Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa

Protokół ten pozwala na rozwój nokautu komórek mięśniowych w dowolnym genie, w celu dalszego badania funkcji tego genu w mięśniach. Zaletą jest to, że jest to tanie i szybsze niż rozwój zwierząt nokautujących do badania dowolnego genu. Technika ta może być wykorzystana na przykład do zbadania udziału nowo zidentyfikowanego genu w miopatii.

Jeśli opisana tutaj technika zostanie zastosowana do komórek iPS, może to prowadzić do rozwoju komórek nokautujących dla dowolnego genu w dowolnym typie komórek. Aby rozpocząć grupowanie regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych lub delecji genów za pośrednictwem CRISPR, najpierw użyj narzędzi przeglądarki genomu, takich jak ensembl. org w celu identyfikacji docelowego genu wraz z sekwencjami DNA po obu jego stronach.

Aby uzyskać listę eksonów genów, najpierw kliknij na transkrypcję sekwencji kodującej białko, a następnie na Eksony. Następnie kliknij Pobierz sekwencję i wybierz tylko sekwencję genomową, aby pobrać pełną sekwencję konsensusu całego genu. Przewiń listę eksonów i intronów genu, aby wybrać te docelowe.

Aby zaprojektować przewodnik RNA, najpierw wybierz sekwencje nukleotydowe intronów bezpośrednio przed i za sekwencją docelową. Następnie przejdź do strony internetowej, takiej jak crispr.tefor. i wykorzystaj wybrane sekwencje do zaprojektowania dwóch przewodników RNA, każdy o długości 20 nukleotydów bez motywu sąsiadującego z protospacerem oddzielonego kilkuset parami zasad.

Następnie określ odwrotną sekwencję dopełniacza dla każdego przewodnika RNA i uporządkuj startery. Aby skonstruować kasety przewodnika RNA do klonowania plazmidu, najpierw przeprowadź PCR z jednym zestawem starterów przy użyciu receptury i programu opisanego w tekście, a następnie oddziel produkty PCR w 1% żelu agarozowym za pomocą buforu Tris-borate-EDTA. Następnie wytnij fragment 300 par zasad i oczyść za pomocą zestawu.

Podobnie, po przeprowadzeniu kolejnego PCR z innym zestawem starterów, oczyść fragment DNA o długości 400 par zasad do 20 mikrolitrów buforu elucyjnego. Aby wprowadzić kasety przewodnika RNA do szkieletu plazmidu lentiwirusowego, najpierw należy ustawić podwójną reakcję trawienia plazmidu z enzymami restrykcyjnymi Xma 1 i Blp 1, jak opisano w tekście. Po inkubacji probówki reakcyjnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, inkubować ją w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut, następnie uruchomić produkt trawienia w 1% żelu agarozowym i oczyścić plazmid z około 10 par kilozasad za pomocą odpowiedniego zestawu.

Określ również ilościowo oczyszczony produkt, mierząc gęstość optyczną. Aby podwiązać kasetę przewodnika RNA z plazmidem, przygotuj mieszankę reakcyjną z oczyszczonym przewodnikiem RNA, zlinearyzowanym plazmidowym DNA, enzymem i wodą do końcowej objętości 10 mikrolitrów, a następnie inkubuj probówkę reakcyjną w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby wygenerować końcowy plazmid, zwany pGuide. Do produkcji lentiwirusa należy najpierw wysiać 145-centymetrową płytkę z 1 milionem komórek HEK 293 w DMEM z wysoką glukozą i pirogronianem uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną lub streptomycyną.

Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Czwartego dnia sprawdź komórki, aby upewnić się, że 60 do 65% zbieżności. Następnie przygotuj roztwór do transfekcji składający się z interesującego nas plazmidu, plazmidu kodującego otoczkę wirusa, plazmidu pakującego lentiwirusa psPAX2 i fosforanu wapnia.

Dostosuj końcową objętość do 1000 mikrolitrów z wodą. Następnie dodać roztwór do transfekcji kroplami do jednego mililitra 2X HBS pod mieszaniem i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut. Następnie dodaj roztwór kroplami do komórek.

Aby uzyskać jednorodny rozkład roztworu do transfekcji, delikatnie przechyl płytkę we wszystkich kierunkach, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej pięć godzin. Następnie usuń pożywkę z płytek i umyj komórki PBS, aby pozbyć się odczynników do transfekcji, a następnie dodaj 12 mililitrów świeżej pożywki. Po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza zebrać pożywkę ze wszystkich płytek w probówce.

Umieścić probówkę w szczelnie zamkniętym wiadrze i odwirować w temperaturze 800 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, następnie przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 mikrometra i odwirować filtrat w temperaturze 68, 300 razy G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, używając kołyszącego się wirnika kubełkowego. Po usunięciu supernatantu trzymaj probówki do góry nogami na ręczniku papierowym w komorze bezpieczeństwa przez pięć do 10 minut, aby maksymalnie usunąć płyn z granulek. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki proliferacyjnej HEC i utrzymuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny.

Następnie ponownie zawiesić osad przez pipetowanie. Po zebraniu wszystkich zawieszonych granulek należy zrobić porcje 10 lub 25 mikrolitrów, a następnie przechowywać podwielokrotności w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza po błyskawicznym zamrożeniu w ciekłym wodorze. W przypadku transdukcji mioblastów należy najpierw zasiać każdą studzienkę 96-dołkowej płytki ze 100 mikrolitrami pożywki proliferacyjnej zawierającej 10 000 komórek mioblastów.

Następnego dnia dodaj wstępnie obliczone objętości prowadnic nn i LV Cas9 do komórek w szafie bezpieczeństwa. Po pięciu dniach inkubacji uwolnij komórki ze studzienki, dodając trypsynę. Po zliczeniu numerów komórek przenieś komórki z dołków o zbiegu od 40 do 50% na nową płytkę.

Po pięciu godzinach inkubacji dodać obliczone objętości LV killera przy wielokrotności infekcji 20 i inkubować przez pięć do 10 dni lub co najmniej dwa pasaże pomiędzy nimi. W celu funkcjonalnej charakterystyki klonów z edytowanym genem za pomocą obrazowania wapnia, umieść 50 000 komórek w środku pokrytej lamininą 35-milimetrowej naczynia. Aby wywołać różnicowanie, dodaj pożywkę różnicującą zgodnie z opisem w tekście.

Po sześciu dniach inkubacji zdjąć pożywkę hodowlaną i nakreślić komórki za pomocą hydrofobowego pisaka. Następnie dodaj 50 mikrolitrów Fluo-4 Direct, rozcieńczonego jeden do jednego w pożywce różnicującej, do zróżnicowanych mioprobówek. Po inkubacji szalek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, umyj komórki dwukrotnie buforem Krebsa uzupełnionym jednym miligramem na mililitr glukozy.

Następnie użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego z obiektywem 10X, aby zmierzyć zmiany fluorescencji z szybkością jednej klatki na sekundę przez 90 sekund i wybierz pole z co najmniej 10 rurkami mięśniowymi. Po usunięciu dodatkowego buforu Krebsa należy stymulować komórki dwoma mililitrami chlorku potasu w celu depolaryzacji błony lub dwoma mililitrami metakrezolu florochloralnego lub bezpośrednią stymulacją 4CmC lub RyR1. Wizualizuj zmienność fluorescencji po stymulacji, a następnie określ ilościowo zmianę fluorescencji w każdej rurki mięśniowej.

Protokół ten może być z powodzeniem wykorzystany do wyeliminowania genu RyR1 z ludzkich mioblastów, co spowodowało skrócenie genomowego DNA w komórkach. Nokaut RyR1 został również potwierdzony na poziomie białka, ponieważ białko RyR1 nie mogło zostać wykryte w docelowych komórkach za pomocą Western blot. Brak aktywności RyR1 w miotubach zróżnicowanych z komórek nokautujących RyR1 został dodatkowo zweryfikowany za pomocą obrazowania wapnia Fluo-4 po bezpośredniej stymulacji RyR1 przez 4CmC lub pośredniej stymulacji przez depolaryzację błony wywołaną chlorkiem potasu.

Sekwencja, która zostanie usunięta, powinna być wymagana do przewidywania funkcjonalnego białka. Technika ta idealnie nadaje się do opracowania narzędzi postgenomicznych do badania udziału nowego genu w chorobach mięśni.