Name: Budowa modelu narządów na chipie komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty do rekapitulacji naprężeń biomechanicznych w ścianie aorty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Poznaj budowę modelu organ-on-a-chip z komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty do symulacji naprężeń biomechanicznych. Ta metoda umożliwia badania chorób aorty i personalizowaną medycynę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy przyznają, że ta praca była wspierana przez granty Komisji Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (20ZR1411700), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81771971) oraz Shanghai Sailing Program (22YF1406600).

Ludzkie próbki aorty zostały wykorzystane do pierwotnej izolacji HASMC za zgodą Szpitala Zhongshan, Komisji Etyki Uniwersytetu Fudan (nr B2020-158). Próbki aorty pobrano od pacjentów, którzy przeszli operację aorty wstępującej w szpitalu Zhongshan na Uniwersytecie Fudan. Przed udziałem w badaniu uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich pacjentów.
1. Pierwotna izolacja komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty
<ol>
	<li>Umyj prawą boczną część aorty wstępującej sterylnym PBS, 1x-2x.</li>
	<li>Usuń warstwy błony wewnętrznej i przydanki tkanki za pomocą dwóch kleszczy okulistycznych i zachowaj warstwę pożywki, aby pobrać komórki.</li>
	<li>Warstwę pożywki ułożyć na 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym i pokroić nożyczkami na małe kawałki (2-3 mm). Dodać 5 ml pożywki do hodowli komórek mięśni gładkich (SMCM) zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Przenieś małą tkankę do butelki hodowlanej za pomocą sterylnego zakraplacza, równomiernie rozprowadzając tkankę. Wyrzuć pożywkę hodowlaną tak bardzo, jak to możliwe, a następnie odwróć butelkę do góry nogami.</li>
	<li>Dodać 2 ml SMCM do odwróconej butelki hodowlanej i umieścić ją w inkubatorze (5% CO2 ) w temperaturze 37 °C na 1-2 godziny, a następnie powoli obrócić prawą stroną do góry i dodać kolejne 2 ml SMCM.</li>
	<li>Po 5-7 dniach inkubacji wymień SMCM na 4 ml świeżego SMCM. Ogólnie rzecz biorąc, sporadyczne komórki mięśni gładkich wydostają się w ciągu około 2 tygodni.</li>
	<li>Powoli wyrzuć SMCM i dodawaj go powoli podczas zmiany podłoża. Transportuj butelkę z kulturą powoli podczas przenoszenia do stacji mikroskopowej; W przeciwnym razie tkanki będą unosić się na wodzie, a komórki będą rosły powoli.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną około 80% zbieżności, przemyj 2 ml PBS, strawij 2 ml 0,25% trypsyny i podziel je na dwie nowe butelki hodowlane z 4 ml świeżego SMCM.</li>
	<li>Zidentyfikuj komórki za pomocą analizy immunofluorescencyjnej czterech różnych specyficznych markerów dla komórek mięśni gładkich (CNN1, SM22)14.</li>
</ol>
2. Przygotowanie układu PDMS
<ol>
	<li>Aby polimeryzować PDMS, dodać utwardzacz (składnik B) do zasady (składnik A) w stosunku wagowym A: B = 10:1 w/w i całkowicie mieszać kompleks przez 5 minut; objętość zależy od potrzeby badania.</li>
	<li>Przygotowany żel PDMS umieścić w próżniowym zbiorniku ekstrakcyjnym na 30-60 minut i utrzymać ciśnienie poniżej -0,8 mPa. 
	UWAGA: Wysokie ciśnienie doprowadzi do niewystarczającej ekstrakcji małych pęcherzyków wewnątrz żelu PDMS, co wpłynie na następny etap produkcji chipa.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), zaprojektuj formę z zewnętrzną konstrukcją ramy 100 mm × 40 mm × 8 mm oraz kanałem 70 mm × 6 mm × 4 mm.</li>
	<li>Wykonaj na zamówienie formy trzech warstw za pomocą precyzyjnej komputerowej maszyny do grawerowania sterowanego numerycznie. Wytnij ramę form i mikrokanalików za pomocą płytek z polimetakrylanu metylu (PMMA), a następnie przyklej je do innej płyty PMMA.</li>
	<li>Tak przygotowany żel PDMS wylać na formę z ramką zewnętrzną 100 mm × 40 mm × 6 mm i kanałem 70 mm × 6 mm × 4 mm, a następnie usieciować w temperaturze 70 °C przez 1-2 h.</li>
	<li>Oderwij usieciowane płyty PDMS od formy i pokrój skomercjalizowane membrany PDMS na odcinki 100 mm × 40 mm.</li>
	<li>Trzy przygotowane płyty PDMS i dwie membrany PDMS należy traktować plazmą tlenową przez 5 minut w celu aktywacji powierzchni PDMS. Zastosuj następujące ustawienia: powietrze w pomieszczeniu jako gaz procesowy; ciśnienie ustawione na -100 kPa; prąd ustawiony na 180--200 Ma; napięcie ustawione na 200 V; czas procesu do 5 min.</li>
	<li>Przebij otwory w trzech płytach PDMS za pomocą dziurkacza o średnicy 1 mm, aby wykonać wlot i wylot powietrza i średnich mikrokanałów na chipie PDMS.</li>
	<li>Połącz ze sobą trzy płyty PDMS i dwie membrany PDMS w kolejności: płyta PDMS kanału powietrznego (warstwa górna) - membrana PDMS - płyta PDMS średniokanałowa (warstwa środkowa) - membrana PDMS - płyta PDMS kanałowa (warstwa dolna). Wykonaj ten krok pod mikroskopem stereoskopowym przy 4x, aby całkowicie nałożyć mikrokanaliki powietrzne na mikrokanały średnie.</li>
	<li>Umieść zmontowany chip PDMS w inkubatorze o temperaturze 70 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Przygotuj kilka węży lateksowych o średnicy wewnętrznej 1 mm i długości 3 cm. Włóż igłę ze stali nierdzewnej o średnicy zewnętrznej 1 mm i długości 1 cm do jednego końca przygotowanego węża, a następnie włóż Luer do drugiego końca węża, aby utworzyć rurkę podłączoną do mikrokanalików powietrznych i średnich chipa PDMS.</li>
	<li>Włóż przygotowane rurki do wylotów i wlotów mikrokanalików powietrza i medium na chipie PDMS.</li>
</ol>
3. Obróbka powierzchni chipów PDMS i sterylizacja
<ol>
	<li>Wlej 2 ml kolagenu myszy o stężeniu 80 mg/ml do pożywki mikrokanałowej chipa PDMS za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Po inkubacji usuń kolagen z kanału i odzyskaj za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml. Umieść na noc pokryte kolagenem chipsy PDMS w inkubatorze o temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Umieść chipy PDMS w sterylizatorze UV na dłużej niż 1 godzinę. Umieść wysterylizowane chipy PDMS na ultraczystej ławce w ramach przygotowań do eksperymentu z komórkami.</li>
</ol>
4. Rozsiewanie komórek na chipie PDMS i proces rozciągania komórek
<ol>
	<li>Posiew 4 x 105 pierwotnych ludzkich komórek mięśni gładkich (HASMC) od pacjentów przy użyciu pożywki z komórek mięśni gładkich (SMCM) zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Gdy gęstość HASMC osiągnie 80%, wyrzuć SMCM i umyj komórki 2 ml PBS.</li>
	<li>Trawić komórki za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny przez 2 minuty i wirować przy 100 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml świeżego SMCM. Użyj 8 ml SMCM do hodowli komórek na 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym.</li>
	<li>Oblicz liczbę komórek za pomocą cytometru i użyj komórek w końcowym stężeniu 2 x 105 komórek/ml.</li>
	<li>Powoli wlej 2 ml PBS do pokrytego kolagenem i wysterylizowanego mikrokanalika z chipem PDMS, a następnie wyrzuć za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Powoli wlej łącznie 2 ml zawiesiny HASMC 2 x 105 komórek/ml do średniego mikrokanału chipa PDMS za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml. Następnie zamknij Luer na wejściu i wyjściu chipa PDMS. Umieścić chip PDMS w inkubatorze (5% CO2 ) w temperaturze 37 °C na 1 dzień.</li>
	<li>Po podłączeniu ogniw do membrany PDMS w chipie PDMS, prawie po 24 godzinach, podłącz wylot mikrokanału powietrza na chipie PDMS do systemu sterownika podciśnienia. Kiedy komórka jest przyczepiona, pod mikroskopem można zobaczyć wydłużoną, normalną formę komórkową, kontrastującą z zawieszonymi okrągłymi komórkami.</li>
	<li>Włącz zawór elektromagnetyczny i pompę próżniową. Otwórz regulator podciśnienia i ustaw poziom ciśnienia na 10 kPa dla 7,18 ± 0,44% odkształcenia i 15 kPa dla 17,28 ± 0,91% odkształcenia.</li>
	<li>Po ustawieniu parametrów układu sterowania umieścić chipy PDMS w inkubatorze (5% CO2) w temperaturze 37 °C i rozciągać przez 24 godziny.</li>
</ol>
5. Przygotowanie mechanicznego systemu sterowania
<ol>
	<li>Przygotuj kilka zaworów elektromagnetycznych, filtrów próżniowych, regulatorów podciśnienia, pompy próżniowej, pompy perystaltycznej i programowalnego sterownika logicznego (PLC) sterującego zaworem elektromagnetycznym.</li>
	<li>Zaprogramuj sterownik PLC i ustaw interwał czasu włączenia/wyłączenia na 1 Hz. Podłącz zawory elektromagnetyczne do zaprogramowanego sterownika.</li>
	<li>Podłącz wlot pompy próżniowej do filtrów próżniowych, a następnie podłącz wylot filtrów próżniowych do regulatorów podciśnienia. Podłącz wylot regulatorów podciśnienia do zaworów elektromagnetycznych, a na koniec podłącz wylot zaworów elektromagnetycznych do wylotów mikrokanałów powietrznych chipów PDMS.</li>
	<li>Podłączyć wylot pompy perystaltycznej do wlotu średniego mikrokanału chipa PDMS, a wlot pompy perystaltycznej do wylotu średniego mikrokanałowego chipa PDMS w celu wymiany pożywki hodowlanej i obchodzenia się z lekiem.</li>
	<li>Dostosuj amplitudę odkształcenia za pomocą regulatora i częstotliwość odkształcenia za pomocą mikrokontrolera.</li>
</ol>

<ol><li>Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection%3A+increasing+prevalence+and+improved+outcomes+reported+in+a+nationwide+population-based+study+of+more+than+14%2C000+cases+from+1987+to+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002.</a> Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).</li>
<li>van Varik, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+arterial+remodeling%3A+lessons+from+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases.</a> Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).</li>
<li>Halka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+stretch+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro.</a> Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+wall+stress+induces+phenotypic+switching+of+arterial+smooth+muscle+cells+in+vascular+remodeling+by+activating+the+YAP%2FTAZ+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).</li>
<li>Fabre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+a+manuscript+series+on+the+characterization+and+use+of+microphysiological+systems+%28MPS%29+in+pharmaceutical+safety+and+ADME+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications.</a> Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).</li>
<li>Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+predictive+value+of+animal+models+for+vaccine+efficacy+in+humans%3F+The+importance+of+bridging+studies+and+species-independent+correlates+of+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902(2018).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organs-on-chips+for+disease+modelling%2C+drug+development+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).</li>
<li>Niu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chip+for+odontoblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chip for odontoblasts in vitro.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).</li>
<li>Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+liver+models+on+a+microplatform%3A+well-defined+culture%2C+engineering+of+liver+tissue+and+liver-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip.</a> Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).</li>
<li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li>
<li>Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-on-a-chip+based+on+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Heart-on-a-chip based on stem cell biology.</a> Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).</li>
<li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Netherlands+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).</li>
<li>Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ%2Fbody-on-a-chip+devices+at+the+convergence+of+biology+and+microengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering.</a> Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+cancer-on-a-chip+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Construction of cancer-on-a-chip for drug screening.</a> Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+organ-on-a-chip+to+improve+cell+capture+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mechanical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency.</a> International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705(2021).</li>
<li>Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective%3A+Fabrication+of+integrated+organ-on-a-chip+via+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting.</a> Biomicrofluidics. 11 (3), 031301(2017).</li>
<li>Mohammed, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+devices%3A+improvement+of+surface+quality+of+CO2+laser+machined+poly+%28methylmethacrylate%29+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021(2017).</li>
<li>Tsao, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+microfluidics%3A+Simple%2C+low-cost+fabrication+process+bridging+academic+lab+research+to+commercialized+production%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production.</a> Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).</li>
<li>Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+electrochemiluminescence+%28ECL%29+in+and+for+microfluidic+analytical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).</li>
<li>Stefanadis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-diameter+relation+of+the+human+aorta.+A+new+method+of+determination+by+the+application+of+a+special+ultrasonic+dimension+catheter%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter.</a> Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).</li>
<li>Williams, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+influences+on+vascular+smooth+muscle+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function.</a> Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).</li>
<li>Abudupataer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta+smooth+muscle-on-a-chip+reveals+impaired+mitochondrial+dynamics+as+a+therapeutic+target+for+aortic+aneurysm+in+bicuspid+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease.</a> eLife. 10, 69310(2021).</li>
<li>Poussin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+human+microvessel-on-a-chip+model+for+studying+monocyte-to-endothelium+adhesion+under+flow+-+application+in+systems+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology.</a> Altex. 1, 47-63 (2020).</li>
<li>Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artery-on-a-chip+platform+for+automated%2C+multimodal+assessment+of+cerebral+blood+vessel+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function.</a> Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wraz z szybkim rozwojem technologii mikroprzepływowej, w ostatnich latach pojawiły się modele OOC, które mogą replikować funkcję biologiczną i strukturę jednego lub więcej narządów in vitro do zastosowań w biologii, medycynie i farmakologii15. OOC może symulować kluczowe funkcje mikrośrodowiska fizjologicznego człowieka, niezbędne do badania mechanizmów choroby i promowania przedklinicznej translacji leków 8,16. Chociaż OOC jest w...

Tętniak i rozwarstwienie aorty piersiowej (TAAD) to miejscowe poszerzenie lub rozwarstwienie ściany aorty, które wiąże się z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością1. Ludzkie komórki mięśni gładkich aorty (HASMC) odgrywają istotną rolę w patogenezie TAAD. HASMC nie są kończnie zróżnicowanymi komórkami, a HASMC zachowują wysoką plastyczność, co pozwala im zmieniać fenotypy w odpowiedzi na różne bodźce2. HASMC poddawane są głównie rytmicznemu naprężeniu rozciągającemu in vivo, co jest jednym z kluczowych czynników regulujących zmiany morfologiczne, różnicowanie i funkcje fizjologiczne mięśni gładkich3,4. Dlatego nie można ignorować roli szczepu cyklicznego w badaniu HASMC. Jednak konwencjonalne hodowle komórkowe 2D nie są w stanie odtworzyć biomechanicznej stymulacji cyklicznego szczepu, której doświadczają HASMC in vivo. Ponadto konstrukcja zwierzęcego modelu TAAD nie jest odpowiednia dla niektórych typów TAAD, takich jak TAAD związany z dwupłatkową zastawką aortalną (BAV). Co więcej, nie można ignorować różnic gatunkowych między badaniami klinicznymi na ludziach a doświadczeniami na zwierzętach. Utrudnia to tłumaczenie farmaceutyczne w praktyce klinicznej. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania bardziej złożonych i fizjologicznych systemów do symulacji środowiska biomechanicznego in vivo w badaniach nad chorobami aorty.
Eksperymenty na zwierzętach wykorzystywane w badaniach biomedycznych i opracowywaniu leków są kosztowne, czasochłonne i etycznie wątpliwe. Ponadto wyniki badań na zwierzętach często nie są w stanie przewidzieć wyników uzyskanych w badaniach klinicznych na ludziach5,6. Brak ludzkich modeli przedklinicznych i wysoki wskaźnik niepowodzeń w badaniach klinicznych spowodowały, że klinika ma niewiele skutecznych leków, co zwiększyło koszty opieki zdrowotnej7. W związku z tym pilne jest znalezienie innych modeli eksperymentalnych, które uzupełniłyby modele zwierzęce. Mikrofabrykacja i techniki mikroprzepływowe znacznie się rozwinęły w ostatnich latach, zapewniając nowatorskie techniki tworzenia modeli organoidów na chipie, które eliminują wady tradycyjnych technik hodowli komórkowych 2D i ustanawiają bardziej realistyczny, tani i wydajny model in vitro do badań fizjologicznych i opracowywania leków. Za pomocą urządzeń mikroprzepływowych tworzy się narządy na chipach, które hodują żywe komórki w komorach o rozmiarach mikrometrów z różnymi bodźcami w celu odtworzenia kluczowych funkcji tkanki lub narządu. System składa się z jednego lub wielu mikroprzepływowych mikrokanałów, przy czym jeden rodzaj komórek jest hodowany w perfundowanej komorze replikującej funkcje jednego typu tkanki lub różnych typów komórek hodowanych na porowatych błonach w celu odtworzenia interfejsów między różnymi tkankami. Organoidy oparte na mikroprzepływach w połączeniu z komórkami pochodzącymi od pacjentów mają wyjątkową zaletę polegającą na zniwelowaniu dużej różnicy gatunkowej między modelami chorób myszy i ludzi oraz przezwyciężeniu wad tradycyjnej hodowli komórkowej 2D w badaniach nad mechanizmami choroby i odkrywaniu leków. Wraz z szybkim rozwojem mikrofluidyki w ciągu ostatnich kilku lat, naukowcy zdali sobie sprawę z użyteczności modeli in vitro organ-on-a-chip (OOC) replikujących złożone parametry biologiczne in vivo8. Te mikroprzepływowe organoidy symulują środowiska biomechaniczne in vitro, takie jak cykliczne odkształcenia, naprężenia ścinające i ciśnienie cieczy, zapewniając trójwymiarowe (3D) środowisko hodowli komórkowej. Do tej pory stworzono kilka modeli OOC symulujących bodźce biomechaniczne w narządach takich jak lung9, kidney10, liver11, intestine12 i heart13, ale nie były one powszechnie stosowane w badaniach nad chorobami aorty u ludzi.
W tym badaniu prezentujemy model ludzkiego układu na chipie (HASMC-OOC), który może kontrolować biomimetyczne siły mechaniczne i rytmy stosowane do pierwotnych HASMC pochodzących od pacjentów TAAD. Chip składa się z trójwarstwowych grubych płytek z polidimetylosiloksanu (PDMS) wytrawionych kanałami i dwóch skomercjalizowanych, wysoce elastycznych membran PDMS. HASMC są hodowane na membranach PDMS. Kanał w środku chipa jest wypełniony pożywką do hodowli komórek. Górny i dolny kanał chipa są podłączone do systemu zasilania podciśnieniem, który może kontrolować rytm i częstotliwość mechanicznego naprężenia rozciągającego membran PDMS. Rytmiczne obciążenie doświadczane przez HASMC może być symulowane w HASMC-OOC, replikując biomechaniczne mikrośrodowisko tkanki lub narządu, które nie jest funkcjonalnie osiągalne za pomocą konwencjonalnych systemów hodowli 2D. Dzięki wysokiej rozdzielczości obrazowaniu w czasie rzeczywistym i mikrośrodowisku biomechanicznemu, można badać aktywność biochemiczną, genetyczną i metaboliczną żywych komórek pod kątem rozwoju tkanek, fizjologii narządów, etiologii chorób, mechanizmów molekularnych i identyfikacji biomarkerów, chorób układu krążenia i aorty. W połączeniu z komórkami specyficznymi tkankowo i komórkami pacjenta, system ten może być używany do badań przesiewowych leków, medycyny spersonalizowanej i testów toksyczności. Model HASMC-OOC stanowi nowatorską platformę in vitro do badania patogenezy choroby aorty.

<table><tbody><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Beyotime</td><td>P0099-100ml</td><td>Używany do immobilizacji komórek</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0408</td><td>Przeciwciała stosowane do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Beyotime</td><td>ST025-20g</td><td></td></tr><tr><td>Wapń AM/PI</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>CNN1</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>Ab46794</td><td></td></tr><tr><td>Komercyjna elastyczna membrana PDMS </td><td>Hangzhou Bald Advanced Materials</td><td>KYQ-200</td><td></td></tr><tr><td>F-actin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>M8318</td><td></td></tr><tr><td>Węże</td><td>Runze Fluid</td><td>96410</td><td>Średnica wewnętrzna 1 mm; Średnica zewnętrzna 3 mm; Grubość ścianki 1 mm; Oficjalny adres strony internetowej: https://www.runzefluidsystem.com</td></tr><tr><td>Ludzka linia komórek mięśniowych gładkich CRL1999</td><td>ATCC</td><td>Numer serii:70019189</td><td></td></tr><tr><td>Obraz J</td><td>Imagej.net/fiji/downloads</td><td>Pobierz za darmo: https://fiji.sc</td><td>Platforma obrazowania, która służy do identyfikacji intensywności fluorescencji</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Zapewnia, że temperatura, wilgotność i ekspozycja na światło są dokładnie takie same przez cały eksperyment .</td></tr><tr><td>Luer</td><td>Runze Fluid</td><td>RH-M016</td><td>Oficjalny adres strony internetowej: https://www.runzefluidsystem.com.</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolagen myszy</td><td>Sigma</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Plazma tlenowa&nbsp;</td><td>Changzhou Hongming Instrument</td><td>HM-Plasma5L</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Beyotime</td><td>C0221A</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma</td><td>P4458-100ml</td><td>Antybiotyki stosowane w celu zapobiegania bakteryjnemu zanieczyszczeniu komórek podczas hodowli.</td></tr><tr><td>pompa perystaltyczna</td><td>Kamoer</td><td>F01A-STP-B046</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>sterownik PLC</td><td>Zhejiang Jun Teng (BenT) Fabryka CNC</td><td>BR010-11T8X2M</td><td>Szczegółowe ustawienia programu można znaleźć w uzupełnieniu. Oficjalny adres strony: files.http://www.btcnc.net</td></tr><tr><td>polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>SM22</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab14106</td><td></td></tr> Zawór elektromagnetyczny <tr><td>SMCM</td><td>ScienCell</td><td>Cat 1101</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SMC (Chiny)</td> <td>VQZ300</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300841</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Beyotime</td><td>ST795</td><td>Do przenikania przez błony komórkowe</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>10296010</td><td>Służy do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>trypsyna</td><td>Filtr</td> próżniowy Sigma <td>15400054</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SMC (Chiny)</td><td>ZFC5-6</td><td>Oficjalny adres strony internetowej: https://www.smc.com.cn</td></tr><tr><td>pompa próżniowa</td><td>Kamoer</td><td>KVP15-KL-S regulator</td><td></td></tr><tr><td>podciśnienia</td><td>AirTAC</td><td>GVR-200-06</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Nazwa</td><td>Naprzód (5' do 3")</td><td>Bieg wsteczny (od 5' do 3')</td><td></td></tr><tr><td>SM22</td><td>CCGTGGAGATCCCAACTGG</td><td>CCATCTGAAGGCCAATGACAT</td><td></td></tr><tr><td>CNN1</td><td>CTCCATTGACTCGAACGACTC</td><td>CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA</td><td></td></tr></tbody></table>

budowa modelu narządów na chipie komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty do rekapitulacji naprężeń biomechanicznych w ścianie aorty

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Konwencjonalne techniki dwuwymiarowych hodowli komórkowych i modele zwierzęce zostały wykorzystane w badaniach nad tętniakiem i rozwarstwieniem ludzkiej aorty piersiowej (TAAD). Jednak ludzkiego TAAD czasami nie można scharakteryzować za pomocą modeli zwierzęcych. Istnieje wyraźna luka gatunkowa między badaniami klinicznymi na ludziach a eksperymentami na zwierzętach, która może utrudniać odkrywanie leków terapeutycznych. W przeciwieństwie do tego, konwencjonalny model hodowli komórkowej nie jest w stanie symulować bodźców biomechanicznych in vivo. W tym celu w ostatnich latach nastąpił znaczny rozwój technik mikrowytwarzania i mikroprzepływowości, które dostarczyły nowatorskich technik tworzenia modeli organoidów na chipie, które replikują biomechaniczne mikrośrodowisko. W tym badaniu opracowano model ludzkiego narządu na chipie komórki mięśni gładkich aorty (HASMC-OOC) w celu symulacji patofizjologicznych parametrów biomechaniki aorty, w tym amplitudy i częstotliwości cyklicznego obciążenia doświadczanego przez ludzkie komórki mięśni gładkich aorty (HASMC), które odgrywają istotną rolę w TAAD. W tym modelu morfologia HASMC stała się wydłużona, wyrównana prostopadle do kierunku odkształcenia i prezentowała bardziej kurczliwy fenotyp w warunkach odkształcenia niż w statycznych warunkach konwencjonalnych. Było to zgodne z orientacją i fenotypem komórek w natywnych ludzkich ścianach aorty. Dodatkowo, korzystając z dwupłatkowych TAAD (BAV-TAAD) związanych z dwupłatkową zastawką aortalną i TAAD związanych z zastawką trójdzielną (TAV-TAAD) pochodzących od pacjentów pierwotnych HASMC, ustaliliśmy modele choroby BAV-TAAD i TAV-TAAD, które replikują charakterystykę HASMC w TAAD. Model HASMC-OOC zapewnia nowatorską platformę in vitro, która jest komplementarna z modelami zwierzęcymi w celu dalszego badania patogenezy TAAD i odkrywania celów terapeutycznych.

Model HASMC-OOC składa się z systemu kontroli próżni, systemu cyrkulacyjnego oraz chipów PDMS, a schematyczny projekt modelu HASMC-OOC przedstawiono na Rysunku 1. System kontroli próżni składa się z pompy próżniowej, zaworów elektromagnetycznych i sterownika PLC. Jako system cyrkulacyjny wykorzystano pompę perystaltyczną do odświeżania pożywki hodowlanej i podawania leków. Chip PDMS składał się z dwóch komór próżniowych i komory środkowej wypełnionej SMCM dla wzrostu komórek. Zgodnie z proje...

Tutaj opracowaliśmy model ludzkiego narządu na chipie komórek mięśni gładkich aorty, aby odtworzyć in vivo biomechaniczne napięcie komórek mięśni gładkich w ludzkiej ścianie aorty.

Budowa modelu narządów na chipie komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty do rekapitulacji naprężeń biomechanicznych w ścianie aorty

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Model ten stymuluje bodźce biomechaniczne odczuwane przez komórki mięśni gładkich w ludzkiej aorcie. W połączeniu z komórkami pochodzącymi od pacjentów, system ten może być wykorzystywany do badań przesiewowych leków i spersonalizowanej medycyny chorób aorty. Model ten może naśladować i precyzyjnie kontrolować podstawowe parametry mechaniczne komórek mięśni gładkich w ludzkiej aorcie, co stanowi nowatorską platformę in vitro do badania i patogenezy chorób aorty.Procedurę zademonstruje Mieradilijiang Abudubat, doktor plakatowy z naszego laboratorium. Zacznij od przemycia prawego bocznego obszaru aorty wstępującej sterylnym pbs, raz lub dwa razy. Usuń warstwy błony wewnętrznej i przydanki tkanki za pomocą dwóch kleszczy ocznych i zachowaj warstwę pożywki, aby pobrać komórki.Umieść warstwę podłoża na 10-centymetrowym naczyniu i pokrój ją na dwa do trzech milimetrowych kawałków. Następnie dodaj pięć mililitrów SMCM zawierającego 10% fbs i 1% streptomycyny penicyliny do próbek tkanek. Przenieś małą tkankę do butelki hodowlanej za pomocą sterylnego zakraplacza, równomiernie rozprowadzając tkankę.Wyrzuć pożywkę hodowlaną w jak największym stopniu. Następnie odwróć butelkę do góry nogami. Dodaj dwa mililitry SMCM do odwróconej butelki hodowlanej i umieść ją w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną do dwóch godzin.Następnie powoli obróć go prawą stroną do góry i dodaj kolejne dwa mililitry SMCM. Po pięciu do siedmiu dniach inkubacji wymień SMCM na cztery mililitry świeżego SMCM. Powoli wyrzuć i dodaj SMCM podczas zmiany pożywki.Ogólnie rzecz biorąc, sporadyczne komórki mięśni gładkich wydostają się w ciągu około dwóch tygodni. Delikatnie transportuj butelkę z kulturą podczas przenoszenia do stacji mikroskopowej. W przeciwnym razie tkanki będą unosić się na wodzie, a komórki będą rosły powoli.Kiedy komórki wyrosną, podziel je na dwie nowe butelki hodowlane z czterema mililitrami świeżego SMCM. Zidentyfikuj komórki za pomocą analizy immunofluorescencyjnej czterech specyficznych markerów komórek mięśni gładkich. Aby spolimeryzować PDMS, dodaj utwardzacz lub składnik B do bazy lub składnika A i mieszaj kompleks przez pięć minut.Objętość będzie zależała od potrzeby badania. Przygotowany żel PDMS należy umieścić w próżniowym zbiorniku ekstrakcyjnym na 30 do 60 minut i utrzymać ciśnienie poniżej ujemnych 0,8 milipaskala. Korzystając z oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo, zaprojektuj formę.Wykonaj na zamówienie formy trzech warstw za pomocą precyzyjnej komputerowej maszyny do grawerowania sterowanego numerycznie. Po wycięciu ramy form i mikrokanalików za pomocą płytek PMMA, przyklej je do innej płytki. Tak przygotowany żel PDMS wlewamy na przeznaczoną do tego formę.Następnie sieciuj w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Oderwij usieciowane płyty PDMS od formy i pokrój skomercjalizowane membrany PDMS na odcinki o wymiarach 100 milimetrów na 40 milimetrów. Przebij otwory w trzech płytach PDM za pomocą jednomilimetrowego dziurkacza, aby wykonać wlot i wylot powietrza i średnich mikrokanałów na chipie PDMS.Potraktuj trzy przygotowane płyty PDMS i dwie membrany PDMS plazmą tlenową przez pięć minut w celu aktywacji powierzchni PDM. Ustaw powietrze w pomieszczeniu na gaz procesowy, ciśnienie na minus 100 kilopaskalów, prąd na 180 do 200 miliamperów, napięcie na 200 woltów, a czas przetwarzania na pięć minut. Połącz ze sobą trzy płyty PDMS i dwie membrany PDMS pod mikroskopem stereoskopowym, tak aby górna warstwa składała się z płyty PDMS kanału powietrznego, a następnie membrany PDMS.Kanał medium składa się z płyty PDMS, następnie membrany PDMS, a dolną warstwą jest płyta PDMS kanału powietrznego. Umieść zmontowany chip PDMS w inkubatorze o temperaturze 70 stopni Celsjusza na godzinę. Przygotuj kilka węży lateksowych o średnicy wewnętrznej jednego milimetra i długości trzech centymetrów.Włóż igłę ze stali nierdzewnej o średnicy jednego milimetra i długości jednego centymetra do jednego końca przygotowanego węża. Następnie włóż przynętę do drugiego końca węża, aby utworzyć rurkę połączoną z mikrokanalikami powietrza i medium chipa PDMS. Włóż przygotowane rurki do wylotów i wlotów mikrokanalików powietrza i medium na chipie PDMS.Wlej dwa mililitry po 80 miligramów na mililitr kolagenu myszy do pożywki mikrokanałowej chipa PDM za pomocą dwumililitrowej strzykawki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji usuń kolagen z kanału za pomocą dwumililitrowej strzykawki. Umieść na noc chipy PDMS z kodowaniem kolagenu w inkubatorze o temperaturze 60 stopni Celsjusza.Umieść chipy PDMS w sterylizatorze UV na ponad godzinę. Umieść wysterylizowane chipy PDMS na ultra czystej ławce w ramach przygotowań do eksperymentu z komórkami. Hodowla cztery razy 10 do pięciu pierwotnych ludzkich komórek mięśni gładkich aorty od pacjentów stosujących SMCM zawierającego 2% FBS i 1% streptomycyny penicyliny w inkubatorze 5% dwutlenku węgla, ustawionym na 37 stopni Celsjusza.Gdy gęstość komórek mięśni gładkich osiągnie 80%, wyrzuć SMCM i umyj komórki dwoma mililitrami PPS. Trawić komórki za pomocą jednego mililitra 0,25% trypsyny przez dwie minuty i wirować w temperaturze 100 RCF przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze świeżego SMCM.Użyj ośmiu mililitrów SMCM do hodowli komórek na 10-centymetrowej naczyniu hodowlanym. Za pomocą cytometru oblicz liczbę komórek i postępuj zgodnie z końcowym stężeniem dwa razy 10 do pięciu komórek na mililitr. Powoli wlej dwa mililitry PBS do mikrokanału z kodowanym kolagenem i wysterylizowanym mikrokanałem chipowym PDMS, a następnie wyrzuć za pomocą dwumililitrowej strzykawki.Powoli wlej dwa mililitry po dwa razy 10 do pięciu komórek na mililitr zawiesiny komórek mięśni gładkich do mikrokanału pożywki chipa PDMS. Następnie zamknij przynętę na wejściu i wyjściu z chipa PDMS. Umieść chip PDMS w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na jeden dzień.Po inkubacji, gdy komórki są przyłączone do membrany PDMS w chipie PDMS, podłącz wylot mikrokanału powietrza na chipie PDMS do systemu kontrolera podciśnienia. Wydłużona normalna forma komórkowa będzie widoczna pod mikroskopem, gdy komórka zostanie przyczepiona. Kontrastuje z zawieszonymi okrągłymi komórkami.Włącz zawór elektromagnetyczny i pompę próżniową. Otwórz regulator podciśnienia i dostosuj poziom ciśnienia w zależności od naprężeń. Następnie umieść chipy PDMS i inkubator ustawiony na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 24 godziny.Przygotuj kilka zaworów elektromagnetycznych, filtrów próżniowych, regulatorów podciśnienia, pompy próżniowej, pompy perystaltycznej i sterownika PLC sterującego zaworem elektromagnetycznym. Zaprogramuj sterownik PLC i ustaw interwał czasu włączania i wyłączania na jeden herc. Podłącz zawory elektromagnetyczne do zaprogramowanego sterownika.Podłącz wlot pompy próżniowej do filtrów próżniowych, a następnie podłącz wylot filtrów próżniowych do regulatorów podciśnienia. Podłącz wylot regulatorów podciśnienia do zaworów elektromagnetycznych. I na koniec podłącz wylot zaworów elektromagnetycznych do wylotów mikrokanałów powietrznych chipów PDMS.Podłączyć wylot pompy perystaltycznej do wlotu średniego mikrokanału chipa PDMS, a wlot pompy perystaltycznej do wylotu średniego mikrokanałowego chipa PDMS w celu wymiany pożywki hodowlanej i obchodzenia się z lekiem. Dostosuj amplitudę odkształcenia za pomocą regulatora i częstotliwość odkształcenia za pomocą mikrokontrolera. Żywotność ludzkiej linii komórkowej mięśni gładkich aorty, CRL 1990, w chipie PDMS, oszacowano za pomocą testu żywych i martwych w trzecim i piątym dniu hodowli komórek.Żywotność komórek stwierdzono wyższą niż 90% w trzecim i piątym dniu. Barwienie cytoszkieletu F-aktyną CRL 1990 w chipie PDMS wykazało normalną morfologię komórek i komórki ustawione prostopadle do szczepu po rozciąganiu przez 24 godziny. Immunofluorescencja markerów kurczliwości SM22 i CNN1 była wyższa w warunkach obciążenia w porównaniu z warunkami statycznymi.Ponadto geny SM22 i CNN1 były regulowane w górę w warunkach obciążenia komórek mięśni gładkich. Barwienie BAV i TAV aktyną F, tętniak aorty piersiowej i rozwarstwienie pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty pochodzących od pacjenta, wykazało normalną morfologię komórek i komórki ustawione prostopadle do kierunku odkształcenia po rozciąganiu przez 24 godziny. Fluorescencja SM22 i CNN1 w tętniaku i rozwarstwieniu aorty piersiowej BAVTAAD i TAV była wyższa w warunkach obciążenia niż w warunkach statycznych.Podobnie jak w przypadku poziomów ekspresji genów SM22 i CNN1, które również były regulowane w górę w warunkach szczepu w porównaniu z warunkami statycznymi. Podczas izolowania pierwotnego HASMC należy zwrócić uwagę na zasadę sterylności. Po potraktowaniu plazmą laboratoriów PDMS i membran powierzchnie nie powinny być zabrudzone.W oparciu o ten protokół, komórki śródbłonka mogą być hodowane wspólnie z komórkami mięśni gładkich, a czysty stres może być przenoszony na komórki z cyklicznym obciążeniem, aby dalej symulować więcej sił mechanicznych.

construction-human-aorta-smooth-muscle-cell-organ-on-chip-model-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Restenoza po zabiegach sercowo-naczyniowych (operacja pomostowania, angioplastyka lub stentowanie) jest poważnym problemem zmniejszającym trwałość tych procedur. Idealna terapia hamowałaby proliferację komórek mięśni gładkich (VSMC), jednocześnie promując regenerację śródbłonka. Opisano model jednoczesnej oceny proliferacji VSMC i funkcji śródbłonka in vivo.

Mysi uraz zmiażdżenia aorty: skuteczny model in vivo proliferacji komórek mięśni gładkich i funkcji śródbłonka

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Obecny protokół opisuje możliwości i podstawowe metody hodowli Open-Top Organ-Chip do pomyślnego zakładania i dojrzewania pełnogrubych kultur narządów na chipach tkanek pierwotnych (skóry, pęcherzyków płucnych, dróg oddechowych i jelit), dając możliwość zbadania różnych funkcjonalnych aspektów interfejsu ludzkiej nabłonka/mezenchymalnej i niszy naczyniowej in vitro.

Odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym

Poznaj budowę modelu organ-on-a-chip z komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty do symulacji naprężeń biomechanicznych. Ta metoda umożliwia badania chorób aorty i personalizowaną medycynę.

Budowa modelu narządów na chipie komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty do rekapitulacji naprężeń biomechanicznych w ścianie aorty (Wideo) | JoVE Journal

Budowa modelu narządów na chipie komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty do rekapitulacji naprężeń biomechanicznych w ścianie aorty

Przeglądaj więcej filmów