Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych
16 czerwca 2022
Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.
Znaczenie tego protokołu polega na przetestowaniu dużego prawdopodobieństwa enteroidów na modelu in vitro przedwczesnego nabłonka. Główną zaletą tej techniki jest pomiar przepuszczalności z zamkniętego światła, które naśladuje środowisko świetlne jelit. Protokół ten może być wykorzystany do badania czynników, które wywołują lub łagodzą nieszczelną chorobę jelitową.
Może być również stosowany do układów śródbłonka lub naczyń krwionośnych w celu zbadania warunków, które mogą indukować nieszczelność naczyniową. Ten protokół wymaga pewnej praktyki. Zalecamy przećwiczenie każdej sekcji osobno przed złożeniem całej procedury w całość.
Na początek przenieś segmenty jelita na szalkę Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów kwadratowych z lodowatym PBS Dulbecco z amfoteracyną i moczyć przez 20 minut na lodzie. Za pomocą skalpela z nożyczkami pokrój segmenty jelita na trzy do pięciu milimetrowych kawałków i umieść jeden do dwóch kawałków na szalce Petriego o wymiarach 35 na 15 milimetrów kwadratowych zawierającej od 0,5 do jednego mililitra pożywki wzrostowej organoidów na lodzie. Przeciąć rurkę jelitową wzdłużnie za pomocą mikronożyczek i kleszczy do preparowania.
Następnie użyj kleszczy, aby zeskrobać komórki nabłonkowe z powięzi. Usuń powięź i zakręć naczyniem, aby rozbić grudki komórek. Następnie, za pomocą końcówki do pipet o pojemności 20 mikrolitrów, przenieś komórki i pożywkę z dokładnością od pięciu do 10 mikrolitrów do mieszanki matrycy z membraną podstawną, aby uzyskać roztwór o pojemności 285 mikrolitrów.
Wymieszaj komórki, pipetując matrycę membrany podstawnej na lodzie za pomocą końcówki o pojemności 200 mikrolitrów. Po wymieszaniu umieść pięć 50-mikrolitrowych pasków mieszanki matrycowej błony podstawnej komórki w jednym dołku wstępnie podgrzanej sześciodołkowej płytki umieszczonej na ciepłej cegle piankowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 10 minut, aby umożliwić polimeryzację i utwardzenie matrycy błony podstawnej.
Po zestaleniu pasków matrycy dodaj dwa mililitry enteroidalnej pożywki wzrostowej do studzienki przed ponownym umieszczeniem płytki w inkubatorze. Po przeniesieniu enteroidów do studzienki z sześciodołkową lub 12-dołkową płytką, co drugi dzień należy zastąpić stare podłoże świeżymi pożywkami. A gdy enteroidy zaczną się rozwijać, przechodź przez komórki co pięć do siedmiu dni.
W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego dodaj 500 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała w buforze blokującym do każdej studzienki enteroidów i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała i trzykrotnie przemyj enteroidy PBS. Po inkubacji w jednym do 400 rozcieńczonych roztworze przeciwciał drugorzędowych, a następnie inkubacji w DAPI, przemyć enteroidy trzykrotnie PBS.
Aby zachować trójwymiarowe struktury enteroidów, użyj wycięć z cienkich arkuszy gumy silikonowej lub szkiełek nakrywkowych, aby stworzyć odstęp od 0,5 do jednego milimetra między dolnym szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Do montażu przemyć poplamione enteroidy 70% glicerolem. Następnie, za pomocą jednomikrolitrowej pętli inokulacyjnej lub wyciętej końcówki o pojemności 200 mikrolitrów, wyjmij enteroidy z płytki i zamontuj z glicerolem na szklanym szkiełku mikroskopowym.
Przygotuj szalkę Petriego pokrytą przezroczystą folią i dodaj dwie do czterech jednomikrolitrowych kropli Dextran-FITC na folię. Za pomocą mikromanipulatora wbić końcówkę mikropipety do cieczy i nad folię pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie delikatnie pociągnąć za strzykawkę, aby wyjąć Dextran-FITC do mikropipety. Po napełnieniu mikropipety dwoma do czterech mikrolitrów Dextran-FITC, należy popchnąć strzykawkę, aby usunąć powietrze z końcówki pipety.
Należy również sprawdzić kolumnę wstrzykiwanego materiału w mikropipecie, aby upewnić się, że nie ma kieszeni powietrznej i zapisać objętość leku Dextran-FITC wewnątrz mikropipety. Następnie włącz źródło powietrza podłączone do pompy pneumatycznej przed włączeniem pompy i ustawieniem czasu pracy pompy na 10 do 15 milisekund. Następnie przekręć zawór odcinający na strzykawce, aby otworzyć przewód od pompy do mikropipety.
Wyjmij enteroidy z inkubatora i umieść naczynie na ciepłym cegle piankowym w przykrytym pojemniku, aby zminimalizować ekspozycję na światło po mikrowstrzyknięciu. Umieść szalkę Petriego z enteroidami pod mikroskopem stereoskopowym i przesuń pokrętła mikromanipulatora, aby umieścić końcówkę mikropipety pod kątem 35 do 45 stopni do powierzchni poziomej. Wizualizuj i identyfikuj sferyczne enteroidy z celem wstrzyknięcia od trzech do pięciu enteroidów na talerz.
Następnie przesuń końcówkę do enteroidu docelowego, patrząc przez okulary mikroskopu. Następnie, przesuwając pokrętło osi Z precyzyjnym, powolnym ruchem, nakłuj enteroid końcówką mikropipety. Postęp powinien się zatrzymać, gdy końcówka przejdzie przez powierzchnię enteroidu, która wciska się i odskakuje.
Postukaj jedną nogą w pedał pompy i napełnij enteroid zielonkawym roztworem Dextran-FITC, aż się rozpręży. Zapisz liczbę pomp, aby obliczyć pompowaną objętość i stężenie dekstranu. Protokół ten wykazał charakterystykę enteroidów pochodzących z tkanek płodowych poprzez barwienie różnych biomarkerów specyficznych dla nabłonka jelitowego przeciwciałami immunofluorescencyjnymi, potwierdzając ich pochodzenie z nabłonka jelita cienkiego.
Enteroidy w różnych stadiach są pokazane tutaj. Enteroid w wieku od siedmiu do 10 dni jest mały i gruby. Natomiast enteroid gotowy do mikroiniekcji był duży, ze światłem i cienką ścianką.
Enteroid dwa dni po mikrowstrzyknięciu nadal zawiera znaczne ilości Dextran-FITC. Przepuszczalność enteroidów po mikroiniekcji oceniano, mierząc stężenie dekstranu w pożywce. Jako kontrolę pozytywną zastosowano EGTA, o którym wiadomo, że zwiększa przepuszczalność błony w ciasnych połączeniach.
Test pomiaru dekstranu pokazuje ponadto, że LPS indukował zwiększoną przepuszczalność, a wyższe stężenie LPS indukowało wyższą przepuszczalność. Najważniejszą rzeczą w utrwalaniu i barwieniu jest to, aby nie zakłócić kształtu enteroidów ani nie stracić ich podczas procesu. Po mikroiniekcji można pobrać pożywkę do oznaczania cytokin i enteroidy do sekwencjonowania RNA.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wytwarzania enterodów z tkanki jelita płodowego, zapewniając trójwymiarowy model do badania przepuszczalności jelit. Metoda obejmuje immunofluorescencyjne obrazowanie w celu scharakteryzowania modelu i oceny przepuszczalności nabłonka w odpowiedzi na lipopolisacharydy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Gastroenterologia
Tło
- Enteroidy służą jako model do badania funkcji nabłonka jelitowego.
- Ten model naśladuje środowisko światła jelita, umożliwiając badania przepuszczalności.
- Rozumienie choroby przepuszczalnego jelita jest kluczowe dla zdrowia przewodu pokarmowego.
- Protokół można również dostosować do badań naczyniowych.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu in vitro nabłonka jelitowego.
- Zbadanie czynników wpływających na przepuszczalność nabłonka.
- Dostarczenie wglądu w warunki prowadzące do przeciekania naczyniowego.
Stosowane metody
- Przygotowanie tkanki jelita płodowego i kultury enterodów.
- Barwienie immunofluorescencyjne dla biomarkerów nabłonkowych.
- Mikrowstrzyknięcie Dextran-FITC do oceny przepuszczalności.
- Pomiar stężenia Dextran w celu oceny zmian przepuszczalności.
Główne wyniki
- Charakteryzacja enterodów potwierdziła ich nabłonkowe pochodzenie.
- Mikrowstrzyknięcie z powodzeniem wywołało zmiany przepuszczalności.
- Ekspozycja na LPS zwiększyła przepuszczalność w sposób zależny od dawki.
- EGTA została użyta jako pozytywna kontrola dla oceny przepuszczalności.
Wnioski
- Model enteroidów jest skuteczny w badaniu przepuszczalności jelit.
- Ten protokół może pomóc w zrozumieniu mechanizmów przepuszczalnego jelita.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badania przepuszczalności naczyniowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Human fetal tissue-derived enteroids provide a physiologically relevant in vitro system for interrogating epithelial barrier function and permeability mechanisms in preterm intestinal injury. This model enables quantitative assessment of tight junction integrity and response to pathogenic stimuli, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. The approach addresses a critical gap where direct human studies are not feasible, informing risk-adjusted portfolio decisions in gastrointestinal and neonatal research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of epithelial barrier disruption by quantifying permeability changes in response to defined stimuli.
- Supports functional validation of tight junction protein targets implicated in leaky gut and mucosal injury.
- Facilitates biological de-risking by modeling disease-relevant epithelial responses to bacterial endotoxins.
- Provides a platform for hypothesis-driven evaluation of candidate modulators of barrier integrity.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, three-dimensional enteroid system for standardized permeability assays.
- Delivers quantitative, scalable readouts via dextran leakage measurements for compound screening.
- Enables assay standardization and cross-study comparability through immunofluorescent characterization of tight junctions.
- Prepares validated biological systems for downstream screening of permeability modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by modeling preterm intestinal injury and dysbiosis-driven barrier dysfunction.
- Supports translational continuity by enabling cytokine profiling and RNA sequencing from the same enteroid samples.
- Informs preclinical risk assessment by quantifying dose-dependent effects of pathogenic exposures.
- Provides predictive de-risking for therapeutic strategies targeting epithelial integrity.
Pipeline & Workflow Integration
This enteroid-based permeability assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational biomarker development in gastrointestinal research.
- Discovery Biology: Quantifies tight junction function and barrier disruption in response to defined bacterial and chemical stimuli.
- Screening: Provides a robust, quantitative platform for evaluating permeability-modulating compounds.
- Analytics: Enables serial measurement of dextran leakage and supports downstream cytokine and transcriptomic analyses.
- Translational Research: Models disease-relevant epithelial responses, supporting biomarker alignment and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable system for diverse barrier function studies across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of epithelial barrier dysfunction.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable permeability assays for cross-functional teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in gastrointestinal portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of barrier-targeted therapeutics and translational research investments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enteroid culture, microinjection, and immunofluorescent imaging.
- Demands access to specialized instrumentation for microinjection and quantitative fluorescence measurement.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- Adaptation to other epithelial or vascular systems may require protocol optimization.
- Careful handling is essential to preserve enteroid structure and ensure assay fidelity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:53
Intestinal Epithelial Cell Plating in Basement Membrane Matrix from Whole Specimens
2:54
Immunofluorescent Staining of the Enteroids
3:57
Preparation for Microinjection of Enteroids
6:13
Results: Visualization of Stained Enteroids
7:19
Conclusion
