Name: Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę tworzenia linii komórkowych mięśni z nokautem genowym przy użyciu CRISPR/Cas9 i lentiwirusa. Technika ta umożliwia szybszą i tańszą analizę funkcji genów niż tradycyjne modele zwierzęce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) oraz Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

<ol><li>Claussnitzer, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+metabolic+diseases+from+human+genetic+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries.</a> Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).</li>
<li>Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR+tools+for+variant+interpretation+and+disease+modeling+in+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies.</a> Genes. 11 (5), 473(2020).</li>
<li>Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+therapeutics%3A+current+challenges+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+correction+of+muscular+dystrophy+by+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).</li>
<li>Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+specificity+of+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Target specificity of the CRISPR-Cas9 system.</a> Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).</li>
<li>Merienne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+self-inactivating+KamiCas9+system+for+the+editing+of+CNS+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes.</a> Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).</li>
<li>Marty, I., Fauré, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-contraction+coupling+alterations+in+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Excitation-contraction coupling alterations in myopathies.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li>
<li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick%2C+cost-free+method+of+purification+of+DNA+fragments+from+agarose+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li>
<li>Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+3+and+type+1+ryanodine+receptors+are+localized+in+triads+of+the+same+mammalian+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).</li>
<li>Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+linear+Lowry--Folin+assay+for+both+water-soluble+and+sodium+dodecyl+sulfate-solubilized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins.</a> Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).</li>
<li>Garibaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dusty+core+disease%27+%28DuCD%29%3A+expanding+morphological+spectrum+of+RYR1+recessive+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3(2019).</li>
<li>Marty, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+a+complex+involving+Dihydropyridine+receptor+and+Ryanodine+receptor+in+triad+junctions+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).</li>
<li>Oddoux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triadin+deletion+induces+impaired+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>Cacheux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+central+core+disease+RyR1+mutation+%28p.Y4864H%29+associated+with+quantitative+defect+in+RyR1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).</li>
<li>Luis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+old+and+the+new%3A+Prospects+for+non-integrating+lentiviral+vector+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology.</a> Viruses. 12 (10), 1103(2020).</li>
<li>Leenay, R. T., Beisel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering%2C+communicating%2C+and+engineering+the+CRISPR+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Ważnym krokiem na drodze do scharakteryzowania genów o nieznanej funkcji zaangażowanych w patologie jest opracowanie odpowiednich modeli komórkowych do badania funkcji tych genów. Wykorzystanie edycji genów za pomocą CRISPR/Cas9 jest wykładniczo rozwijającą się dziedziną badań, a rozwój modeli knock-out, jak przedstawiono tutaj, jest jednym z najczęściej stosowanych zastosowań. W tym kontekście proponujemy tutaj wszechstronny protokół rozwoju ludzkiej linii komórkowej w dowolnym genie będącym przedmiotem zainteresowania,...

Wraz z postępem sekwencjonowania genów i identyfikacją mutacji w genach o nieznanych funkcjach w określonej tkance, rozwój odpowiednich modeli komórkowych do zrozumienia funkcji nowego genu docelowego i potwierdzenia jego udziału w powiązanych mechanizmach patofizjologicznych stanowi niezbędne narzędzie. Ponadto modele te mają ogromne znaczenie dla przyszłego rozwoju terapeutycznego1,2 i stanowią interesującą alternatywę dla rozwoju modeli zwierzęcych knock-out zgodnie z międzynarodowymi zaleceniami dotyczącymi ograniczenia wykorzystywania zwierząt w eksperymentach. Edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 jest jednym z najpotężniejszych obecnie dostępnych narzędzi, które pozwoliły na opracowanie wielu modeli knock-out/knock-in, a ukierunkowana walidacja genów za pomocą CRISPR/Cas9 jest jedną z najczęściej używanych aplikacji CRISPR/Cas93. Sukces edycji genów zależy od możliwości wprowadzenia narzędzi CRISPR (przewodnika RNA i nukleazy Cas9) do docelowego modelu komórki, co może być wyzwaniem w wielu trudnych do transfekcji komórkach, takich jak komórki mięśniowe4. Wyzwanie to można przezwyciężyć za pomocą wirusa, zwykle lentiwirusa, który ma tę wielką zaletę, że skutecznie transdukuje wiele typów komórek i dostarcza ich transgen. Ale jego główną wadą jest integracja transgenu z genomem komórki gospodarza, prowadząca do potencjalnej zmiany genów zlokalizowanych w miejscu integracji i do trwałej ekspresji transgenu, co w przypadku nukleazy Cas9 skutkowałoby szkodliwymi konsekwencjami5. Merienne i współpracownicy zaproponowali inteligentne rozwiązanie6, które polega na wprowadzeniu do komórek przewodnika RNA ukierunkowanego na sam gen Cas9, co prowadzi do inaktywacji Cas9. Adaptacja tej strategii jest tutaj przedstawiona jako przyjazny dla użytkownika i wszechstronny protokół pozwalający na wyeliminowanie praktycznie każdego genu w trudnych do transfekcji komórkach.
Celem przedstawionego tutaj protokołu jest wywołanie inaktywacji interesującego genu w unieśmiertelnionych komórkach mięśniowych. Może być używany do wybijania dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania, w różnych typach unieśmiertelnionych komórek. Opisany tutaj protokół zawiera kroki mające na celu zaprojektowanie przewodnikowych RNA i ich klonowanie do plazmidów lentiwirusowych, wytworzenie narzędzi CRISPR w wektorach lentiwirusowych, transdukcję komórek za pomocą różnych lentiwirusów oraz klonowanie komórek w celu wytworzenia jednorodnej edytowanej linii komórkowej.
Korzystając z tego protokołu, unieśmiertelnione ludzkie komórki mięśni szkieletowych zostały opracowane z delecją receptora ryanodine typu 1 (RyR1), niezbędnego kanału wapniowego biorącego udział w wewnątrzkomórkowym uwalnianiu wapnia i skurczu mięśni7. Nokaut (KO) genu został potwierdzony na poziomie białka za pomocą Western blot oraz na poziomie funkcjonalnym za pomocą obrazowania wapnia.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-CACNA1S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>Przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>CalPhos Zestaw do transfekcji ssaków</td><td>Takara</td><td>631312&nbsp;</td><td>Zestaw do transfekcji</td></tr><tr><td>Easy blot anty Mysia IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Easy blot anty IgG królika</td><td>GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>Przeciwciało drugorzędowe HRP</td></tr><tr><td>Fluo-4 bezpośrednie</td><td>sondy molekularne</td><td>F10472</td><td>Obrazowanie wapnia</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) Królik mAb&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>#2118</td><td>Przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>Zestaw do ligacji</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion High Fidelity z GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>Mix do reakcji PCR z polimerazą Taq o wysokiej wierności i przeciwciałem dNTP</td></tr><tr><td>przeciwko ciężkiemu łańcuchowi miozyny</td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>Przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&nbsp; 740424</td><td>Zestaw Maxipreparation do oczyszczania plazmidów</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952</td><td>Kit do ekstrakcji DNA z komórki</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Kompetentny chemicznie&nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>Chemicznie kompetentne komórki</td></tr><tr><td>Plazmid #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>Plazmid lentiwirusowy kodujący SpCas9 (dla LV-Cas9)</td></tr><tr><td>Plazmid #87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>Szkielet lentiwirusowy do wprowadzenia kasety z prowadnicami (dla celu LV)</td></tr> <tr><td>Plazmid #12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Plazmid lentiwirusowy kodujący opakowanie lentiwirusowe Plazmid GAG POL</td></tr><tr><td>#8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Białko otoczki kodujące plazmid lentiwirusowy do wytwarzania cząstek retrowirusowych lentiwirusowych i MuLV</td></tr><tr><td>V5 Tag Przeciwciało monoklonalne</td><td>Invitrogene</td><td>R96025&nbsp;</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>XL10-Gold Ultracompetent Cells</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>Chemicznie kompetentne komórki</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr></tbody></table>

rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów crispr/cas9 za pośrednictwem lentiwirusa

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

Jednym z ważnych zastosowań CRISPR/Cas 9 jest rozwój linii komórkowych knock-out, specjalnie do badania funkcji nowych genów/białek związanych z chorobą, zidentyfikowanych podczas diagnozy genetycznej. Aby opracować takie linie komórkowe, należy rozwiązać dwie główne kwestie: wprowadzenie narzędzi CRISPR (Cas9 i przewodnika RNA) z wysoką wydajnością do wybranych komórek oraz ograniczenie aktywności Cas9 do specyficznej delecji wybranego genu. Opisany tutaj protokół jest poświęcony wprowadzaniu narzędzi CRISPR do trudnych do transfekcji komórek, takich jak komórki mięśniowe. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu lentiwirusów, wytwarzanych z publicznie dostępnych plazmidów, dla których wszystkie etapy klonowania są opisane tak, aby były ukierunkowane na gen będący przedmiotem zainteresowania. Kontrola aktywności Cas9 została przeprowadzona za pomocą adaptacji wcześniej opisanego systemu o nazwie KamiCas9, w którym transdukcja komórek lentiwirusem kodującym przewodnikowe RNA ukierunkowane na Cas9 pozwala na stopniowe zniesienie ekspresji Cas9. Protokół ten został zastosowany do opracowania linii ludzkich komórek mięśniowych z nokautem RYR1, która została dodatkowo scharakteryzowana na poziomie białkowym i funkcjonalnym, aby potwierdzić nokaut tego ważnego kanału wapniowego zaangażowanego w wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia w mięśniach oraz w sprzężeniu wzbudzenie-skurcz. Opisana tutaj procedura może być łatwo zastosowana do innych genów w komórkach mięśniowych lub w innych trudnych do transfekcji komórkach i dostarczyć cennych narzędzi do badania tych genów w komórkach ludzkich.

Protokół ten zastosowano w przypadku unieruchomionych mioblastów od zdrowego dawcy15 (tzw. komórki HM, od ang. human myoblasts), w których wcześniej scharakteryzowano RyR116, w celu wywołania nokautu genu RYR1 kodującego białko RyR1. Projekt gRNA został opracowany tak, aby usunąć sekwencję obejmującą część eksonu 101 oraz intronu 101 tego genu. Przewiduje się, że delecja części eksonu 101 doprowadzi do przesunięcia ramki odczytu. Ponadto ekson 101 koduje por białka...

Protokół opisuje, jak generować nokautujące mioblasty za pomocą CRISPR/Cas9, zaczynając od projektowania przewodników RNA, aż po klonowanie komórkowe i charakterystykę klonów nokautujących.

Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Protokół ten pozwala na rozwój nokautu komórek mięśniowych w dowolnym genie, w celu dalszego badania funkcji tego genu w mięśniach. Zaletą jest to, że jest to tanie i szybsze niż rozwój zwierząt nokautujących do badania dowolnego genu. Technika ta może być wykorzystana na przykład do zbadania udziału nowo zidentyfikowanego genu w miopatii.Jeśli opisana tutaj technika zostanie zastosowana do komórek iPS, może to prowadzić do rozwoju komórek nokautujących dla dowolnego genu w dowolnym typie komórek. Aby rozpocząć grupowanie regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych lub delecji genów za pośrednictwem CRISPR, najpierw użyj narzędzi przeglądarki genomu, takich jak ensembl. org w celu identyfikacji docelowego genu wraz z sekwencjami DNA po obu jego stronach.Aby uzyskać listę eksonów genów, najpierw kliknij na transkrypcję sekwencji kodującej białko, a następnie na Eksony. Następnie kliknij Pobierz sekwencję i wybierz tylko sekwencję genomową, aby pobrać pełną sekwencję konsensusu całego genu. Przewiń listę eksonów i intronów genu, aby wybrać te docelowe.Aby zaprojektować przewodnik RNA, najpierw wybierz sekwencje nukleotydowe intronów bezpośrednio przed i za sekwencją docelową. Następnie przejdź do strony internetowej, takiej jak crispr.tefor. i wykorzystaj wybrane sekwencje do zaprojektowania dwóch przewodników RNA, każdy o długości 20 nukleotydów bez motywu sąsiadującego z protospacerem oddzielonego kilkuset parami zasad.Następnie określ odwrotną sekwencję dopełniacza dla każdego przewodnika RNA i uporządkuj startery. Aby skonstruować kasety przewodnika RNA do klonowania plazmidu, najpierw przeprowadź PCR z jednym zestawem starterów przy użyciu receptury i programu opisanego w tekście, a następnie oddziel produkty PCR w 1% żelu agarozowym za pomocą buforu Tris-borate-EDTA. Następnie wytnij fragment 300 par zasad i oczyść za pomocą zestawu.Podobnie, po przeprowadzeniu kolejnego PCR z innym zestawem starterów, oczyść fragment DNA o długości 400 par zasad do 20 mikrolitrów buforu elucyjnego. Aby wprowadzić kasety przewodnika RNA do szkieletu plazmidu lentiwirusowego, najpierw należy ustawić podwójną reakcję trawienia plazmidu z enzymami restrykcyjnymi Xma 1 i Blp 1, jak opisano w tekście. Po inkubacji probówki reakcyjnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, inkubować ją w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut, następnie uruchomić produkt trawienia w 1% żelu agarozowym i oczyścić plazmid z około 10 par kilozasad za pomocą odpowiedniego zestawu.Określ również ilościowo oczyszczony produkt, mierząc gęstość optyczną. Aby podwiązać kasetę przewodnika RNA z plazmidem, przygotuj mieszankę reakcyjną z oczyszczonym przewodnikiem RNA, zlinearyzowanym plazmidowym DNA, enzymem i wodą do końcowej objętości 10 mikrolitrów, a następnie inkubuj probówkę reakcyjną w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby wygenerować końcowy plazmid, zwany pGuide. Do produkcji lentiwirusa należy najpierw wysiać 145-centymetrową płytkę z 1 milionem komórek HEK 293 w DMEM z wysoką glukozą i pirogronianem uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną lub streptomycyną.Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Czwartego dnia sprawdź komórki, aby upewnić się, że 60 do 65% zbieżności. Następnie przygotuj roztwór do transfekcji składający się z interesującego nas plazmidu, plazmidu kodującego otoczkę wirusa, plazmidu pakującego lentiwirusa psPAX2 i fosforanu wapnia.Dostosuj końcową objętość do 1000 mikrolitrów z wodą. Następnie dodać roztwór do transfekcji kroplami do jednego mililitra 2X HBS pod mieszaniem i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut. Następnie dodaj roztwór kroplami do komórek.Aby uzyskać jednorodny rozkład roztworu do transfekcji, delikatnie przechyl płytkę we wszystkich kierunkach, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej pięć godzin. Następnie usuń pożywkę z płytek i umyj komórki PBS, aby pozbyć się odczynników do transfekcji, a następnie dodaj 12 mililitrów świeżej pożywki. Po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza zebrać pożywkę ze wszystkich płytek w probówce.Umieścić probówkę w szczelnie zamkniętym wiadrze i odwirować w temperaturze 800 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, następnie przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 mikrometra i odwirować filtrat w temperaturze 68, 300 razy G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, używając kołyszącego się wirnika kubełkowego. Po usunięciu supernatantu trzymaj probówki do góry nogami na ręczniku papierowym w komorze bezpieczeństwa przez pięć do 10 minut, aby maksymalnie usunąć płyn z granulek. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki proliferacyjnej HEC i utrzymuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny.Następnie ponownie zawiesić osad przez pipetowanie. Po zebraniu wszystkich zawieszonych granulek należy zrobić porcje 10 lub 25 mikrolitrów, a następnie przechowywać podwielokrotności w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza po błyskawicznym zamrożeniu w ciekłym wodorze. W przypadku transdukcji mioblastów należy najpierw zasiać każdą studzienkę 96-dołkowej płytki ze 100 mikrolitrami pożywki proliferacyjnej zawierającej 10 000 komórek mioblastów.Następnego dnia dodaj wstępnie obliczone objętości prowadnic nn i LV Cas9 do komórek w szafie bezpieczeństwa. Po pięciu dniach inkubacji uwolnij komórki ze studzienki, dodając trypsynę. Po zliczeniu numerów komórek przenieś komórki z dołków o zbiegu od 40 do 50% na nową płytkę.Po pięciu godzinach inkubacji dodać obliczone objętości LV killera przy wielokrotności infekcji 20 i inkubować przez pięć do 10 dni lub co najmniej dwa pasaże pomiędzy nimi. W celu funkcjonalnej charakterystyki klonów z edytowanym genem za pomocą obrazowania wapnia, umieść 50 000 komórek w środku pokrytej lamininą 35-milimetrowej naczynia. Aby wywołać różnicowanie, dodaj pożywkę różnicującą zgodnie z opisem w tekście.Po sześciu dniach inkubacji zdjąć pożywkę hodowlaną i nakreślić komórki za pomocą hydrofobowego pisaka. Następnie dodaj 50 mikrolitrów Fluo-4 Direct, rozcieńczonego jeden do jednego w pożywce różnicującej, do zróżnicowanych mioprobówek. Po inkubacji szalek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, umyj komórki dwukrotnie buforem Krebsa uzupełnionym jednym miligramem na mililitr glukozy.Następnie użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego z obiektywem 10X, aby zmierzyć zmiany fluorescencji z szybkością jednej klatki na sekundę przez 90 sekund i wybierz pole z co najmniej 10 rurkami mięśniowymi. Po usunięciu dodatkowego buforu Krebsa należy stymulować komórki dwoma mililitrami chlorku potasu w celu depolaryzacji błony lub dwoma mililitrami metakrezolu florochloralnego lub bezpośrednią stymulacją 4CmC lub RyR1. Wizualizuj zmienność fluorescencji po stymulacji, a następnie określ ilościowo zmianę fluorescencji w każdej rurki mięśniowej.Protokół ten może być z powodzeniem wykorzystany do wyeliminowania genu RyR1 z ludzkich mioblastów, co spowodowało skrócenie genomowego DNA w komórkach. Nokaut RyR1 został również potwierdzony na poziomie białka, ponieważ białko RyR1 nie mogło zostać wykryte w docelowych komórkach za pomocą Western blot. Brak aktywności RyR1 w miotubach zróżnicowanych z komórek nokautujących RyR1 został dodatkowo zweryfikowany za pomocą obrazowania wapnia Fluo-4 po bezpośredniej stymulacji RyR1 przez 4CmC lub pośredniej stymulacji przez depolaryzację błony wywołaną chlorkiem potasu.Sekwencja, która zostanie usunięta, powinna być wymagana do przewidywania funkcjonalnego białka. Technika ta idealnie nadaje się do opracowania narzędzi postgenomicznych do badania udziału nowego genu w chorobach mięśni.

development-knock-out-muscle-cell-lines-using-lentivirus-mediated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej modyfikacji pierwotnych lub rozszerzonych komórek NK (ang. human natural killer) za pomocą rybonukleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy ludzkie komórki NK z niedoborem receptora 2 czynnika wzrostu b (TGFBR2) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1).

Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

W miarę jak protokoły związane z CRISPR stają się coraz bardziej użyteczne i dostępne, w określonych warunkach eksperymentalnych nadal mogą pojawić się komplikacje i przeszkody. Protokół ten przedstawia w zarysie tworzenie wchodzącej w interakcję z receptorem ludzkiej linii komórkowej kinazy serynowo-treoninowej 1 (RIPK1/RIP1) przy użyciu CRISPR/Cas9 i podkreśla potencjalne wyzwania napotkane podczas tego procesu.

Generowanie linii komórkowej U937 z nokautem RIP1 przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Przedstawiono szczegóły dotyczące sposobu wykorzystania mapowania QTL z mapą genetyczną opartą na całej sekwencji genomu do identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii i jak można to zweryfikować za pomocą systemu CRISPR/Cas9, który skutecznie edytuje cel genomowy, w tym przypadku gen oporności na leki.

Mapowanie QTL i edycja CRISPR/Cas9 w celu identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii

Poznaj metodę tworzenia linii komórkowych mięśni z nokautem genowym przy użyciu CRISPR/Cas9 i lentiwirusa. Technika ta umożliwia szybszą i tańszą analizę funkcji genów niż tradycyjne modele zwierzęce.

Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa

Przeglądaj więcej filmów