Głęboka obserwacja fluorescencji pędów ryżowych za pomocą technologii oczyszczania
27 czerwca 2022
Obecny protokół opisuje technikę oczyszczania pędów ryżu, które są trudne do przygotowania do wewnętrznych obserwacji strukturalnych ze względu na twardą, grubą lub warstwową naturę tkanek. Metoda ta ułatwia ciągłe i głębokie obserwacje fluorescencyjne, nawet u dorosłych roślin ryżu.
Metoda ta rozwiązuje problemy związane z obserwacją głębokiej fluorescencji pędów ryżu, takie jak ograniczona penetracja tkanki roztworu oczyszczającego i rzeczywista rozdzielczość pod mikroskopem konfokalnym. Główną zaletą tej techniki jest obserwacja struktury znacznie większych tkanek w skali makro, nawet w przypadku tkanek twardych i grubych, takich jak pędy dorosłe. Metoda ta ma zastosowanie do głębokiego obrazowania tkanek twardych i grubych u różnych gatunków roślin.
Może pomóc w przyspieszeniu odkrywania nowych zjawisk w badaniach biologicznych roślin. Na początek ostrożnie odetnij korzenie, nie uszkadzając roślin i umyj je wodą, aby usunąć brud. Teraz użyj pęsety, aby oderwać stare zewnętrzne liście.
Aby uniknąć zmiażdżenia komórek, użyj jednosiecznej brzytwy ruchem posuwnym, aby przeciąć tkankę od pędu, merystemu wierzchołkowego lub młodej wiechy do podstawy. Jeśli położenie merystemu wierzchołkowego pędu lub młodej wiechy nie jest widoczne, przytnij go dłużej. Pęd ryżu ma owalny przekrój
.Użyj obosiecznej maszynki do golenia, aby cienko ogolić jedną stronę owalu, w kierunku jego długiej osi. Potwierdź położenie merystema wierzchołkowego pędu lub młodej wiechy przez pojawienie się biało-białego koloru w próbce i odetnij nadmiar tkanki. Umieść próbkę w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej zawierającej jeden mililitr roztworu utrwalającego.
Wytnij kawałek folii parafinowej o powierzchni 2,5 centymetra kwadratowego i uformuj z niego kulkę. Teraz umieść te kulki na próbkach, aby zapobiec ich wypływaniu z roztworu utrwalającego. Umieścić probówkę zawierającą próbkę w eksykatorze.
Zamknij pokrywę eksykatora i uruchom pompę próżniową, aby powoli rozhermetyzować wnętrze eksykatora, aż do osiągnięcia ciśnienia minus 0,095 megapaskali . Po zamknięciu eksykatora na minus 0,095 megapaskali wyłącz pompę próżniową i pozostaw ją na 30 minut w temperaturze pokojowej. Lekko otwórz eksykator i powoli przywróć go do ciśnienia atmosferycznego.
Jeśli próbka jest prawidłowo zamocowana, zanurza się w roztworze utrwalającym. A jeśli nie zatonie, ponownie zmniejsz ciśnienie. Usuń folię parafinową.
Zamknij pokrywkę i trzymaj probówki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą niestrzępiących się chusteczek usuń nadmiar roztworu utrwalającego z próbki i utrwal próbkę na wibrującej tacy z mikrokrajalnicą za pomocą kleju błyskawicznego. Umieścić próbkę na tacy płaską stroną do dołu, która została ogolona podczas pobierania próbek, i ustawić warunki przycinania zgodnie z ustaloną próbką.
Wyreguluj pozycję próbki za pomocą przycisku do tyłu lub do przodu oraz przycisku w górę lub w dół i napełnij tacę wodą dejonizowaną, aż wszystkie próbki zostaną zanurzone. Po napełnieniu tacki naciśnij przycisk start i umieść przycięte próbki na szklanym szkiełku z kroplą PBS. Sprawdzić próbkę zawierającą miejsce docelowe pod mikroskopem stereoskopowym i przenieść przyciętą próbkę na płytkę wielodołkową z jednym mililitrem PBS.
Wyjąć PBS z płytki wielodołkowej. Dodaj świeży PBS i odstaw na minutę. Usuń PBS i dodaj CS. Umieścić płytkę wielodołkową zawierającą próbkę w eksykatorze i zamknąć pokrywę.
Następnie uruchom pompę próżniową, aby powoli rozhermetyzować wnętrze eksykatora do minus 0,09 megapaskala. Po zamknięciu eksykatora przy minus 0,09 megapaskali należy wyłączyć pompę próżniową i odstawić na godzinę w temperaturze pokojowej. Lekko otwórz eksykator i powoli przywróć go do ciśnienia atmosferycznego.
Wlej wodę dejonizowaną do szczeliny między studzienkami, aby zapobiec parowaniu CS i przechowuj płytki wielodołkowe w temperaturze pokojowej w ciemności w celu oczyszczenia. Gdy CS zmieni kolor na zielony, zastąp go świeżym roztworem. Nieprzycięte próbki pozostały zielone i nie stały się przezroczyste po trzech miesiącach leczenia, przy czym próbki CS.In, które zostały oderwane od wszystkich liści, stały się białe po tygodniu, chociaż węzły pozostały zielone.
Próbka nie stała się przezroczysta po czterech tygodniach. Ręcznie przycięte próbki stały się białe po tygodniu leczenia CS, ale nie stały się przezroczyste po czterech tygodniach. Próbki przycięte do grubości 130 mikrometrów stały się przezroczyste po tygodniu leczenia CS.
Po dwóch tygodniach próbka była prawie przezroczysta. W węźle obserwowalna głębokość po tygodniu leczenia CS wynosiła minus 60 mikrometrów i minus 90 mikrometrów po dwóch tygodniach. Sygnały fluorescencyjne obserwowano na głębokości minus 80 mikrometrów po trzech tygodniach i na głębokości minus 100 mikrometrów po czterech tygodniach.
W międzywęźlu sygnały fluorescencyjne obserwowano na głębokości minus 60 mikrometrów bez leczenia CS. Obserwowalna głębokość wynosiła minus 90 mikrometrów po tygodniu do trzech tygodni leczenia CS i minus 100 mikrometrów po czterech tygodniach. W liściach sygnały fluorescencyjne zaobserwowano na głębokości minus 90 mikrometrów bez leczenia CS, ale jasność była słabsza niż w innych tkankach.
Po tygodniu sygnały były jaśniejsze i obserwowane na głębokości minus 120 mikrometrów. Ekspresję czynnika transkrypcyjnego OS MASU 15 mOrange obserwowano u młodych wiechowców, liści, węzłów, międzywęźli i fleurette. Kluczem jest znalezienie najlepszych warunków dla roślin lub tkanek, na przykład okresu i podciśnienia lub pozycji i obróbki CS, czasu, grubości, prędkości i odpowiedniego roztworu do barwienia.
Połączenie technologii pomiaru czasu i utwardzania umożliwia przestrzenną obserwację czasową wzorca ekspresji genów i komunikacji międzykomórkowej w wielu tkankach jednego odcinka.
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia nową technikę klarowania pędów ryżu, która pozwala pokonać trudności w głębokiej obserwacji fluorescencyjnej, szczególnie w roślinach dorosłych o twardej strukturze tkanek. Protokół ten usprawnia obrazowanie tkanek poprzez umożliwienie ciągłych obserwacji fluorescencyjnych, co ułatwia lepsze zrozumienie struktur wewnętrznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia roślin
- Techniki obrazowania tkanek
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Tradycyjne metody napotykają ograniczenia w obserwacji wewnętrznej struktury pędów ryżu.
- Ta konkretna technika rozwiązuje problemy związane z penetracją tkanek i rozdzielczością w mikroskopii konfokalnej.
- Zrozumienie wewnętrznej struktury umożliwia nowe odkrycia w biologii roślin.
Zastosowane metody
- Opracowano systematyczne podejście do przygotowania pędów ryżu, obejmujące protokoły starannego cięcia i fiksacji.
- Skupiono się na dorosłych roślinach ryżu, aby umożliwić głębokie obrazowanie twardych tkanek.
- Wykorzystano ciśnienie próżniowe oraz roztwory do przejaśniania w celu zwiększenia widoczności i głębokości sygnału fluorescencyjnego.
Główne wyniki
- Określono optymalną grubość przycięcia i warunki niezbędne do uzyskania przejrzystości w próbkach pędów ryżu.
- Wykazano możliwość skutecznej obserwacji sygnałów fluorescencyjnych na określonych głębokościach w różnych odstępach czasu.
- Opracowano zależność między przygotowaniem próbki a intensywnością sygnału fluorescencji.
Wnioski
- Technika ta pozwala na lepszą wizualizację wewnętrznych struktur roślin oraz ekspresji genów w różnych tkankach.
- Ma ona istotne znaczenie dla rozwoju badań w dziedzinie biologii roślin oraz zrozumienia złożonych procesów biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Głęboka obserwacja fluorescencyjna pędów ryżu z wykorzystaniem zoptymalizowanej technologii przejaśniania rozwiązuje krytyczny problem w obrazowaniu tkanek roślinnych, umożliwiając wysokorozdzielczą, trójwymiarową wizualizację struktur wewnętrznych w tkankach twardych i grubych. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad ekspresją genów i wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego na wczesnych etapach odkryć oraz walidacji celów. Podejście to jest istotne dla zespołów badawczo-rozwojowych poszukujących niezawodnych i skalowalnych procesów obrazowania złożonych systemów roślinnych oraz badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mapowanie czasowo-przestrzenne ekspresji genów na różnych etapach rozwoju tkanek roślinnych.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów genetycznych poprzez wizualizację ekspresji reportera in situ.
- Ułatwia analizę mechanizmów poprzez wyjaśnianie tkankowo specyficznych wzorców ekspresji.
Przesiew i opracowywanie testów
- Przygotowuje standaryzowane, przezroczyste przekroje tkanek odpowiednie do ilościowych analiz fluorescencyjnych.
- Poprawia powtarzalność i porównywalność wyników obrazowania pomiędzy próbkami.
- Umożliwia skalowalne procesy obrazowania w ramach wysokoprzepustowego screeningu fenotypów roślin.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność wyników obrazowania z odkrywaniem translacyjnych biomarkerów w systemach roślinnych.
- Wspiera ciągłość procesu od wczesnego etapu odkryć po przedkliniczną walidację funkcji genów.
- Przynosi wartość prognostyczną dla późniejszego doboru cech oraz badań nad ulepszaniem roślin uprawnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół przejaśniania wpisuje się w ciąg procesów badawczych – od wczesnego testowania hipotez po walidację przedkliniczną – wspierając zarówno identyfikację celów, jak i genomikę funkcjonalną w badaniach i rozwoju roślin.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących ekspresji genów i architektury tkanek.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników obrazowania do analizy porównawczej.
- Analityka: Zapewnia pomiary fluorescencji z rozdzielczością głębokości w celu wsparcia oceny statystycznej warunków doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z fazą przedkliniczną, umożliwiając dopasowanie biomarkerów w złożonych tkankach.
- Zastosowania szerokie: Oferuje szeroko stosowalną możliwość obrazowania dla różnorodnych gatunków roślin i typów tkanek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność w badaniach nad funkcjami genów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie tkanek i obrazowanie w celu stworzenia skalowalnych i powtarzalnych schematów postępowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz alokację zasobów w procesach badawczo-rozwojowych w dziedzinie roślin.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów genetycznych i cech fenotypowych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu przekrojów tkanek, ich utrwalaniu oraz w mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do wibracyjnych mikrotomów, systemów próżniowych oraz platform do obrazowania konfokalnego.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania próbek i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych gatunków roślin lub typów tkanek posiadających specyficzne bariery strukturalne.
- Efektywność klarowania oraz głębokość obrazowania zależą od grubości tkanki, penetracji roztworu klarującego oraz czasu trwania zabiegu.
