Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Procedura ta była odpowiedzią na potrzebę prostego i wiarygodnego pobierania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych oraz zastosowania w tłumaczeniu badań. Pobieranie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą wirowania różnicowego jest proste, łatwo skalowalne i powtarzalne, co będzie przydatne w terenie. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe nieodróżnialne}od niewyraźnych}mezenchymalnych komórek macierzystych to niewyraźne zastosowanie w nowoczesnym leczeniu chorób.

Nie będę się bał błędów. Ta operacja jest prosta i łatwa do nauczenia. W tym prostym programie jest wiele szczegółów, które można lepiej przedstawić za pomocą wideo.

Na początek należy wyhodować mezenchymalne komórki macierzyste do ponad 90% konfluencji. Zastąp pożywkę hodowlaną w każdym naczyniu 8 ml uzupełnionego alfa-MEM. Po 48 godzinach hodowli komórki muszą być równomiernie wyhodowane, aby w pełni zebrać pożywkę hodowlaną do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.

Następnie odwirować pożywkę hodowlaną o sile 800 x g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do stożkowych probówek o pojemności 1,5 ml w celu usunięcia fragmentów komórek i resztek komórkowych. Odwirować supernatant o stężeniu 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Za pomocą pipety przenieś zawiesinę do probówek ultrawirówek. Następnie odwirować w temperaturze 150 000 x g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zawiesić osad mikropęcherzyków w 50 μl PBS na naczynie.

Wyrzuć supernatant i zbierz pozostałość, którą są egzosomy. Ponownie zawiesić egzosomy z siedmiu szalek komórek w 50 μl PBS. W probówce o pojemności 15 ml rozcieńczyć 1 μl pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w 1 499 μl PBS i wymieszać.

Następnie uruchom kompatybilne oprogramowanie dla analizatora śledzenia. Napełnij celę próbki wodą destylowaną, a następnie pozwól przyrządowi rozpocząć sprawdzanie komórki. Skalibruj przyrząd przygotowanym roztworem wzorcowym.

Upewnij się, że liczba cząstek wyświetlana w interfejsie wykrywania oprogramowania mieści się w zakresie od 50 do 400, a najlepiej około 200, i kliknij przycisk OK. Następnie przepłucz celę próbki 5 ml wody destylowanej. Przed analizą próbki przepłukać kanał 1 ml wody destylowanej.

Upewnij się, że liczba cząstek wyświetlana w interfejsie wykrywania oprogramowania jest mniejsza niż 10. W stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml ponownie zawieś pęcherzyki zewnątrzkomórkowe za pomocą 250 μl PBS. W innej stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml przygotuj roztwór roboczy barwnika PKH26.

Wymieszaj zawieszone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z roztworem roboczym. Pozostaw w temperaturze pokojowej na pięć minut, a następnie dodaj 500 uL FBS zubożonego w EV, aby zatrzymać reakcję. W przypadku mikropęcherzyków odwirować przy 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant. Dodaj 1 ml PBS, aby spłukać pozostałości. Ponownie odwirować i wyrzucić supernatant w celu usunięcia niezwiązanego barwnika.

W przypadku mikropęcherzyków odwirować przy 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zawiesić pozostałość za pomocą 200 μl PBS. Upuść 20 μl zawiesiny na szkiełko i obserwuj je pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Ponownie zawiesić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w 200 μl PBS, a następnie wymieszać z roztworem heparyny w stosunku objętościowym 10:1. Umieść mysz w systemie obrazowania żył ogonowych. Naciśnij przełącznik, aby podnieść dźwignię.

Za pomocą ilustratora żył ogonowych wykonuj systematyczne wstrzykiwanie zawiesiny pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przez żyłę ogonową. Analiza rozkładu wielkości cząstek za pomocą NTA wykazała, że wielkość egzosomów z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych wahała się od 40 do 335 nm, przy wielkości piku około 100 nm. Również wielkość mikropęcherzyków wahała się od 50 do 445 nm, przy wielkości piku 150 nm.

Charakterystyka morfologiczna egzosomów wykazała, że wykazywały one typowy kształt miseczki. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe zostały skutecznie znakowane za pomocą PKH26, który był obserwowany w widoku ogólnym jako znakowane granulki, a także za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Operator powinien zachować ostrożność podczas pobierania supernatantu, ponieważ komórki muszą być równomiernie wydmuchiwane, aby w pełni zebrać uwolnione EV zatrzymane w niewyraźnych mezenchymalnych komórkach macierzystych.

W celu zweryfikowania powodzenia wstrzyknięcia można wykonać obrazowanie in vivo biodystrybucji EV znakowanych fluorescencyjnie lub zamrożonych odcinków określonych miejsc tkankowych wszczepienia.