Ustandaryzowane przygotowanie pierścienia wieńcowego u szczurów i rejestracja w czasie rzeczywistym dynamicznych zmian napięcia wzdłuż średnicy naczynia

Protokół ten szczegółowo przedstawia lokalizację, separację i utrwalenie pierścienia mięśniowego tętnic wieńcowych szczura. Zapewnienie nowej metody mechanizmów, eksploracji i leczenia różnych chorób sercowo-naczyniowych. System nadaje się do stabilnego rejestrowania dynamicznych zmian napięcia tętniczego in vitro, odczytując średnicę od 60 mikrometrów do 10 milimetrów.

Sugerujemy, aby nowicjusze najpierw dokładnie zrozumieli anatomiczne położenie każdego naczynia i mogli zacząć od nieco większego naczynia, takiego jak tętnica piersiowa i tętnica krezkowa. Po dysocjacji i usunięciu serca zacznij od spuszczenia pozostałej krwi ze wszystkich komór serca, delikatnie ściskając medycznymi kleszczami z tworzywa sztucznego. Szybko umieść wstępnie przetworzone serce na szalce Petriego zawierającej 95% tlenu i 5% nasyconego dwutlenkiem węgla roztworu soli fizjologicznej o temperaturze czterech stopni Celsjusza, o wartości pH 7,40.

Aby dokładnie określić anatomiczne położenie tętnic wieńcowych, dostosuj postawę izolowanego serca pod mikroskopem świetlnym zgodnie ze schematem ideowym. Wytnij lewą i prawą jamę komorową wzdłuż przegrody międzykomorowej od nasady tętnicy płucnej za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety. Aby oddzielić lewą i prawą tętnicę wieńcową od tkanki mięśnia sercowego, należy rozciąć prawą komorę pod optycznym mikroskopem anatomicznym, aby dokładnie odsłonić prawą gałąź tętnicy wieńcowej.

Następnie określ położenie lewej tętnicy wieńcowej, obracając tkankę serca o 45 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Po usunięciu otaczającej lepkiej tkanki mięśnia sercowego wyraźnie rozróżnij pulsującą lewą i prawą tętnicę wieńcową. Natychmiast oddziel tętnice wieńcowe na środku i całkowicie zanurz w fizjologicznym roztworze soli o temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Uzyskaj pierścień tętniczy o długości około dwóch milimetrów, przecinając pionowo odłączoną tętnicę anatomicznymi nożyczkami, aby zarejestrować napięcie naczyniowe pod wpływem różnych bodźców. Przygotuj dwa dwucentymetrowe druty ze stali nierdzewnej i wstępnie zanurz w roztworze soli fizjologicznej o temperaturze czterech stopni Celsjusza nasyconym 95% tlenu i 5% dwutlenkiem węgla. Przeprowadź oba druty równolegle przez pierścień tętniczy zgodnie z kierunkiem naczynia pod optycznym mikroskopem anatomicznym i z drutami o równej długości odsłoniętymi na obu końcach jamy naczyniowej.

Zamocuj pierścień tętniczy za pomocą drutu stalowego z przodu iz tyłu w kąpieli mikrofotografii drucianej wypełnionej bulgoczącym roztworem soli fizjologicznej z 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla. Obróć poziome pokrętło, aby uzyskać odpowiedni odstęp z przodu i z tyłu, tak aby oba przewody były poziome, a pierścień tętniczy znajdował się w naturalnym stanie relaksu. Po zainstalowaniu kąpieli DMT na aparacie termostatycznym należy otworzyć oprogramowanie do akwizycji danych, aby upewnić się, że zarejestrowano odpowiedni sygnał ścieżki.

Ustaw parametry. Osiągnij optymalne napięcie początkowe pierścienia tętniczego, stosując rozsądne napięcie wzdłuż średnicy naczynia. W tym momencie ustaw wyświetlaną wartość napięcia naczyniowego na zero.

Następnie zastosuj bodziec impulsowy o sile trzech miliniutonów do pierścienia tętniczego, obracając oś spiralną wanny. Kliknij panel LCD, aby ustawić go na zero miliniutonów i utrzymać przez jedną godzinę. Po inkubacji przez godzinę w nasyconym tlenem buforze roztworu soli fizjologicznej o pH 37 stopni Celsjusza 7,40, ponownie ustaw wartość naprężenia na zero miliniutonów na panelu sterowania napięciem mikrografu drutu.

Wykonaj aktywność skurczową pierścienia tętnicy wieńcowej za pomocą techniki miografu drucianego i zwaliduj w trzech oddzielnych operacjach, stymulując 60 milimolami roztworu jonów potasu przez 10 minut każda. Po każdej stymulacji należy przepłukać kąpiel nasyconym tlenem roztworem soli fizjologicznej, aż napięcie naczyniowe powróci do stanu początkowego. Dodać 0,3 mikromola U46619 do kąpieli i obserwować przez 10 minut.

Dodaj jedną apigeninę mikromolową i obserwuj efekty naczyniowe. Gdy rozwarcie osiągnie plateau, dodaj następne stężenie. Dodaj jedną apigeninę mikromolową do 60-milimolowego roztworu wstępnego obkurczania potasu, aby zaobserwować efekt naczyniowy.

Gdy rozwarcie osiągnie plateau, dodaj następne stężenie. Dodaj 28 milimolowy jon potasu do spoczynkowego pierścienia naczyniowego. Gdy skurcz osiągnie plateau, dodaj następne stężenie.

Dodać 0,01 mikromola U46619 do spoczynkowego pierścienia naczyniowego. Gdy skurcz osiągnie plateau, dodaj następne stężenie. Po przyłożeniu początkowego napięcia o wartości trzech miliniutonów do pierścienia tętniczego, jego napięcie przekroczyło ponad dwa miliniutony poprzez trzykrotne przyłożenie równolegle 60-milimolowego stężenia jonów potasu

W ten sposób powyższe procedury doprowadziły do powstania izolowanego pierścienia wieńcowego o doskonałej aktywności fizjologicznej. Skumulowane stężenie jonów potasu lub U46619 dodano do kąpieli DMT620M, co spowodowało zależny od stężenia wzrost napięcia naczyniowego in vitro. Następne stężenie jonu potasu lub U46619 dodawano, gdy efekt zwężenia naczyń krwionośnych osiągnął plateau.

W przypadku izolowanych pierścieni wieńcowych zwężonych przez jon potasu i U46619, badany lek apigenina powodował rozszerzenie naczyń krwionośnych w zaskakująco zależny od stężenia. Serce jest preparowane wzdłuż przegrody komorowej od nasady tętnicy płucnej, odsłaniając i oddzielając dwumilimetrowy pierścień mięśniowy naczyń wieńcowych. Po tym zabiegu możemy zarejestrować napięcie naczyniowe w mikronaczyniach siatkówki, funkcji nerek, tętnicy nerkowej oraz w tętnicy środkowej mózgu.

Dynamika obszaru od 60 mikrometrów do 10 milimetrów.