Awersyjne uczenie się asocjacyjne i tworzenie pamięci poprzez połączenie dwóch substancji chemicznych w Caenorhabditis elegans
23 czerwca 2022
Wcześniej opracowaliśmy protokoły dla Caenorhabditis elegans do tworzenia krótko- i długoterminowych wspomnień asocjacyjnych odpowiednio poprzez trening masowy i rozłożony w odstępach. Tutaj opisano szczegółowe protokoły warunkowania C. elegans poprzez parowanie 1-propanolu i kwasu solnego jako bodźców uwarunkowanych i bezwarunkowych, odpowiednio, w celu utworzenia awersyjnej pamięci asocjacyjnej.
Uczenie się i pamięć są niezbędne, aby zwierzęta mogły przetrwać i rozmnażać się poprzez skuteczne poruszanie się w ciągle zmieniającym się środowisku. Jest to również jeden z głównych przedmiotów badanych w neurobiologii. Caenorhabditis elegans jest atrakcyjnym organizmem do nauki i pamięci ze względu na prostotę układu nerwowego.
Całkowicie zrekonstruowane zostały również jego schematy połączeń chemicznych i elektrycznych. Analiza behawioralna Caenorhabditis elegans jest niezwykle trudna i wpływa na nią szereg parametrów, takich jak naprężenia chemiczne, mechaniczne i temperaturowe. Na początek przygotuj sześciocentymetrowe podłoże do wzrostu nicieni lub płytki NGM, rozprowadzając 0,2 mililitra płynnej kultury E.coli OP50 w pożywce Luria-Bertani i inkubując je w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 24 godziny.
Pierwszego dnia wybierz i umieść pięć dobrze odżywionych zwierząt ciężarnych na każdej sześciocentymetrowej płytce NGM za pomocą platynowego zbieracza robaków i pozwól im złożyć około 50 jaj przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, aby uzyskać zsynchronizowaną populację dorosłych zwierząt. Aby zatrzymać składanie jaj, usuń zwierzęta rodzicielskie z talerzy za pomocą platynowego zbieracza robaków. Hoduj zwierzęta w temperaturze pokojowej przez około pięć dni, aby osiągnąć dojrzałe stadium dorosłe, a nie stadium młodego dorosłego osobnika.
Po pięciu dniach zbierz około 200 dorosłych zwierząt do kolektora dla zwierząt, myjąc każdą płytkę jednym mililitrem 0,25% wodnej żelatyny, która zapobiegnie przywieraniu zwierząt do powierzchni tworzyw sztucznych, takich jak końcówki do pipet. Następnie umyj zwierzęta, delikatnie przesuwając kolektor dwukrotnie w górę iw dół w 10 mililitrach podwójnie destylowanej wody. Powtórz proces dwukrotnie.
Delikatnie zanurz pojemnik na zwierzęta zawierający około 200 zwierząt w 40 mililitrach mieszaniny 1%1-propanolu i kwasu solnego o pH 4 w naczyniu krystalizującym na jedną sekundę. Umyj zwierzęta w kolektorze, bardzo delikatnie zanurzając kolektor raz w studzience 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 10 mililitrów podwójnie destylowanej wody. Następnie umieść kolektor na trawniku E.coli OP50 na sześciocentymetrowej płycie NGM na 10 minut, aby zwierzęta mogły odpocząć.
Następnie umyj zwierzęta w kolektorze 10 mililitrami podwójnie destylowanej wody, delikatnie przesuwając kolektor w górę iw dół. Powtórz to płukanie trzy razy i przystąp do testu chemotaksji. Kolejno myj zwierzęta w kolektorze mieszaniną propanolu i podwójnie destylowaną wodą, po jednym razie, jak pokazano wcześniej.
Następnie umieść kolektor na trawniku E.coli OP50 na agarze NGM na sześciocentymetrowej szalce Petriego na 10 minut, aby zwierzęta mogły odpocząć. Następnie umyj zwierzęta trzykrotnie, delikatnie przesuwając kolektor dwukrotnie w górę iw dół w 10 mililitrach podwójnie destylowanej wody, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu i przystąp do testu chemotaksji. Przygotuj płytki ślimakowe do testu chemotaksji na sześciocentymetrowych plastikowych szalkach Petriego.
Następnie użyj odpiłowanej końcówki pipety z otworem większym niż jeden milimetr, aby przenieść zwierzęta z kolektora do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr 0,25% wodnej żelatyny. Po tym, jak zwierzęta osiądą na dnie probówki pod wpływem grawitacji, usuń supernatant z probówki. Ponownie zawiesić zwierzęta w jednym mililitrze buforu do chemotaksji i pozwolić im osiąść grawitacyjnie na dnie probówki na około jedną minutę.
Następnie należy usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą pipetowania. Następnie po przekątnej umieść cztery mikrolitry 5% wodnego 1-propanolu w dwóch miejscach, a następnie cztery mikrolitry podwójnie destylowanej wody w dwóch innych miejscach na płytce Petriego. Następnie użyj odpiłowanej końcówki pipety z otworem o średnicy jednego milimetra, aby wykryć sześć mikrolitrów zawiesiny zwierzęcej w buforze do testu chemotaksji zawierającym około 60 zwierząt w środku trzech płytek.
Usuń płyn w jak największym stopniu za pomocą laboratoryjnego do chusteczek, nie dotykając zwierząt. Umieść pokrywkę na talerzu i pozwól zwierzętom swobodnie poruszać się po talerzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby zatrzymać chemotaksję, przenieś tę płytkę na szklaną szalkę Petriego na lodzie na trzy minuty.
Następnie umieść talerz w lodówce, aż policzysz liczbę zwierząt na talerzu. Policz liczbę zwierząt w czterech sekcjach z wyjątkiem tych w środkowym okręgu pod mikroskopem stereoskopowym i oblicz wskaźnik chemotaksji za pomocą równania. Na podstawie wartości indeksu chemotaksji oblicz wartości indeksu uczenia się jako różnicę między wartością indeksu chemotaksji zwierząt referencyjnych a wartością indeksu chemotaksji zwierząt kondycjonowanych.
W teście chemotaksji zwierzęta kondycjonowane mieszaniną 1-propanolu i kwasu solnego nie są przyciągane do 5%1-propanolu nakrapianego na płytkach agarowych, podczas gdy zwierzęta naiwne i referencyjne były przyciągane do 5%1-propanolu. Zwierzęta kondycjonowane przez trening rozłożony w czasie mieszaniną wodnego 1-propanolu i kwasu solnego nie były już przyciągane do 5% 1-propanolu w porównaniu ze zwierzętami leczonymi 1%1-propanolem lub kwasem solnym lub tylko wodą podwójnie destylowaną. Badanie wpływu mutacji na pamięć ujawniło, że tworzenie pamięci krótkotrwałej i długotrwałej zależy od genów odgrywających istotną rolę w klasycznym warunkowaniu zwierząt.
Po każdym kondycjonowaniu zwierzęta należy delikatnie umyć tylko raz wodą podwójnie destylowaną. Po utworzeniu pamięci długotrwałej za pomocą tej procedury, obrazowanie wapnia i elektrofizjologia mogą zidentyfikować obwody neuronalne odpowiedzialne za pamięć. Dzięki analizom genetycznym i analizom pojedynczych neuronów, procesy przechowywania i odzyskiwania pamięci mogą być analizowane na poziomie molekularnym i pojedynczych komórek.
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje protokoły warunkowania Caenorhabditis elegans w celu tworzenia awersyjnych pamięci asocjacyjnych z wykorzystaniem 1-propanolu i kwasu solnego jako bodźców. Poprzez badanie roli czynników genetycznych, praca dostarcza informacji na temat formowania pamięci krótkotrwałej i długotrwałej w prostych układach nerwowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- analiza behawioralna
- uczenie się i pamięć
Wstęp
- Caenorhabditis elegans jest idealnym modelem do badania uczenia się i pamięci ze względu na swój prosty układ nerwowy.
- Badanie koncentruje się na strategiach wywoływania pamięci krótkotrwałej i długotrwałej poprzez warunkowanie asocjacyjne.
- Uczenie się i pamięć są niezbędne dla przetrwania zwierząt w zmieniającym się środowisku.
- Na zachowanie mogą wpływać różne czynniki zewnętrzne, co komplikuje analizę.
Cel badania
- Opisanie protokołów warunkowania pamięci awersyjnej u C. elegans.
- Zbadanie roli specyficznych genów w tworzeniu pamięci asocjacyjnej.
- Ocena wpływu warunkowania na zachowanie ruchowe organizmów.
Zastosowane metody
- Procedury eksperymentalne obejmują hodowlę na płytkach NGM oraz różnorodne zabiegi chemiczne w celu kondycjonowania.
- Wykorzystanym modelem biologicznym jest C. elegans, ze szczególnym uwzględnieniem reakcji behawioralnych na bodźce chemiczne.
- Kluczowe etapy obejmują synchronizację populacji dorosłych osobników oraz późniejsze testy chemotaksji.
- Protokoły szczegółowo opisują procesy przemywania i kondycjonowania zwierząt w celu przygotowania ich do testów.
- Analizy obejmują zliczanie reakcji zwierząt na bodźce w określonych warunkach pod mikroskopem.
Główne wyniki
- Zwarunkowane zwierzęta wykazywały zmniejszone przyciąganie do 1-propanolu, co wskazuje na skuteczne utworzenie pamięci awersyjnej.
- Tworzenie pamięci długotrwałej było powiązane ze specyficznymi czynnikami genetycznymi niezbędnymi do warunkowania klasycznego.
- Wyniki porównawcze zwierząt naiwnych i warunkowanych podkreśliły znaczące różnice behawioralne.
- Zastosowane metodologie pozwoliły na kalibrację indeksów pamięci na podstawie reakcji chemotaktycznych.
Wnioski
- Badanie pogłębia zrozumienie procesów formowania pamięci asocjacyjnej w prostych obwodach neuronalnych.
- Identyfikuje podstawy genetyczne przyczyniające się do powstawania różnych rodzajów pamięci, torując drogę do przyszłych badań.
- Wyniki mają szersze znaczenie dla neurobiologii, szczególnie w zakresie wyjaśniania mechanizmów pamięci.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Uczenie asocjacyjne i formowanie pamięci u Caenorhabditis elegans stanowią genetycznie podatny system do analizy molekularnych i neuronalnych mechanizmów leżących u podstaw adaptacji behawioralnej. Model ten umożliwia wysoką wiarygodność walidacji celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego na wczesnych etapach odkrywania, wspierając ciągłość predykcyjną od generowania hipotez po badania przedkliniczne. Podejście to jest bezpośrednio istotne dla zespołów biofarmaceutycznych poszukujących solidnych, ilościowych odczytów dla portfeli skoncentrowanych na neurobiologii.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków uczenia się i pamięci z wykorzystaniem zdefiniowanych tła genetycznych.
- Wspiera walidację funkcjonalną genów kandydackich zaangażowanych w plastyczność synaptyczną i formowanie pamięci.
- Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie zaburzeń molekularnych z fenotypami behawioralnymi.
- Zapewnia platformę do szybkiego testowania hipotez w kontekście całego organizmu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane wskaźniki chemotaksji i uczenia się do ilościowej oceny fenotypów pamięci.
- Umożliwia powtarzalne analizy behawioralne odpowiednie do przesiewania genetycznego lub farmakologicznego.
- Wspiera skalowalność analiz oraz porównywalność między badaniami dzięki zdefiniowanym protokołom i kontrolom.
- Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do późniejszej oceny związków ukierunkowanej na obwody neuronalne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z mechanizmami istotnymi dla chorób poprzez modelowanie konserwowanych ścieżek pamięci.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od odkryć genetycznych do walidacji funkcjonalnej w prostych obwodach neuronalnych.
- Wspiera optymalizację rozwoju celów neurobiologicznych o potencjale translacyjnym w oparciu o analizę ryzyka.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy, który pomaga w wyborze modeli przedklinicznych i opracowaniu strategii biomarkerów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywczego, od wczesnych testów hipotez, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną w programach neurobiologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej oraz wyjaśnianie szlaków dla celów związanych z pamięcią.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki behawioralne dla rozwoju testów i selekcji związków.
- Analityka: Umożliwia obliczanie indeksów chemotaksji i uczenia się w celu porównania warunków genetycznych lub terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia molekularne z wynikami funkcjonalnymi w systemie całego organizmu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnych badań genetycznych, farmakologicznych lub mechanistycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy behawioralne w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez powiązanie zmian molekularnych z wynikami funkcjonalnymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i szlaków neurobiologicznych z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie neuronauki behawioralnej oraz manipulacji genetycznych C. elegans.
- Wymagany jest dostęp do mikroskopii, infrastruktury do testów chemotaksji oraz narzędzi do analizy ilościowej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów warunkowania i testów pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych tło genetycznych lub warunków środowiskowych.
- Wyniki behawioralne mogą być pod wpływem zewnętrznych czynników stresogennych, co wymaga starannej kontroli eksperymentalnej.
Najczęściej zadawane pytania dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Preparation of Synchronized Caenorhabditis elegans
2:06
Mass Training for Short-Term Associative Learning and Memory
2:54
Spaced Training for Long-term Associative Learning and Memory
3:27
Chemotaxis Assay
5:47
Results: Aversive Associative Learning and Memory Formation in Caenorhabditis elegans
6:39
Conclusion
