Selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych
7 września 2022
Udostępniamy protokół, który może być ogólnie stosowany do wybranych aptamerów, które wiążą się tylko z wirusami zakaźnymi, a nie z wirusami, które stały się niezakaźne za pomocą metody dezynfekcji lub z innymi podobnymi wirusami. Otwiera to możliwość określenia statusu zakaźności w testach przenośnych i szybkich.
Protokół ten opisuje, w jaki sposób wybrać aptamery DNA, które potrafią odróżnić wirusy zakaźne od wirusów niezakaźnych, w celu uzyskania cząsteczki wykrywającej zdolnej do informowania o zakaźności próbek klinicznych lub środowiskowych. Technika ta może być stosowana do uzyskiwania selektywnych aptamerów dla wielu innych wirusów, w tym nowych wirusów, ponieważ nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat struktur lub sekwencji wirusa. Technika ta pozwala na opracowanie czujników aptamerowych do diagnostyki klinicznej i monitorowania środowiska zakaźnych wirusów w celu wykrycia, czy ktoś jest zaraźliwy lub czy metoda dezynfekcji środowiska działa zgodnie z przeznaczeniem.
Selekcja może być trudnym procesem, szczególnie dla tych, którzy są w niej nowicjuszami. Ważne jest, aby zoptymalizować warunki PCR i monitorować postęp selekcji za pomocą qPCR. Procedurę zademonstruje Marcos Gramajo, doktorant z mojego laboratorium.
Na początek zaprojektuj początkową jednoniciową bibliotekę i startery SS-DNA. Pozyskaj oligonukleotydy DNA ze źródeł komercyjnych ze standardowym oczyszczaniem odsalającym. Oczyść bibliotekę SS-DNA i startery na 10% denaturującym elektroforezie w żelu poliakrylamidowym, a następnie wytrącaniu etanolu.
Następnie należy zaopatrzyć się w roztwór podstawowy wirusów zakaźnych i niezakaźnych lub przygotować je zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. W celu denaturacji biblioteki SS-DNA należy zmieszać 10 mikrolitrów 100-mikromolowej biblioteki SS-DNA z 240 mikrolitrami buforu SELEX. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut w suchej kąpieli, a następnie umieść rurkę na lodzie na 15 minut.
Wymieszaj 250 mikrolitrów biblioteki SS-DNA w buforze SELEX z 50 mikrolitrami zakaźnego wirusa w celu pozytywnej selekcji. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 400 mikrolitrów jednej milimolowej sekwencji T20 do filtra o pojemności 0,5 mililitra, aby zablokować niespecyficzne miejsca.
Inkubuj filtry przez 30 minut. Odwirować filtr przy sile 14 000 G przez 10 minut, aby usunąć roztwór T20. Następnie trzykrotnie przemyj filtr buforem SELEX, aby usunąć nadmiar sekwencji T20.
Następnie dodaj mieszaninę zakaźnych wirusów z biblioteki SS-DNA do zablokowanego filtra 100 kilodaltonów i odwiruj, aby przepłukać niezwiązane sekwencje. Umyć filtr trzykrotnie, dodając 400 mikrolitrów buforu SELEX i odwirowując. Zachowaj frakcję w filtrze i wyrzuć przepływ.
Aby wymyć związane sekwencje, należy zmienić probówkę zbiorczą filtra wirówkowego i dodać do filtra 300 mikrolitrów buforu SELEX zawierającego osiem molowych moczników. Podgrzej filtr w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie odwiruj, aby zebrać przepływ zawierający eluowane sekwencje. Po zakończeniu umyj materiały 10% wybielaczem.
Następnie dodać roztwór wirusa zakaźnego SS-DNA zebrany we wcześniejszym kroku do zablokowanego filtra o mocy 10 kilodaltonów, odwirować przy 14 000 G przez 15 minut i odrzucić przepływ. Przemyć filtr trzykrotnie 300 mikrolitrami buforu SELEX w celu usunięcia mocznika przez odwirowanie i wyrzucić przepływ. Odzyskaj roztwór w filtrze, obracając go do góry nogami w czystej probówce zbiorczej i odwirowując przez pięć minut.
Zmierzyć końcową objętość odzyskanego roztworu za pomocą pipety i oznaczyć ją jako próbkę Round 1A. Weź 90% próbki z rundy 1A jako szablon w pierwszej rundzie i przeprowadź PCR w zoptymalizowanych warunkach. Aby odzyskać SS-DNA za pomocą modyfikowanych streptawidyną kulek magnetycznych lub MB, należy podzielić produkt na 50 mikrolitrów i dodać je do probówek do mikrowirówek zawierających 50 mikrolitrów MB. Inkubować probówkę przez 30 minut z łagodnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
Następnie umieścić probówkę na stojaku magnetycznym, aby odizolować MB i usunąć supernatant przez pipetowanie. Umyć MB dwukrotnie, dodając do probówki 200 mikrolitrów buforu wiążącego i myjącego. Następnie wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i postukaj w nią przed ponownym wymieszaniem MB do jednorodnego roztworu przez pipetowanie.
Umieść probówkę ponownie na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Po drugim płukaniu ponownie zawiesić MB w 100 mikrolitrach bufora SELEX i podgrzewać roztwór w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Natychmiast umieść probówkę w stojaku magnetycznym i zbierz supernatant zawierający pulę SS-DNA.
Powtórz ten krok odzyskiwania, dodając 50 mikrolitrów buforu SELEX. Zmierz końcową objętość odzyskanej frakcji i oznacz ją jako Round 1X. W celu denaturacji puli SS-DNA należy pobrać 60% próbki Round 1X i wymieszać ją z 50 mikrolitrami buforu SELEX.
Podgrzej próbkę w suchej kąpieli, a następnie umieść probówkę na lodzie na 15 minut. Następnie wymieszaj zdenaturowaną pulę SS-DNA w buforze SELEX z 50 mikrolitrami każdego wirusa jako etap kontrselekcji i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu niespecyficznych miejsc w filtrach wirówkowych, dodać mieszaninę zdenaturowanej puli SS-DNA inkubowanej z roztworem wirusa do zablokowanego filtra 100 kilodaltonów.
Odwirować filtr o stężeniu 14 000 G przez 10 minut i zebrać przepływ. Weź 300 mikrolitrów frakcji i wymieszaj z 50 mikrolitrami zakaźnego wirusa zawierającego 100 milionów kopii na mililitr. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.
Przygotować wzorcową mieszaninę wzorcową qPCR i rozcieńczenia oczyszczonej biblioteki SS-DNA, jak opisano w tekście. Uruchom qPCR, aby określić cykl progowy. Po przebiegu użyj krzywej standardowej, aby określić ilościowo ilość SS-DNA w rundzie 1A i rundzie 1X.
Następnie oblicz wydajność elucji jako ilość związanego DNA podzieloną przez początkową ilość DNA i wykreśl wydajność elucji w stosunku do liczby okrągłej. Na koniec wykreśl krzywe topnienia dla różnych rund. W przypadku sekwencjonowania o wysokiej przepustowości należy wybrać odpowiedni zestaw dostępny na rynku.
Przygotuj wiele pul rund selekcyjnych reprezentujących wysokie, średnie i niskie wzbogacenie, a także pulę końcową, używając innej pary indeksów w adapterach dla każdej puli. Następnie wyślij przygotowaną bibliotekę końcową do zakładu sekwencjonowania. Na potrzeby analizy sekwencjonowania sekwencje zostały zdemultipleksowane przez urządzenie do sekwencjonowania.
Usuń adaptery sekwencjonowania i startery wyboru za pomocą programu wiersza poleceń Cutadapt. Następnie użyj programu FASTX-Toolkit, aby usunąć sekwencje o niskiej jakości. Następnie połącz pliki sekwencji w odwrotnym kierunku z tymi w kierunku do przodu za pomocą FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ funkcji uzupełniania na plikach w odwrotnym kierunku.
Następnie użyj wbudowanego programu CAT, aby scalić pliki w jeden plik. Zestaw narzędzi do analizy FASTAptamer służy do analizowania wzbogacenia sekwencji w różnych pulach wyboru. Po pierwsze, aby użyć funkcji klastra FASTAptamer count i FASTAptamer w celu grupowania podobnych sekwencji w klastry.
Następnie należy użyć funkcji wzbogacania FASTAptamer w celu uzyskania informacji na temat wzbogacania sekwencji i klastrów. Zidentyfikuj potencjalne sekwencje aptamerów na podstawie informacji o wzbogaceniu uzyskanych w wyniku analizy sekwencji. Wybierz kilka sekwencji aptamerów i przeprowadź wstępne badanie przesiewowe za pomocą testu wiązania.
W niniejszej analizie qPCR wykorzystano do monitorowania postępu SELEX zakaźnych aptamerów specyficznych dla SARS-CoV-2. Wydajność elucji początkowo wzrastała z każdą rundą SELEX i wyrównywała się w rundach ósmej i dziewiątej. Porównując krzywe topnienia, zaobserwowano przesunięcie od szczytu przy wysokiej temperaturze topnienia z 77 do 79 stopni Celsjusza.
Co więcej, w ostatnich dwóch rundach zaobserwowano szczyt przy niskiej temperaturze topnienia. Pokazano względną obfitość odczytów na milion dla zsekwencjonowanego SARS2 AR10 uzyskanego w kolejnych rundach selekcji. Przewidywana struktura SARS2 AR10 wykazała ustrukturyzowaną strukturę drugorzędową zawierającą region pętli macierzystej, który może być zaangażowany w rozpoznawanie wirusa.
Po uzyskaniu aptamerów można je włączyć do elektrycznych czujników optycznych, innego rodzaju czujników, w celu opracowania portalu i szybkiego testu wykrywania wirusów, który może informować o zakaźności wirusa. Przewidujemy, że możliwe będzie uzyskanie aptamerów specyficznych dla różnych wariantów lub stereotypów wirusa, co umożliwi szybkie monitorowanie wariantów, które są największym zagrożeniem dla społeczeństwa.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę selekcji aptamerów DNA, które potrafią odróżnić wirusy zakaźne od niezakaźnych. To rozwiązanie umożliwia opracowanie czujników do diagnostyki klinicznej oraz monitorowania środowiska.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia
- Wirusologia
- Metody diagnostyczne
Wstęp
- Aptamery to krótkie, jednoniciowe cząsteczki DNA lub RNA, które mogą wiązać się ze specyficznymi celami.
- Obecne metody wykrywania wirusów zakaźnych często charakteryzują się niską swoistością.
- Niniejszy protokół ma na celu usprawnienie wykrywania wirusów zakaźnych w różnych próbkach.
- Nie wymaga on wcześniejszej wiedzy na temat struktury lub sekwencji wirusa.
Cel badania
- Opracowanie protokołu selekcji aptamerów specyficznie wiążących się z wirusami zakaźnymi.
- Umożliwienie szybkiego i przenośnego testowania stanu zakaźności.
- Ułatwienie monitorowania metod dezynfekcji środowiska.
Zastosowane metody
- Wybór aptamerów DNA poprzez systematyczny proces.
- Optymalizacja warunków PCR dla amplifikacji aptamerów.
- Monitorowanie postępów selekcji przy użyciu qPCR.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez studenta studiów magisterskich.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na skuteczną identyfikację aptamerów wiążących selektywnie wirusy zakaźne.
- Stanowi on podstawę do opracowywania czujników dla różnych rodzajów wirusów.
- Metoda wykazuje potencjał do zastosowań zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i w badaniach środowiskowych.
- Wyniki wskazują na poprawę swoistości w porównaniu z istniejącymi metodami detekcji.
Wnioski
- Niniejszy protokół oferuje niezawodne podejście do wykrywania wirusów zakaźnych.
- Można go dostosować do użytku w przypadku wirusów nowo pojawiających się.
- Technika ta zwiększa możliwości monitorowania zdrowia i bezpieczeństwa publicznego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Odróżnienie wirusów zakaźnych od niezakaźnych jest kluczową, niezaspokojoną potrzebą zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i w monitorowaniu środowiska, co ma bezpośredni wpływ na reakcję na ogniska chorób oraz kontrolę zakażeń. Protokół selekcji aptamerów oparty na metodzie SELEX umożliwia opracowanie czujników molekularnych raportujących zakaźność wirusów, co wspiera szybkie podejmowanie decyzji i ograniczanie ryzyka w całym procesie odkrywczym i translacyjnym. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych, redukując niejednoznaczność w wykrywaniu patogenów i wspierając strategie nadzoru w całym portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę cech powierzchni wirusa bez wcześniejszej wiedzy o jego strukturze.
- Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez izolację aptamerów rozróżniających stany zakaźne.
- Ułatwia walidację celu dla narzędzi diagnostycznych i nadzorczych specyficznych dla danego patogenu.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane pule aptamerów do integracji w ilościowych testach wiązania.
- Umożliwia powtarzalną selekcję i monitorowanie za pomocą qPCR oraz sekwencjonowania wysokoprzepustowego.
- Wspiera standaryzację testów dla dalszego rozwoju czujników i platform przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami dotyczącymi biomarkerów translacyjnych, umożliwiając wykrywanie funkcjonalnie istotnych stanów wirusowych.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrywania do przedklinicznej walidacji czynników diagnostycznych.
- Zmniejsza ryzyko związane z wdrażaniem kandydackich sensorów do zastosowań klinicznych i środowiskowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół SELEX znajduje zastosowanie na styku wczesnego etapu odkrywania oraz opracowywania testów, stanowiąc pomost do badań translacyjnych i walidacji przedklinicznej w diagnostyce chorób zakaźnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zakaźności wirusów i rozpoznawania stanu powierzchni.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki w zakresie wzbogacania i swoistości aptamerów.
- Analityka: Integruje odczyty oparte na qPCR i sekwencjonowaniu w celu rzetelnego porównania rund selekcji.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie do funkcjonalnych biomarkerów zakaźności w celu późniejszej walidacji.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Zapewnia modularną platformę, którą można dostosować do pojawiających się zagrożeń wirusowych i nowych celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w rozróżnianiu czynników zakaźnych, redukując niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje selekcję i monitorowanie aptamerów, wspierając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w zakresie rozwoju diagnostyki i narzędzi monitoringu środowiskowego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do diagnostyki i nadzoru z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii molekularnej, qPCR i analizy sekwencji.
- Wymaga dostępu do zakaźnych i niezakaźnych zapasów wirusów oraz odpowiedniej infrastruktury bezpieczeństwa biologicznego.
- Wymaga standaryzacji protokołów selekcji i analizy pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych systemów wirusowych bez uprzedniej wiedzy o strukturze.
- Zależność od optymalizacji procesów PCR i sekwencjonowania w celu uzyskania wiarygodnych wyników.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Design and Synthesis of DNA Library and Primers and Infectious and Non‐Infectious Virus Samples
1:46
In Vitro Selection or SELEX Process: Initial Round
6:38
Subsequent Selection Rounds
7:55
Monitoring the SELEX Process
8:46
High‐Throughput Sequencing, Sequencing Analysis, and Aptamer Binding Validation and Assays
10:38
Results: SELEX Process of Aptamers for Distinguishing Infectious from Non‐Infectious Viruses
11:42
Conclusion
