Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej
January 20th, 2023
Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.
Technika ta wykorzystuje obrazowanie PET do wyjaśnienia rozmieszczenia i dynamiki komórek B in vivo w ośrodkowym układzie nerwowym. Nasze podejście jest korzystne w badaniu chorób neurologicznych, w których dotknięty rdzeń kręgowy sprawia, że analiza jest trudniejsza. Jest więc kilka głównych zalet naszej techniki.
Po pierwsze, stworzyliśmy nowe narzędzie do śledzenia biomarkera limfocytów B, które pozwala nam uchwycić szereg podzbiorów limfocytów B i wizualizować je in vivo. Po drugie, nasza metoda analizy rdzenia kręgowego umożliwia bardzo dokładne i powtarzalne określenie ilościowe sygnałów PET w tym regionie. Wspaniałą rzeczą w naszej technice jest to, że jest ona niezależna od choroby.
Może być stosowany od przedklinicznego do klinicznego obrazowania PET w dowolnym scenariuszu, w którym interesujące są limfocyty B i/lub rdzeń kręgowy. 18 do 24 godzin po znakowaniu radioaktywnym i wstrzyknięciu przeciwciała myszy, przygotuj mysz do skanowania, nakładając żel do oczu na oczy. Upewnij się, że łóżko skanujące z czterema myszami jest wyposażone w poduszkę grzewczą z izofluranem ustawionym od 1,5 do 2%Umieść mysz w pozycji leżącej na łóżku skanującym i delikatnie pociągnij ogonek myszy, aby wyprostować kręgosłup.
Gdy mysz znajdzie się w pozycji leżącej, bezpiecznie przyklej ją miękką taśmą mikroskopową do głowy i brzucha, aby zminimalizować ruch podczas oddychania. Zapisz pozycję skanowania dla każdej myszy w notatniku laboratoryjnym. Po zabezpieczeniu pierwszej grupy zamknij łóżko i sprawdź ułożenie łóżka, przeprowadzając tomografię komputerową.
Kliknij środkowe pole widzenia CT, a gdy łóżko znajdzie się na swoim miejscu, uruchom skan testowy CT, aby upewnić się, że umieszczenie jest prawidłowe. Powtarzaj, aż pozycja łóżka będzie zadowalająca. Umieść małą białą taśmę na stole skanera, aby zaznaczyć prawidłowe ustawienie łóżka do końca badania.
Otwórz menu Kontroler ruchu i kliknij Środkowe pole widzenia PET, aby przenieść myszy do pierścienia PET. Gdy łóżko znajdzie się w pierścieniu PET, zainicjuj sekwencję skanowania, klikając Uruchom i poczekaj, aż skaner automatycznie zakończy skanowanie PET, a następnie przejdź z pierścienia PET do CT w celu akwizycji CT. Od czasu eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), myszy mają wyraźną krzywiznę kręgosłupa z powodu postępu choroby, skanowanie ich na plecach pomaga wyprostować kręgosłup.
Wykonaj nacięcie po grzbietowej stronie zwierzęcia i usuń skórę i futro, aby odsłonić kręgosłup. Przeciąć wzdłuż trzech płaszczyzn poprzecznych przez kręgosłup przy szyi, bezpośrednio pod klatką piersiową i w górnej części miednicy, aby oddzielić odcinek lędźwiowy od odcinka szyjnego i piersiowego. Ostrożnie usuń segmentowany kręgosłup, aby uzyskać dwie części, lędźwiową i szyjną klatkę piersiową.
Następnie odizoluj lędźwiowy kręgosłup, ostrożnie przycinając kręgosłup od końca miednicy, aż będzie widoczny lędźwiowy rdzeń kręgowy. Aby usunąć rdzeń kręgowy w odcinku lędźwiowym, użyj strzykawki z końcówką wypełnioną PBS i utwórz uszczelnienie między strzykawką a kręgosłupem za pomocą kciuka i palca wskazującego. Delikatnie przepchnąć PBS przez strzykawkę, aby wypchnąć rdzeń kręgowy na wkładkę chłonną, a następnie powtórzyć dla rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym piersiowym, wkładając strzykawkę od strony szyjki macicy.
Umieść tkanki rdzenia kręgowego w probówce zliczającej promienie gamma. Zapisz suchą masę i dodaj PBS, aby upewnić się, że tkanka znajduje się na dnie probówki, aby uniknąć wysuszenia. Umieść probówkę na lodzie, aż będzie gotowa do liczenia.
Aby rozpocząć analizę obszarów zainteresowania w rdzeniu kręgowym, otwórz narzędzie 3D Region zainteresowania z menu Nawigacja. Pod nagłówkiem Regiony zainteresowania użyj znaku plus u dołu menu, aby utworzyć sześć obszarów zainteresowania, obszar zainteresowania lędźwiowy, obszar zainteresowania szyjny klatki piersiowej, szkielet lędźwiowy, szkielet klatki piersiowej, rdzeń kręgowy lędźwiowy, rdzeń kręgowy klatki piersiowej. Aby uniknąć zakłóceń wizualnych spowodowanych sygnałem PET, kliknij F3, aby wyłączyć PET.
Przejdź do górnej części operatora narzędzia Obszar zainteresowania 3D i kliknij solidną kropkę po prawej stronie symbolu kursora, aby otworzyć menu Tryb malowania 3D i Erozja/Rozszerzenie. Wybierz opcję Sfera i zmień rozmiar na 20 pikseli. Podobnie ustaw rozszerzanie na plus pięć.
Zanim przejdziesz dalej, przejdź na dół menu i upewnij się, że wybrany jest obszar lędźwiowy. W tomografii komputerowej znajdź kręg L6 kręgosłupa. Zaczynając od jednego kręgu powyżej L6, narysuj szorstki obszar lędźwiowy zainteresowania nad pięcioma kręgami powyżej bioder.
Następnie przejdź do interesującego nas odcinka piersiowego szyjki macicy i prześledź pozostałą część kręgosłupa do podstawy czaszki. Po narysowaniu uogólnionych obszarów zainteresowania przejdź do górnej części operatora i wybierz menu Algorytmy segmentacji. Z menu rozwijanego wybierz opcję Otsu Thresholding, a następnie wybierz obszar lędźwiowy zainteresowania jako dane wejściowe i upewnij się, że szkielet lędźwiowy jest wybrany u dołu menu.
W menu rozwijanym obok opcji Obraz upewnij się, że wybrano skan CT, oznaczony tutaj cyfrą zero. Kliknij Zastosuj i powtórz procedurę dla interesującego nas odcinka piersiowego szyjki macicy i szkieletu klatki piersiowej. Po użyciu Otsu Thresholding do utworzenia szkieletowych obszarów zainteresowania, wróć do menu Nawigacja i usuń interesujący Cię obszar lub zaznacz pole wyboru w kolumnie H zarówno dla szorstkiego odcinka lędźwiowego, jak i szyjnego odcinka piersiowego, aby je ukryć.
Zaznacz kolumnę I dla obu obszarów zainteresowania szkieletu, aby nie można było ich edytować. Na koniec wróć na górę operatora narzędzia Obszar zainteresowania 3D i przejdź do menu Malowanie 3D, aby narysować interesujące obszary rdzenia kręgowego. Ponownie wybierz narzędzie Sfera i prześledź rdzeń kręgowy w szkielecie zarówno dla odcinka lędźwiowego, jak i piersiowego, upewniając się, że u dołu menu wybrano właściwy obszar zainteresowania.
Aby usunąć dowolny obszar zainteresowania, kliknij Command/Control i narysuj na części, która ma zostać usunięta. Sprawdź obszar rdzenia kręgowego zainteresowania ze wszystkich trzech płaszczyzn, aby upewnić się, że żaden obszar zainteresowania nie jest rysowany poza kręgosłupem. Jeśli sygnał PET został wyłączony, naciśnij F3 po narysowaniu obszarów rdzenia kręgowego będących przedmiotem zainteresowania, aby ponownie włączyć PET, lub wybierz kontroler wizualny i kliknij pasek PET.
Wróć do menu nawigacyjnego. Kliknij ikonę siatki, aby wyświetlić tabelę. Skopiuj tabelę do arkusza kalkulacyjnego i zapisz plik.
Obrazowanie PET wykazało zwiększone wiązanie radioznacznika w mózgu i piersiowym rdzeniu kręgowym myszy EAE w porównaniu z myszami wcześniej nieleczonymi. Liczenie gamma ex vivo wykazało zwiększone wiązanie zarówno w odcinkach lędźwiowych, jak i szyjnych odcinkach kręgosłupa piersiowego oraz w mózgu myszy EAE w porównaniu z myszami naiwnymi. Obrazy autoradiograficzne ex vivo wykazały zwiększone wiązanie radioznacznika w strzałkowych odcinkach mózgu, szczególnie w pniu mózgu, móżdżku i komorach myszy EAE w porównaniu z myszami wcześniej nieleczonymi.
Podobnie, zwiększone wiązanie radioznacznika zaobserwowano zarówno w odcinku szyjnym piersiowym, jak i lędźwiowym rdzenia kręgowego myszy EAE w porównaniu z wcześniejszymi rdzeniami kręgowymi. Po obrazowaniu PET i zliczaniu promieniowania gamma możemy zbadać związek między sygnałem PET a obiektem zainteresowania za pomocą technik biologii molekularnej, takich jak cytometria przepływowa i immunohistochemia. Nasza technika utorowała naukowcom drogę do zadawania pytań dotyczących roli limfocytów B in vivo w wielu obszarach chorobowych, w tym w udarze, stwardnieniu rozsianym, innych chorobach autoimmunologicznych i nowotworach.
Przegląd
Niniejsza praca prezentuje metodę znakowania przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko ludzkiemu CD19, zawierającego znacznik radioaktywny, w celu ilościowego oznaczenia komórek B w układzie nerwowym centralnym i tkankach obwodowych, wykorzystując model myszy z chorobą rozsianą smolastą. Podejście łączy w vivo PET, ex vivo liczenie promieni gamma i autoradiografię w celu poprawy zrozumienia dynamiki komórek B w chorobach neurologicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Nauki o mózgu
- Immunologia
- Techniki obrazowania
Wprowadzenie
- Badanie koncentruje się na ilościowym oznaczaniu komórek B w modelach stwardnienia rozsianego.
- Zrozumienie dynamiki komórek B jest kluczowe dla zwalczania chorób neurologicznych.
- Istniejące metody analizy rdzenia kręgowego są często trudne ze względu na ograniczenia anatomiczne.
- Nowa technika ma na celu skuteczne śledzenie różnych podzbiorów komórek B.
Cel badania
- Opracowanie nowej metody do in vivo śledzenia komórek B.
- Umożliwienie dokładnej ilościowej oceny sygnałów PET w rdzeniu kręgowym.
- Dostarczenie wszechstronnej techniki, która może być zastosowana w różnych modelach chorobowych.
Wykorzystane metody
- Wykorzystanie technologii PET do badania dystrybucji komórek B.
- Model myszy doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu (EAE) do analizy.
- Szczegółowy opis sekwencyjnych kroków, w tym znakowania radioaktywnego, przygotowania myszy i skanowania.
- Obejmuje specyficzne procedury dotyczące dissekowania rdzenia kręgowego i obchodzenia się z tkankami.
- Obejmuje tworzenie obszarów zainteresowania w celu szczegółowej analizy sygnałów PET.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na wysoką dokładność i powtarzalność w ilościowym oznaczaniu komórek B.
- Umożliwia wizualizację lokalizacji i dynamiki podzbiorów komórek B w układzie nerwowym centralnym.
- Umożliwia analizę wpływu przebiegu choroby na zachowanie komórek B.
- Dostarcza informacji o nieprawidłowościach rdzenia kręgowego w warunkach neurologicznych.
Wnioski
- Niniejsze badanie demonstruje nową technikę obrazowania służącą do badania roli komórek B w stwardnieniu rozsianym.
- Narzędzie może być wykorzystywane w różnych scenariuszach badawczych neurologicznych.
- Wyniki zwiększają zrozumienie odpowiedzi immunologicznych w chorobach układu nerwowego centralnego.
Najczęściej zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative PET imaging of CD19+ B cells in the EAE mouse model enables non-invasive, spatially resolved assessment of B cell dynamics in neuroinflammatory disease. This capability addresses a critical gap in translational research by supporting target validation and mechanistic de-risking for B cell-directed therapies. The approach enhances predictive confidence at the discovery-to-preclinical inflection point for CNS autoimmune indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables in vivo interrogation of B cell involvement in CNS pathology for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing B cell distribution and burden in disease-relevant tissues.
- Facilitates hypothesis-driven evaluation of B cell-targeted therapeutic strategies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated imaging workflow for quantifying B cell load in preclinical models.
- Delivers reproducible, quantitative PET readouts suitable for assay standardization.
- Enables robust comparison of compound effects on B cell dynamics across cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging biomarkers with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of B cell-targeted candidates by quantifying pharmacodynamic effects.
- Bridges discovery and preclinical validation through non-invasive, longitudinal monitoring.
Pipeline & Workflow Integration
This PET imaging method integrates from early discovery through preclinical validation, enabling iterative hypothesis testing and quantitative assessment of B cell modulation in CNS disease models.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing on B cell involvement in neuroinflammation.
- Screening: Provides standardized, quantitative PET outputs for cross-study comparability.
- Analytics: Enables statistical analysis of B cell burden and spatial distribution in CNS and peripheral tissues.
- Translational Research: Aligns imaging endpoints with clinical biomarker strategies for B cell therapies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging platform for diverse autoimmune and neuroinflammatory models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in B cell-targeted programs.
- Operational Value: Standardizes imaging and quantification workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in neuroimmunology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of B cell-directed assets based on quantitative in vivo data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PET imaging, radiotracer synthesis, and neuroanatomical analysis.
- Demands access to small-animal PET/CT instrumentation and radiochemistry infrastructure.
- Necessitates standardized region-of-interest analysis and cross-team data harmonization.
- Adaptable to other disease models where B cell dynamics are relevant.
- Potential limitations include anatomical complexity and tracer specificity in heterogeneous tissues.
![Obrazowanie PET zapalenia układu nerwowego przy użyciu [11C] DPA-713 w mysim modelu udaru niedokrwiennego](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F57243.jpg%3Fv%3D2026-07-04T03%253A09%253A02.000Z&w=384&q=75)
![Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
