Podstawy histologii i wykrywanie śmierci komórki w tkance pszczoły miodnej

Metody immunohistochemiczne są przydatne w badaniach nad pszczołami miodnymi do wykrywania i oceny poziomu apoptozy i nekrozy w jelicie środkowym i gruczołach podgardłowych dorosłych pszczół.

Protokół ten jest przydatny w wielu badaniach biologicznych i toksykologicznych pszczół miodnych leczonych pestycydami. Pomaga wykryć odpowiedzi komórkowe tkanki pszczoły miodnej na akarycydy, które są stosowane w koloniach pszczół do leczenia przeciwko roztoczom Varroa. Jest to potężne narzędzie do wykrywania sub-małych skutków dla tkanek w połączeniu z zachowaniem pszczół lub innych pożytecznych owadów.

Na początek ostrożnie weź pszczołę robotnicę z kleszczami i połóż ją na lodzie lub zamrażarce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na dwie minuty, aby ją unieruchomić. Przypnij pszczołę do szalki Petriego po przekątnej przez najwyższą tylną część klatki piersiowej dwa razy od lewej do prawej i od prawej do lewej. Słaba sól fizjologiczna z owadów do przykrycia ciała.

Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym, ustaw ostrość i wyreguluj. Aby wypreparować jelito środkowe, zacznij od brzucha, wkładając jeden punkt nożyczek pod tergit A5 pośrodku prawej strony ciała pszczoły. Przyciąć do tergitu A2. Trzymaj wewnętrzne ostrze nożyczek równolegle do boku ciała, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych.

Obróć nożyczki w lewo i tnij. Delikatnie otwórz lewą część brzucha i przypnij ją. Za pomocą kleszczy jedną ręką delikatnie pociągnij żołądek pszczoły miodnej do góry, a nożyczkami w drugiej ręce przetnij na samym końcu przełyku.

Odciągnij żołądek i jelito środkowe od brzucha i przetnij odbytnicę. Użyj pipety z roztworem soli fizjologicznej dla owadów i usuń kał lub części tkanki. W celu wypreparowania gruczołów podgardłowych unieruchomij pszczołę robotnicę na lodzie, jak opisano wcześniej.

Odetnij głowę i umieść ją na mniejszej płycie z anteną skierowaną do góry. Zabezpiecz głowę dwoma kołkami, jednym przez lewe oko złożone, a drugim przez prawe oko złożone. Wykonaj nacięcie w poprzek pierwszego ucha złożonego po wewnętrznej stronie szpilek, kontynuuj do obrąbka, a następnie wykonaj kolejne cięcie po drugiej stronie w poprzek drugiego oka złożonego.

Odetnij anteny. Zdejmij maskę i odetnij w miejscu, w którym jest nadal przymocowana. Weź kleszcze i ostrożnie usuń gruczoły wraz z mózgiem i częścią oczu złożonych.

W przypadku barwienia hematoksyliną i eozyną umieść odparafinowane, ponownie uwodnione skrawki w hematoksylinie na pięć minut. Następnie ostrożnie umieść je pod bieżącą wodą z kranu na dwie minuty. Następnie włóż je do wody destylowanej na jedną minutę i eozyny na cztery minuty.

Umieść szkiełka z 96% etanolem na jedną minutę, następnie 2-propanol na dwie minuty, a na koniec w środku czyszczącym na dwie minuty. Dodaj podłoże montażowe i szklankę nakrywkową i pozostaw do wyschnięcia. Obserwuj pod mikroskopem świetlnym.

Przygotuj słoiki z koplinu. Przygotuj proteinazę-K. Po odparafinowaniu i ponownym nawodnieniu skrawków umieść szkiełka w PBS na pięć minut.

Umieść szkiełka płasko w pojemniku i dodaj proteinazę-K. Umyj szkiełka w wodzie destylowanej. Schłodzić w endogennej peroksydazie w temperaturze pokojowej.

Opłukać szkiełka PBS lub wodą. Umieść szkiełka płasko w pojemniku i nałóż bufor równoważący na 10 sekund w temperaturze pokojowej. Po wytarciu tkanki dodaj końcowy enzym deoksynukleotydylotransferazy do każdej sekcji i inkubuj w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przed inkubacją włóż zwilżone ręczniki papierowe do tacki wokół szkiełek i przykryj je folią. Po inkubacji umieść próbki na stojaku i pozostaw je w buforze do mycia zatrzymującego. Po umyciu szkiełek w PBS i wytarciu wokół tkanek, dodać dwie krople ciepłej koniugatu peroksydazy anty-digoksygeninowej do skrawków i inkubować przez 30 minut w wilgotnym pojemniku.

Po umyciu w PBS przygotuj podłoże do peroksydazy o wytrzymałości roboczej, przykryj skrawki substratem peroksydazy i bejcuj przez pięć minut. Umieść szkiełko pod mikroskopem i określ optymalny czas barwienia. Po umyciu szkiełek w stojaku do barwienia i wodzie destylowanej, inkubuj szkiełka w wodzie destylowanej przez pięć minut.

Przeciwdziałaj barwieniu za pomocą hematoksyliny przez dwie minuty. Umyj szkiełka, umieszczając je pod bieżącą wodą z kranu na trzy minuty, a następnie w wodzie destylowanej. Zamontuj szkiełka pod szkiełkami nakrywającymi i medium montażowym i pozostaw płasko do wyschnięcia.

Obserwuj pod mikroskopem świetlnym. Odsetek dotkniętych komórek obliczono za pomocą mikroskopu świetlnego. Wyniki wskazały, że leczenie kwasem szczawiowym znacząco wpłynęło na komórki w jelicie środkowym.

Barwienie immunologiczne wykazało dodatnie czerwone lub brązowe produkty reakcji w jądrach apoptozy gruczołów podgardłowych. Pozytywny produkt reakcji po leczeniu imidakloprydem lub kumarosem stwierdzono w większości komórek gruczołowych. Podczas podnoszenia maski głowy pszczoły należy uważać, aby nie uszkodzić ani nie oderwać części gruczołów podgardłowych.

Technika ta wykrywa subkliniczne zmiany u pszczół i nadaje się również do wykrywania innych skutków środowiskowych dla pszczół i niektórych innych organizmów żywych.