Budowa modelu narządów na chipie komórek mięśni gładkich ludzkiej aorty do rekapitulacji naprężeń biomechanicznych w ścianie aorty
6 lipca 2022
Tutaj opracowaliśmy model ludzkiego narządu na chipie komórek mięśni gładkich aorty, aby odtworzyć in vivo biomechaniczne napięcie komórek mięśni gładkich w ludzkiej ścianie aorty.
Model ten stymuluje bodźce biomechaniczne odczuwane przez komórki mięśni gładkich w ludzkiej aorcie. W połączeniu z komórkami pochodzącymi od pacjentów, system ten może być wykorzystywany do badań przesiewowych leków i spersonalizowanej medycyny chorób aorty. Model ten może naśladować i precyzyjnie kontrolować podstawowe parametry mechaniczne komórek mięśni gładkich w ludzkiej aorcie, co stanowi nowatorską platformę in vitro do badania i patogenezy chorób aorty.
Procedurę zademonstruje Mieradilijiang Abudubat, doktor plakatowy z naszego laboratorium. Zacznij od przemycia prawego bocznego obszaru aorty wstępującej sterylnym pbs, raz lub dwa razy. Usuń warstwy błony wewnętrznej i przydanki tkanki za pomocą dwóch kleszczy ocznych i zachowaj warstwę pożywki, aby pobrać komórki.
Umieść warstwę podłoża na 10-centymetrowym naczyniu i pokrój ją na dwa do trzech milimetrowych kawałków. Następnie dodaj pięć mililitrów SMCM zawierającego 10% fbs i 1% streptomycyny penicyliny do próbek tkanek. Przenieś małą tkankę do butelki hodowlanej za pomocą sterylnego zakraplacza, równomiernie rozprowadzając tkankę.
Wyrzuć pożywkę hodowlaną w jak największym stopniu. Następnie odwróć butelkę do góry nogami. Dodaj dwa mililitry SMCM do odwróconej butelki hodowlanej i umieść ją w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną do dwóch godzin.
Następnie powoli obróć go prawą stroną do góry i dodaj kolejne dwa mililitry SMCM. Po pięciu do siedmiu dniach inkubacji wymień SMCM na cztery mililitry świeżego SMCM. Powoli wyrzuć i dodaj SMCM podczas zmiany pożywki.
Ogólnie rzecz biorąc, sporadyczne komórki mięśni gładkich wydostają się w ciągu około dwóch tygodni. Delikatnie transportuj butelkę z kulturą podczas przenoszenia do stacji mikroskopowej. W przeciwnym razie tkanki będą unosić się na wodzie, a komórki będą rosły powoli.
Kiedy komórki wyrosną, podziel je na dwie nowe butelki hodowlane z czterema mililitrami świeżego SMCM. Zidentyfikuj komórki za pomocą analizy immunofluorescencyjnej czterech specyficznych markerów komórek mięśni gładkich. Aby spolimeryzować PDMS, dodaj utwardzacz lub składnik B do bazy lub składnika A i mieszaj kompleks przez pięć minut.
Objętość będzie zależała od potrzeby badania. Przygotowany żel PDMS należy umieścić w próżniowym zbiorniku ekstrakcyjnym na 30 do 60 minut i utrzymać ciśnienie poniżej ujemnych 0,8 milipaskala. Korzystając z oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo, zaprojektuj formę.
Wykonaj na zamówienie formy trzech warstw za pomocą precyzyjnej komputerowej maszyny do grawerowania sterowanego numerycznie. Po wycięciu ramy form i mikrokanalików za pomocą płytek PMMA, przyklej je do innej płytki. Tak przygotowany żel PDMS wlewamy na przeznaczoną do tego formę.
Następnie sieciuj w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Oderwij usieciowane płyty PDMS od formy i pokrój skomercjalizowane membrany PDMS na odcinki o wymiarach 100 milimetrów na 40 milimetrów. Przebij otwory w trzech płytach PDM za pomocą jednomilimetrowego dziurkacza, aby wykonać wlot i wylot powietrza i średnich mikrokanałów na chipie PDMS.
Potraktuj trzy przygotowane płyty PDMS i dwie membrany PDMS plazmą tlenową przez pięć minut w celu aktywacji powierzchni PDM. Ustaw powietrze w pomieszczeniu na gaz procesowy, ciśnienie na minus 100 kilopaskalów, prąd na 180 do 200 miliamperów, napięcie na 200 woltów, a czas przetwarzania na pięć minut. Połącz ze sobą trzy płyty PDMS i dwie membrany PDMS pod mikroskopem stereoskopowym, tak aby górna warstwa składała się z płyty PDMS kanału powietrznego, a następnie membrany PDMS.
Kanał medium składa się z płyty PDMS, następnie membrany PDMS, a dolną warstwą jest płyta PDMS kanału powietrznego. Umieść zmontowany chip PDMS w inkubatorze o temperaturze 70 stopni Celsjusza na godzinę. Przygotuj kilka węży lateksowych o średnicy wewnętrznej jednego milimetra i długości trzech centymetrów.
Włóż igłę ze stali nierdzewnej o średnicy jednego milimetra i długości jednego centymetra do jednego końca przygotowanego węża. Następnie włóż przynętę do drugiego końca węża, aby utworzyć rurkę połączoną z mikrokanalikami powietrza i medium chipa PDMS. Włóż przygotowane rurki do wylotów i wlotów mikrokanalików powietrza i medium na chipie PDMS.
Wlej dwa mililitry po 80 miligramów na mililitr kolagenu myszy do pożywki mikrokanałowej chipa PDM za pomocą dwumililitrowej strzykawki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji usuń kolagen z kanału za pomocą dwumililitrowej strzykawki. Umieść na noc chipy PDMS z kodowaniem kolagenu w inkubatorze o temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Umieść chipy PDMS w sterylizatorze UV na ponad godzinę. Umieść wysterylizowane chipy PDMS na ultra czystej ławce w ramach przygotowań do eksperymentu z komórkami. Hodowla cztery razy 10 do pięciu pierwotnych ludzkich komórek mięśni gładkich aorty od pacjentów stosujących SMCM zawierającego 2% FBS i 1% streptomycyny penicyliny w inkubatorze 5% dwutlenku węgla, ustawionym na 37 stopni Celsjusza.
Gdy gęstość komórek mięśni gładkich osiągnie 80%, wyrzuć SMCM i umyj komórki dwoma mililitrami PPS. Trawić komórki za pomocą jednego mililitra 0,25% trypsyny przez dwie minuty i wirować w temperaturze 100 RCF przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze świeżego SMCM.
Użyj ośmiu mililitrów SMCM do hodowli komórek na 10-centymetrowej naczyniu hodowlanym. Za pomocą cytometru oblicz liczbę komórek i postępuj zgodnie z końcowym stężeniem dwa razy 10 do pięciu komórek na mililitr. Powoli wlej dwa mililitry PBS do mikrokanału z kodowanym kolagenem i wysterylizowanym mikrokanałem chipowym PDMS, a następnie wyrzuć za pomocą dwumililitrowej strzykawki.
Powoli wlej dwa mililitry po dwa razy 10 do pięciu komórek na mililitr zawiesiny komórek mięśni gładkich do mikrokanału pożywki chipa PDMS. Następnie zamknij przynętę na wejściu i wyjściu z chipa PDMS. Umieść chip PDMS w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na jeden dzień.
Po inkubacji, gdy komórki są przyłączone do membrany PDMS w chipie PDMS, podłącz wylot mikrokanału powietrza na chipie PDMS do systemu kontrolera podciśnienia. Wydłużona normalna forma komórkowa będzie widoczna pod mikroskopem, gdy komórka zostanie przyczepiona. Kontrastuje z zawieszonymi okrągłymi komórkami.
Włącz zawór elektromagnetyczny i pompę próżniową. Otwórz regulator podciśnienia i dostosuj poziom ciśnienia w zależności od naprężeń. Następnie umieść chipy PDMS i inkubator ustawiony na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 24 godziny.
Przygotuj kilka zaworów elektromagnetycznych, filtrów próżniowych, regulatorów podciśnienia, pompy próżniowej, pompy perystaltycznej i sterownika PLC sterującego zaworem elektromagnetycznym. Zaprogramuj sterownik PLC i ustaw interwał czasu włączania i wyłączania na jeden herc. Podłącz zawory elektromagnetyczne do zaprogramowanego sterownika.
Podłącz wlot pompy próżniowej do filtrów próżniowych, a następnie podłącz wylot filtrów próżniowych do regulatorów podciśnienia. Podłącz wylot regulatorów podciśnienia do zaworów elektromagnetycznych. I na koniec podłącz wylot zaworów elektromagnetycznych do wylotów mikrokanałów powietrznych chipów PDMS.
Podłączyć wylot pompy perystaltycznej do wlotu średniego mikrokanału chipa PDMS, a wlot pompy perystaltycznej do wylotu średniego mikrokanałowego chipa PDMS w celu wymiany pożywki hodowlanej i obchodzenia się z lekiem. Dostosuj amplitudę odkształcenia za pomocą regulatora i częstotliwość odkształcenia za pomocą mikrokontrolera. Żywotność ludzkiej linii komórkowej mięśni gładkich aorty, CRL 1990, w chipie PDMS, oszacowano za pomocą testu żywych i martwych w trzecim i piątym dniu hodowli komórek.
Żywotność komórek stwierdzono wyższą niż 90% w trzecim i piątym dniu. Barwienie cytoszkieletu F-aktyną CRL 1990 w chipie PDMS wykazało normalną morfologię komórek i komórki ustawione prostopadle do szczepu po rozciąganiu przez 24 godziny. Immunofluorescencja markerów kurczliwości SM22 i CNN1 była wyższa w warunkach obciążenia w porównaniu z warunkami statycznymi.
Ponadto geny SM22 i CNN1 były regulowane w górę w warunkach obciążenia komórek mięśni gładkich. Barwienie BAV i TAV aktyną F, tętniak aorty piersiowej i rozwarstwienie pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty pochodzących od pacjenta, wykazało normalną morfologię komórek i komórki ustawione prostopadle do kierunku odkształcenia po rozciąganiu przez 24 godziny. Fluorescencja SM22 i CNN1 w tętniaku i rozwarstwieniu aorty piersiowej BAVTAAD i TAV była wyższa w warunkach obciążenia niż w warunkach statycznych.
Podobnie jak w przypadku poziomów ekspresji genów SM22 i CNN1, które również były regulowane w górę w warunkach szczepu w porównaniu z warunkami statycznymi. Podczas izolowania pierwotnego HASMC należy zwrócić uwagę na zasadę sterylności. Po potraktowaniu plazmą laboratoriów PDMS i membran powierzchnie nie powinny być zabrudzone.
W oparciu o ten protokół, komórki śródbłonka mogą być hodowane wspólnie z komórkami mięśni gładkich, a czysty stres może być przenoszony na komórki z cyklicznym obciążeniem, aby dalej symulować więcej sił mechanicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia model organ-on-a-chip z wykorzystaniem ludzkich komórek mięśni gładkich aorty, zaprojektowany w celu odwzorowania naprężeń biomechanicznych występujących w ścianie ludzkiej aorty. Ta innowacyjna platforma umożliwia symulację bodźców mechanicznych i może być wykorzystywana do przesiewania leków oraz w medycynie personalizowanej w kontekście chorób aorty.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria biomedyczna
- Badania sercowo-naczyniowe
- Biologia komórkowa
Wprowadzenie
- Zrozumienie środowiska mechanicznego komórek mięśni gładkich jest kluczowe dla badania chorób aorty.
- Obecne modele nie odtwarzają w sposób wystarczający warunków in vivo, w jakich znajdują się te komórki.
- Komórki pochodzące od pacjentów mogą zwiększyć istotność badań in vitro.
- Technologia organ-on-a-chip oferuje nowatorskie podejście do naśladowania warunków fizjologicznych.
Cel badania
- Opracowanie modelu, który dokładnie symuluje bodźce biomechaniczne komórek mięśni gładkich w aorcie.
- Zapewnienie platformy do przesiewania leków istotnych w chorobach aorty.
- Ułatwienie stosowania podejść medycyny personalizowanej z wykorzystaniem komórek pochodzących od pacjentów.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie komórek mięśni gładkich z warstwy błony środkowej ludzkiej aorty.
- Wykorzystanie technologii organ-on-a-chip do odtworzenia parametrów mechanicznych.
- Połączenie komórek pochodzących od pacjenta z modelem organ-on-a-chip.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez pracownika laboratorium.
Główne wyniki
- Model z sukcesem naśladuje środowisko mechaniczne komórek mięśni gładkich.
- Umożliwia on precyzyjną kontrolę parametrów mechanicznych.
- Wykazał potencjał w zastosowaniach związanych z przesiewowym badaniem leków.
- Dostarcza wiedzy na temat patogenezy chorób aorty.
Wnioski
- Ten model organ-on-a-chip stanowi istotny postęp w badaniach nad chorobami aorty.
- Otwiera on nowe możliwości dla medycyny personalizowanej oraz opracowywania leków.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do dalszego zgłębiania mechanizmów chorób aorty.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zniwelowanie luki translacyjnej w badaniach nad chorobami aorty wymaga zastosowania fizjologicznie odpowiednich modeli ludzkich, które odtwarzają naprężenia biomechaniczne. Platforma organ-on-a-chip HASMC umożliwia predykcyjną analizę odpowiedzi ludzkich komórek mięśni gładkich aorty w kontrolowanych warunkach mechanicznych, wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku tętniaka i rozwarstwienia aorty piersiowej (TAAD). System ten zwiększa pewność portfela badawczego poprzez umożliwienie modelowania z wykorzystaniem materiału pochodzącego od pacjentów z danej jednostki chorobowej na etapie wczesnego odkrywania i oceny przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmanutyków
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w ludzkim kontekście biomechanicznym.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie fenotypu kurczliwego i ekspresji genów pod wpływem naprężenia.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych z wykorzystaniem HASMC pochodzących od pacjentów w przypadkach BAV-TAAD i TAV-TAAD.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie selekcji projektów z portfolio poprzez odtworzenie komórkowych odpowiedzi istotnych dla przebiegu choroby.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane, reagujące na naprężenia układy HASMC do późniejszej oceny związków.
- Standaryzuje parametry biomechaniczne w celu uzyskania powtarzalnych, ilościowych wyników w zakresie orientacji komórek i ekspresji markerów.
- Umożliwia badanie wpływu leków na fenotyp kurczliwy i żywotność w kontrolowanym mikrośrodowisku.
- Zapewnia skalowalność i możliwość ponownego wykorzystania platformy dla wielu modeli chorób oraz różnych profili pacjentów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki in vitro z biologią natywnej ściany aorty ludzkiej w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju skorygowanych o ryzyko poprzez modelowanie fenotypów choroby specyficznych dla pacjenta.
- Stanowi komplementarną alternatywę dla modeli zwierzęcych w przedklinicznych badaniach mechanistycznych.
- Ułatwia badanie patogenezy choroby oraz odkrywanie celów terapeutycznych w TAAD.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model organ-on-a-chip wpisuje się w proces od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez, walidację celów oraz wczesny screening związków w biomechanicznym systemie odpowiadającym warunkom ludzkim.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez modelowanie zmian w ekspresji genów i białek indukowanych naprężeniem.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki dotyczące żywotności komórek, ich orientacji oraz ekspresji markerów kurczliwych w określonych warunkach naprężenia.
- Analityka: Zapewnia mierzalne punkty końcowe do porównywania warunków statycznych i naprężeniowych oraz oceny odpowiedzi komórek pochodzących od pacjentów.
- Badania translacyjne: Łączy mechanistyczne wyniki in vitro z fenotypami istotnymi dla choroby, obserwowanymi w ludzkiej tkance aorty.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułową, wielokrotnego użytku platformę, którą można dostosować do różnych modeli chorób aorty i kohort pacjentów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w modelowaniu chorób aorty.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje symulacje biomechaniczne i wspiera powtarzalność eksperymentów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową dzięki dostarczeniu istotnych dla człowieka danych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów terapeutycznych w zakresie TAAD.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu mikroprzepływów, hodowli komórkowych i symulacji biomechanicznych.
- Wymaga dostępu do infrastruktury precyzyjnej fabrykacji, kontroli próżni oraz obrazowania analitycznego.
- Konieczne jest zachowanie rygorystycznej sterylności i standaryzacja międzyzespołowa w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Metoda jest dostosowywalna do systemów kokultury oraz dodatkowych sił mechanicznych, takich jak naprężenie ścinające, zgodnie z opisem w protokole.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność pozyskania pierwotnych komórek od pacjentów oraz ostrożne obchodzenie się z komponentami z PDMS.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:03
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cell Isolation
2:53
Preparation of PDMS Chip
5:29
PDMS Chip Surface Treatment and Sterilization
6:12
Cell Seeding on the PDMS Chip and Cell Stretching Process
8:23
Preparation of the Mechanical Control System
9:30
Results: An HASMC‐Organ‐On‐A‐Chip Model to Precisely Control the Parameters of the Biomechanical Strain on the Aortic Wall
11:03
Conclusion
