Obrazowanie limfocytów B CD19 ⁺ w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Technika ta wykorzystuje obrazowanie PET do wyjaśnienia rozmieszczenia i dynamiki komórek B in vivo w ośrodkowym układzie nerwowym. Nasze podejście jest korzystne w badaniu chorób neurologicznych, w których dotknięty rdzeń kręgowy sprawia, że analiza jest trudniejsza. Jest więc kilka głównych zalet naszej techniki.

Po pierwsze, stworzyliśmy nowe narzędzie do śledzenia biomarkera limfocytów B, które pozwala nam uchwycić szereg podzbiorów limfocytów B i wizualizować je in vivo. Po drugie, nasza metoda analizy rdzenia kręgowego umożliwia bardzo dokładne i powtarzalne określenie ilościowe sygnałów PET w tym regionie. Wspaniałą rzeczą w naszej technice jest to, że jest ona niezależna od choroby.

Może być stosowany od przedklinicznego do klinicznego obrazowania PET w dowolnym scenariuszu, w którym interesujące są limfocyty B i/lub rdzeń kręgowy. 18 do 24 godzin po znakowaniu radioaktywnym i wstrzyknięciu przeciwciała myszy, przygotuj mysz do skanowania, nakładając żel do oczu na oczy. Upewnij się, że łóżko skanujące z czterema myszami jest wyposażone w poduszkę grzewczą z izofluranem ustawionym od 1,5 do 2%Umieść mysz w pozycji leżącej na łóżku skanującym i delikatnie pociągnij ogonek myszy, aby wyprostować kręgosłup.

Gdy mysz znajdzie się w pozycji leżącej, bezpiecznie przyklej ją miękką taśmą mikroskopową do głowy i brzucha, aby zminimalizować ruch podczas oddychania. Zapisz pozycję skanowania dla każdej myszy w notatniku laboratoryjnym. Po zabezpieczeniu pierwszej grupy zamknij łóżko i sprawdź ułożenie łóżka, przeprowadzając tomografię komputerową.

Kliknij środkowe pole widzenia CT, a gdy łóżko znajdzie się na swoim miejscu, uruchom skan testowy CT, aby upewnić się, że umieszczenie jest prawidłowe. Powtarzaj, aż pozycja łóżka będzie zadowalająca. Umieść małą białą taśmę na stole skanera, aby zaznaczyć prawidłowe ustawienie łóżka do końca badania.

Otwórz menu Kontroler ruchu i kliknij Środkowe pole widzenia PET, aby przenieść myszy do pierścienia PET. Gdy łóżko znajdzie się w pierścieniu PET, zainicjuj sekwencję skanowania, klikając Uruchom i poczekaj, aż skaner automatycznie zakończy skanowanie PET, a następnie przejdź z pierścienia PET do CT w celu akwizycji CT. Od czasu eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), myszy mają wyraźną krzywiznę kręgosłupa z powodu postępu choroby, skanowanie ich na plecach pomaga wyprostować kręgosłup.

Wykonaj nacięcie po grzbietowej stronie zwierzęcia i usuń skórę i futro, aby odsłonić kręgosłup. Przeciąć wzdłuż trzech płaszczyzn poprzecznych przez kręgosłup przy szyi, bezpośrednio pod klatką piersiową i w górnej części miednicy, aby oddzielić odcinek lędźwiowy od odcinka szyjnego i piersiowego. Ostrożnie usuń segmentowany kręgosłup, aby uzyskać dwie części, lędźwiową i szyjną klatkę piersiową.

Następnie odizoluj lędźwiowy kręgosłup, ostrożnie przycinając kręgosłup od końca miednicy, aż będzie widoczny lędźwiowy rdzeń kręgowy. Aby usunąć rdzeń kręgowy w odcinku lędźwiowym, użyj strzykawki z końcówką wypełnioną PBS i utwórz uszczelnienie między strzykawką a kręgosłupem za pomocą kciuka i palca wskazującego. Delikatnie przepchnąć PBS przez strzykawkę, aby wypchnąć rdzeń kręgowy na wkładkę chłonną, a następnie powtórzyć dla rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym piersiowym, wkładając strzykawkę od strony szyjki macicy.

Umieść tkanki rdzenia kręgowego w probówce zliczającej promienie gamma. Zapisz suchą masę i dodaj PBS, aby upewnić się, że tkanka znajduje się na dnie probówki, aby uniknąć wysuszenia. Umieść probówkę na lodzie, aż będzie gotowa do liczenia.

Aby rozpocząć analizę obszarów zainteresowania w rdzeniu kręgowym, otwórz narzędzie 3D Region zainteresowania z menu Nawigacja. Pod nagłówkiem Regiony zainteresowania użyj znaku plus u dołu menu, aby utworzyć sześć obszarów zainteresowania, obszar zainteresowania lędźwiowy, obszar zainteresowania szyjny klatki piersiowej, szkielet lędźwiowy, szkielet klatki piersiowej, rdzeń kręgowy lędźwiowy, rdzeń kręgowy klatki piersiowej. Aby uniknąć zakłóceń wizualnych spowodowanych sygnałem PET, kliknij F3, aby wyłączyć PET.

Przejdź do górnej części operatora narzędzia Obszar zainteresowania 3D i kliknij solidną kropkę po prawej stronie symbolu kursora, aby otworzyć menu Tryb malowania 3D i Erozja/Rozszerzenie. Wybierz opcję Sfera i zmień rozmiar na 20 pikseli. Podobnie ustaw rozszerzanie na plus pięć.

Zanim przejdziesz dalej, przejdź na dół menu i upewnij się, że wybrany jest obszar lędźwiowy. W tomografii komputerowej znajdź kręg L6 kręgosłupa. Zaczynając od jednego kręgu powyżej L6, narysuj szorstki obszar lędźwiowy zainteresowania nad pięcioma kręgami powyżej bioder.

Następnie przejdź do interesującego nas odcinka piersiowego szyjki macicy i prześledź pozostałą część kręgosłupa do podstawy czaszki. Po narysowaniu uogólnionych obszarów zainteresowania przejdź do górnej części operatora i wybierz menu Algorytmy segmentacji. Z menu rozwijanego wybierz opcję Otsu Thresholding, a następnie wybierz obszar lędźwiowy zainteresowania jako dane wejściowe i upewnij się, że szkielet lędźwiowy jest wybrany u dołu menu.

W menu rozwijanym obok opcji Obraz upewnij się, że wybrano skan CT, oznaczony tutaj cyfrą zero. Kliknij Zastosuj i powtórz procedurę dla interesującego nas odcinka piersiowego szyjki macicy i szkieletu klatki piersiowej. Po użyciu Otsu Thresholding do utworzenia szkieletowych obszarów zainteresowania, wróć do menu Nawigacja i usuń interesujący Cię obszar lub zaznacz pole wyboru w kolumnie H zarówno dla szorstkiego odcinka lędźwiowego, jak i szyjnego odcinka piersiowego, aby je ukryć.

Zaznacz kolumnę I dla obu obszarów zainteresowania szkieletu, aby nie można było ich edytować. Na koniec wróć na górę operatora narzędzia Obszar zainteresowania 3D i przejdź do menu Malowanie 3D, aby narysować interesujące obszary rdzenia kręgowego. Ponownie wybierz narzędzie Sfera i prześledź rdzeń kręgowy w szkielecie zarówno dla odcinka lędźwiowego, jak i piersiowego, upewniając się, że u dołu menu wybrano właściwy obszar zainteresowania.

Aby usunąć dowolny obszar zainteresowania, kliknij Command/Control i narysuj na części, która ma zostać usunięta. Sprawdź obszar rdzenia kręgowego zainteresowania ze wszystkich trzech płaszczyzn, aby upewnić się, że żaden obszar zainteresowania nie jest rysowany poza kręgosłupem. Jeśli sygnał PET został wyłączony, naciśnij F3 po narysowaniu obszarów rdzenia kręgowego będących przedmiotem zainteresowania, aby ponownie włączyć PET, lub wybierz kontroler wizualny i kliknij pasek PET.

Wróć do menu nawigacyjnego. Kliknij ikonę siatki, aby wyświetlić tabelę. Skopiuj tabelę do arkusza kalkulacyjnego i zapisz plik.

Obrazowanie PET wykazało zwiększone wiązanie radioznacznika w mózgu i piersiowym rdzeniu kręgowym myszy EAE w porównaniu z myszami wcześniej nieleczonymi. Liczenie gamma ex vivo wykazało zwiększone wiązanie zarówno w odcinkach lędźwiowych, jak i szyjnych odcinkach kręgosłupa piersiowego oraz w mózgu myszy EAE w porównaniu z myszami naiwnymi. Obrazy autoradiograficzne ex vivo wykazały zwiększone wiązanie radioznacznika w strzałkowych odcinkach mózgu, szczególnie w pniu mózgu, móżdżku i komorach myszy EAE w porównaniu z myszami wcześniej nieleczonymi.

Podobnie, zwiększone wiązanie radioznacznika zaobserwowano zarówno w odcinku szyjnym piersiowym, jak i lędźwiowym rdzenia kręgowego myszy EAE w porównaniu z wcześniejszymi rdzeniami kręgowymi. Po obrazowaniu PET i zliczaniu promieniowania gamma możemy zbadać związek między sygnałem PET a obiektem zainteresowania za pomocą technik biologii molekularnej, takich jak cytometria przepływowa i immunohistochemia. Nasza technika utorowała naukowcom drogę do zadawania pytań dotyczących roli limfocytów B in vivo w wielu obszarach chorobowych, w tym w udarze, stwardnieniu rozsianym, innych chorobach autoimmunologicznych i nowotworach.