Name: Selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T12:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Poznaj metodę selekcji aptamerów DNA do rozróżniania wirusów zakaźnych od niezakaźnych. Technika ta umożliwia rozwój czujników do diagnostyki klinicznej i monitorowania środowiska bez konieczności znajomości struktury wirusa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Pani Laurze M. Cooper i Dr. Lijun Rong z Uniwersytetu Illinois w Chicago za dostarczenie próbek pseudowirusów używanych w tym protokole (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), a także Dr. Alvaro Hernandez i Dr. Chris Wright z Centrum Usług DNA Centrum Biotechnologii im. Roya J. Carvera na Uniwersytecie Illinois w Urbana-Champaign za pomoc w sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości, oraz wielu członków grupy Lu, którzy pomogli nam w selekcji in vitro i technikach charakteryzacji aptamerów. Prace te były wspierane przez grant RAPID z National Science Foundation (CBET 20-29215) oraz grant zalążkowy z Instytutu Zrównoważonego Rozwoju, Energii i Środowiska na Uniwersytecie Illinois w Urbana-Champaign oraz Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. dziękuje PEW Latin American Fellowship za wsparcie finansowe. Dziękujemy również Fundacji Roberta A. Welcha (Grant F-0020) za wsparcie programu badawczego grupy Lu na Uniwersytecie Teksańskim w Austin.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

SELEX pozwala nie tylko na identyfikację aptamerów o wysokim powinowactwie, w zakresie pM-nM 22,43,44,45, ale także o wysokiej i przestrajalnej selektywności. Korzystając z selekcji przeciwnej, można uzyskać aptamery o trudnej selektywności. Na przykład grupa Li wykazała zdolność do uzyskiwania sekwencji, które mogą odróżniać patogenne szczepy bakterii od szczepów niepatogennych<sup class="xref...

Infekcje wirusowe mają ogromne skutki ekonomiczne i społeczne na całym świecie, co stało się coraz bardziej widoczne po niedawnej pandemii COVID-19. Terminowa i dokładna diagnoza ma kluczowe znaczenie w leczeniu infekcji wirusowych, jednocześnie zapobiegając rozprzestrzenianiu się wirusów na zdrowych ludzi. Chociaż opracowano wiele metod wykrywania wirusów, takich jak testy PCR1,2 i inmunoassays3, większość obecnie stosowanych metod nie jest w stanie określić, czy wykryty wirus jest rzeczywiście zakaźny, czy nie. Dzieje się tak dlatego, że sama obecność składników wirusa, takich jak wirusowy kwas nukleinowy lub białka, nie wskazuje, że nienaruszony, zakaźny wirus jest obecny, a poziomy tych biomarkerów wykazały słabą korelację z zakaźnością4,5,6. Na przykład wirusowe RNA, powszechnie stosowane w obecnych testach COVID-19 opartych na PCR, ma bardzo niski poziom we wczesnych stadiach infekcji, gdy pacjent jest zaraźliwy, podczas gdy poziom RNA jest często nadal bardzo wysoki, gdy pacjenci wyzdrowieli z infekcji i nie są już zaraźliwi7,8. Biomarkery białka wirusa lub antygenu podążają za podobnym trendem, ale zazwyczaj pojawiają się nawet później niż wirusowe RNA, a zatem są jeszcze mniej predykcyjne dla zakaźności6,9. Aby rozwiązać ten problem, opracowano pewne metody, które mogą informować o stanie zakaźności wirusa, ale opierają się one na technikach mikrobiologii hodowli komórkowych, które wymagają długiego czasu (dni lub tygodni) do uzyskania wyników4,10. W związku z tym opracowanie nowych czujników, które mogą informować o zakaźności próbek klinicznych lub środowiskowych, może uniknąć opóźnień w leczeniu i dalszego rozprzestrzeniania się wirusa. Jednak bardzo niewiele metod pozwala uzyskać cząsteczki wykrywające, które mogą rozpoznać nienaruszony zakaźny wirion i odróżnić go od tego samego wirusa, który stał się niezakaźny.
W tym kontekście, aptamery szczególnie dobrze sprawdzają się jako unikalne narzędzie biomolekularne11,12,13,14. Aptamery to krótkie, jednoniciowe cząsteczki DNA lub RNA o specyficznej sekwencji nukleotydowej, która pozwala im tworzyć specyficzną konformację 3D w celu rozpoznania celu o wysokim powinowactwie i selektywności15,16. Uzyskuje się je w procesie selekcji kombinatorycznej zwanym systematyczną ewolucją ligandów przez wzbogacenie wykładnicze (SELEX), znanym również jako selekcja in vitro, który przeprowadza się w probówkach z dużą biblioteką losowego pobierania próbek DNA zawierającą 1014-10 15 sekwencji17,18,19. W każdej rundzie tego iteracyjnego procesu pula DNA jest najpierw poddawana presji selekcyjnej poprzez inkubację z celem w pożądanych warunkach. Wszelkie sekwencje, które nie są powiązane z celem, są następnie usuwane, pozostawiając tylko te kilka sekwencji, które są w stanie związać się w danych warunkach. Na koniec sekwencje, które zostały wybrane w poprzednim kroku, są amplifikowane metodą PCR, wzbogacając populację puli o pożądane sekwencje funkcjonalne dla następnej rundy selekcji, a proces jest powtarzany. Gdy aktywność puli selekcyjnej osiąga plateau (zwykle po 8-15 rundach), biblioteka jest analizowana przez sekwencjonowanie DNA w celu zidentyfikowania zwycięskich sekwencji wykazujących najwyższe powinowactwo.
SELEX ma unikalne zalety, które można wykorzystać do zwiększenia selektywności w stosunku do innych podobnych celów20,21, np. dla statusu zakaźności wirusa22. Po pierwsze, do selekcji można wykorzystać szeroką gamę różnych typów celów, od małych cząsteczek i białek po całe patogeny i komórki16. Tak więc, aby uzyskać aptamer, który wiąże się z zakaźnym wirusem, jako cel można użyć nienaruszonego wirusa, zamiast białka powierzchniowego wirusa19. Cały wirus SELEX pozwala na wybór aptamerów, które wiążą się specyficznie ze stanem natywnym wirusa, bez konieczności zakłócania działania wirusa. Po drugie, SELEX może być dostosowany do usuwania konkurencyjnych celów21,23, takich jak inne podobne wirusy lub niezakaźne wirusy inaktywowane, korzystając z kroków wyboru licznika w każdej rundzie selekcji22. Podczas etapów kontrselekcji pula DNA jest wystawiana na działanie celów, dla których wiązanie nie jest pożądane, a wszelkie sekwencje, które się wiążą, są odrzucane.
W tej pracy udostępniamy protokół, który może być ogólnie stosowany do wyboru aptamerów, które wiążą się z zakaźnym wirusem, ale nie z tym samym wirusem, który stał się niezakaźny za pomocą określonej metody dezynfekcji lub z innymi pokrewnymi wirusami. Metoda ta pozwala na uzyskanie czynników rozpoznających na podstawie funkcjonalnych różnic powierzchni wirusa, które nie muszą być znane z wyprzedzeniem, a tym samym oferują dodatkową korzyść w wykrywaniu nowo powstałych patogenów lub niedostatecznie zbadanych chorób.

<table><tbody><tr><td>10% Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS bez wapnia i magnezu</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>40% roztwór akrylamidu/bisakryloamidu (29:1)</td><td>BioRad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Koraliki</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA Kulki czyszczące - Sekcja 7.2.2</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0.5</td><td>Odcięcie UFC501024 Merck 10 kDa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5</td> Odcięcie <td>UFC510024</td> kwas borowy <td>100 kDa</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td> dotykowy <td>Sigma-Aldrich</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>C1000 z podwójnym modułem szybkiej reakcji 48/48</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>BioRad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowe suche wanny/grzejniki blokowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptawidin C1</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td>kulki magnetyczne modyfikowane streptawidyną - sekcja 4.9</td></tr><tr><td>Sól disodowa EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>324503</tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf Safe-Lock</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Lenti-X p24 Zestaw do szybkiego</td><td>mianowania Takara Bio USA, Inc.</td><td>632200</td><td>Zestaw do kwantyfikacji lentiwirusa - sekcja 3.3.2.1</td></tr><tr><td>Stojak separacyjny MagJET, probówka 12 x 1,5 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>MR02</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR Folia uszczelniająca, klej, optyczna</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>nieabsorbująca promieniowania UV</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell do gotowych żelowych żeli prefabrykowanych</td><td>BioRad</td><td>1658004EDU</td><td></td></tr><tr><td>Płytki krótkie Mini-PROTEAN Płytki dystansowe</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN ze zintegrowanymi przekładkami 0,75 mm BioRad</td><td></td><td>1653310</td><td></td></tr><tr><td>Biologia molekularna Klasa wodna</td><td>Lonza</td><td>51200</td><td></td></tr><tr><td>Multiplate 96-dołkowe płytki do PCR, wysokoprofilowe, bez osłony, przezroczyste</td><td>BioRad</td><td>MLP9611</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq DNA Polimeraza New</td><td>England BioLab</td><td>M0480S</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Ultralow v2 + UDI</td><td>Tecan</td><td>0344NB-A01</td><td>Zestaw do przygotowania biblioteki sekwencjonowania o wysokiej wydajności - Sekcja 7.2.</td></tr><tr><td>PIPETMAN G (100-1000 &mikro; L, 20-200 i mikro; L, 2-20 i mikro; L oraz 0,2-2 &mikro; L)</td> <td>Gilson</td><td>F144059M, F144058M, F144056M, F144054M</td><td></td></tr><tr><td>Purifier Logic+ klasa II, Szafy bezpieczeństwa biologicznego typu A2</td><td>Labconco</td><td>4261</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA BR Zestaw do oznaczania</td> fluorescencji <td>Invitrogen</td><td>Q32850</td> na <td>bazie fluorescencji&nbsp; Zestaw do oznaczania DSDN&nbsp; - Sekcja 7.2.3</td></tr><tr><td>Klasyczne końcówki do pipet SHARP o niskiej retencji (10 uL, 200 uL, 1000 uL)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158U43, 1159M44, 1158U40</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka Sorvall Legend Micro 17R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002440</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>BioRad</td><td>1725201</td><td>qPCR mastermix - Sekcja 6.2.</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Probówki i Ultra Clear Caps, paski po 8</td><td></td><td>amerykańskich naukowych probówek PCR</td><td>AB1183</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr></tbody></table>

selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych

In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses

Infekcje wirusowe mają duży wpływ na społeczeństwo; większość metod wykrywania ma trudności z ustaleniem, czy wykryty wirus jest zakaźny, co powoduje opóźnienia w leczeniu i dalsze rozprzestrzenianie się wirusa. Opracowanie nowych czujników, które mogą informować o zakaźności próbek klinicznych lub środowiskowych, sprosta temu niespełnionemu wyzwaniu. Jednak bardzo niewiele metod pozwala uzyskać cząsteczki wykrywające, które mogą rozpoznać nienaruszonego wirusa zakaźnego i odróżnić go od tego samego wirusa, który stał się niezakaźny za pomocą metod dezynfekcji. W tym miejscu opisujemy protokół wyboru aptamerów, które mogą odróżnić wirusy zakaźne od wirusów niezakaźnych przy użyciu systematycznej ewolucji ligandów przez wzbogacenie wykładnicze (SELEX). Korzystamy z dwóch cech firmy SELEX. Po pierwsze, SELEX może być dostosowany do usuwania konkurencyjnych celów, takich jak wirusy niezakaźne lub inne podobne wirusy, przy użyciu selekcji liczników. Dodatkowo, cały wirus może być wykorzystany jako cel dla SELEX, zamiast np. białka powierzchniowego wirusa. Cały wirus SELEX pozwala na wybór aptamerów, które wiążą się specyficznie ze stanem natywnym wirusa, bez konieczności przerywania działania wirusa. Metoda ta pozwala zatem na uzyskanie czynników rozpoznających w oparciu o funkcjonalne różnice w powierzchni patogenów, które nie muszą być znane z wyprzedzeniem.

Ponieważ aptamery DNA można pozyskać za pomocą metody SELEX w probówce15, strategia SELEX została starannie zaprojektowana tak, aby obejmować zarówno etapy selekcji pozytywnej w kierunku nienaruszonego, całego wirusa zakaźnego (tj. zatrzymanie cząsteczek DNA wiążących się z wirusem zakaźnym), jak i etapy kontrselekcji dla tego samego wirusa, który został uczyniony niezakaźnym za pomocą konkretnej metody dezynfekcji, a mianowicie naświetlania UV, poprzez odrzucenie sekwencji DNA zdolnych do wiązani...

Udostępniamy protokół, który może być ogólnie stosowany do wybranych aptamerów, które wiążą się tylko z wirusami zakaźnymi, a nie z wirusami, które stały się niezakaźne za pomocą metody dezynfekcji lub z innymi podobnymi wirusami. Otwiera to możliwość określenia statusu zakaźności w testach przenośnych i szybkich.

Selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych

Virus infections have a major impact on society; most methods of detection have difficulties in determining whether a detected virus is infectious, ...

Protokół ten opisuje, w jaki sposób wybrać aptamery DNA, które potrafią odróżnić wirusy zakaźne od wirusów niezakaźnych, w celu uzyskania cząsteczki wykrywającej zdolnej do informowania o zakaźności próbek klinicznych lub środowiskowych. Technika ta może być stosowana do uzyskiwania selektywnych aptamerów dla wielu innych wirusów, w tym nowych wirusów, ponieważ nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat struktur lub sekwencji wirusa. Technika ta pozwala na opracowanie czujników aptamerowych do diagnostyki klinicznej i monitorowania środowiska zakaźnych wirusów w celu wykrycia, czy ktoś jest zaraźliwy lub czy metoda dezynfekcji środowiska działa zgodnie z przeznaczeniem.Selekcja może być trudnym procesem, szczególnie dla tych, którzy są w niej nowicjuszami. Ważne jest, aby zoptymalizować warunki PCR i monitorować postęp selekcji za pomocą qPCR. Procedurę zademonstruje Marcos Gramajo, doktorant z mojego laboratorium.Na początek zaprojektuj początkową jednoniciową bibliotekę i startery SS-DNA. Pozyskaj oligonukleotydy DNA ze źródeł komercyjnych ze standardowym oczyszczaniem odsalającym. Oczyść bibliotekę SS-DNA i startery na 10% denaturującym elektroforezie w żelu poliakrylamidowym, a następnie wytrącaniu etanolu.Następnie należy zaopatrzyć się w roztwór podstawowy wirusów zakaźnych i niezakaźnych lub przygotować je zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. W celu denaturacji biblioteki SS-DNA należy zmieszać 10 mikrolitrów 100-mikromolowej biblioteki SS-DNA z 240 mikrolitrami buforu SELEX. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut w suchej kąpieli, a następnie umieść rurkę na lodzie na 15 minut.Wymieszaj 250 mikrolitrów biblioteki SS-DNA w buforze SELEX z 50 mikrolitrami zakaźnego wirusa w celu pozytywnej selekcji. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 400 mikrolitrów jednej milimolowej sekwencji T20 do filtra o pojemności 0,5 mililitra, aby zablokować niespecyficzne miejsca.Inkubuj filtry przez 30 minut. Odwirować filtr przy sile 14 000 G przez 10 minut, aby usunąć roztwór T20. Następnie trzykrotnie przemyj filtr buforem SELEX, aby usunąć nadmiar sekwencji T20.Następnie dodaj mieszaninę zakaźnych wirusów z biblioteki SS-DNA do zablokowanego filtra 100 kilodaltonów i odwiruj, aby przepłukać niezwiązane sekwencje. Umyć filtr trzykrotnie, dodając 400 mikrolitrów buforu SELEX i odwirowując. Zachowaj frakcję w filtrze i wyrzuć przepływ.Aby wymyć związane sekwencje, należy zmienić probówkę zbiorczą filtra wirówkowego i dodać do filtra 300 mikrolitrów buforu SELEX zawierającego osiem molowych moczników. Podgrzej filtr w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie odwiruj, aby zebrać przepływ zawierający eluowane sekwencje. Po zakończeniu umyj materiały 10% wybielaczem.Następnie dodać roztwór wirusa zakaźnego SS-DNA zebrany we wcześniejszym kroku do zablokowanego filtra o mocy 10 kilodaltonów, odwirować przy 14 000 G przez 15 minut i odrzucić przepływ. Przemyć filtr trzykrotnie 300 mikrolitrami buforu SELEX w celu usunięcia mocznika przez odwirowanie i wyrzucić przepływ. Odzyskaj roztwór w filtrze, obracając go do góry nogami w czystej probówce zbiorczej i odwirowując przez pięć minut.Zmierzyć końcową objętość odzyskanego roztworu za pomocą pipety i oznaczyć ją jako próbkę Round 1A. Weź 90% próbki z rundy 1A jako szablon w pierwszej rundzie i przeprowadź PCR w zoptymalizowanych warunkach. Aby odzyskać SS-DNA za pomocą modyfikowanych streptawidyną kulek magnetycznych lub MB, należy podzielić produkt na 50 mikrolitrów i dodać je do probówek do mikrowirówek zawierających 50 mikrolitrów MB. Inkubować probówkę przez 30 minut z łagodnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.Następnie umieścić probówkę na stojaku magnetycznym, aby odizolować MB i usunąć supernatant przez pipetowanie. Umyć MB dwukrotnie, dodając do probówki 200 mikrolitrów buforu wiążącego i myjącego. Następnie wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i postukaj w nią przed ponownym wymieszaniem MB do jednorodnego roztworu przez pipetowanie.Umieść probówkę ponownie na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Po drugim płukaniu ponownie zawiesić MB w 100 mikrolitrach bufora SELEX i podgrzewać roztwór w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Natychmiast umieść probówkę w stojaku magnetycznym i zbierz supernatant zawierający pulę SS-DNA.Powtórz ten krok odzyskiwania, dodając 50 mikrolitrów buforu SELEX. Zmierz końcową objętość odzyskanej frakcji i oznacz ją jako Round 1X. W celu denaturacji puli SS-DNA należy pobrać 60% próbki Round 1X i wymieszać ją z 50 mikrolitrami buforu SELEX.Podgrzej próbkę w suchej kąpieli, a następnie umieść probówkę na lodzie na 15 minut. Następnie wymieszaj zdenaturowaną pulę SS-DNA w buforze SELEX z 50 mikrolitrami każdego wirusa jako etap kontrselekcji i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu niespecyficznych miejsc w filtrach wirówkowych, dodać mieszaninę zdenaturowanej puli SS-DNA inkubowanej z roztworem wirusa do zablokowanego filtra 100 kilodaltonów.Odwirować filtr o stężeniu 14 000 G przez 10 minut i zebrać przepływ. Weź 300 mikrolitrów frakcji i wymieszaj z 50 mikrolitrami zakaźnego wirusa zawierającego 100 milionów kopii na mililitr. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Przygotować wzorcową mieszaninę wzorcową qPCR i rozcieńczenia oczyszczonej biblioteki SS-DNA, jak opisano w tekście. Uruchom qPCR, aby określić cykl progowy. Po przebiegu użyj krzywej standardowej, aby określić ilościowo ilość SS-DNA w rundzie 1A i rundzie 1X.Następnie oblicz wydajność elucji jako ilość związanego DNA podzieloną przez początkową ilość DNA i wykreśl wydajność elucji w stosunku do liczby okrągłej. Na koniec wykreśl krzywe topnienia dla różnych rund. W przypadku sekwencjonowania o wysokiej przepustowości należy wybrać odpowiedni zestaw dostępny na rynku.Przygotuj wiele pul rund selekcyjnych reprezentujących wysokie, średnie i niskie wzbogacenie, a także pulę końcową, używając innej pary indeksów w adapterach dla każdej puli. Następnie wyślij przygotowaną bibliotekę końcową do zakładu sekwencjonowania. Na potrzeby analizy sekwencjonowania sekwencje zostały zdemultipleksowane przez urządzenie do sekwencjonowania.Usuń adaptery sekwencjonowania i startery wyboru za pomocą programu wiersza poleceń Cutadapt. Następnie użyj programu FASTX-Toolkit, aby usunąć sekwencje o niskiej jakości. Następnie połącz pliki sekwencji w odwrotnym kierunku z tymi w kierunku do przodu za pomocą FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ funkcji uzupełniania na plikach w odwrotnym kierunku.Następnie użyj wbudowanego programu CAT, aby scalić pliki w jeden plik. Zestaw narzędzi do analizy FASTAptamer służy do analizowania wzbogacenia sekwencji w różnych pulach wyboru. Po pierwsze, aby użyć funkcji klastra FASTAptamer count i FASTAptamer w celu grupowania podobnych sekwencji w klastry.Następnie należy użyć funkcji wzbogacania FASTAptamer w celu uzyskania informacji na temat wzbogacania sekwencji i klastrów. Zidentyfikuj potencjalne sekwencje aptamerów na podstawie informacji o wzbogaceniu uzyskanych w wyniku analizy sekwencji. Wybierz kilka sekwencji aptamerów i przeprowadź wstępne badanie przesiewowe za pomocą testu wiązania.W niniejszej analizie qPCR wykorzystano do monitorowania postępu SELEX zakaźnych aptamerów specyficznych dla SARS-CoV-2. Wydajność elucji początkowo wzrastała z każdą rundą SELEX i wyrównywała się w rundach ósmej i dziewiątej. Porównując krzywe topnienia, zaobserwowano przesunięcie od szczytu przy wysokiej temperaturze topnienia z 77 do 79 stopni Celsjusza.Co więcej, w ostatnich dwóch rundach zaobserwowano szczyt przy niskiej temperaturze topnienia. Pokazano względną obfitość odczytów na milion dla zsekwencjonowanego SARS2 AR10 uzyskanego w kolejnych rundach selekcji. Przewidywana struktura SARS2 AR10 wykazała ustrukturyzowaną strukturę drugorzędową zawierającą region pętli macierzystej, który może być zaangażowany w rozpoznawanie wirusa.Po uzyskaniu aptamerów można je włączyć do elektrycznych czujników optycznych, innego rodzaju czujników, w celu opracowania portalu i szybkiego testu wykrywania wirusów, który może informować o zakaźności wirusa. Przewidujemy, że możliwe będzie uzyskanie aptamerów specyficznych dla różnych wariantów lub stereotypów wirusa, co umożliwi szybkie monitorowanie wariantów, które są największym zagrożeniem dla społeczeństwa.

in-vitro-selection-aptamers-to-differentiate-infectious-from-non

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Aptamery to krótkie oligonukleotydy rybo- lub deoksyrybonukleinowe, wyselekcjonowane metodami ewolucji in-vitro na podstawie powinowactwa do konkretnego celu. Aptamery są narzędziami rozpoznawania molekularnego o wszechstronnych zastosowaniach terapeutycznych, diagnostycznych i badawczych. Prezentujemy metody selekcji aptamerów przeciwko białku amyloid β, czynnikowi sprawczemu choroby Alzheimera.

Wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby Alzheimera

Protokoły SELEX obejmują wiele rund selekcji, z których każda wymaga regeneracji związanych ligandów, co z kolei wymaga stałych sekwencji starterów flankujących regiony losowej biblioteki. Te stałe sekwencje starterów mogą zakłócać proces selekcji (powodując wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne). Przedstawiamy tutaj protokół bez użycia starterów.

Selekcja aptamerów bez użycia starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki DNA

Kilka aptamerów 2’-Fluoro RNA przeciwko HIV-1Ba-L gp120 o powinowactwie nanomolowym zostało wyizolowanych z biblioteki RNA za pomocą procedury in vitro SELEX. Stworzono nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji hamującej przeciwko gp120, która wykazuje znaczny potencjał w systemowej terapii przeciw HIV.

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Dostępny jest protokół do wyboru aptamerów przełączających strukturę dla małych cząsteczek w oparciu o przestrajalną metodę selekcji kulek magnetycznych z regulacją. Aptamery wybrane ze względu na właściwości przełączania struktur są korzystne w testach, które wymagają zmiany konformacyjnej w celu zasygnalizowania obecności celu, takich jak opisany test nanocząstek złota.

Metoda wyboru aptamerów przełączających strukturę zastosowana do kolorymetrycznego testu nanocząstek złota

Tutaj prezentujemy protokół, który bada konkretne etapy wejścia wirusa w celu identyfikacji i oceny nowych środków przeciwwirusowych.

Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Pierwszym krokiem w cyklu życia arenawirusa jest dołączenie cząsteczek wirusa do komórek gospodarza. Przedstawiamy ilościowy test oparty na (q)RT-PCR do ultraczułego wykrywania i ilościowego oznaczania zdarzeń związanych z przyłączeniem arenawirusa.

Bardzo czuły test do pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Koniecznym krokiem w rozwoju aptameru przeciwnowotworowego jest przetestowanie jego wiązania z celem. Demonstrujemy test oparty na cytometrii przepływowej w celu zbadania tego wiązania, podkreślając znaczenie włączenia aptameru kontroli ujemnej i komórek rakowych, które są dodatnie lub ujemne dla tego konkretnego białka.

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

Poznaj metodę selekcji aptamerów DNA do rozróżniania wirusów zakaźnych od niezakaźnych. Technika ta umożliwia rozwój czujników do diagnostyki klinicznej i monitorowania środowiska bez konieczności znajomości struktury wirusa.

Selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych

Przeglądaj więcej filmów