mikropipety. Po napełnieniu mikropipety dwoma do czterech mikrolitrów Dextran-FITC, należy popchnąć strzykawkę, aby usunąć powietrze z końcówki pipety.Należy również sprawdzić kolumnę wstrzykiwanego materiału w mikropipecie, aby upewnić się, że nie ma kieszeni powietrznej i zapisać objętość leku Dextran-FITC wewnątrz mikropipety. Następnie włącz źródło powietrza podłączone do pompy pneumatycznej przed włączeniem pompy i ustawieniem czasu pracy pompy na 10 do 15 milisekund. Następnie przekręć zawór odcinający na strzykawce, aby otworzyć przewód od pompy do mikropipety.Wyjmij enteroidy z inkubatora i umieść naczynie na ciepłym cegle piankowym w przykrytym pojemniku, aby zminimalizować ekspozycję na światło po mikrowstrzyknięciu. Umieść szalkę Petriego z enteroidami pod mikroskopem stereoskopowym i przesuń pokrętła mikromanipulatora, aby umieścić końcówkę mikropipety pod kątem 35 do 45 stopni do powierzchni poziomej. Wizualizuj i identyfikuj sferyczne enteroidy z celem wstrzyknięcia od trzech do pięciu enteroidów na talerz.Następnie przesuń końcówkę do enteroidu docelowego, patrząc przez okulary mikroskopu. Następnie, przesuwając pokrętło osi Z precyzyjnym, powolnym ruchem, nakłuj enteroid końcówką mikropipety. Postęp powinien się zatrzymać, gdy końcówka przejdzie przez powierzchnię enteroidu, która wciska się i odskakuje.Postukaj jedną nogą w pedał pompy i napełnij enteroid zielonkawym roztworem Dextran-FITC, aż się rozpręży. Zapisz liczbę pomp, aby obliczyć pompowaną objętość i stężenie dekstranu. Protokół ten wykazał charakterystykę enteroidów pochodzących z tkanek płodowych poprzez barwienie różnych biomarkerów specyficznych dla nabłonka jelitowego przeciwciałami immunofluorescencyjnymi, potwierdzając ich pochodzenie z nabłonka jelita cienkiego.Enteroidy w różnych stadiach są pokazane tutaj. Enteroid w wieku od siedmiu do 10 dni jest mały i gruby. Natomiast enteroid gotowy do mikroiniekcji był duży, ze światłem i cienką ścianką.Enteroid dwa dni po mikrowstrzyknięciu nadal zawiera znaczne ilości Dextran-FITC. Przepuszczalność enteroidów po mikroiniekcji oceniano, mierząc stężenie dekstranu w pożywce. Jako kontrolę pozytywną zastosowano EGTA, o którym wiadomo, że zwiększa przepuszczalność błony w ciasnych połączeniach.Test pomiaru dekstranu pokazuje ponadto, że LPS indukował zwiększoną przepuszczalność, a wyższe stężenie LPS indukowało wyższą przepuszczalność. Najważniejszą rzeczą w utrwalaniu i barwieniu jest to, aby nie zakłócić kształtu enteroidów ani nie stracić ich podczas procesu. Po mikroiniekcji można pobrać pożywkę do oznaczania cytokin i enteroidy do sekwencjonowania RNA.

testing-epithelial-permeability-in-fetal-tissue-derived-enteroids

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Obecny protokół przedstawia metodę, która wykorzystuje żółć lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym do określenia przepuszczalności jelit. Metodę tę można zastosować do określenia przepuszczalności parakomórkowej w enteroidach, które modelują choroby zapalne jelit, takie jak martwicze zapalenie jelit.

Określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym

Escherichia coli powoduje sepsę u noworodków, które połykają bakterie w czasie porodu. Proces związany ze zdolnością E. coli do przemieszczania się z przewodu pokarmowego do krwiobiegu jest słabo poznany. Ten model in vitro ocenia zdolność szczepów E. coli do przemieszczania się przez komórki nabłonka jelitowego.

Ocena transcytozy jelitowej izolatów bakteriemii Escherichia coli u noworodków

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

Opisano ustandaryzowane, kompleksowe i w pełni ilościowe badanie funkcji autonomicznych. Testy autonomiczne obejmują ocenę trzech głównych obszarów autonomicznych, w tym układu kardjowagalnego, adrenergicznego oraz sudomotorycznego. Stopień nasilenia i rozprzestrzenienie dysautonomii określa się ilościowo za pomocą Złożonych Wyników Nasilenia Autonomicznego (Composite Autonomic Severity Scores).

Ilościowe badanie autonomiczne

Poznaj metodę oceny przepuszczalności nabłonka jelitowego w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych. Technika mikroinjekcji Dextran-FITC pozwala badać mechanizmy nieszczelnego jelita in vitro.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

Przeglądaj więcej filmów