Obrazowanie transportu komórek za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej: metoda znakowania radioaktywnego komórek

Protokół ten opisuje krokową metodę znakowania radioaktywnego komórek i cyrkonu-89-DBN oraz jego nieinwazyjne śledzenie przez PET. Technika ta zapewnia również niezawodną i stabilną metodę znakowania radioaktywnego komórek poprzez kowalencyjną koniugację cyrkonu-89-DBN z podstawowymi środkami białek powierzchniowych komórki. Lekarze i naukowcy zajmujący się terapiami komórkowymi w chorobach neurologicznych i różnych nowotworach uznają ten protokół za kluczowy w zrozumieniu farmakokinetyki terapii komórkowych za pomocą nieinwazyjnego obrazowania PET.

Szczegółowy protokół zawiera wskazówki dla nowych użytkowników, aby nauczyć się i przyjąć tę technikę znakowania radioaktywnego. Dodatkowe węzły uwzględnione w krytycznych krokach pomogą w rozwiązywaniu problemów dla nowego użytkownika. Na początek przygotuj kolumnę z około 100 miligramami żywicy hydroksaminowej i aktywuj ją, przemywając kolumnę ośmioma mililitrami czystego bezwodnego acetonitrylu, a następnie przepłucz pięcioma do sześciu mililitrami powietrza.

Przepuścić dwa mililitry 0,5 normalnego kwasu solnego do kolumny. Po przejściu dodatkowego płukania pięcioma do sześciu mililitrów powietrza, powoli załaduj roztwór zawierający zarówno cyrkon-89, jak i naturalny itr do żywicy hydroksamatowej. Umyj niezwiązany naturalny itr z żywicy hydroksamianowej 20 mililitrami dwóch normalnych kwasów solnych, a następnie 10 mililitrami wody dejonizowanej.

W celu uniknięcia cyrkonu w postaci wodorofosforanu cyrkonu-89 dodać 0,5 mililitra 1,2-molowego buforu diwodorofosforanu dipotasowego do kolumny i pozostawić go na kolumnie przez 30 minut. Dodaj dodatkowe 1,5 mililitra buforu 1,2 molowego, aby wymyć cyrkon z kolumny. Następnie weź około 120 mikrolitrów wodorofosforanu cyrkonu-89 sformułowanego w buforze i zneutralizuj roztwór za pomocą HEPES-KOH i węglanu potasu, aby osiągnąć pH 7,528.

Dodaj cztery mikrolitry świeżo przygotowanego pięciomilimolowego DFO-Bn-NCS do około 285 mikrolitrów zobojętnionego wodorofosforanu cyrkonu-89. I wymieszać roztwór, pipetując. Po wyizolowaniu cyrkonu z itru dodaj 0,5 mililitra jednego molowego kwasu szczawiowego do kolumny i pozostaw go na kolumnie przez jedną minutę, aby wymyć cyrkon w postaci szczawianu cyrkonu-89.

Dodaj dodatkowe 2,5 mililitra jednego molowego kwasu szczawiowego do kolumny. Aby przekształcić szczawian cyrkonu-89 w chlorek cyrkonu-89, przemyj kolumnę anionowymienną sześcioma mililitrami acetonitrylu, a następnie przepłucz pięcioma do sześciu mililitrami powietrza. Następnie umyj kolumnę 10 mililitrami soli fizjologicznej, a następnie ponownie przepłucz powietrzem.

Powoli załaduj roztwór zawierający szczawian cyrkonu-89 do aktywowanej kolumny wymieniacza anionowego przed ponownym przemyciem jej powietrzem. Następnie umyj kolumnę 50 mililitrami dejonizowanej wody, aby usunąć niezwiązany jon szczawianowy. W celu uniknięcia cyrkonu w postaci chlorku cyrkonu-89 dodaj 0,1 mililitra jednego normalnego kwasu solnego do kolumny i pozostaw go na kolumnie przez jedną minutę.

Eluować cyrkon z kolumny za pomocą dodatkowych 0,4 mililitra jednego normalnego kwasu solnego. Wysuszyć wypłukany chlorek cyrkonu-89 w fiolce w kształcie litery V, umieszczając ją w bloku grzewczym w temperaturze 65 stopni Celsjusza pod stałym przepływem azotu przez 10 do 30 minut, a następnie rozpuść wysuszony chlorek cyrkonu-89 w wodzie. Przygotuj 500 mikrolitrów zawiesiny komórkowej z około 6 milionami komórek w 500 mikrolitrach HBSS buforowanego przez HEPES w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej i dodaj około 100 mikrolitrów sformułowanego cyrkonu-89-DBN.

Wymieszaj cyrkon-89-DBN i zawiesinę komórek, delikatnie pipetując roztwór w górę iw dół za pomocą mikropipety. Inkubować komórki i mieszaninę cyrkonu-89-DBN na wytrząsarce z prędkością około 550 obr./min w temperaturze od 25 do 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut w celu znakowania komórek. Przeprowadzić radioaktywną TLC w reakcji znakowania radioaktywnego komórki przy użyciu świeżo przygotowanego radioaktywnego rozpuszczalnika TLC.

Oblicz procent radioaktywności przy Rf równym 0,01 do 0,02, korzystając z równania pokazanego na ekranie. W oddzielnej mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra wymieszaj około 100 mikrolitrów sformułowanego cyrkonu-89-DBN z około 500 mikrolitrami buforowanego przez HEPES HBSS, aby użyć go jako kontroli bez komórek do korekcji tła. Oblicz procent radioaktywności przy Rf równym 0,01 do 0,02, korzystając z równania pokazanego na ekranie, a następnie oblicz efektywne znakowanie radiokomórkowe, odejmując dwie obliczone wartości procentowe radioaktywności.

Po potwierdzeniu zakończenia znakowania radioizotopowego dodać 600 mikrolitrów schłodzonej, kompletnej pożywki odpowiedniej dla komórek, aby przeprowadzić wygaszanie reakcji znakowania radioaktywnego. Odwiruj komórki w temperaturze 96G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. I wyrzuć supernatant.

Delikatnie zawiesić granulowane komórki w 500 mikrolitrach schłodzonego podłoża, pipetując pożywkę w górę iw dół za pomocą mikropipety. Odwirować komórki w temperaturze 96G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant. Następnie oblicz końcową skuteczność znakowania radioizotopowego po wszystkich praniach, korzystając z równania pokazanego na ekranie.

W celu zapewnienia jakości komórek znakowanych radioizotopowo, należy przeprowadzić wzrokową kontrolę końcowej zawiesiny komórek znakowanych radioizotopem, a jeśli nie ma żadnych grudek, przeprowadzić test żywotności na wykluczenie błękitu trypanowego przy użyciu 0,4% roztworu błękitu trypanowego przygotowanego w PBS w ciągu jednej godziny od znakowania radioizotopem i etapów mycia. Skuteczność chelatacji DFO-Bn-NCS dla cyrkonu-89 przy użyciu wodorofosforanu cyrkonu-89 i chlorku cyrkonu-89 jest różna w zależności od miary radioaktywnej TLC. Pokazano tutaj stabilność różnych komórek znakowanych radioaktywnie cyrkonem-89 w ciągu siedmiu dni.

Stwierdzono, że zatrzymywanie radioaktywności cyrkonu-89 przez komórki znakowane radioaktywnie jest stabilne we wszystkich badanych komórkach, z nieznacznym wypływem obserwowanym w ciągu siedmiu dni po znakowaniu. Skuteczność znakowania radioaktywnego komórek w różnych typach komórek za pomocą cyrkonu-89-DBN przedstawiono w tej tabeli. Skuteczność znakowania radioizotopowego komórek waha się od 20 do 50% jako nieskorygowana wydajność obserwowana w znakowanej radioizotopowo osadce komórkowej po umyciu.

Najważniejszym etapem tego protokołu jest dodanie DFO-Bn-NCS do mieszaniny chelatacyjnej i ocena jakości komórek znakowanych radioizotopem. Zastosowanie tej techniki pomoże zrozumieć farmakokinetykę terapii komórkowych. Rodziłoby to również pytania o jakąkolwiek kliniczną potrzebę zmiany profilu klirensu terapii komórkowych.