Name: Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowej wirowania. Ta technika umożliwia charakterystykę ekzosomów i mikropęcherzyków dla zastosowań terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (32000974, 81930025 i 82170988) oraz Chińskiej Fundacji Nauk Podoktoranckich (2019M663986 i BX20190380). Jesteśmy wdzięczni za pomoc Narodowemu Centrum Demonstracyjnemu Nauczania Doświadczalnego Medycyny Podstawowej (AMFU) oraz Centralnemu Laboratorium Analityczno-Badawczemu Wojskowego Centrum Innowacji Medycznych Uniwersytetu Medycznego Wojsk Lotniczych.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Czwartego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystano ośmiotygodniowe myszy C57Bl/6 (bez preferencji ani dla samic, ani samców). Kriokonserwowane MSC pochodzące z ludzkiej pępowiny (UCMSC), wykorzystane w niniejszym badaniu, uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Wykorzystanie komórek ludzkich zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną IV Wojskowego Uniwersytetu Medycznego.
1. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC)
<ol>
	<li>Przygotować akcesoria i roztwory wymagane do pracy doświadczalnej, w tym pipety, końcówki do pipet, 10 cm szalkę Petriego, sprzęt termostatyczny (łaźnia wodna), gumowe rękawice, 75% alkohol, pożywkę hodowlaną (inkubowaną w temperaturze 37 °C), śmiertelną surowicę bydlęcą (FBS) i 100-krotny roztwór penicyliny-streptomycyny (P/S) (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotuj dostępne na rynku pożywkę alfa-Minimum Essential Medium (α-MEM), uzupełniając 20% FBS i 1% P/S. 
	UWAGA: Rozcieńczyć wszystkie roztwory używane do izolacji i analizy pojazdów elektrycznych w ultraczystej filtrowanej wodzie wykonanej przez ultraczysty system oczyszczania wody filtrowanej (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Odzyskaj kriokonserwowane ludzkie MSC pochodzące z pępowiny (UCMSC) z ciekłego azotu poprzez stopienie ich w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Szybko i delikatnie przenieść zawiesinę stopionych komórek do probówki o pojemności 15 ml z 5 ml pożywki hodowlanej (krok 1.2). Wirować w temperaturze 4 °C, 500 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą sterylnej pipety i zatrzymać osad komórkowy. Dodać 2 ml pożywki hodowlanej do probówki wirówkowej i delikatnie zawiesić komórki.</li>
	<li>Umieść komórki na 10-centymetrowej szalce Petriego i dodaj 8 ml pożywki hodowlanej, co daje w sumie 10 ml.</li>
	<li>Hodowla MSCs w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.</li>
</ol>
2. Wirowanie różnicowe do izolacji Exos i MV
<ol>
	<li>Gdy MSCs osiągną konfluencję >90%, zastąp pożywkę hodowlaną α-MEM uzupełnioną 20% FBS zubożonym w EV i 1% P/S na 8 ml każdej potrawy. 
	UWAGA: Odwirować FBS w temperaturze 4 °C, 1,50,000 x >g przez noc, aby usunąć EV i inne zanieczyszczenia.</li>
	<li>Po 48 godzinach hodowli zebrać pożywkę (krok 2.1) do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować pożywkę hodowlaną MSC w temperaturze 4 °C, 800 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć fragmenty komórek i resztki komórkowe, przenosząc supernatant do czystych probówek stożkowych o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Użycie stożkowych probówek o pojemności 1,5 ml jest konieczne, aby zwiększyć wydajność EV.</li>
	<li>Odwirować supernatant w temperaturze 4 °C, 16 000 x g przez 30 minut. Osad składa się z MVs. MV z każdej płytki komórek zawieszono ponownie w 50 μl PBS.</li>
	<li>Przenieść supernatant otrzymany przez odwirowanie w kroku 2.5 za pomocą pipety do czystych probówek ultrawirówek. Wirować przy 1 50 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyrzuć supernatant i zbierz pozostałość, którą jest Exos. Zawiesić Exo z siedmiu szalek komórkowych w 50 μl PBS. 
	UWAGA: UCMSC z szóstym pasażem służą do izolacji EV. Aby uzyskać wystarczającą ilość MV i egzowirusów do użytku eksperymentalnego, zwykle potrzeba 7-8 szalek z hodowanymi komórkami. Próbki EV są natychmiast wykorzystywane do następujących etapów charakterystyki lub do zastosowania terapeutycznego, którego lepiej nie przechowywać. 
	UWAGA: Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania pojazdów elektrycznych, a najlepiej przechowywać je w temperaturze 4 °C w krótkim okresie, a nie w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Wykrywanie liczby cząstek i rozkładu wielkości EV z MSC
UWAGA: Do oceny rozkładu wielkości, analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest wykonywana przez dostępny na rynku analizator śledzenia nanocząstek (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 1 μl EV (z kroku 2.5 i kroku 2.7) w 1,499 μl PBS i wymieszać wystarczającą ilość w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Obsługuj analizator śledzenia zgodnie z instrukcjami producenta. Najpierw uruchom kompatybilne oprogramowanie (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Napełnij celę próbki wodą destylowaną, a następnie pozwól przyrządowi rozpocząć sprawdzanie komórki.</li>
	<li>Skalibruj przyrząd przygotowanym roztworem wzorcowym. Upewnij się, że liczba cząstek wyświetlana w interfejsie wykrywania oprogramowania mieści się w zakresie 50-400 (najlepiej około 200). Kliknij przycisk OK. 
	UWAGA: Przygotować roztwór wzorcowy, rozpuszczając 1 μl roztworu kalibracyjnego (patrz tabela materiałów) w 1 ml wody destylowanej w celu wytworzenia roztworu podstawowego, a następnie pobrać 100 μl roztworu podstawowego i dodać 25 ml wody destylowanej w celu przygotowania roztworu wzorcowego (1:250 000). Przechowywać ten odczynnik roboczy w temperaturze 4 °C przez tydzień.</li>
	<li>Przepłukać próbkę 5 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Przed analizą próbki przepłukać kanał 1 ml wody destylowanej. Upewnij się, że liczba cząstek wyświetlana w interfejsie wykrywania oprogramowania jest mniejsza niż 10.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 ml próbki EV przygotowanej w kroku 3.1. Wykonaj test pęcherzykowy zgodnie z instrukcją obsługi przyrządu. 
	UWAGA: Próbkę i wodę destylowaną wstrzykuje się za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml ze stałą prędkością 0,5 ml/s pod staranną kontrolą ręczną.</li>
</ol>
4. Charakterystyka morfologii EV za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 1 μl EV z kroku 2.7 w 199 μl PBS i wystarczająco wymieszać. Dodaj 20 μl kropli zawieszenia EV do kwadratowej siatki pokrytej formvarem/węglem (patrz tabela materiałów) i pozostaw na 3 minuty.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu za pomocą małej bibuły filtracyjnej i pozostaw na 15 sekund, aby lekko wysuszyć powierzchnię.</li>
	<li>Próbki EV należy barwić ujemnie 1,5% kropelkami kwasu fosfowolframowego przez 40 s.</li>
	<li>Usuń nadmiar kwasu fosfowolframowego i odstaw na 15 sekund, aby lekko wysuszyć powierzchnię.</li>
	<li>Umieścić próbkę zawierającą siatkę kwadratową pokrytą formvarem/węglem do czystego naczynia pokrytego bibułą filtracyjną. Obserwuj i rejestruj obrazy za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. 
	UWAGA: W tym procesie egzo są brane za przykład.</li>
</ol>
5. Oznakowanie pojazdów elektrycznych pochodzących od MSC
<ol>
	<li>Po ekstrakcji EVs (krok 2.5) ponownie zawiesić z 250 μl PBS w stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Użyj innej stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml do przygotowania roztworu roboczego barwnika PKH26; użyj 1 μl odczynnika do znakowania PKH26 rozcieńczonego 250 μl rozcieńczalnika C (składnik dostępnego na rynku zestawu do znakowania EV używanego w niniejszym badaniu, patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Roztwór roboczy należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. 
	UWAGA: Nadmierna ilość barwnika PKH26 lub etykietowanie bez wstępnego rozcieńczenia grozi uszkodzeniem pojazdów elektrycznych.</li>
	<li>Wymieszaj zawieszone EV z roztworem roboczym. Odstawić w temperaturze pokojowej na 5 minut, a następnie dodać 500 μl FBS zubożonego w EV, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>W przypadku SN odwirować w temperaturze 4 °C, 16 000 x g przez 30 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety. Dodaj 1 ml PBS, aby spłukać pozostałości.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 4 °C, 16 000 x g przez 30 minut i odrzucić supernatant w celu usunięcia niezwiązanego barwnika.</li>
	<li>Zawiesić pozostałość w 200 μl PBS. Upuść 20 μl zawiesiny na szkiełko i obserwuj je pod mikroskopem fluorescencyjnym. 
	UWAGA: W tym procesie MV są traktowane jako przykład.</li>
</ol>
6. Miejscowy przeszczep i ogólnoustrojowe wstrzykiwanie MSC-EVs
UWAGA: Dla następujących procedur, umieść EV na lodzie przed wstrzyknięciem.
<ol>
	<li>Wykonaj przeszczep miejscowy, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Znieczulić myszy 4% (obj./obj.) izofluranem. Podczas zabiegu utrzymuj znieczulenie na poziomie 1%-3% izofluranu.</li>
		<li>Przed zabiegiem należy podać 5 mg/kg karprofenu (IP) w celu złagodzenia bólu pozabiegowego.</li>
		<li>Przed wycięciem rany należy ogolić włosy na grzbiecie i wysterylizować powierzchnię grzbietową, nakładając 3 naprzemienne rundy 10% jodu powidonu i 75% etanolu. </li>
		<li>Za pomocą stempla biopsyjnego (patrz Tabela materiałów) utwórz ranę o pełnej grubości o średnicy 1 cm na skórze grzbietowej.</li>
		<li>Zawiesić EV pochodzące z MSC z dwóch szalek w 100 μl PBS i podać wstrzyknięcie w warstwę podskórną łożyska rany, wokół każdej rany w czterech miejscach. 
		UWAGA: Wstrzykuje się średnio 100 μg EV na mysz (EV z dwóch 10-centymetrowych szalek komórek). Dziesięć 10-centymetrowych szalek MSC jest potrzebnych do uzyskania wystarczającej liczby EV, aby przeprowadzić eksperyment n = 5 w modelu mysim.</li>
		<li>Po zabiegu owiń myszy sterylną gazą i umieść je na podkładkach termoizolacyjnych (patrz Tabela materiałów), aż się obudzą.</li>
		<li>Upewnij się, że myszy nie są pozostawione bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności. Nie zwracaj myszy do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.</li>
		<li>W razie potrzeby należy podać dodatkowe dawki środka przeciwbólowego w 2. i 3. dniu po operacji. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać wstrzyknięcie ogólnoustrojowe.
	<ol>
		<li>Zawiesić EV pochodzące z MSC w 200 μl PBS, a następnie wymieszać z roztworem heparyny w stosunku objętościowym 10:1.</li>
		<li>Umieść myszy w systemie obrazowania żył ogonowych (patrz tabela materiałów). Naciśnij przełącznik, aby podnieść dźwignię.</li>
		<li>Zdezynfekuj żyłę ogonową za pomocą wacika nasączonego alkoholem przed wstrzyknięciem dożylnym. Następnie należy systematycznie wstrzykiwać myszom zawiesinę przygotowaną w kroku 6.2.1 przez żyłę ogonową. W zabiegu pomaga ilustrator żył ogonowych. 
		UWAGA: Zawiesinę EV wstrzyknąć natychmiast po zmieszaniu z heparyną. Wstrzykuje się średnio 100 μg EV na mysz (EV z dwóch 10-centymetrowych szalek komórek). Dziesięć 10-centymetrowych szalek MSC jest potrzebnych do uzyskania wystarczającej liczby EV, aby przeprowadzić eksperyment n = 5 w modelu mysim. 
		UWAGA: Iniekcja do żyły ogonowej myszy jest zwykle ograniczona do 200 μl objętości. Wstrzyknięcie powinno przebiegać powoli i zostać przerwane, jeśli zauważysz guzek lub opór, który sugeruje, że igła jest poza żyłą. Jeśli myszy wykazują niepożądane objawy kliniczne, takie jak zwijanie się i drżenie, może to być reakcja szokowa na wstrzyknięcie dużej objętości, szybkie wstrzyknięcie lub toksyczność/anafilaksję.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+MSCs-derived+extracellular+vesicles+in+bone+disorders%3A+Novel+cell-free+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619(2020).</li>
<li>Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+applications+of+multipotential+mesenchymal%2Fstromal+stem+cells+in+skeletal+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair.</a> Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).</li>
<li>Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+functions+of+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells+mediated+via+paracrine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025(2019).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+miRNAs%3A+From+Biomarkers+to+Mediators+of+Physiology+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).</li>
<li>Lei, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Obesity-Related+Insulin+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996(2021).</li>
<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li>
<li>Gatti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols In Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3 22(2006).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li>
<li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li>
<li>Boing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteins+in+extracellular+vesicles+as+candidate+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).</li>
<li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+exosome+isolation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC+Transplantation+Improves+Osteopenia+via+Epigenetic+Regulation+of+Notch+Signaling+in+Lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).</li>
<li>Deng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+protection+by+mesenchymal+stem+cell+transplantation+identifies+exosomal+MiR-21+as+a+therapeutic+for+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHED+aggregate+exosomes+shuttled+miR-26a+promote+angiogenesis+in+pulp+regeneration+via+TGF-beta%2FSMAD2%2F3+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling.</a> Cell Proliferation. 54 (7), 13074(2021).</li>
<li>Qiu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+released+from+educated+mesenchymal+stem+cells+accelerate+cutaneous+wound+healing+via+promoting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis.</a> Cell Proliferation. 53 (8), 12830(2020).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-derived+exosome+promotes+M2+polarization+and+enhances+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing.</a> Stem Cells International. 2019, 7132708(2019).</li>
<li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-associated+procoagulant+phospholipid+and+tissue+factor+activity+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma.</a> PLoS One. 14 (1), 0210835(2019).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).</li>
<li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles%3A+A+systematic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162(2022).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).</li>
<li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+isolation+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162(2016).</li>
<li>Williams, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+provide+neuroprotection+and+improve+long-term+neurologic+outcomes+in+a+swine+model+of+traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+vesicles+activate+autophagy+in+recipient+cells+to+induce+angiogenesis+and+dental+pulp+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).</li>
<li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+a+multiple+biomarkers+strategy+including+endothelial+dysfunction+to+improve+risk+stratification+for+cardiovascular+events+in+patients+at+high+risk+for+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).</li>
<li>Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applicability+of+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+treatment+of+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274(2019).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat+diet-induced+upregulation+of+exosomal+phosphatidylcholine+contributes+to+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance.</a> Nature Communications. 12 (1), 213(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Pojawiają się EV, które odgrywają ważną rolę w różnych działaniach biologicznych, w tym w prezentacji antygenu, transporcie materiału genetycznego, modyfikacji mikrośrodowiska komórkowego i innych. Ponadto ich szerokie zastosowanie przynosi nowe podejścia i możliwości w diagnozowaniu i leczeniu chorób21. Implementacja terapeutycznych zastosowań EV opiera się na udanej izolacji i charakterystyce. Jednak ze względu na brak ustandaryzowanych metod izolacji i oczyszczania oraz niską wydajność ekstrakc...

Komórki macierzyste to niezróżnicowane komórki pluripotencjalne o zdolności do samoodnawiania się i potencjale translacyjnym1. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są łatwo izolowane, hodowane, namnażane i oczyszczane w laboratorium, co pozostaje charakterystyczne dla komórek macierzystych po wielu pasażach. W ostatnich latach coraz więcej dowodów potwierdza pogląd, że MSCs działają w trybie parakrynnym w zastosowaniu terapeutycznym2,3. Zwłaszcza wydzielanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w biologicznych funkcjach MSC. Jako heterogeniczne błoniaste nanocząstki uwalniane z większości typów komórek, EV składają się z podkategorii zwanych egzosomami (Exos), mikropęcherzykami (MV), a nawet większymi ciałami apoptotycznymi4,5. Wśród nich Exos jest najszerzej przebadanym EV o wielkości 40-150 nm, który jest pochodzenia endosomalnego i aktywnie wydzielany w warunkach fizjologicznych. MV powstają w wyniku zrzucania bezpośrednio z powierzchni błony komórkowej o średnicy 100-1 000 nm, które charakteryzują się wysoką ekspresją fosfatydyloseryny i ekspresją markerów powierzchniowych komórek dawcy6. EV zawierają RNA, białka i inne bioaktywne cząsteczki, które pełnią podobne funkcje do komórek macierzystych i odgrywają znaczącą rolę w komunikacji komórkowej, odpowiedzi immunologicznej i naprawie uszkodzeń tkanek7. MSC-EV zostały szeroko przebadane jako potężne narzędzie terapeutyczne bezkomórkowe w medycynie regeneracyjnej8.
Izolacja i oczyszczanie pojazdów elektrycznych pochodzących od MSC jest częstym problemem w dziedzinie badań i zastosowań. Obecnie ultrawirowanie w gradiencie różnicowym i gęstości9, proces ultrafiltracji10, separacja immunomagnetyczna11, chromatograf wykluczenia molekularnego12, oraz chip mikroprzepływowy13 są szeroko stosowanymi metodami izolacji i oczyszczania pojazdów elektrycznych. Biorąc pod uwagę zalety i wady każdego podejścia, ilość, czystość i aktywność zebranych EV nie mogą być spełnione w tym samym czasie14,15. W niniejszym badaniu szczegółowo przedstawiono protokół wirowania różnicowego izolacji i charakterystyki EV z hodowanych MSC, co przyczyniło się do skutecznego zastosowania terapeutycznego16,17,18,19,20. Kolejnym przykładem jest możliwość dostosowania tej metody do szeregu dalszych podejść, takich jak znakowanie fluorescencyjne, przeszczep miejscowy i wstrzyknięcie ogólnoustrojowe. Wdrożenie tej procedury zaspokoi potrzebę prostego i niezawodnego gromadzenia i stosowania MSC-EV w badaniach translacyjnych.

<table><tbody><tr><td>10% powidon-jod (Betadine)</td><td>Weizhenyuan</td><td>10053956954292</td><td>Dezynfekcja ran</td></tr><tr><td>Roztwór kalibracyjny</td><td>Particle Metrix</td><td>110-0020</td><td>Kalibracja instrumentu NTA</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Sigma</td><td>53716-49-7</td><td>Lek przeciwbólowy</td></tr><tr><td>Obrazowanie żył ogonowych&nbsp;</td><td>KEW Life Science</td><td>KW-XXY</td><td>Wirówka do obrazowania żył ogonowych</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td>Wirowanie</td></tr><tr><td>Śmiertelna surowica bydlęca</td><td>Corning</td><td>35-081-CV</td><td>Hodowla UCMSC</td></tr><tr>Test PBL o<td>siatce kwadratowej powlekanej farbą/węglem</td><td>Nauka&nbsp;</td><td>24916-25</td><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Zhongke Life Science</td><td>Z8G5JBMz</td><td>Opieka pozabiegowa zwierząt</td></tr><tr><td>Roztwór heparyny</td><td>StemCell</td><td>7980</td><td>Wstrzyknięcie ogólnoustrojowe</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-22</td><td>Znieczulenie zwierząt</td></tr><tr><td>Minimum Niezbędne podłoże Alpha basic (1x)</td><td>Gibco</td><td>C12571500BT</td><td>Kultura UCMSC</td></tr><tr><td>Analizator śledzenia</td><td>nanocząstek Particle Metrix</td><td>ZetaView PMX120</td><td>Analiza śledzenia nanocząstek</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Meilunbio</td><td>MA0015</td><td>Ponowne zawieszenie EVs</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Procell Nauki przyrodnicze</td><td>PB180120</td><td>Hodowla UCMSC</td></tr><tr><td>Kwas fosfowolframowy</td><td>Solarbio</td><td>12501-23-4</td><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000224</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Zestaw łącznika komórek czerwonej fluorescencji</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>Etykietowanie EVs</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji skóry</td><td>Acuderm</td><td>69038-10-50</td><td>Wady skóry</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>Wersja 8.05.14 SP7&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt termostatyczny</td><td>Grant</td><td>v-0001-0005</td><td>Łaźnia wodna</td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>HITACHI</td><td>HT7800</td><td>Transmisyjny mikroskop</td></tr><tr><td>elektronowy UCMSC</td><td>Bai'ao&nbsp;</td><td>UKK220201</td><td>Komercyjnie UCMSC</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman</td><td>XPN-100</td><td>Wirowanie</td></tr><tr><td>System oczyszczania wody filtrowanej ultraczystej</td><td>Milli-Q</td><td>IQ 7000</td><td>Przygotowanie wody ultraczystej</td></tr></tbody></table>

izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to heterogeniczne nanocząsteczki błonowe uwalniane przez większość typów komórek, coraz częściej uznawane za fizjologiczne regulatory homeostazy organizmu i ważne wskaźniki patologii; w międzyczasie pojawia się ich ogromny potencjał do tworzenia dostępnych i kontrolowanych terapii chorób. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mogą uwalniać duże ilości EV w hodowli, co daje nadzieję na rozpoczęcie skutecznej regeneracji tkanek i ułatwienie szerokich zastosowań terapeutycznych o dobrej skalowalności i odtwarzalności. Rośnie zapotrzebowanie na proste i skuteczne protokoły zbierania i stosowania MSC-EV. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół oparty na wirowaniu różnicowym w celu wyizolowania i scharakteryzowania reprezentatywnych EV z hodowanych ludzkich MSC, egzosomów i mikropęcherzyków do dalszych zastosowań. Zdolność adaptacyjna tej metody jest wykazywana w przypadku szeregu dalszych podejść, takich jak znakowanie, przeszczep miejscowy i wstrzyknięcie ogólnoustrojowe. Wdrożenie tej procedury zaspokoi potrzebę prostego i niezawodnego gromadzenia i stosowania MSC-EVs w badaniach translacyjnych.

MVs oraz Exos z hodowanych ludzkich UCMSCs są izolowane zgodnie z schematem doświadczalnym (Rysunek 1). Wyniki NTA wykazują, że rozmiar Exos z ludzkich MSCs mieści się w zakresie od 40 nm do 335 nm z rozkładem szczytowym około 100 nm, a rozmiar MVs mieści się w zakresie od 50 nm do 445 nm z rozkładem szczytowym 150 nm (Rysunek 2). Charakterystyka morfologiczna Exos pochodzących z MSC wykazuje typowy kształt miseczkowaty (Rysunek 3)....

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Procedura ta była odpowiedzią na potrzebę prostego i wiarygodnego pobierania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych oraz zastosowania w tłumaczeniu badań. Pobieranie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą wirowania różnicowego jest proste, łatwo skalowalne i powtarzalne, co będzie przydatne w terenie. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe nieodróżnialne}od niewyraźnych}mezenchymalnych komórek macierzystych to niewyraźne zastosowanie w nowoczesnym leczeniu chorób.Nie będę się bał błędów. Ta operacja jest prosta i łatwa do nauczenia. W tym prostym programie jest wiele szczegółów, które można lepiej przedstawić za pomocą wideo.Na początek należy wyhodować mezenchymalne komórki macierzyste do ponad 90% konfluencji. Zastąp pożywkę hodowlaną w każdym naczyniu 8 ml uzupełnionego alfa-MEM. Po 48 godzinach hodowli komórki muszą być równomiernie wyhodowane, aby w pełni zebrać pożywkę hodowlaną do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.Następnie odwirować pożywkę hodowlaną o sile 800 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do stożkowych probówek o pojemności 1,5 ml w celu usunięcia fragmentów komórek i resztek komórkowych. Odwirować supernatant o stężeniu 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Za pomocą pipety przenieś zawiesinę do probówek ultrawirówek. Następnie odwirować w temperaturze 150 000 x g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zawiesić osad mikropęcherzyków w 50 μl PBS na naczynie.Wyrzuć supernatant i zbierz pozostałość, którą są egzosomy. Ponownie zawiesić egzosomy z siedmiu szalek komórek w 50 μl PBS. W probówce o pojemności 15 ml rozcieńczyć 1 μl pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w 1 499 μl PBS i wymieszać.Następnie uruchom kompatybilne oprogramowanie dla analizatora śledzenia. Napełnij celę próbki wodą destylowaną, a następnie pozwól przyrządowi rozpocząć sprawdzanie komórki. Skalibruj przyrząd przygotowanym roztworem wzorcowym.Upewnij się, że liczba cząstek wyświetlana w interfejsie wykrywania oprogramowania mieści się w zakresie od 50 do 400, a najlepiej około 200, i kliknij przycisk OK. Następnie przepłucz celę próbki 5 ml wody destylowanej. Przed analizą próbki przepłukać kanał 1 ml wody destylowanej.Upewnij się, że liczba cząstek wyświetlana w interfejsie wykrywania oprogramowania jest mniejsza niż 10. W stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml ponownie zawieś pęcherzyki zewnątrzkomórkowe za pomocą 250 μl PBS. W innej stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml przygotuj roztwór roboczy barwnika PKH26.Wymieszaj zawieszone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z roztworem roboczym. Pozostaw w temperaturze pokojowej na pięć minut, a następnie dodaj 500 uL FBS zubożonego w EV, aby zatrzymać reakcję. W przypadku mikropęcherzyków odwirować przy 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odrzucić supernatant. Dodaj 1 ml PBS, aby spłukać pozostałości. Ponownie odwirować i wyrzucić supernatant w celu usunięcia niezwiązanego barwnika.W przypadku mikropęcherzyków odwirować przy 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zawiesić pozostałość za pomocą 200 μl PBS. Upuść 20 μl zawiesiny na szkiełko i obserwuj je pod mikroskopem fluorescencyjnym.Ponownie zawiesić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w 200 μl PBS, a następnie wymieszać z roztworem heparyny w stosunku objętościowym 10:1. Umieść mysz w systemie obrazowania żył ogonowych. Naciśnij przełącznik, aby podnieść dźwignię.Za pomocą ilustratora żył ogonowych wykonuj systematyczne wstrzykiwanie zawiesiny pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przez żyłę ogonową. Analiza rozkładu wielkości cząstek za pomocą NTA wykazała, że wielkość egzosomów z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych wahała się od 40 do 335 nm, przy wielkości piku około 100 nm. Również wielkość mikropęcherzyków wahała się od 50 do 445 nm, przy wielkości piku 150 nm.Charakterystyka morfologiczna egzosomów wykazała, że wykazywały one typowy kształt miseczki. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe zostały skutecznie znakowane za pomocą PKH26, który był obserwowany w widoku ogólnym jako znakowane granulki, a także za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Operator powinien zachować ostrożność podczas pobierania supernatantu, ponieważ komórki muszą być równomiernie wydmuchiwane, aby w pełni zebrać uwolnione EV zatrzymane w niewyraźnych mezenchymalnych komórkach macierzystych.W celu zweryfikowania powodzenia wstrzyknięcia można wykonać obrazowanie in vivo biodystrybucji EV znakowanych fluorescencyjnie lub zamrożonych odcinków określonych miejsc tkankowych wszczepienia.

isolation-characterization-therapeutic-application-extracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół produkcji dużej liczby egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą bioreaktora 3D.

Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje wszystkie procedury, od hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i pobierania supernatantu po ekstrakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą ultrawirowania.

Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Komórki macierzyste nowotworu (CSCs) zidentyfikowano w wielu typach zmian złośliwych. W niniejszym protokole opisujemy metodę cytometrii przepływowej wykorzystującą aktywność dehydrogenazy aldehydowej oraz ekspresję CD44 i CD24 do izolacji CSCs z ksenoprzeszczepów gruczolakoprzewodowego raka trzustki człowieka. Te żywe komórki mogą być następnie wykorzystane w badaniach funkcjonalnych i analitycznych.

Izolacja komórek macierzystych z ksenoprzeszczepów raka trzustki człowieka

Opisano szybką i skuteczną metodę izolacji żywych dorosłych komórek macierzystych nabłonka ze skóry ludzkiej. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne macierzy kolagenowej skóry, a następnie wyrywanie mieszków włosowych i izolację zawiesin pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki do hodowli komórkowej.

Izolacja i hodowla dorosłych epitelialnych komórek macierzystych ze skóry człowieka

W niniejszym artykule prezentujemy izolację mysich rezydentnych mezenchymalnych komórek macierzystych płuc (lung MSC), ich ekspansję, charakterystykę oraz analizę właściwości immunomodulacyjnych.

Izolacja &amp;#38; Charakterystyka barwnika Hoechstniski CD45ujemny Mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy

Opisana jest prosta metoda indukcji przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT) w różnych typach komórek.  Uwzględniono metody analizy komórek w stanach EMT za pomocą immunocytochemii.

Indukcja i analiza przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego

Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowej wirowania. Ta technika umożliwia charakterystykę ekzosomów i mikropęcherzyków dla zastosowań terapeutycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów