Name: Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę obrazowania PET limfocytów B CD19+ w mysim modelu EAE. Technika umożliwia ilościową analizę dynamiki komórek B w ośrodkowym układzie nerwowym i rdzeniu kręgowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony ośrodka obrazowania małych zwierząt SCi3 w Stanford oraz Dr. Frezghi Habte za jego pomoc techniczną przy PET/CT. LC-MS jest wykonywany przez główny personel w głównym ośrodku spektrometrii mas Uniwersytetu Stanforda (SUMS) i doceniamy personel za świadczenie tej usługi. Dziękujemy firmie Horizon Therapeutics za bardzo uprzejme dostarczenie hCD19-mAb, a w szczególności Jodi Karnell za jej wskazówki techniczne i wsparcie. Praca ta została sfinansowana przez NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1).

<ol><li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+with+Rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).</li>
<li>Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inebilizumab%2C+a+B+cell-depleting+anti-CD19+antibody+for+the+treatment+of+autoimmune+neurological+diseases%3A+Insights+from+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107(2016).</li>
<li>Stevens, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+CD19+PET+tracer+for+detecting+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Development of a CD19 PET tracer for detecting B cells in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 275(2020).</li>
<li>Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+neuroinflammation+using+%5B11C%5DDPA-713+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57243(2018).</li>
<li>Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+antigen-specific+antibody+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+recombinant+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).</li>
<li>Haugen, M., Frederiksen, J. L., Degn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+follicle-like+structures+in+multiple+sclerosis-With+focus+on+the+role+of+B+cell+activating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">cell follicle-like structures in multiple sclerosis-With focus on the role of B cell activating factor.</a> Journal of Neuroimmunology. 273 (1-2), 1-7 (2014).</li>
<li>James, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis+using+64Cu-Rituximab+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li>
<li>Lyons, J. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+are+critical+to+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+protein+but+not+by+a+short+encephalitogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide.</a> European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).</li>
</ol>

Przeciwciało CD19 zostało dostarczone przez firmę Horizon Therapeutics.

W tym artykule opisano uproszczoną metodę obrazowania ludzkich komórek B CD19 + w mysim modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu CD19-PET. Ze względu na niejednorodny obraz stwardnienia rozsianego i różne odpowiedzi na leczenie, zarządzanie nim w klinice może być trudne i bardzo potrzebne są nowe podejścia do wyboru i monitorowania terapii. Obrazowanie PET może służyć jako potężne narzędzie do monitorowania postępu choroby i indywidualnej odpowiedzi na terapię zubożającą limfocyty B. Oprócz stwardnienia rozsianego, obrazowanie CD19-PET może być stosowane do monitorowania wyczerpania komórek B po leczeniu w podtypach chłoniaków i białaczki lub innych chorób zależnych od komórek B. Ten protokół i reprezentatywne dane pokazują użyteczność obrazowania limfocytów B w chorobach neurologicznych.
Do badania ludzkich limfocytów B CD19 + w kontekście stwardnienia rozsianego wybraliśmy zależny od limfocytów B MOG1-125 EAE model7. Podobnie jak inne modele EAE, model ten objawia się objawami postępującego paraliżu i infiltracji komórek odpornościowych do OUN. Jednak model MOG1-125 jest wyjątkowy, ponieważ jest modelem sterowanym przez limfocyty B: myszy zawierają różną liczbę komórek B w przestrzeni podpajęczynówkowej w oponach mózgowych, pniu mózgu, miąższu i komorach. Limfocyty te mogą być słabo rozproszone w tych regionach i/lub tworzyć struktury podobne do pęcherzyków, które obserwuje się również u ludzi ze stwardnieniemrozsianym 8,9. Oprócz używania naiwnych myszy jako kontroli, można użyć kompletnego zestawu do indukcji adiuwanta Freunda (CFA) (tj. identycznej emulsji indukcyjnej do tego, którą podaje się myszom EAE bez białka MOG). W mysim modelu EAE bariera krew-mózg (BBB) jest dysfunkcyjna i umożliwia przekraczanie większych jednostek, takich jak przeciwciała. Radioznacznik CD19-mAb zwiąże się i pozostanie w OUN tylko wtedy, gdy obecne są komórki B; znacznik będzie krążył z powrotem do puli krwi, jeśli limfocyty B nie są obecne. Wykazaliśmy to za pomocą zliczania promieniowania gamma i autoradiografii ex vivo tkanek OUN poprzez perfuzję przed pomiarem poziomu radioaktywności w tkankach. Wykazaliśmy to również we wcześniejszych publikacjach informujących o zastosowaniu radioznaczników PET opartych na mAb (tj. Metod obrazowania immunoPET) do wykrywania komórek B w OUN 1,2.
Chelator DOTA został użyty, ponieważ był stosowany w klinicznym obrazowaniu PET z peptydami i przeciwciałami znakowanymi miedzią-64, a naszym celem jest translacja hCD19-mAb do obrazowania klinicznego pacjentów ze stwardnieniem rozsianym. DOTA ma odpowiednie powinowactwo wiązania do miedzi-64 in vivo. Stabilność in vivo jest bardzo ważna, ponieważ wolne 64Cu trafia do wątroby i może zaciemniać sygnał związanego radioznacznika; Dlatego ważne jest, aby zmierzyć sygnał w wątrobie, aby obliczyć względny sygnał w porównaniu z innymi narządami. Mięśnie są zwykle traktowane jako tkanka kontrolna, ale w przypadku EAE w mięśniach może występować stan zapalny. Okres półtrwania 64Cu wynosi 12,7 h, co daje wystarczająco dużo czasu na związanie się DOTA-hCD19-mAb z celem, zapewniając jednocześnie możliwość pomiaru sygnału przez PET. Podczas przygotowywania koniugatu należy przeprowadzić reakcje testowe na małą skalę (75-125 μg) w celu określenia ilości DOTA, którą należy dodać do mAb, aby uzyskać pożądany stosunek DOTA/mAb (np. reakcja 6-10-krotnego nadmiaru estru DOTA-NHS na mol mAb może dać koniugat 1-2 DOTA/mAb). Czas reakcji i temperatura (np. 2-4 godziny lub noc w temperaturze 4 °C lub temperaturze pokojowej) również wpływają na stosunek DOTA/mAb i powinny być zoptymalizowane. Można przeprowadzić miareczkowanie nieradioaktywną miedzią w celu obliczenia liczby DOTA na mAb; jednak zalecamy wykonanie MALDI-MS i/lub LC-MS w celu uzyskania bardziej wiarygodnych i dokładnych wyników.
Obliczony stosunek DOTA/mAb jest średnią wartością dla konkretnej próbki i oczekuje się pewnej zmienności. W przypadku MALDI pobiera się kilka dawek na próbkę dla sprzężonych i niesprzężonych mAb. Następnie obliczamy stosunek sprzężonych do niesprzężonych, aby określić średnią liczbę DOTA/mAb. Stosunek DOTA/mAb jest ważny, ponieważ zbyt wiele chelatorów zakłóci wiązanie przeciwciał, a zbyt mała doprowadzi do niespójnego znakowania radioaktywnego i niskiego sygnału. Stosunek między partiami koniugatu powinien być bardzo zbliżony, aby utrzymać stałą intensywność sygnału i kinetykę wiązania; Idealnie byłoby, gdyby ta sama partia koniugatu była używana do wszystkich eksperymentów w ramach danego badania. Obiecującą techniką zmniejszania potencjalnego wpływu na immunoreaktywność z powodu możliwej nadmiernej koniugacji jest zastosowanie koniugacji specyficznejdla miejsca 10 , w której koniugacja chelatora jest selektywna miejscowo na glikanach łańcucha ciężkiego przeciwciała, gwarantując w ten sposób dodanie 1 chelatora na mAb.
Warunki reakcji znakowania radioaktywnego powinny być zoptymalizowane, aby zapewnić najwyższą skuteczność znakowania i wydajność, ponieważ różnice między innymi w przeciwciałach, stosunku DOTA/mAb i aktywności molowej 64Cu będą miały wpływ na znakowanie radioaktywne. Zastosowanie optymalnego stosunku koniugatu 64Cu do mAb może pozwolić na użycie radioznacznika bez oczyszczania, skracając czas potrzebny do znakowania radioaktywnego i strat spowodowanych przepływem grawitacyjnym i rozpadem promieniotwórczym. Stałą i wiarygodną aktywność molową można również osiągnąć, gdy stosuje się ten sam stosunek koniugatu 64Cu do mAb, co jest szczególnie ważne przy porównywaniu wyników w wielu kohortach myszy lub badaniach obrazowych. Warunki ITLC mogą być również modyfikowane w celu dopasowania do każdego użytkownika. Jeżeli konieczne jest oczyszczanie, należy zachować podwielokrotność do spektrofotometrii HPLC i/lub UV/Vis, aby można było obliczyć aktywność molową.
Należy zauważyć, że stosowanie przeciwciał znakowanych radioaktywnie do obrazowania może być trudne. Istotne jest, aby przeciwciało użyte w radioznaczniku było biologicznie obojętne, aby nie wywoływało efektu fizjologicznego. Ponadto, ponieważ przeciwciała długo przebywają we krwi, należy czekać wystarczająco długo na krążenie, wiązanie i klirens danego mAb, aby zapewnić odpowiedni sygnał do tła bez pogorszenia jakości obrazu. Zazwyczaj wystarczające jest odczekanie 20-48 godzin na mAb znakowane 64Cu, ale należy obrazować po 2, 4, 6, 12, 24, 48 godzinach od wstrzyknięcia podczas oceny nowego znacznika mAb PET, aby określić najlepszy punkt czasowy do obrazowania w danym modelu gryzoni. To samo dotyczy pozyskiwania obrazów ARG o najwyższym stosunku sygnału do tła. Reprezentatywne obrazy w tym protokole zostały wykonane po 18-20 godzinach od wstrzyknięcia, chociaż można użyć innych punktów czasowych w zależności od użytego radioizotopu. Różne przeciwciała wiążące się z różnymi epitopami CD19 dają różne wyniki i powinny być rygorystycznie scharakteryzowane.
Podczas analizy sygnału rdzenia kręgowego ważne jest, aby ułożyć myszy na plecach w łóżku skanującym, aby zmniejszyć ruch spowodowany oddychaniem. Dodatkowo ułożenie na plecach może pomóc wyprostować kręgosłup u myszy, które mają zwiększoną krzywiznę kręgosłupa z powodu postępu choroby EAE. Innym ważnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę, dążąc do wykrycia sygnału w kręgosłupie i rdzeniu kręgowym, jest unikanie wstrzykiwania MOG1-125 w bok, ponieważ miejsca wstrzyknięcia mogą wiązać znacznik ze względu na związaną odpowiedź immunologiczną w tych obszarach. Bliskie sąsiedztwo miejsca wstrzyknięcia może zakłócać analizę rdzenia kręgowego; W związku z tym wstrzyknięcia w klatkę piersiową są preferowane w przypadku zastosowania opisanego w niniejszym dokumencie.
Zastosowane techniki analizy obrazu są specyficzne dla obrazowania OUN. Narzędzie do tworzenia atlasu mózgu w oprogramowaniu do analizy obrazu zapewnia powtarzalne i wiarygodne wyniki, o ile rejestracja PET i CT jest dokładna. Korzystanie z półautomatycznego atlasu mózgu 3D i dostosowywanie go do czaszki każdej myszy pozwala na uzyskanie spójnego zwrotu z inwestycji między zwierzętami. Ponieważ obecnie nie ma zautomatyzowanego lub półautomatycznego podejścia do analizy sygnału w rdzeniu kręgowym, należy ręcznie narysować zwrot z inwestycji. Warto zauważyć, że przy ilościowym określaniu komórek B CD19 + (lub dowolnego typu komórek obecnych zarówno w szpiku kostnym, jak i rdzeniu kręgowym) bardzo ważne jest wyeliminowanie sygnału powstającego z kręgosłupa i szpiku kostnego w jak największym stopniu. Powodem tego jest to, że wiadomo, że myszy naiwne zawierają więcej komórek B CD19 + w szpiku kostnym niż myszy EAE, u których komórki B opuszczają obrzeża, aby infiltrować OUN 5,11. Ten sygnał szpiku kostnego może przesłaniać prawdziwy sygnał w rdzeniu kręgowym.
Aby określić prawdziwy sygnał rdzenia kręgowego przy jednoczesnym zminimalizowaniu udziału sygnału z kręgosłupa i szpiku kostnego, można użyć progowania Otsu obrazu CT w celu uzyskania niezmiennego zwrotu z inwestycji dla kręgosłupa. Oddzielny ROI rdzenia kręgowego można wtedy łatwo narysować w obrębie kręgosłupa. Tę samą technikę można również zastosować do pomiaru szpiku kostnego w kości udowej. Jest to bardzo przydatna metoda uzyskiwania wglądu w wiązanie znaczników w rdzeniu kręgowym. Jednak ze względu na stosunkowo niską rozdzielczość przestrzenną PET i problemy związane z efektem częściowej objętości podczas skanowania małych obszarów anatomicznych myszy, zastosowanie dodatkowych technik potwierdzających ex vivo (np. Zliczanie promieniowania gamma, ARG) umożliwia walidację wiązania radioznacznika w rdzeniu kręgowym bez obecności krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego lub sygnału rozlewającego się z kręgosłupa.
Sygnał w rdzeniu kręgowym szyjnym / piersiowym ma tendencję do różnicowania się u myszy EAE w zależności od ciężkości choroby i liczby limfocytów B naciekających podczas adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Ta różnica w liczbie naciekających komórek B, a także niewielka ilość komórek B w OUN w porównaniu z tymi w szpiku kostnym miednicy/rdzenia kręgowego nieleczonych myszy, może utrudnić ilościowe określenie tkanki rdzenia kręgowego in vivo u myszy. Biorąc pod uwagę rozdzielczość przestrzenną PET w obrazowaniu małych zwierząt, sygnał ze szpiku kostnego może rozlać się na sygnał rdzenia kręgowego. Wykonana tutaj biodystrybucja ex vivo i autoradiografia pomagają w walidacji sygnału PET kręgów w porównaniu z tkanką rdzenia kręgowego. Myszy są poddawane perfuzji przed sekcją w celu usunięcia niezwiązanego znacznika z puli krwi, tak aby wyniki zliczania promieniowania gamma i autoradiografii odzwierciedlały znacznik, który jest faktycznie związany w każdym narządzie, a nie znacznik, który znajduje się w puli krwi w tym narządzie.
Radioznaczniki krążą we krwi, a w przypadku znaczników przeciwciał często niezwiązany radioznacznik jest obecny we krwi przez kilka tygodni po pierwszym wstrzyknięciu. Ponieważ obrazujemy mózg i rdzeń kręgowy, które mają wiele naczyń krwionośnych, ważne jest, aby zrozumieć, która część sygnału jest naprawdę spowodowana wiązaniem znacznika w mózgu / tkance będącej przedmiotem zainteresowania, a która jest obecna w puli krwi. W związku z tym konieczne jest podzielenie sygnału mózgowego przez sygnał w puli serca/krwi. W warunkach klinicznych do oceny ilościowej można zastosować te same techniki analizy obrazu progów Otsu kręgów i ROI tkanek rdzenia kręgowego. Biorąc pod uwagę większą objętość tkanek u ludzi w porównaniu z myszami, wpływ efektów objętości częściowej powinien być znacznie mniejszy, co prowadzi do poprawy dokładności i eliminuje potrzebę stosowania technik ex vivo w celu potwierdzenia wyników in vivo . Zastosowanie PET w klinice pozwoli klinicystom na spersonalizowanie terapii dla każdego pacjenta w zależności od indywidualnego obciążenia komórkami B.
ARG jest szczególnie przydatny do pozyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości, aby umożliwić dokładniejsze określenie przestrzennej lokalizacji wiązania znacznika w małych obszarach, takich jak pień mózgu i móżdżek. Te same skrawki i/lub sąsiednie sekcje można zachować do barwienia immunohistochemicznego w celu potwierdzenia obecności limfocytów B. Wcześniej wybarwiliśmy tkanki OUN CD45R / B220 (rysunek uzupełniający S1), aby skorelować liczbę komórek B z sygnałem PET i ARG 5,9. Barwienie można następnie porównać przestrzennie z wynikami ARG w celu sprawdzenia, czy sygnał radioznacznika pasuje do wzorca barwienia. Limfocyty B mogą być obecne w skupiskach lub dyfuzyjnie w całym pniu mózgu; Czułość PET jest wystarczająco wysoka, aby zmierzyć sygnał, co jest zachęcające do translacji klinicznej. W przypadku rdzenia kręgowego ARG usunięcie rdzenia kręgowego z kręgów zapewnia, że mierzony sygnał jest spowodowany wiązaniem znacznika w tkance rdzenia kręgowego, a nie w szpiku kostnym i/lub krwi, co może zaciemniać obrazy PET z powodu częściowego wpływu objętości.
Podobnie jak w przypadku ARG, zliczanie promieniowania gamma ex vivo umożliwia ilościowe określenie sygnału radioaktywnego w poszczególnych narządach. W przypadku tej konkretnej techniki ważne jest, aby zmierzyć mokrą masę tkanek i upewnić się, że znajdują się one na dnie odpowiednich probówek przed umieszczeniem probówek w liczniku gamma. Probówki muszą być oznaczone numerem myszy i tkanką, tak aby używana była właściwa probówka; Probówkę następnie waży się na skalibrowanej wadze, a narządy umieszcza się z dokładnością do jednej dziesiątej mikrograma (0,0001 mg). Niektóre tkanki są bardzo małe, a różnica w masie probówki przed i po będzie rzędu 0,0001 mg. Tkanki należy zważyć natychmiast po sekcji, aby zapobiec utracie wilgoci, co skutkuje mniejszą masą. Po zważeniu rurki mózgowe i rdzenia kręgowego należy wypełnić PBS, aby zapobiec wysuszeniu przed zamrożeniem tych tkanek do ARG.

Stwardnienie rozsiane jest zaburzeniem neurologicznym o podłożu immunologicznym; unikalna prezentacja u każdego pacjenta może utrudnić leczenie zarówno pacjentom, jak i klinicystom1. Sama choroba charakteryzuje się obecnością zmian demielinizacyjnych i infiltracji komórek odpornościowych w mózgu i rdzeniu kręgowym, co skutkuje upośledzeniem fizycznym i poznawczym2. Tradycyjny paradygmat, zgodnie z którym stwardnienie rozsiane jest chorobą wywoływaną przez limfocyty T, został po raz pierwszy zakwestionowany w przełomowym badaniu klinicznym fazy II rytuksymabu3, terapii ukierunkowanej na podzbiór limfocytów B CD20+. Od tego czasu opracowano dodatkowe terapie komórkami B, które są ukierunkowane na CD194, biomarker limfocytów B pan, który ulega ekspresji w szerszym zakresie limfocytów B, co może być korzystne zarówno diagnostycznie, jak i terapeutycznie. Co więcej, istniejące metody oceny skuteczności leczenia (tj. monitorowania liczby nawrotów i aktywności rezonansu magnetycznego [MRI]) nie pozwalają na wczesne pomiary odpowiedzi, co naraża pacjentów na znaczne ryzyko uszkodzenia OUN z powodu nieoptymalnego doboru i optymalizacji terapii. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania strategii monitorowania określonych komórek odpornościowych, takich jak limfocyty B CD19+, w czasie rzeczywistym w OUN i na obrzeżach pacjentów ze stwardnieniem rozsianym.
Obrazowanie PET to solidna technika obrazowania, która pozwala na wizualizację in vivo całego ciała danego celu zainteresowania, takiego jak CD19. Podczas gdy pobieranie krwi, rejestry częstości nawrotów i monitorowanie zmian za pomocą rezonansu magnetycznego dostarczają informacji na temat skuteczności leczenia, obrazowanie PET może umożliwić badaczom i klinicystom monitorowanie skuteczności terapii w całym ciele. To proaktywne podejście do monitorowania terapeutycznego pozwala klinicystom oceniać skuteczność leków w czasie rzeczywistym, umożliwiając szybkie dostosowanie w razie potrzeby. Monitorowanie lokalizacji i gęstości populacji komórek związanych z chorobą umożliwia również długotrwałą ocenę ciężkości choroby przy użyciu informacji anatomicznych specyficznych dla pacjenta. W związku z tym niezbędne jest opracowanie powtarzalnych metod analitycznych, aby niezawodnie wykorzystać pełny potencjał obrazowania PET w warunkach klinicznych i przedklinicznych.
Ten artykuł opisuje metody (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) do wykonywania obrazowania PET, liczenia gamma ex vivo i autoradiografii (ARG) komórek B CD19+ z przeciwciałem monoklonalnym (mAb) anty-ludzkim CD19 znakowanym 64Cu, znanym jako 16C4-TM (64Cu-hCD19-mAb), w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) wywołanego u myszy transgenicznych z ekspresją ludzkiego CD19 (hCD19) przy użyciu ludzkiej rekombinowanej mieliny glikoproteina oligodendrocytów 1-125 (MOG1-125). Dostarczamy również metody do dokładnej i powtarzalnej oceny wiązania radioznacznika w mózgu i rdzeniu kręgowym, obu krytycznych miejscach patogenezy, często poważnie dotkniętych w tym i innych modelach neurodegeneracyjnych. Techniki te pozwalają na nieinwazyjne badanie roli limfocytów B w patologii choroby i mają potencjał do klinicznego przełożenia na ocenę skuteczności terapii komórkami anty-B w stwardnieniu rozsianym.

<table><tbody><tr><td>0,5 ml 50 kDa MWCO Filtr odśrodkowy</td><td>MiliporeSigma</td><td>UFC505008</td><td>filtr odśrodkowy</td></tr><tr><td>64Cu-CuCl3</td><td>Uniwersytet Waszyngtoński w St. Louis; Uniwersytet Wisonsin, Madison; lub innego dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AR-2000 Skaner obrazowania radiowego TLC</td><td>Eckert & Kaseta autoradiograficzna Ziegler</td><td>AR-2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole Palmer</td><td>EW-21700-34</td><td>Aluminiowa, 8" x 10"</td></tr> <tr><td>Film autoradiograficzny</td><td>&nbsp; GE Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td>Przechowywanie ekranu fosforowego BAS-IP SR 2025 E Super rozdzielczość, 20 x 25 cm, tylko ekran</td></tr><tr><td>Cewnik igłowy motylkowy</td><td>SAI Technologie infuzyjne</td><td>BLF-24</td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS-ester</td><td>Makrocykliczny</td> zestaw indukcyjny <td>B-280</td><td></td></tr><tr><td>EAE</td><td>Hooke Laboratories</td><td>EK-2160</td><td></td></tr><tr><td>Licznik Geigera</td><td>Ludlum</td><td>14C</td><td></td></tr><tr><td>Skaner GNEXT PET/CT</td><td>Sofie</td><td>GNEXT</td><td></td></tr><tr><td>Hidex Automatyczny licznik gamma</td><td>Kolumna Hidex</td><td>AMG</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>&nbsp; 00H-2146-K0</td><td>5 &mu; m SEC-s3000 400 & Aring;, 300 x 7,8 mm</td></tr><tr><td>Illustra NAP-5</td><td>kolumna Cytiva</td><td>17085301</td><td>Kolumna grawitacyjna DNA</td></tr><tr><td>Obraz J</td> Oprogramowanie do analizy <td>NIH</td><td></td><td>ARG</td></tr><tr><td>Probówki do zbierania o niskim poziomie wiązania białek (1,5 ml)</td><td>Spektrofotometr Thermo Scientific</td><td>PI90410</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Termo Scientific</td><td>840281400</td><td>Mikro/nanospektrofotometr UV-Vis</td></tr><tr><td>Probówki PCR 0,2 ml, do</td><td></td> obrazowania luminoforowego <td>Eppendorf</td> 30124707 <td></td></tr><tr><td>Typhoon klasy DNA 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr>Oprogramowanie do analizy PET<td>VivoQuant</td><td>Invicro</td><td>w wersji 4 z łatką 3</td>; <td>należy zakupić dodatek do atlasu mózgu</td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89882</td><td>Kolumna odsalająca</td></tr></tbody></table>

obrazowanie limfocytów b cd19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography

Stwardnienie rozsiane (MS) jest najczęstszą chorobą demielinizacyjną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) dotykającą młodych dorosłych, często powodującą deficyty neurologiczne i niepełnosprawność w miarę postępu choroby. Limfocyty B odgrywają złożoną i kluczową rolę w patologii stwardnienia rozsianego i są celem kilku terapii w badaniach klinicznych. Obecnie nie ma sposobu, aby dokładnie wybrać pacjentów do specyficznych terapii komórkami anty-B lub nieinwazyjnie określić ilościowo wpływ tych terapii na obciążenie limfocytów B w OUN i narządach obwodowych. Obrazowanie za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) ma ogromny potencjał, aby dostarczyć bardzo szczegółowych, ilościowych informacji dotyczących czasoprzestrzennego rozmieszczenia i obciążenia limfocytów B in vivo u żywych osób.
Ten artykuł opisuje metody syntezy i zastosowania znacznika PET specyficznego dla ludzkich komórek B CD19+ w dobrze znanym mysim modelu SM opartym na komórkach B, eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), które jest indukowane przez ludzką rekombinowaną glikoproteinę oligodendrocytów mieliny 1-125. Opisano tutaj zoptymalizowane techniki wykrywania i ilościowego oznaczania komórek B CD19 + w mózgu i rdzeniu kręgowym za pomocą obrazowania PET in vivo. Ponadto w artykule przedstawiono uproszczone metody liczenia ex vivo gamma narządów istotnych dla choroby, w tym szpiku kostnego, rdzenia kręgowego i śledziony, wraz z autoradiografią o wysokiej rozdzielczości wiązania znacznika CD19 w tkankach OUN.

Przeciwciało hCD19-mAb sprzęgnięto z DOTA i oznakowano izotopem 64Cu, jak pokazano na Rysunku 2. Myszy z EAE oraz myszy naiwne poddano badaniu PET/CT (Rysunek 3) od 18 do 24 h po wstrzyknięciu 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. Obrazy PET/CT zarejestrowano wspólnie przy użyciu oprogramowania do analizy PET, a tkanki OUN przeanalizowano z wykorzystaniem ręcznie wyznaczonych ROI lub półautomatycznego atlasu mózgu 3D. Wiązanie radioznacznika w ROI (Rysunek 4) było wyższe u myszy z EAE niż u myszy naiwnych. Pomiary gamma ex vivo oraz ARG wykazały zwiększone wiązanie w rdzeniu kręgowym (zarówno w odcinkach lędźwiowych, jak i szyjno-piersiowych) oraz w mózgu (tylko ARG) u myszy z EAE w porównaniu do myszy naiwnych (Rysunek 5 i Rysunek 6). Pomiary gamma ex vivo u myszy perfundowanych wykazały również zmniejszone wiązanie radioznacznika w narządach obwodowych, w tym w śledzionie, kości udowej i szpiku kostnym (Rysunek 5), co jest zgodne z migracją limfocytów B z obwodu i naciekaniem OUN w tym modelu EAE.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Schemat koniugacji i znakowania radioizotopowego w celu otrzymania przeciwciała monoklonalnego swoistego dla ludzkiego CD19 znakowanego 64Cu, 16C4-TM mAb (64Cu-DOTA-hCD19-mAb), wraz z danymi kontroli jakości. (A) Reakcja estru DOTA-NHS z przeciwciałem monoklonalnym hCD19 w celu wytworzenia koniugatu hCD19-DOTA (nie w skali) oraz znakowanie radioizotopowe za pomocą 64Cu-CuCl3 w celu otrzymania 64Cu-DOTA-hCD19-mAb.&#160;(B) Reprezentatywny chromatogram ITLC. Piki w zakresie 40-60 cm odpowiadają znakowanemu przeciwciału; niezwiązany 64Cu-CuCl3 przemieszcza się wraz z fazą ruchomą i występowałby w zakresie od 200 do 240 cm. Na tym chromatogramie nie wykryto wolnego 64Cu-CuCl3. (C) Specyfikacje kontroli jakości znakowanego przeciwciała. Skróty: ester DOTA-NHS = ester mono-N-hydroksysuccynimidowy kwasu 1,4,7,10-tetraazacyklododekanu-1,4,7,10-tetraoctowego; ITLC/HPLC = błyskawiczna chromatografia cienkowarstwowa/wysokosprawna chromatografia cieczowa; MALDI/LC-MS = spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą/chromatografią cieczową; CPM = zliczeń na minutę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig03.jpg" /> 
Rycina 3: Fotografie przedstawiające sposób unieruchamiania myszy w wydrukowanym w technologii 3D podłożu wewnątrz skanera PET w celu uzyskania wysokiej jakości obrazowania rdzenia kręgowego i mózgu przy jednoczesnej minimalizacji ruchów. (A) Wydrukowane w 3D podłoże skanera dla czterech myszy (znane również jako „hotel dla myszy”) wyposażone w elementy grzejne i przewody do znieczulenia. (B) Znieczulone myszy w pozycji grzbietnej w celu maksymalnego wyprostowania kręgosłupa; rejestrowana jest pozycja każdej myszy w podłożu. (C) Myszy zabezpieczone taśmą w obrębie głowy, aby zminimalizować ruchy mózgu, oraz w obrębie brzucha, aby zminimalizować ruchy związane z oddychaniem, bez wpływania na proces oddychania. (D) Podłoże dla myszy umieszczone wewnątrz skanera i przymocowane taśmą do stołu skanującego. Przewody do znieczulenia zostały podłączone ze skanera do podłoża, a stężenie izofluranu ustawiono na 2%. Przed zamknięciem drzwi skanera monitorowano oddychanie myszy, aby zapewnić odpowiedni poziom izofluranu. Skrót: PET = pozytonowa tomografia emisyjna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig04.jpg" /> 
Rycina 4Obrazowanie rdzenia kręgowego oraz analiza mózgu i wyniki z wykorzystaniem oprogramowania do analizy PET. (A) i) Obszary zainteresowania (ROI, kolory różowy i beżowy) wyznaczone na kręgosłup w celu oddzielenia kręgów lędźwiowych od piersiowych i szyjnych oraz przygotowania obrazu do progowania metodą Otsu. ii) Kręgi kręgosłupa (turkusowe i czerwone) zostały wysegmentowane przy użyciu progowania Otsu. iii) Następnie w menu 3D ROI ustawiono kręgi jako niezmienne, a rdzeń kręgowy podzielono na ROI odcinka szyjnego/piersiowego (fioletowy) oraz lędźwiowego (granatowy). iv) Usunięto ROI kręgów, pozostawiając ROI rdzenia kręgowego i zastosowany reprezentatywny atlas mózgu.B) Reprezentatywna analiza wyników PET z różnych obszarów OUN przedstawiona jako %ID/g znormalizowany do ROI serca dla każdego zwierzęcia. Akwizycja PET polegała na 10-minutowym skanie statycznym poprzez Obrazowanie PET/CT. Regiony mózgu ilościowo określone przy użyciu półautomatycznego podejścia z wykorzystaniem atlasu mózgu, przedstawione na panelu A. iv) Reprezentatywne wyniki wskazują na istotność statystyczną lub tendencję do istotnego wzrostu wiązania znacznika w mózgu i piersiowym odcinku rdzenia kręgowego. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu testu Studenta t-test (*: p &#60; 0,0332). Skróty: PET = pozytonowa tomografia emisyjna; ROIs = obszary zainteresowania; CNS = ośrodkowy układ nerwowy; CT = tomografia komputerowa; %ID/g = procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig05.jpg" /> 
Rycina 5Reprezentatywne ilościowe oznaczenie ex vivo pomiar aktywności gamma w różnych narządach u myszy z EAE i myszy naiwnych, wyrażony jako %ID/g. Po badaniu PET myszy poddano perfuzji roztworem PBS w celu usunięcia radiotracera obecnego we krwi, zarówno w formie wolnej, jak i związanego z krążącymi w krwi komórkami CD19.+ limfocyty B, a organy są szybko wycinane i ważone, aby uzyskać dokładną masę każdego z nich. Wiązanie znacznika jest znacznie zmniejszone w śledzionie i szpiku kostnym myszy z EAE w porównaniu do myszy naiwnych. Zwiększone wiązanie radioznacznika obserwuje się zarówno w odcinku lędźwiowym, jak i szyjnym/piersiowym rdzenia kręgowego myszy z EAE. W mózgu nie stwierdzono istotnego wzrostu sygnału radioznacznika, choć wykazuje on tendencję do istotnego wzrostu. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą testu Studenta t-test (*: p &#60; 0,0332; ****: p &#60; 0,0001). Skróty: PET = pozytonowa tomografia emisyjna; %ID/g = procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia; PBS = roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig06.jpg" /> 
Rysunek 6: Obrazy ARG ex vivo przedstawiają wiązanie 64Cu-DOTA-hCD19-mAb w sagitalnych przekrojach mózgu oraz w całych rdzeniach kręgowych myszy z EAE w porównaniu z myszami naiwnymi. Cyfrowe folie fosforowe były skanowane za pomocą obrazownika fosforowego po naświetlaniu próbkami tkanek radioaktywnych przez około 10 okresów połowicznego rozpadu (127 h lub 5 dni). Uzyskane obrazy wykazują wizualnie wyższy sygnał w mózgach myszy z EAE w porównaniu z przekrojami mózgu myszy naiwnych, co jest oczekiwane ze względu na regiony znane z obecności limfocytów B w tym modelu5. W szczególności zwiększony sygnał znacznika obserwuje się w pniu mózgu, móżdżku i komorach w przekrojach mózgu myszy z EAE. Ten wzrost sygnału w przekrojach mózgu myszy z EAE odzwierciedla wyniki ilościowej analizy PET całego mózgu opisanej powyżej. Podobnie, następuje zwiększenie wiązania radioznacznika zarówno w szyjnym/piersiowym, jak i lędźwiowym odcinku rdzenia kręgowego w porównaniu z rdzeniami myszy naiwnych, co odpowiada wynikom uzyskanym podczas zliczania gamma ex vivo. Skróty: PET = pozytonowa tomografia emisyjna; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia; Vent = komory; Cb = móżdżek; BS = pień mózgu; TSc = połączone odcinki piersiowy i szyjny rdzenia kręgowego; LSc = lędźwiowy odcinek rdzenia kręgowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający S1: Barwienie tkanek OUN mózgu myszy naiwnych i z modelem EAE przeciwko CD45R/B220. Komórki B obserwuje się w pniu mózgu, oponach mózgowo-rdzeniowych i istoci białej u myszy z EAE (n = 7 EAE, n = 5 myszy naiwnych, średnio cztery skrawki na zwierzę). Rysunek pochodzi z 5. Paski skali = 5 mm (małe powiększenie [1x]) na obrazach mózgu w przekroju strzałkowym, 100 µm (duże powiększenie [20x]) w pniu mózgu, oponach mózgowo-rdzeniowych i istoci białej móżdżku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/Suppl Fig 1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.

Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Multiple sclerosis (MS) is the most common demyelinating central nervous system (CNS) disease affecting young adults, often resulting in neurological ...

Technika ta wykorzystuje obrazowanie PET do wyjaśnienia rozmieszczenia i dynamiki komórek B in vivo w ośrodkowym układzie nerwowym. Nasze podejście jest korzystne w badaniu chorób neurologicznych, w których dotknięty rdzeń kręgowy sprawia, że analiza jest trudniejsza. Jest więc kilka głównych zalet naszej techniki.Po pierwsze, stworzyliśmy nowe narzędzie do śledzenia biomarkera limfocytów B, które pozwala nam uchwycić szereg podzbiorów limfocytów B i wizualizować je in vivo. Po drugie, nasza metoda analizy rdzenia kręgowego umożliwia bardzo dokładne i powtarzalne określenie ilościowe sygnałów PET w tym regionie. Wspaniałą rzeczą w naszej technice jest to, że jest ona niezależna od choroby.Może być stosowany od przedklinicznego do klinicznego obrazowania PET w dowolnym scenariuszu, w którym interesujące są limfocyty B i/lub rdzeń kręgowy. 18 do 24 godzin po znakowaniu radioaktywnym i wstrzyknięciu przeciwciała myszy, przygotuj mysz do skanowania, nakładając żel do oczu na oczy. Upewnij się, że łóżko skanujące z czterema myszami jest wyposażone w poduszkę grzewczą z izofluranem ustawionym od 1,5 do 2%Umieść mysz w pozycji leżącej na łóżku skanującym i delikatnie pociągnij ogonek myszy, aby wyprostować kręgosłup.Gdy mysz znajdzie się w pozycji leżącej, bezpiecznie przyklej ją miękką taśmą mikroskopową do głowy i brzucha, aby zminimalizować ruch podczas oddychania. Zapisz pozycję skanowania dla każdej myszy w notatniku laboratoryjnym. Po zabezpieczeniu pierwszej grupy zamknij łóżko i sprawdź ułożenie łóżka, przeprowadzając tomografię komputerową.Kliknij środkowe pole widzenia CT, a gdy łóżko znajdzie się na swoim miejscu, uruchom skan testowy CT, aby upewnić się, że umieszczenie jest prawidłowe. Powtarzaj, aż pozycja łóżka będzie zadowalająca. Umieść małą białą taśmę na stole skanera, aby zaznaczyć prawidłowe ustawienie łóżka do końca badania.Otwórz menu Kontroler ruchu i kliknij Środkowe pole widzenia PET, aby przenieść myszy do pierścienia PET. Gdy łóżko znajdzie się w pierścieniu PET, zainicjuj sekwencję skanowania, klikając Uruchom i poczekaj, aż skaner automatycznie zakończy skanowanie PET, a następnie przejdź z pierścienia PET do CT w celu akwizycji CT. Od czasu eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), myszy mają wyraźną krzywiznę kręgosłupa z powodu postępu choroby, skanowanie ich na plecach pomaga wyprostować kręgosłup.Wykonaj nacięcie po grzbietowej stronie zwierzęcia i usuń skórę i futro, aby odsłonić kręgosłup. Przeciąć wzdłuż trzech płaszczyzn poprzecznych przez kręgosłup przy szyi, bezpośrednio pod klatką piersiową i w górnej części miednicy, aby oddzielić odcinek lędźwiowy od odcinka szyjnego i piersiowego. Ostrożnie usuń segmentowany kręgosłup, aby uzyskać dwie części, lędźwiową i szyjną klatkę piersiową.Następnie odizoluj lędźwiowy kręgosłup, ostrożnie przycinając kręgosłup od końca miednicy, aż będzie widoczny lędźwiowy rdzeń kręgowy. Aby usunąć rdzeń kręgowy w odcinku lędźwiowym, użyj strzykawki z końcówką wypełnioną PBS i utwórz uszczelnienie między strzykawką a kręgosłupem za pomocą kciuka i palca wskazującego. Delikatnie przepchnąć PBS przez strzykawkę, aby wypchnąć rdzeń kręgowy na wkładkę chłonną, a następnie powtórzyć dla rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym piersiowym, wkładając strzykawkę od strony szyjki macicy.Umieść tkanki rdzenia kręgowego w probówce zliczającej promienie gamma. Zapisz suchą masę i dodaj PBS, aby upewnić się, że tkanka znajduje się na dnie probówki, aby uniknąć wysuszenia. Umieść probówkę na lodzie, aż będzie gotowa do liczenia.Aby rozpocząć analizę obszarów zainteresowania w rdzeniu kręgowym, otwórz narzędzie 3D Region zainteresowania z menu Nawigacja. Pod nagłówkiem Regiony zainteresowania użyj znaku plus u dołu menu, aby utworzyć sześć obszarów zainteresowania, obszar zainteresowania lędźwiowy, obszar zainteresowania szyjny klatki piersiowej, szkielet lędźwiowy, szkielet klatki piersiowej, rdzeń kręgowy lędźwiowy, rdzeń kręgowy klatki piersiowej. Aby uniknąć zakłóceń wizualnych spowodowanych sygnałem PET, kliknij F3, aby wyłączyć PET.Przejdź do górnej części operatora narzędzia Obszar zainteresowania 3D i kliknij solidną kropkę po prawej stronie symbolu kursora, aby otworzyć menu Tryb malowania 3D i Erozja/Rozszerzenie. Wybierz opcję Sfera i zmień rozmiar na 20 pikseli. Podobnie ustaw rozszerzanie na plus pięć.Zanim przejdziesz dalej, przejdź na dół menu i upewnij się, że wybrany jest obszar lędźwiowy. W tomografii komputerowej znajdź kręg L6 kręgosłupa. Zaczynając od jednego kręgu powyżej L6, narysuj szorstki obszar lędźwiowy zainteresowania nad pięcioma kręgami powyżej bioder.Następnie przejdź do interesującego nas odcinka piersiowego szyjki macicy i prześledź pozostałą część kręgosłupa do podstawy czaszki. Po narysowaniu uogólnionych obszarów zainteresowania przejdź do górnej części operatora i wybierz menu Algorytmy segmentacji. Z menu rozwijanego wybierz opcję Otsu Thresholding, a następnie wybierz obszar lędźwiowy zainteresowania jako dane wejściowe i upewnij się, że szkielet lędźwiowy jest wybrany u dołu menu.W menu rozwijanym obok opcji Obraz upewnij się, że wybrano skan CT, oznaczony tutaj cyfrą zero. Kliknij Zastosuj i powtórz procedurę dla interesującego nas odcinka piersiowego szyjki macicy i szkieletu klatki piersiowej. Po użyciu Otsu Thresholding do utworzenia szkieletowych obszarów zainteresowania, wróć do menu Nawigacja i usuń interesujący Cię obszar lub zaznacz pole wyboru w kolumnie H zarówno dla szorstkiego odcinka lędźwiowego, jak i szyjnego odcinka piersiowego, aby je ukryć.Zaznacz kolumnę I dla obu obszarów zainteresowania szkieletu, aby nie można było ich edytować. Na koniec wróć na górę operatora narzędzia Obszar zainteresowania 3D i przejdź do menu Malowanie 3D, aby narysować interesujące obszary rdzenia kręgowego. Ponownie wybierz narzędzie Sfera i prześledź rdzeń kręgowy w szkielecie zarówno dla odcinka lędźwiowego, jak i piersiowego, upewniając się, że u dołu menu wybrano właściwy obszar zainteresowania.Aby usunąć dowolny obszar zainteresowania, kliknij Command/Control i narysuj na części, która ma zostać usunięta. Sprawdź obszar rdzenia kręgowego zainteresowania ze wszystkich trzech płaszczyzn, aby upewnić się, że żaden obszar zainteresowania nie jest rysowany poza kręgosłupem. Jeśli sygnał PET został wyłączony, naciśnij F3 po narysowaniu obszarów rdzenia kręgowego będących przedmiotem zainteresowania, aby ponownie włączyć PET, lub wybierz kontroler wizualny i kliknij pasek PET.Wróć do menu nawigacyjnego. Kliknij ikonę siatki, aby wyświetlić tabelę. Skopiuj tabelę do arkusza kalkulacyjnego i zapisz plik.Obrazowanie PET wykazało zwiększone wiązanie radioznacznika w mózgu i piersiowym rdzeniu kręgowym myszy EAE w porównaniu z myszami wcześniej nieleczonymi. Liczenie gamma ex vivo wykazało zwiększone wiązanie zarówno w odcinkach lędźwiowych, jak i szyjnych odcinkach kręgosłupa piersiowego oraz w mózgu myszy EAE w porównaniu z myszami naiwnymi. Obrazy autoradiograficzne ex vivo wykazały zwiększone wiązanie radioznacznika w strzałkowych odcinkach mózgu, szczególnie w pniu mózgu, móżdżku i komorach myszy EAE w porównaniu z myszami wcześniej nieleczonymi.Podobnie, zwiększone wiązanie radioznacznika zaobserwowano zarówno w odcinku szyjnym piersiowym, jak i lędźwiowym rdzenia kręgowego myszy EAE w porównaniu z wcześniejszymi rdzeniami kręgowymi. Po obrazowaniu PET i zliczaniu promieniowania gamma możemy zbadać związek między sygnałem PET a obiektem zainteresowania za pomocą technik biologii molekularnej, takich jak cytometria przepływowa i immunohistochemia. Nasza technika utorowała naukowcom drogę do zadawania pytań dotyczących roli limfocytów B in vivo w wielu obszarach chorobowych, w tym w udarze, stwardnieniu rozsianym, innych chorobach autoimmunologicznych i nowotworach.

imaging-cd19-b-cells-an-experimental-autoimmune-encephalomyelitis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Ten film demonstruje metodę wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) poprzez wstrzykiwanie peptydów pochodzących z mieliny z adiuwantem w celu aktywacji autoreaktywnych limfocytów T, które migrują do mózgu. Toksyna krztuścowa jest podawana w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając tym limfocytom T i innym komórkom odpornościowym przedostanie się do mózgu. Te komórki odpornościowe powodują demielinizację, co prowadzi do...

Generowanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Pokazujemy technikę obrazowania in vivo na żywo bioluminescencji i bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) dla stwardnienia rozsianego u myszy SJL/J.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Ten manuskrypt przedstawia protokół indukcji aktywnego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy. Przedstawiono również metodę izolacji i charakterystyki naciekających limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), aby pokazać, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Ten protokół ma na celu monitorowanie in vivo zmian mielinowych (demielinizacja i remielinizacja) za pomocą obrazowania metodą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) w zwierzęcym modelu stwardnienia rozsianego.

Obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej do pomiaru in vivo zawartości mieliny w szczurzym modelu stwardnienia rozsianego z lizolecytyną

Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to zwierzęcy model stwardnienia rozsianego (MS), który dzieli z ludzką chorobą silną humoralną odpowiedź autoimmunologiczną. W tym miejscu przedstawiamy prosty i elastyczny protokół ELISA do ilościowego oznaczania autoprzeciwciał w surowicy myszy uodpornionych na EAE.

Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

Poznaj metodę obrazowania PET limfocytów B CD19+ w mysim modelu EAE. Technika umożliwia ilościową analizę dynamiki komórek B w ośrodkowym układzie nerwowym i rdzeniu kręgowym.

Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie limfocytów B CD19 ⁺ w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Przeglądaj więcej filmów