Name: Podstawy histologii i wykrywanie śmierci komórki w tkance pszczoły miodnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Poznaj metody immunohistochemiczne do wykrywania apoptozy i nekrozy w tkankach pszczoły miodnej, w tym jelicie środkowym i gruczołach podgardzielowych. Technika ta pozwala ocenić wpływ pestycydów na zdrowie pszczół.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękuję za wsparcie Słoweńskiej Agencji Badawczej, grant nr P4-133.

1. Podstawy histologii w badaniach nad pszczołą miodną
<ol>
	<li>Disekcja tkanek pszczoły miodnej 
	UWAGA: Do dyssekcji pszczół robotnic należy użyć mikroskopu stereoskopowego z oświetleniem LED. Najbardziej użyteczne powiększenie to ~20x.
	<ol>
		<li>Manipulacja i dyssekcja
		<ol>
			<li>Ostrożnie chwycić pszczołę robotnicę pęsetą i umieścić ją na lodzie (lub w zamrażarce w temperaturze -20 °C) na 2 min w celu unieruchomienia22. Przypiąć pszczołę do szalki Petriego szpilkami ukośnie przez najwyższą tylną część toraksu dwukrotnie, od lewej do prawej i od prawej do lewej.</li>
			<li>Wlać sól fizjologiczną dla owadów, aby przykryć ciało. Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem, ustawić ostrość i wyregulować obraz.</li>
			<li>Przygotować instrumenty (patrz Tabela materiałów).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dyssekcja jelita środkowego
		<ol>
			<li>Rozpocząć od odwłoka, wsuwając jedno ostrze nożyczek pod tergit A5 (Rycina 1) w centrum prawej strony ciała pszczoły. Przeciąć do tergitu A2.</li>
			<li>Trzymać wewnętrzne ostrze nożyczek równolegle do boku ciała, aby uniknąć uszkodzenia organów wewnętrznych. Obrócić nożyczki w lewo i wykonać jedno cięcie; obrócić w prawo i wykonać drugie cięcie. Delikatnie otworzyć lewą część odwłoka i przypiąć ją szpilką. Powtórzyć czynność po drugiej stronie.</li>
			<li>Używając pęsety w jednej ręce, delikatnie pociągnąć żołądek pszczoły do góry, a nożyczkami w drugiej ręce przeciąć w samym końcu przełyku. Odciągnąć żołądek i jelito środkowe od odwłoka i przeciąć w miejscu odbytnicy. Użyć pipety z roztworem soli fizjologicznej dla owadów i usunąć odchody lub fragmenty tkanek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dyssekcja HPGs
		<ol>
			<li>Unieruchomić pszczołę robotnicę na lodzie zgodnie z opisem w kroku 1.1.1. Odciąć głowę i umieścić ją na mniejszej płytce czułkami skierowanymi do góry. Zabezpieczyć głowę dwiema szpilkami: jedną przez lewe oko złożone, a drugą przez prawe oko złożone.</li>
			<li>Wykonać cięcie przez pierwsze oko złożone po wewnętrznej stronie szpilek, kontynuować do labrum, a następnie wykonać kolejne cięcie po drugiej stronie przez drugie oko złożone (Rycina 2).</li>
			<li>Odciąć czułki. Podnieść maskę i odciąć w miejscu, gdzie wciąż jest przytwierdzona. Używając pęsety, ostrożnie usunąć gruczoły wraz z mózgiem i częścią oczu złożonych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fiksacja, odwodnienie i zatapianie w parafinie 
	UWAGA: Należy stosować rękawice ochronne.
	<ol>
		<li>Umieścić tkankę w butelkach po penicylinie, wypełnionych w 3/4 10% formaliną. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po 24 h odwodnić tkankę w serii alkoholi: 70%, 80%, 90%, 100%, po 1 h w każdym, w 100% 2-propanolu przez 1 h, w 100% 2-propanolu przez 12 h i na koniec w 100% 2-propanolu przez 1 h.</li>
		<li>Umieścić tkankę w kasetkach histologicznych; opisać je i umieścić w komorach szklanych z 2-propanolem i parafiną (1:1) w inkubatorze w temperaturze 60 °C przez 24 h.</li>
		<li>Przenieść kasetki histologiczne do drugiej komory z parafiną (I.) na kolejne 24 h. Powtórzyć procedurę ze świeżą parafiną jeszcze dwukrotnie (II. i III.), za każdym razem przez 24 h.</li>
		<li>Na koniec przygotować stację do zatapiania i rozpocząć zatapianie tkanki w wosku.
		<ol>
			<li>Otworzyć każdą kasetkę histologiczną i zdjąć pokrywkę. Wypełnić formę woskiem i ostrożnie umieścić tkankę za pomocą ciepłej pęsety na środku formy.</li>
			<li>Umieścić kasetkę histologiczną na formie i lekko przykryć woskiem. Natychmiast położyć formę na zimnej powierzchni stacji do zatapiania na kilka sekund, a następnie na zimnej płycie przez kilka minut, aż wosk stwardnieje i oddzieli się od formy wraz z kasetką histologiczną.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przechowywać gotowe próbki w pudełku, z dala od kurzu i ciepła.</li>
		<li>Wyciąć sekcje o grubości 4 µm na mikrotomie: najpierw dwie sekcje przylegające do siebie, a następnie jedną osobno. Przenieść sekcje pęsetą i pozwolić im pływać na wodzie destylowanej (42 °C), a następnie zebrać je na czystych szkiełkach, umieszczając dwie sekcje razem po lewej stronie szkiełka przedmiotowego i trzecią po prawej stronie, tak aby pozostały wyraźnie oddzielone. Pozostawić opisane szkiełka na noc na urządzeniu grzewczym i na koniec przechowywać je w pudełku przeznaczonym dla próbek histologicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwoskowanie i rehydratacja 
	UWAGA: Należy stosować rękawice ochronne.
	<ol>
		<li>Przygotować dziewięć słoików Coplina i umieścić sekcje w serii środków rozjaśniających (I., II., III.) po 5 min w każdym.</li>
		<li>Umieścić w 2-propanolu, etanolu 96% (I., II.), alkoholu 90% i 80% oraz w wodzie destylowanej po 3 min w każdym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie hematoksyliną i eozyną 
	UWAGA: Należy stosować rękawice ochronne.
	<ol>
		<li>Przygotować sześć słoików Coplina.</li>
		<li>W celu barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E), odwoskowane i rehydratyzowane sekcje umieścić w hematoksylinie na 5 min, a następnie ostrożnie opłukać pod bieżącą wodą z kranu przez 2 min. Następnie umieścić je w wodzie destylowanej na 1 min i w eozynie na 4 min (dla eozyny słoik Coplina nie jest konieczny).</li>
		<li>Umieścić szkiełka w etanolu 96% na 1 min, następnie w 2-propanolu na 2 min i na koniec w środku rozjaśniającym na 2 min.</li>
		<li>Dodać medium montażowe i szkiełko zakrywkowe i pozostawić do wyschnięcia. Obserwować pod mikroskopem świetlnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat anatomii owada z opisanymi segmentami ciała A1-A7, szczegółowa struktura do badań entomologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Widok grzbietowy ciała pszczoły miodnej. Tergity A1-A7. Szczegółowe instrukcje dotyczące sekcji pszczoły miodnej można znaleźć w pracy Carreck et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tkanka grzybowa pod mikroskopem, eksperyment mykologiczny; struktura komórkowa, skala 500 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Widok grzbietowy HPG, części złożonych oczu przytwierdzone do mózgu (niewidoczne). Młoda pszczoła robotnica w wieku od 5 do 6 dni posiada pełne i kremowo-białe HPG. Acini znajdują się na mózgu i wypełniają obszar głowy, a ich odgałęzienia sięgają tylnej części mózgu. U pszczół zbieraczek gruczoły te są znacznie pomniejszone i pozostawiają jedynie cienkie, nitkowate szczątki. Z tego powodu lepiej jest usuwać gruczoły wraz z mózgiem, aby w dalszych procedurach uniknąć utraty tkanki. Pasek skali = 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Wykrywanie śmierci komórek w przekrojach tkanek
<ol>
	<li>Zestaw do wykrywania apoptozy (Test A) 
	UWAGA: Należy postępować zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przygotować naczynia Copilina.</li>
		<li>Po odparafinowaniu i rehydratacji (patrz krok 1.3) zanurzyć preparaty w 0,85% roztworze NaCl, a następnie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (5 min).</li>
		<li>Umieścić preparaty w 4% paraformaldehydzie 2 x 15 min.</li>
		<li>Ułożyć preparaty płasko w pojemniku i dodać 100 µL roztworu Proteinazy K (20 µg/mL), następnie pozostawić na 10-30 min.</li>
		<li>Umieścić preparaty w PBS (5 min).</li>
		<li>Umieścić preparaty w 4% paraformaldehydzie w PBS (5 min).</li>
		<li>Zanurzyć preparaty w PBS (2 x 5 min).</li>
		<li>Ułożyć preparaty płasko w pojemniku, dodać 100 µL buforu równoważącego i pozostawić na 5-10 min.</li>
		<li>Dodać 100 µL mieszaniny reakcyjnej TdT. Włożyć ręczniki papierowe do wnętrza pojemnika, wokół preparatów, zwilżyć ręczniki wodą, a następnie przykryć folią plastikową. Inkubować preparaty przez 60 min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umieścić preparaty z powrotem w statywie do barwienia i zanurzyć w 2x roztworze SSC (cytrynian sodu i sól) na 15 min.</li>
		<li>Zanurzyć preparaty 3 x 5 min w PBS, następnie w 0,3% nadtlenku wodoru przez 3-5 min, a potem ponownie w PBS 3 x 5 min.</li>
		<li>Ponownie ułożyć preparaty płasko w pojemniku, dodać 100 µL Streptawidyny HRP (peroksydazy chrzanowej) i pozostawić na 30 min (przykryć folią plastikową).</li>
		<li>Zanurzyć preparaty 3 x 5 min w PBS.</li>
		<li>Ułożyć preparaty płasko w pojemniku i dodać 100 µL roztworu 3,3'-diaminobenzydyny (DAB). Kontrolować pojawienie się jasnobrązowego tła.</li>
		<li>Przenieść preparaty do statywu i kilkukrotnie przemyć wodą (podwójnie destylowaną).</li>
		<li>Zamontować preparaty pod szkiełkami nakrywkowymi w medium montażowym i pozostawić w pozycji poziomej do wyschnięcia.</li>
		<li>Obserwować pod mikroskopem świetlnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zestaw do wykrywania apoptozy (Test B) 
	UWAGA: Należy postępować zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przygotować naczynia Copilina.</li>
		<li>Przygotować Proteinazę K (20 µg/mL rozcieńczoną w PBS).</li>
		<li>Po odparafinowaniu i rehydratacji skrawków (krok 1.3) umieścić preparaty w PBS na 5 min.</li>
		<li>Ułożyć preparaty płasko w pojemniku i dodać Proteinazę K (20 µg/mL, 60 µL na 5 cm² próbki).</li>
		<li>Przemyć preparaty 2 x 2 min w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Zablokować endogenną peroksydazę (w 3% nadtlenku wodoru) w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepłukać preparaty 2 x 5 min w PBS lub wodzie.</li>
		<li>Ułożyć preparaty płasko w pojemniku i nałożyć bufor równoważący (75 µL/5 cm2) na 10 s w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie wytrzeć obszar wokół tkanki.</li>
		<li>Dodać enzym TdT (terminalową nukleotydylotransferazę do końca łańcucha) do każdego skrawka i inkubować w komorze wilgotnej przez 1 h w 37 °C. Włożyć ręczniki papierowe do tacy, wokół preparatów, zwilżyć ręczniki wodą i przykryć folią plastikową.</li>
		<li>Po inkubacji umieścić próbki w statywie i pozostawić w buforze zatrzymującym/płuczącym (10 min).</li>
		<li>Dociągnąć koniugat anty-digoksygieniny do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Przemyć preparaty w PBS (3 x 1 min).</li>
		<li>Ostrożnie wytrzeć obszar wokół tkanki.</li>
		<li>Dodać dwie krople koniugatu anty-digoksygenina-peroksydaza (65 µL/5 cm²) do skrawków i inkubować przez 30 min w pojemniku wilgotnym.</li>
		<li>Po przemyciu w PBS 4 x 2 min przygotować substrat peroksydazy o mocy roboczej, delikatnie odprowadzić nadmiar cieczy i odessać płyn wokół skrawka.</li>
		<li>Przykryć skrawki substratem peroksydazy (75 µL/5 cm²) i barwić przez 5 min. Umieścić preparat pod mikroskopem i określić optymalny czas barwienia.</li>
		<li>Przemyć preparaty w statywie do barwienia w wodzie destylowanej (3 x 1 min).</li>
		<li>Inkubować preparaty w wodzie destylowanej przez 5 min.</li>
		<li>Zbarwić kontrastowo hematoksyliną przez 2 min.</li>
		<li>Przepłukać preparat pod bieżącą wodą z kranu przez 3 min.</li>
		<li>Przemyć preparat w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Zamontować preparaty pod szkiełkami nakrywkowymi w medium montażowym i pozostawić w pozycji poziomej do wyschnięcia.</li>
		<li>Obserwować pod mikroskopem świetlnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zestaw do wykrywania apoptozy (Test C) 
	UWAGA: Należy postępować zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przygotować naczynia Copilina.</li>
		<li>Odparafinować i rehydratować skrawki tkanki (patrz krok 1.3).</li>
		<li>Inkubować tkankę z Proteinazą K (15-30 min w 37 °C).</li>
		<li>Umieścić preparaty z powrotem w statywie i przepłukać 2x w PBS.</li>
		<li>Przykryć 50 µL „mieszaniny reakcyjnej TUNEL”. Włożyć mokre ręczniki papierowe do wnętrza pojemnika, przykryć je folią plastikową i pozostawić na 60 min w 37 °C.</li>
		<li>Przepłukać 3x w PBS.</li>
		<li>Umieścić preparaty w pojemniku i osuszyć obszar wokół próbki tkanki.</li>
		<li>Dodać 50 µL Converter-AP do próbki i inkubować w pojemniku wilgotnym przez 30 min w 37 °C.</li>
		<li>Przepłukać 3x w PBS.</li>
		<li>Dodać 50-100 µL roztworu substratu i pozostawić na 10 min w ciemności. 
		UWAGA: Obserwować barwienie pod mikroskopem świetlnym.</li>
		<li>Przepłukać preparaty 3x w PBS.</li>
		<li>Zbarwić kontrastowo, przenosząc skrawki do hematoksyliny na 2 min, a następnie ostrożnie płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.</li>
		<li>Zamontować preparaty pod szkiełkami nakrywkowymi w wodnym medium montażowym i pozostawić w pozycji poziomej do wyschnięcia.</li>
		<li>Obserwować pod mikroskopem świetlnym. Ocenić komórki dotknięte procesem (pozytywne), licząc od 70 do 100 komórek w każdej próbce jelita środkowego lub HPG pod mikroskopem świetlnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ruttner, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuttner%2C+F+%22Naturgeschichte+der+Honigbienen%22">Naturgeschichte der Honigbienen</a>. , Ehrenwirth. München. (1992).</li>
<li>Jordan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kleine+Bienenkunde%5BTitle%5D)+AND+%22%C3%96sterreichischer+Agrarverlag+Wien+M%C3%BCnchen%22%5BJournal%5D)">Kleine Bienenkunde.</a> Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).</li>
<li>Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSnodgrass%2C+RE+%22The+Hive+and+the+Honey+Bee%22">The Hive and the Honey Bee</a>. , Dadant and Sons. 111-113 (1975).</li>
<li>Snodgrass, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSnodgrass%2C+RE+%22The+Anatomy+of+the+Honey+Bee%22">The Anatomy of the Honey Bee</a>. , Cornell University Press. (2004).</li>
<li>Hrassnigg, N., Crailsheim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+hypopharyngeal+gland+development+to+the+brood+status+of+honeybee+%28Apis+mellifera+L.%29+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies.</a> Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).</li>
<li>Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+hypopharyngeal+glands+in+honeybees+%28Apis+mellifera+carnica%29+from+a+nurse+colony%5BTitle%5D)+AND+%22Slovenian+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony.</a> Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).</li>
<li>Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+the+expression+of+hypopharyngeal-gland+proteins+of+the+worker+honeybees+%28Apis+mellifera+L.%29+with+age+and%2For+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role.</a> Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).</li>
<li>Sammataro, D., Yoder, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSammataro%2C+D+%22Honey+bee+colony+health%3A+Challenges+and+sustainable+solutions%22">Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions</a>. , Taylor & Francis Group. 302(2012).</li>
<li>Crailsheim, K., Stolberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+diet%2C+age+and+colony+condition+upon+intestinal+proteolytic+activity+and+size+of+the+hypopharyngeal+glands+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).</li>
<li>Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+proteins+and+cell+death+in+situ+localisation+in+hypopharyngeal+glands+of+honeybee+%28Apis+mellifera+carnica%29+workers+after+imidacloprid+or+coumaphos+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment.</a> Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).</li>
<li>Gregorc, A., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+characterisation+of+cell+death+in+honeybee+larvae+midgut+after+treatment+with+Paenibacillus+larvae%2C+Amitraz+and+Oxytetracycline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline.</a> Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).</li>
<li>Higes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+pathogenesis+of+Nosema+ceranae+%28Microsporidia%3A+Nosematidae%29+in+honey+bees+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera).</a> Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).</li>
<li>Kurze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+dynamics+of+Nosema+ceranae+in+honey+bee+midgut+and+host+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).</li>
<li>Johnson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+bee+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Honey bee toxicology.</a> Annual Review of Entomology. 60 (1), 415-434 (2005).</li>
<li>Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+and+natural+acaricides+impair+hygienic+and+foraging+behaviors+of+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees.</a> Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).</li>
<li>McMenamin, A. J., Genersch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+bee+colony+losses+and+associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Honey bee colony losses and associated viruses.</a> Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).</li>
<li>Ramsey, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varroa+destructor+feeds+primarily+on+honey+bee+fat+body+tissue+and+not+hemolymph%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).</li>
<li>Requier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+bee+diet+in+intensive+farmland+habitats+reveals+an+unexpectedly+high+flower+richness+and+a+major+role+of+weeds%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Applications%22%5BJournal%5D)">Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds.</a> Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).</li>
<li>Santos, C., Serrão, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+of+the+ileum+in+bees+%28Hymenoptera%2C+Apoidea%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Morphological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea).</a> Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).</li>
<li>Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+comparison+of+the+hypopharyngeal+gland+in+Apis+cerana+Fabricius%2C+1793+workers+and+Apis+mellifera+Linnaeus%2C+1758+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Psyche%3A+A+Journal+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers.</a> Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).</li>
<li>Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, Ö <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histomorphological+and+histochemical+structure+of+the+midgut+and+hindgut+of+the+Caucasian+honey+bee+%28Apis+mellifera+caucasia%29%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Veterinary+and+Animal+Sciences%22%5BJournal%5D)">Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia).</a> Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).</li>
<li>Human, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miscellaneous+standard+methods+for+Apis+mellifera+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Apicultural+Research%22%5BJournal%5D)">Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).</li>
<li>Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+and+immunohistochemical+testing+of+honeybees+after+oxalic+and+rotenone+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments.</a> Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).</li>
<li>Carreck, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+methods+for+Apis+mellifera+anatomy+and+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Apicultural+Research%22%5BJournal%5D)">Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).</li>
<li>Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowen%2C+ID+%22Mitosis+and+apoptosis%3A+Matters+of+Life+and+Death%22">Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death</a>. , Chapman & Hall. London. (1998).</li>
<li>Eisenberg-Lerner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+and+death+partners%3A+apoptosis%2C+autophagy+and+the+cross-talk+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).</li>
<li>Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+the+salivary+gland+of+the+blow+fly+Calliphora+vomitoria%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+Techniques%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria.</a> Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).</li>
<li>D'Arcy, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death%3A+a+review+of+the+major+forms+of+apoptosis%2C+necrosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy.</a> Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).</li>
<li>Matylevitch, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+accidental+cell+death+in+cultured+human+keratinocytes+after+thermal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury.</a> American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).</li>
<li>Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+detection+of+apoptosis+and+necrosis+in+monolayer+cultures+by+TUNEL+and+trypan+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining.</a> BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).</li>
<li>Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+apoptotic+cells+using+a+modified+in+situ+TUNEL+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).</li>
<li>Gregorc, A., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L.%29+larvae+midgut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut.</a> Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).</li>
<li>Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+honey+bee+%28Apis+mellifera%29+larvae+treated+with+oxalic+or+formic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Apidologie%22%5BJournal%5D)">Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid.</a> Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).</li>
</ol>

Autor nie pozostaje w konflikcie interesów.

W organizmach żywych śmierć komórki jest definiowana jako apoptoza lub nekroza25 i może jej towarzyszyć autofagia26. Różnica między komórkami apoptozycznymi i martwiczymi polega na tym, że apoptoza jest formą zaprogramowanej śmierci komórki i pojawia się w normalnych komórkach, podczas gdy nekroza występuje z powodu warunków śmiertelnych (np. wypadku, choroby)27,28. Apoptozę można wykryć za pomocą zestawów testowych...

Pszczoły miodne (Apis mellifera L.) są, wśród innych dzikich zapylaczy, najważniejszymi zapylaczami roślin rolniczych. Przez tysiące lat zmieniające się środowisko wpłynęło na pszczoły, aby przystosowały swoją morfologię, fizjologię, zachowanie i tolerancję na kilka patogenów i pasożytów. W związku z tym pszczoły miodne rozwinęły bardzo różnorodną gamę gatunków i podgatunków na całym świecie1. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami, że istnieje zmienność genetyczna w strukturze przewodu pokarmowego pszczoły miodnej, ale sugerują również, że zmiany w jelicie środkowym są spowodowane czynnikami środowiskowymi2,3.
Przewód pokarmowy pszczoły miodnej składa się z trzech głównych części: jelita przedniego, środkowego (ventriculus) i hindgut4. Komora jest niezbędnym narządem do trawienia pyłku i nektaru/miodu; W jelicie tylnym kontrola osmotyczna odbywa się poprzez absorpcję wody i jonów2. Gruczoły podgardłowe (HPG) robotnic pszczół miodnych znajdują się w głowie i syntetyzują oraz wydzielają składniki mleczka pszczelego, aby karmić czerw, królową i członków rodziny. Ich wielkość zmienia się wraz z wiekiem i zadaniami i zależy od prawidłowego odżywiania (jakości pyłku). Pielęgniarki w wieku od 6 do 18 dni zajmują się hodowlą czerwiu, a rozmiar HPG wzrasta5,6. U pszczół zbieraczek HPG degenerują się i wydzielają tylko te enzymy, które są ważne do przekształcenia cukrów złożonych w proste (α-glukozydazy, leucyna-arylamidaza, inwertaza) w miodzie7.
Pszczoły miodne są narażone na kilka biotycznych i abiotycznych czynników stresogennych8, a na przewód pokarmowy może wpływać kilka negatywnych stymulantów. Pierwszą barierą chroniącą organizm przed patogenami jest błona perytroficzna w jelicie środkowym, która składa się z błony śluzowej jelit w celu ochrony przed patogenami4. Rozwój i funkcja HPG zależą od diety, wieku i stanu kolonii9 i mają na nie wpływ insektycydy, akarycydy10 i patogeny11,12,13. Pozostałości akarycydów w ulu spowodowane zwalczaniem warrozy i pestycydami ze środowiska wpływają na pszczoły zbieraczki i pszczoły pielęgniarki14,15. Największym zagrożeniem dla kolonii pszczół miodnych jest roztocza Varroa destructor, zarówno jako wektor wirusów przyczyniających się do utraty kolonii16, jak i jako konsument tłuszczu gospodarza (ważnego ważnego narządu u pszczół miodnych), który w konsekwencji wpływa na funkcjonowanie organizmu i kolonii osobnika17.
Jednak intensywne siedliska na polach uprawnych mogą zapewnić krótkoterminowe źródło pożywienia dla pszczół miodnych. W związku z tym programy rolno-środowiskowe powinny zwiększyć dostępność kwiatów miododajnych w krajobrazach rolniczych18. Aby ocenić morfologię różnych podgatunków6,19,20,21 lub subletalne skutki tych czynników na poziomie komórek lub tkanek, zwłaszcza jelita środkowego i HPG, metody histologiczne i immunohistochemiczne są praktyczne i wystarczająco dokładne, aby można je było stosować w badaniach histologicznych u pszczół miodnych.

<table><tbody><tr><td>Zestaw peroksydazy 2-propanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApopTag (ApopTag Peroksydaza in situ Wykrywanie apoptozy)</td><td>Test Sigma-Aldrich</td><td>S7100</td><td>B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Kontrole pozytywne zawarte w S7101</td></tr><tr><td>Obejmuje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>system kolorymetryczny TUNEL DeadEnd</td><td>Promega</td><td>G7360</td><td>Test A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny&nbsp; (do sekcji pszczół)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td></td><td>destylowana</td></tr><tr><td>Kaseta</td><td></td><td></td><td></td>do zatapiania</tr><tr><td>EnVision System zestaw fosfatazy alkalicznej</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>alkoholowy</td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>95% (lub mniej czysty), 90%, 80%</td></tr><tr><td>Faramount podłoże montażowe</td><td>, wodneŚredni</td><td>montażowy</td>Dako <td></td></tr><tr><td>Stół spłaszczający</td><td>Leica</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze&nbsp; (do sekcji pszczół)</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11294-00</td><td>Standard #4</td></tr><tr><td>Formalina 10%</td><td></td><td></td><td>Formaldehyd</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td> Środek czyszczący <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoChoice Środek</td><td>czyszczący</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza wodorowa 3%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów&nbsp; (do sekcji pszczół)</td><td>Entosphinx</td><td>44594</td><td>Szpilki do owadów ze stali nierdzewnej &ndash; białe, rozmiar 2</td></tr><tr><td>ISCDDK, AP (zestaw do wykrywania śmierci komórek in situ, fosfataza alkaliczna)</td><td>Roche</td><td>11684809910</td><td>Test C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zegar laboratoryjny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Szkiełka</td> mikroskopowe Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pudełko ze szkiełkami musi być zabezpieczone w plastikowej folii, aby zapobiec kurzowi</td>Mikrotom Leica Modułowa stacja do zatapiania tkanek Leica Na2HPO4<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 4%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Pipety</td> Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>1,5 mL; 3 ml</td>PBS szalka Petriego&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (do sekcji pszczół)</td><td></td><td></td><td>Wypełniony kondensacją krzemu&nbsp; (Xantoprene L niebieski i Płyn uniwersalny plus aktywator)</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Merck</td><td>21627</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Ringera&nbsp; (do sekcji pszczół)</td><td></td><td></td><td>7,5 g NaCL, 2,38 g Na2HPO4, 2,72 g KH2PO4, 1 l wody destylowanej</td></tr><tr><td>Nożyczki&nbsp; (do sekcji pszczół)</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>1406-09, 14061-09</td><td>Proste i zakrzywione, 9 cm</td></tr><tr><td>Płyn uniwersalny plus aktywator&nbsp; (do sekcji pszczół)</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zegarmistrz s kleszcze (do preparacji pszczół)</td><td>Narzędzia do nauki o naprawach</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Pędzel</td> do akwareli Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>2x</td>Xantoprene L niebieski&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td> (do sekcji pszczół)</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

podstawy histologii i wykrywanie śmierci komórki w tkance pszczoły miodnej

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

Pszczoły miodne (Apis mellifera L.) wewnątrz ula (pielęgniarki i inne pszczoły ulowe) i na zewnątrz ula (zbieracze) są narażone na zmiany klimatu i pogody, różne pestycydy, patogeny i niedożywienie, głównie przedostające się przez usta i wpływające głównie na przewód pokarmowy dorosłych pszczół. Aby zrozumieć i zapobiec wpływowi takich zewnętrznych i wewnętrznych stresorów na pszczoły miodne, jedną z przydatnych metod badawczych jest metoda immunohistochemiczna. Opisano podstawowy protokół przygotowania jelita środkowego (ventriculus) i gruczołów podgardłowych (HPG) dorosłych pszczół do analizy histologicznej. Opisano szczegółową metodologię oceny stopnia uszkodzenia komórek i odróżnienia martwicy od programowanej śmierci komórki (apoptozy) jako naturalnego procesu regeneracji tkanek. Przedstawiono wyniki leczenia dorosłych pszczół miodnych kwasem szczawiowym i pestycydami (insektycydem i akarycydem) oraz oznaczaniem śmierci komórek w komorze i HPG. Omówiono również zalety i wady metodologii.

Wykrywanie śmierci komórek w jelicie środkowym 
Nowo wyklute pszcz zostały (Apis mellifera carnica) z pasieki eksperymentalnej Instytutu Rolnictwa Słowenii w Lublanie poddano indywidualnie działaniu 3% kwasu szczawiowego (OA)23. OA jest często stosowany w pszczelarstwie do zwalczania Varroa destructor. Po zabiegu pszczół robotnic (trzech z każdej grupy) unieruchomiono na lodzie. Wypreparowano jelito środkowe i utrwalono je w 10% formalinie. Następnie tkankę od...

Metody immunohistochemiczne są przydatne w badaniach nad pszczołami miodnymi do wykrywania i oceny poziomu apoptozy i nekrozy w jelicie środkowym i gruczołach podgardłowych dorosłych pszczół.

Podstawy histologii i wykrywanie śmierci komórki w tkance pszczoły miodnej

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather ...

Protokół ten jest przydatny w wielu badaniach biologicznych i toksykologicznych pszczół miodnych leczonych pestycydami. Pomaga wykryć odpowiedzi komórkowe tkanki pszczoły miodnej na akarycydy, które są stosowane w koloniach pszczół do leczenia przeciwko roztoczom Varroa. Jest to potężne narzędzie do wykrywania sub-małych skutków dla tkanek w połączeniu z zachowaniem pszczół lub innych pożytecznych owadów.Na początek ostrożnie weź pszczołę robotnicę z kleszczami i połóż ją na lodzie lub zamrażarce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na dwie minuty, aby ją unieruchomić. Przypnij pszczołę do szalki Petriego po przekątnej przez najwyższą tylną część klatki piersiowej dwa razy od lewej do prawej i od prawej do lewej. Słaba sól fizjologiczna z owadów do przykrycia ciała.Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym, ustaw ostrość i wyreguluj. Aby wypreparować jelito środkowe, zacznij od brzucha, wkładając jeden punkt nożyczek pod tergit A5 pośrodku prawej strony ciała pszczoły. Przyciąć do tergitu A2. Trzymaj wewnętrzne ostrze nożyczek równolegle do boku ciała, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych.Obróć nożyczki w lewo i tnij. Delikatnie otwórz lewą część brzucha i przypnij ją. Za pomocą kleszczy jedną ręką delikatnie pociągnij żołądek pszczoły miodnej do góry, a nożyczkami w drugiej ręce przetnij na samym końcu przełyku.Odciągnij żołądek i jelito środkowe od brzucha i przetnij odbytnicę. Użyj pipety z roztworem soli fizjologicznej dla owadów i usuń kał lub części tkanki. W celu wypreparowania gruczołów podgardłowych unieruchomij pszczołę robotnicę na lodzie, jak opisano wcześniej.Odetnij głowę i umieść ją na mniejszej płycie z anteną skierowaną do góry. Zabezpiecz głowę dwoma kołkami, jednym przez lewe oko złożone, a drugim przez prawe oko złożone. Wykonaj nacięcie w poprzek pierwszego ucha złożonego po wewnętrznej stronie szpilek, kontynuuj do obrąbka, a następnie wykonaj kolejne cięcie po drugiej stronie w poprzek drugiego oka złożonego.Odetnij anteny. Zdejmij maskę i odetnij w miejscu, w którym jest nadal przymocowana. Weź kleszcze i ostrożnie usuń gruczoły wraz z mózgiem i częścią oczu złożonych.W przypadku barwienia hematoksyliną i eozyną umieść odparafinowane, ponownie uwodnione skrawki w hematoksylinie na pięć minut. Następnie ostrożnie umieść je pod bieżącą wodą z kranu na dwie minuty. Następnie włóż je do wody destylowanej na jedną minutę i eozyny na cztery minuty.Umieść szkiełka z 96% etanolem na jedną minutę, następnie 2-propanol na dwie minuty, a na koniec w środku czyszczącym na dwie minuty. Dodaj podłoże montażowe i szklankę nakrywkową i pozostaw do wyschnięcia. Obserwuj pod mikroskopem świetlnym.Przygotuj słoiki z koplinu. Przygotuj proteinazę-K. Po odparafinowaniu i ponownym nawodnieniu skrawków umieść szkiełka w PBS na pięć minut.Umieść szkiełka płasko w pojemniku i dodaj proteinazę-K. Umyj szkiełka w wodzie destylowanej. Schłodzić w endogennej peroksydazie w temperaturze pokojowej.Opłukać szkiełka PBS lub wodą. Umieść szkiełka płasko w pojemniku i nałóż bufor równoważący na 10 sekund w temperaturze pokojowej. Po wytarciu tkanki dodaj końcowy enzym deoksynukleotydylotransferazy do każdej sekcji i inkubuj w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Przed inkubacją włóż zwilżone ręczniki papierowe do tacki wokół szkiełek i przykryj je folią. Po inkubacji umieść próbki na stojaku i pozostaw je w buforze do mycia zatrzymującego. Po umyciu szkiełek w PBS i wytarciu wokół tkanek, dodać dwie krople ciepłej koniugatu peroksydazy anty-digoksygeninowej do skrawków i inkubować przez 30 minut w wilgotnym pojemniku.Po umyciu w PBS przygotuj podłoże do peroksydazy o wytrzymałości roboczej, przykryj skrawki substratem peroksydazy i bejcuj przez pięć minut. Umieść szkiełko pod mikroskopem i określ optymalny czas barwienia. Po umyciu szkiełek w stojaku do barwienia i wodzie destylowanej, inkubuj szkiełka w wodzie destylowanej przez pięć minut.Przeciwdziałaj barwieniu za pomocą hematoksyliny przez dwie minuty. Umyj szkiełka, umieszczając je pod bieżącą wodą z kranu na trzy minuty, a następnie w wodzie destylowanej. Zamontuj szkiełka pod szkiełkami nakrywającymi i medium montażowym i pozostaw płasko do wyschnięcia.Obserwuj pod mikroskopem świetlnym. Odsetek dotkniętych komórek obliczono za pomocą mikroskopu świetlnego. Wyniki wskazały, że leczenie kwasem szczawiowym znacząco wpłynęło na komórki w jelicie środkowym.Barwienie immunologiczne wykazało dodatnie czerwone lub brązowe produkty reakcji w jądrach apoptozy gruczołów podgardłowych. Pozytywny produkt reakcji po leczeniu imidakloprydem lub kumarosem stwierdzono w większości komórek gruczołowych. Podczas podnoszenia maski głowy pszczoły należy uważać, aby nie uszkodzić ani nie oderwać części gruczołów podgardłowych.Technika ta wykrywa subkliniczne zmiany u pszczół i nadaje się również do wykrywania innych skutków środowiskowych dla pszczół i niektórych innych organizmów żywych.

histology-basics-and-cell-death-detection-in-honeybee-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pszczoły można poddać warunkowaniu w paradygmacie apetytywnego uczenia się węchowego (warunkowanie PER). Wykorzystując zapachy jako bodźce, opracowaliśmy metodę, w której rejestrowane jest zachowanie, przy jednoczesnym zastosowaniu obrazowania wapniowego w celu pomiaru aktywności wywołanej zapachem w neuronach ciała grzybowatego in vivo.

In vivo obrazowanie Ca2+ neuronów ciał grzybowych podczas uczenia się zapachów u pszczoły miodnej

Przedstawiamy prosty protokół wizualizacji obszarów programowanej śmierci komórek (PCD) w embrionach myszy oraz w hodowlach różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych (ES) przy użyciu wysoce rozpuszczalnego barwnika o nazwie LysoTracker.

Zastosowanie LysoTracker do wykrywania programowanej śmierci komórki w embrionach i różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych

U robotnic pszczół miodnych starzenie się zależy od zachowań społecznych, a nie od wieku chronologicznego. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób można uzyskać i przeanalizować typy pracowników o bardzo różnych wzorcach starzenia się pod kątem starzenia się komórek.

Uzyskiwanie próbek ze spowolnionym, przyspieszonym i odwróconym starzeniem w modelu pszczoły miodnej

Mikrocząsteczki (MPs) z błoną komórkową są aktywnymi pęcherzykami biologicznymi, które można izolować, a ich patofizjologiczne efekty badać w różnych modelach. W tym miejscu opisano metodę generowania MP pochodzących z limfocytów T (LMP) i wykazywania ich proapoptotycznego działania na komórki nabłonka dróg oddechowych.

Wytwarzanie mikrocząstek limfocytarnych i wykrywanie ich proapoptotycznego wpływu na komórki nabłonka dróg oddechowych

Tkanka tłuszczowa (AT) może wpływać na homeostazę całego organizmu, dlatego zrozumienie molekularnych mechanizmów różnicowania i funkcji adipocytów jest ważne. Udostępniamy protokół uzyskiwania nowych informacji na temat tych procesów poprzez analizę homeostazy, różnicowania i ekspozycji na niedotlenienie adipocytów jako modelu indukowanej apoptozy adipocytów.

Mechanizm regulacji liczby adipocytów w organizmach dorosłych poprzez różnicowanie i homeostazę apoptozy

Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

Brzuszne naczynie grzbietowe pszczoły miodnej i innych owadów służy jako funkcjonalny odpowiednik serca ssaków i odgrywa ważną rolę w transporcie składników odżywczych, usuwaniu odpadów, funkcjonowaniu układu odpornościowego i innych. Tutaj opisujemy protokół wizualizacji i farmakologicznej manipulacji tętnem pszczół.

Sekcja i obserwacja naczynia grzbietowego pszczoły miodnej w celu zbadania funkcji serca

Aby przetestować hamujące działanie środków farmakologicznych na fosfolipazę C (PLC) w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej, przedstawiamy test biochemiczny do pomiaru aktywności PLC w tych regionach. Test ten może być przydatny do porównywania aktywności PLC między tkankami, a także wśród pszczół wykazujących różne zachowania.

Wykrywanie aktywności fosfolipazy C w homogenacie mózgu pszczoły miodnej

Wielkość acinus gruczołów gardłowych jest miarą odżywiania pszczół miodnych pielęgniarek. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół preparowania, barwienia, obrazowania i pomiaru gruczołów dolnych pszczół pielęgniarek.

Pomiar wielkości gruczołu podgardłowego acinus u pracowników pszczół miodnych (Apis mellifera)

Prezentowany tutaj jest protokół użycia systemu CRISPR-Cas9 do zmniejszenia produkcji białka w mózgu dorosłej pszczoły miodnej w celu zbadania swoistości przeciwciał.

Testowanie przeciwciał przeciwko receptorom anty-RDL i anty-mGlutR1 w skrawkach mózgu pszczoły miodnej przy użyciu CRISPR-Cas9

Poznaj metody immunohistochemiczne do wykrywania apoptozy i nekrozy w tkankach pszczoły miodnej, w tym jelicie środkowym i gruczołach podgardzielowych. Technika ta pozwala ocenić wpływ pestycydów na zdrowie pszczół.

Podstawy histologii i wykrywanie śmierci komórki w tkance pszczoły miodnej

Przeglądaj więcej filmów