Name: Technika iniekcji zarodka do edycji genów u kleszcza czarnonogiego, Ixodes scapularis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj technikę iniekcji zarodka kleszcza Ixodes scapularis do edycji genów. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów i interakcji z patogenami, wspierając rozwój szczepionek przeciwko chorobom odkleszczowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Channie Aluvihare i Yonusowi Gebermicale, ITF, UMD, za wgląd i wsparcie podczas początkowej fazy rozwoju protokołu. Igły wolframowe były hojnym prezentem od Davida O'Brochta, ITF, UMD. Jesteśmy wdzięczni dr Ladislavowi Simo za przetestowanie tego protokołu w I. ricinus i za wnikliwe dyskusje. Projekt ten został sfinansowany przez NIH-NIAID R21AI128393 i Plymouth Hill Foundation, NY dla MG-N, fundusze startowe z University of Nevada dla AN, grant National Science Foundation nr 2019609 dla MG-N i AN oraz grant peer-to-peer od IGTRCN dla AS.

Dorosłe osobniki Ixodes scapularis zostały zakupione na Uniwersytecie Stanowym Oklahomy (OSU) lub wyhodowane na Uniwersytecie Nevady w Reno (UNR) (protokół IACUC #21-001-1118).
1. Przygotowanie samic kleszczy do pobrania zarodków
UWAGA: Aby zebrać jaja w odpowiednim wieku, ważne jest zsynchronizowanie składania jaj. Chociaż sygnały dotyczące składania jaj u kleszczy pozostają niejasne, w standardowych warunkach insektowych (temperatura 27 °C i wilgotność względna >90%) samice I. scapularis zaczynają składać jaja około 8 dni po oderwaniu żywiciela. Ten okres można wydłużyć, przechowując pełne samice w temperaturze 4 °C. Samice karmione krwią przechowywaliśmy w temperaturze 4 °C do 8 tygodni bez żadnego negatywnego wpływu na składanie jaj. Warunki te mogą wymagać modyfikacji dla każdego owada.
<ol>
	<li>Przechowuj wszystkie nasycone samice w temperaturze 4 °C z wilgotnością względną >90% w plastikowym pudełku o pojemności 6 litrów wyłożonym wilgotną bibułą filtracyjną do czasu użycia do mikrowstrzyknięć.</li>
	<li>Na tydzień przed wstrzyknięciem przenieść samice z 4 °C do inkubatora o temperaturze 27 °C w celu rozpoczęcia składania jaj.</li>
	<li>Kiedy samice zaczną składać jaja (3-4 dni po przeniesieniu ich do temperatury 27 °C), usuń jaja za pomocą pędzla z cienką końcówką i przygotuj samice do ablacji narządów (gruczołów woskowych) Gené. 
	UWAGA: Narząd Gené rozciąga się od obszaru między scutum a capitulum (grzbietowa podstawa aparatu gębowego), aparat gębowy wygina się nad brzuszną powierzchnią ciała (równolegle do powierzchni), a rozszerzony organ genu pokrywa jaja, gdy tylko jaja zostaną złożone (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Jaja złożone przed usunięciem narządu Gené lub opróżnieniem go z woskowiny będą pokryte woskowiną i nie nadają się do wstrzykiwań i muszą zostać wyrzucone.</li>
	<li>Aby usunąć lub opróżnić narząd Gené, użyj gliny, aby umieścić nabrzmiałą samicę na szklanym szkiełku pod mikroskopem zorientowanym tak, aby aparat gębowy był widoczny zarówno po stronie brzusznej, jak i grzbietowej (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B,C).
	<ol>
		<li>Ostrożnie nakłuj obszar dokładnie między tarczką a aparatem gębowym za pomocą cienkich kleszczy i igieł wolframowych wykonanych w laboratorium przy użyciu drutu wolframowego zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem16 (igły można również kupić komercyjnie i podłączyć do mikrosondy preparucyjnej, patrz Tabela Materiałów).</li>
		<li>Przechodząc do środka za pomocą wolframowej igły, wyciągnij gruczoł woskowy (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D, E). Usunięcie gruczołu może potrwać kilka minut. Zetrzyj płynną wydzielinę wosku za pomocą chusteczek laboratoryjnych. 
		UWAGA: Gruczoł można również usunąć od strony brzusznej tuż pod aparatem gębowym; sięgając z tyłu w kierunku scutum z igłą i kleszczami. Nałożenie kleju silikonowego wokół aparatów gębowych również blokuje wywijanie narządów Gene'a i może być stosowane zamiast usuwania lub opróżniania woskowiny (osobista komunikacja z dr Ladislavem Simo, INRAE, Francja). Nabrzmiałe kleszcze nie pozostaną na taśmie dwustronnej. Używanie gliny do "owijania" kleszcza pomaga utrzymać go na miejscu podczas manipulacji. Użyj kleszczy, aby przytrzymać kleszcza i igłę wolframową do wypreparowania. Część brzuszna jest łatwiejsza do przekłucia igłą i preferowana przez autorów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby opróżnić gruczoł, ułóż kleszcza grawicy, jak wspomniano w kroku 1.4. Ostrożnie nakłuj obszar za aparatem gębowym po stronie grzbietowej i uciskaj stronę brzuszną za pomocą kleszczy. 
	UWAGA: Alternatywnie nie jest konieczne usuwanie gruczołu woskowego; Opróżnienie gruczołu z wosku potrwa kilka dni. Samice składające jaja mają biały obszar wokół części gębowej, który wskazuje lokalizację gruczołu woskowego i może być używany jako odniesienie.
	<ol>
		<li>Umieść krawędź niestrzępiącej się chusteczki laboratoryjnej i usuń płynny wosk wychodzący z miejsca nakłucia. Upewnij się, że unikasz wydzielania hemolimfy, która jest przezroczystym płynem w porównaniu z lekko żółtawym lepkim woskiem. Może minąć 5-10 minut, zanim większość wosku zostanie usunięta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po manipulacji umieścić samice w inkubatorze w temperaturze 27 °C (>90% wilgotności względnej) i pozwolić im dojść do siebie przez 1-2 dni. 
	UWAGA: Leczone samice zwykle potrzebują 1-2 dni, aby dojść do siebie i ponownie rozpocząć składanie jaj.</li>
	<li>Kiedy samice ponownie zaczną składać jaja, za pomocą cienkiego pędzla zbierz świeżo złożone jaja (0-18 godzin po złożeniu jaj) i umieść je w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: W przypadku używania jaj od tej samej samicy przez dłuższy czas, procedurę tę należy powtórzyć po 4-5 dniach składania jaj, jeśli gruczoły nie zostały usunięte.</li>
</ol>
2. Leczenie zarodków za pomocą mikroiniekcji
<ol>
	<li>Dodać ~200 μl (lub objętość wystarczającą do przykrycia jaj, w zależności od liczby jaj) 5% (wagowo/objętościowo) chlorku benzalkoniowego/wody (patrz Tabela materiałów) do probówki zawierającej jaja w wieku 0-18 godzin. Delikatnie obracaj jajkami pędzlem przez 5 minut, aby uniknąć osadzania się jaj na dnie tubki (szczegółowe informacje można znaleźć w Sharma et al.4). Usunąć supernatant za pomocą mikropipety, pozostawiając jaja w probówce. 
	UWAGA: Chlorek benzalkoniowy działa żrąco na skórę i oczy, należy nosić rękawice i okulary ochronne</li>.
	<li>Do probówki z jajami dodać ~200 μl wody destylowanej (DI), zamieszać pędzlem i usunąć wodę z probówki do mikrowirówki za pomocą mikropipety. Powtórz mycie wodą DI jeszcze raz.</li>
	<li>Po umyciu wodą DI dodać ~200 μL 5% (w/v) chlorku sodu (NaCl) i delikatnie mieszać pędzlem przez 5 min. Po 5 minutach wyjąć roztwór z probówki i dwukrotnie umyć jajka wodą DI.</li>
	<li>Dodać ~100 μl 1% (w/v) roztworu NaCl do probówki mikrowirówki zawierającej jaja. Jaja należy przechowywać w 1% (w/v) roztworze NaCl do czasu użycia ich do wstrzykiwań.</li>
	<li>Mikroiniekcje należy rozpocząć po około godzinie. Ta oś czasu pomaga w prawidłowym wysuszaniu jaj i zapobiega ich pękaniu. 
	UWAGA: Jaja można przechowywać w 1% (w/v) roztworze NaCl przez 7-8 godzin bez znaczącego wpływu na przeżywalność. Jeśli jaja są trudne do wstrzyknięcia lub pęknięcia, oznacza to, że jaja nie są wystarczająco wysuszone i mogą być dalej traktowane 5% (w/v) NaCl przez dodatkowe 5 minut.</li>
</ol>
3. Przygotowanie igieł iniekcyjnych
<ol>
	<li>Włóż glinokrzemianowe szkło kapilarne (z żarnikiem, patrz Tabela materiałów) do ściągacza igieł zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Dostosuj ściągacz igieł do następujących ustawień: Ciepło: 575, Ciągnięcie: 20, Prędkość: 50, Czas: 200 i Ciśnienie: 700.</li>
	<li>Aktywuj funkcję ciągnięcia ściągacza igieł i powtórz proces dla dodatkowych igieł.</li>
	<li>Wyciągnięte igły przechowuj, wbijając je w linie gliny modelarskiej na czystej szalce Petriego.</li>
	<li>Naładować igłę mieszanką iniekcyjną za pomocą końcówki do mikropodajnika (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Porównanie igieł używanych do wstrzykiwania zarodków kleszczy i komarów jest pokazane na Rysunek 2.</li>
</ol>
4. Ustawienie szkiełek do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Za pomocą taśmy dwustronnej przyklej do siebie dwa szklane szkiełka mikroskopowe, pozostawiając odstęp około 0,5 cm, aby wspomóc wyrównanie jaj i zapobiec ich przewróceniu się podczas wstrzyknięć (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3A).</li>
	<li>Nałóż kawałek przezroczystego opatrunku foliowego (patrz Tabela materiałów) na taśmę dwustronną w szczelinie między szkiełkami. Upewnij się, że opatrunek foliowy jest idealnie wyrównany ze szczeliną.</li>
</ol>
5. Mikroiniekcje zarodków
<ol>
	<li>Wyrównaj 8-10 jajek na raz na szkiełku (powyżej) za pomocą jednowłosego pędzla. 
	UWAGA: Jaja ustawione w linii prostopadłej do dłuższej osi (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B) do krawędzi szkiełka są łatwiejsze do wstrzyknięcia niż jaja, których oś podłużna jest wyrównana równolegle do krawędzi (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Jaja w orientacji prostopadłej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B) mogą lepiej wytrzymać wstrzyknięcie, co skutkuje wyższą przeżywalnością.</li>
	<li>Umieść szkiełko z wyrównanymi jajami na stoliku mikroskopu złożonego. Użyj kawałka niestrzępiącej się chusteczki, aby usunąć 1% roztwór NaCl, w którym są przechowywane.</li>
	<li>Podłączyć napełnioną igłę do wstrzykiwania do mikrowstrzykiwacza podłączonego do mikromanipulatora (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Otwórz igłę, delikatnie pocierając ją o powierzchnię jaja, ustawiając wysokie ciśnienie na mikrowstrzykiwaczu (>5 000 hPa).</li>
	<li>Po otwarciu igły należy zmniejszyć ciśnienie (1 000-2 500 hPa) mikroiniektora w zależności od otwarcia igły. 
	UWAGA: Mały otwór będzie wymagał stosunkowo wyższego ciśnienia, podczas gdy większy otwór będzie wymagał niższego ciśnienia. Ma to na celu kontrolowanie objętości wstrzykiwanego konstruktu. W zależności od wielkości otworu igły, objętość wstrzyknięcia będzie się wahać od 1 do 5 l.</li>
	<li>Wstrzyknąć wszystkie jaja na szkiełku pod kątem 10°-15° tak szybko, jak to możliwe i natychmiast przesunąć szkiełko do warunków wysokiej wilgotności na szalce Petriego wyłożonej wilgotnym papierem. Zaraz po wstrzyknięciu jaja zaczynają wysychać. 
	UWAGA: Wstrzyknięcie niewielkiej liczby jaj na raz zwiększa powodzenie wstrzyknięcia i prawdopodobieństwo przeżycia. Igły zapychają się przez refluks zarodkowy. Jeśli końcówka jest nadal ostra, aby usunąć zatkane igły, przesuń igłę do małej kropelki 1% NaCl dodanej do krawędzi szkiełka. Działanie kapilarne usunie mały zator. Jeśli igła jest już, zmień ją.</li>
</ol>
6. Opieka nad zarodkami po iniekcji
<ol>
	<li>Umieścić szkiełko z wstrzykniętymi zarodkami na dużej szalce Petriego wyłożonej wilgotną bibułą filtracyjną. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie przeszkadzać jajom przez co najmniej 5-6 godzin. Pozwala to na prawidłowe uszczelnienie rany po wstrzyknięciu. Rana po wstrzyknięciu może się otworzyć po wzburzeniu, a cytoplazma może zacząć wyciekać, powodując śmiertelność jaj.</li>
	<li>Po 5-6 godzinach dodaj niewielką kroplę wody DI do przezroczystego opatrunku filmowego z dołączonymi wstrzykniętymi zarodkami. Za pomocą pędzla delikatnie przesuń jajka. Przenieś jaja na małą szalkę Petriego (10 cm) i zanurz je w wodzie DI. 
	UWAGA: Opatrunek foliowy umożliwia łatwe usunięcie komórek jajowych po wstrzyknięciu. W momencie, gdy kropla wody zostanie dodana do opatrunku foliowego, jajka zaczną poruszać się wraz z wodą.</li>
	<li>Jaja należy przechowywać zanurzone w wodzie i umieścić szalkę Petriego w plastikowym pudełku o pojemności 6 litrów w inkubatorze w temperaturze 27 °C i wilgotności względnej >90%.</li>
	<li>Jaja należy sprawdzać regularnie, codziennie przez pierwsze kilka dni, a następnie co 3-4 dni, aż larwy zaczną się wykluwać. 
	UWAGA: Jeśli duża liczba jaj zostanie uszkodzona podczas mikroiniekcji, delikatne spuszczenie wody z defibrylowanego jaja po tygodniu zapobiegnie rozwojowi grzybów na martwych jajach.</li>
	<li>Kiedy larwy zaczynają wylęgać się z wstrzykniętych zarodków (21-25 dni po wstrzyknięciu w obecnej konfiguracji laboratoryjnej), należy je codziennie sprawdzać i przenosić wyklute larwy do szklanych fiolek z sitkiem na górze. Larwy mogą wykluwać się pod wodą i przetrwać przez ~ 1-2 tygodnie.</li>
	<li>Przesiewaj larwy4, jeśli jajom wstrzyknięto konstrukt, który może skutkować widocznym fenotypem.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
	<li>Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).</li>
	<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
	<li>Criscione, F., O&#39;Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).</li>
	<li>Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).</li>
	<li>Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).</li>
	<li>Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).</li>
	<li>Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).</li>
	<li>Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene&#39;s organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).</li>
	<li>Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).</li>
	<li>Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gen&#233;&#39;s) organ in ixodid ticks. Tissue &#38; Cell. 21 (1), 113-122 (1989).</li>
	<li>Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental &#38; Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).</li>
	<li>Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jest to pierwszy protokół opracowany w celu skutecznego wstrzykiwania wczesnych zarodków kleszczy. Osiągnięto wskaźnik przeżycia na poziomie ~4%-8%, który jest porównywalny z wstrzyknięciem zarodka w innych dobrze ugruntowanych modelach owadów5.
Ponieważ jest to protokół początkowy, przewiduje się, że protokół ten będzie dalej udoskonalany i wyspecjalizowany w odniesieniu do poszczególnych gatunków kleszczy. W szczególności czas wstrzyknięcia będzie się różnił w zależno...

Kleszcze są wektorami o znaczeniu medycznym i weterynaryjnym, zdolnymi do przenoszenia różnych patogenów wirusowych, bakteryjnych, pierwotniaków i nicieni1,2. We wschodnich Stanach Zjednoczonych kleszcz czarnonogi, Ixodes scapularis, jest ważnym wektorem patogenu boreliozy (LD), krętka Borrelia burgdorferi. Każdego roku w Stanach Zjednoczonych odnotowuje się ponad 400 000 przypadków LD, co czyni ją najczęstszą chorobą zakaźną przenoszoną przez wektory w USA1. Oprócz B. burgdorferi, sześć innych mikroorganizmów jest przenoszonych przez I. scapularis, w tym cztery bakterie (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi i Ehrlichia muris eauclarensis), jeden pasożyt pierwotniak (Babesia microti) i jeden wirus (wirus Powassan), co czyni ten gatunek kleszcza poważnym problemem zdrowia publicznego3. Podczas gdy choroby przenoszone przez kleszcze stały się bardziej powszechne w ostatnich latach, badania nad kleszczami pozostały w tyle za innymi wektorami stawonogów, takimi jak komary, ze względu na unikalną biologię kleszczy i wyzwania związane ze stosowaniem genetycznych i funkcjonalnych narzędzi genomicznych4,5.
Techniki edycji genów, szczególnie CRISPR/Cas9, umożliwiły prowadzenie badań genomiki funkcjonalnej w organizmach niemodelowych. W celu tworzenia dziedzicznych mutacji w organizmie, iniekcja zarodka pozostaje preferowaną metodą dostarczania konstruktów do zmiany linii zarodkowej6,7,8,9. Jednak do niedawna4, jaja kleszczy były uważane za zbyt trudne lub wręcz niemożliwe do wstrzyknięcia bez zabicia zarodka10,11. Gruba warstwa wosku na jajach, twarda kosmówka i wysoki nacisk wewnątrz owalu były jednymi z głównych przeszkód, które uniemożliwiały wstrzyknięcie zarodka kleszczom. Dorosły, karmiony krwią I. scapularis składa pojedynczy lęg do 2 000 jaj12 w ciągu 3-4 tygodni (około 100 jaj / dzień). Jaja są składane pojedynczo, a każde jajo jest pokryte woskiem, który jest wydzielany przez wypukłości lub "rogi" narządu gruczołowego Gené13,14,15 matki. Wosk ten chroni jaja przed wysuszeniem i zawiera związki przeciwdrobnoustrojowe15. Aby skutecznie wstrzyknąć jaja kleszczy, ważne jest, aby usunąć warstwę wosku, zmiękczyć kosmówkę i wysuszyć jaja, aby zmniejszyć ciśnienie wewnątrzowalne, aby wstrzyknięcie nie uszkodziło nieodwracalnie jaja. Rozumiejąc krytyczne znaczenie iniekcji zarodków dla udanej transformacji linii zarodkowej, opracowano protokół dla I. scapularis, który można wykorzystać do dostarczenia konstruktu CRISPR/Cas9 i wygenerowania stabilnych mutacji linii zarodkowej4. Oprócz wkładu w badania nad I. scapularis, protokół ten może być również zoptymalizowany pod kątem innych gatunków kleszczy.

<table><tbody><tr><td>Kapilary z krzemianu glinu, z włóknem</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>AF100-64-10</td><td>Iniekcja zarodka</td></tr><tr><td>Chlorek benzalkoniowy 50% w wodzie, 25 g</td><td>TCI-America</td><td>B0414</td><td>Leczenie zarodków, 25 g to około 25 ml</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Pielęgnacja po wstrzyknięciu</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Thomas Scientific</td><td>300-101</td><td>Narząd genu manipulacja</td></tr><tr><td>Chusteczki laboratoryjne</td><td>Genesee Scientific</td><td>88-115</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Ładowanie ciągniętych igieł</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>ROE-200</td><td>Iniekcja zarodka</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe - gładkie, szlifowane krawędzie</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-100</td><td>Wyrównanie zarodka, preferowane są krawędzie szlifowane, można mieć fazowane krawędzie zasłaniać jaja przed wzrokiem</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td>Leczenie zarodków</td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Trwała taśma dwustronna</td><td>Scotch</td><td>34-8716-3417-5</td><td>Wyrównanie zarodków</td></tr><tr><td>Płytki Petriego</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td>Pielęgnacja po wstrzyknięciu</td></tr><tr><td>Tegaderm/ Przezroczysty Opatrunek filmowy</td><td>3M Opieka zdrowotna</td><td>1628</td><td>Wyrównanie zarodków Igły</td></tr><tr><td>wolframowe</td><td>Narzędzia Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>Manipulacja narządami genu</td></tr><tr><td>Drut wolframowy</td><td>Amazon</td><td>B08DNT7ZK3</td><td>Manipulacja narządami genu</td></tr><tr><td>Cyfrowy mikrowtryskiwacz XenoWorks</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>MPC-200</td><td>Wstrzyknięcie zarodka</td></tr></tbody></table>

technika iniekcji zarodka do edycji genów u kleszcza czarnonogiego, ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Kleszcze mogą przenosić różne patogeny wirusowe, bakteryjne i pierwotniakowe i dlatego są uważane za wektory o znaczeniu medycznym i weterynaryjnym. Pomimo rosnącego obciążenia chorobami przenoszonymi przez kleszcze, badania nad kleszczami pozostają w tyle za wektorami chorób owadów ze względu na wyzwania związane z zastosowaniem narzędzi transformacji genetycznej do badań funkcjonalnych nad unikalną biologią kleszczy. Interwencje genetyczne zyskują na popularności w celu ograniczenia chorób przenoszonych przez komary. Jednak rozwój takich interwencji wymaga stabilnej transformacji linii zarodkowej poprzez wstrzykiwanie zarodków. Takiej techniki iniekcji zarodka brakuje w przypadku cheliceratów, w tym kleszczy. Kilka czynników, takich jak zewnętrzna gruba warstwa wosku na zarodkach kleszczy, twarda kosmówka i wysokie ciśnienie wewnątrz owalu, to niektóre z przeszkód, które wcześniej uniemożliwiały opracowanie protokołu wstrzykiwania zarodka u kleszczy. Obecne prace pokonały te przeszkody, a technika wstrzykiwania zarodka dla kleszcza czarnonogiego, Ixodes scapularis, została opisana tutaj. Technika ta może być wykorzystana do dostarczania składników, takich jak CRISPR/Cas9, w celu stabilnych transformacji linii zarodkowej.

W niniejszym artykule opisano skuteczny protokół iniekcji embrionów I. scapularis. Samice składające jaja utrzymywano w warunkach wysokiej wilgotności, aby uniknąć wysychania częściowo powleczonych woskiem jaj. Warstwę wosku usunięto w celu umożliwienia iniekcji embrionów kleszczy poprzez ablację organu Gene'a (gruczołu woskowego) u ciężarnej samicy (Rysunek 1A-E). Użyto szklanych igieł glinoślazowych o krótszej szyjce (Rysunek ...

Obecny protokół opisuje metodę wstrzykiwania zarodków kleszczy. Wstrzyknięcie zarodka jest preferowaną techniką manipulacji genetycznej w celu wytworzenia linii transgenicznych.

Technika iniekcji zarodka do edycji genów u kleszcza czarnonogiego, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Jest to pierwszy protokół wstrzyknięcia zarodka dla gatunku Chelicerata. Możliwość wstrzykiwania zarodków kleszczy otworzy wiele kierunków badań, w szczególności badania nad funkcją genów kleszczy i interakcjami między patogenami kleszczy. Technika ta umożliwia przyszłe prace nad funkcjonalnymi badaniami genów kleszczy i stanowi podstawę do kontroli populacji kleszczy za pomocą systemów napędu genowego.Metoda ta ułatwi zrozumienie interakcji między kleszczami a patogenami, które są ich siedliskiem na poziomie molekularnym. Pozwoli nam to zidentyfikować białka, które mogą zostać wykorzystane do opracowania szczepionek przeciwko boreliozie i innym patogenom. Z kolei kilka obszarów badawczych, takich jak interakcje patogenów kleszczy i przenoszenie patogenów na żywicieli przez kleszcze podczas żerowania, skorzysta z tych prac.Bardziej podstawowe pytania, takie jak to, w jaki sposób kleszcze unikają odpowiedzi immunologicznej gospodarza i różnice w mechanizmach naprawy DNA, mogą być również zrozumiałe teraz. Istnieje kilka aspektów biologii kleszczy, które należy zrozumieć przed przeprowadzeniem tej procedury. Wysokie ciśnienie wewnętrzne zarodka prowadzi do pękania po dotknięciu igłą.Bardzo ważne jest przygotowanie zarodków do wstrzyknięcia. Na początek przenieś samice z inkubatora o temperaturze 4 stopni Celsjusza do inkubatora o temperaturze 27 stopni Celsjusza w celu rozpoczęcia składania jaj na tydzień przed wstrzyknięciami. Po trzech do czterech dniach, gdy samice zaczną składać jaja, usuń je za pomocą pędzla z cienką końcówką, przygotowując samice do ablacji narządów Gene'a.Aby opróżnić gruczoł, ułóż kleszcza grawitacyjnego na szklanym szkiełku pod mikroskopem w taki sposób, aby części gębowe były widoczne zarówno po stronie brzusznej, jak i grzbietowej. Następnie ostrożnie nakłuj obszar za częściami gębowymi po stronie grzbietowej i uciskaj stronę brzuszną za pomocą kleszczy. Umieść krawędź niestrzępiącej się chusteczki i usuń płynny wosk wychodzący z miejsca nakłucia.Alternatywnie, zamiast opróżniać gruczoł przez rozwarstwienie, wokół części pyska kleszcza można użyć klejów, takich jak klej tkankowy. Kiedy samice ponownie zaczną składać jaja, użyj drobnego pędzla, aby zebrać świeżo złożone jaja i umieść je w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Dodaj około 200 mikrolitrów 5% wody chlorku benzalkoniowego do probówki zawierającej jaja w wieku od zera do 18 godzin.Delikatnie obracaj jajka pędzlem przez pięć minut, aby uniknąć osadzania się jaj na dnie probówki, a następnie usuń supernatant za pomocą mikropipety, pozostawiając jaja w probówce. Dodaj około 200 mikrolitrów wody destylowanej do probówki zawierającej jajka. Zakręć pędzlem i usuń wodę z probówki mikrowirówki za pomocą mikropipety.Po umyciu wodą destylowaną dodaj około 200 mikrolitrów 5% chlorku sodu i delikatnie mieszaj pędzlem przez pięć minut. Następnie po pięciu minutach wyjmij roztwór z probówki i dwukrotnie umyj jajka wodą destylowaną. Następnie dodaj około 100 mikrolitrów 1% roztworu chlorku sodu do probówki mikrowirówki zawierającej jaja.Najpierw przyklej do siebie dwa szklane szkiełka mikroskopowe, pozostawiając odstęp około 0,5 centymetra, aby ułatwić wyrównanie jaj za pomocą taśmy dwustronnej, a następnie nałóż kawałek przezroczystego opatrunku foliowego na taśmę dwustronną w szczelinie między szkiełkami. Następnie wyrównaj od ośmiu do 10 jajek na raz na szkiełku za pomocą pędzla. Następnie umieść szkiełko z wyrównanymi jajami na stoliku mikroskopu wieloskładnikowego i usuń 1% roztwór chlorku sodu za pomocą kawałka niestrzępiącej się chusteczki, w której są przechowywane.Podłączyć napełnioną igłę do wstrzykiwacza do mikrowstrzykiwacza podłączonego do mikromanipulatora. Następnie otwórz igłę, delikatnie pocierając ją o powierzchnię jaja, używając ustawienia wysokiego ciśnienia na mikrowstrzykiwaczu. Po otwarciu igły należy zmniejszyć ciśnienie mikrowtryskiwacza w zależności od otwarcia igły.Następnie wstrzyknij wszystkie jaja na szkiełku pod kątem od 10 do 15 stopni tak szybko, jak to możliwe, szybko naciśnij pedał nożny i natychmiast przesuń szkiełko do warunków wysokiej wilgotności na szalce Petriego wilgotnym ręcznikiem papierowym. Po pięciu do sześciu godzinach od umieszczenia szkiełka zawierającego wstrzyknięte zarodki na dużej szalce Petriego wyłożonej wilgotną bibułą filtracyjną, dodaj niewielką kroplę wody destylowanej do przezroczystego opatrunku filmowego z dołączonymi wstrzykniętymi zarodkami. Następnie delikatnie przesuń jajka za pomocą pędzla.Następnie przenieś jajka na małą szalkę Petriego i zanurz je w wodzie destylowanej. Trzymaj jaja zanurzone w wodzie, umieść szalkę Petriego w plastikowym pudełku o pojemności sześciu litrów w inkubatorze w temperaturze 27 stopni Celsjusza i wilgotności względnej powyżej 90%. Kiedy larwa zaczyna wylęgać się z wstrzykniętych zarodków od 21 do 25 dni po wstrzyknięciu, należy je codziennie sprawdzać i przenieść wyklute larwy do szklanych fiolek z sitkiem na górze.Wyniki wykazały, że wstrzyknięcie jaj na wczesnym etapie embriogenezy w wieku od 12 do 18 godzin i ustawienie dłuższej osi jaja prostopadłej do krawędzi szkiełka skutkuje wyższym wskaźnikiem przeżywalności wstrzykniętych jaj. Spośród wszystkich wstrzykniętych jaj przeżyło do 8,5% i wykluły się larwy. Przed rozpoczęciem tej procedury ważne jest, aby pamiętać o krokach 2.4, usunięcie woskowiny z kleszcza matki, oraz krokach od 3.1 do 3.4, zmiękczenie kosmówki zarodka chlorkiem benzalkoniowym i wysuszenie zarodka roztworami chlorku sodu, aby umożliwić udane wstrzyknięcie zarodka.Ta metoda została opracowana przede wszystkim do edycji genów kleszczy, a to pozwoli nam na wykonanie nokautów i knock-inów, które pomogą nam zrozumieć funkcję genów kleszczy. Technika ta pozwoli na zastosowanie narzędzi do edycji genów dostępnych dla wielu innych organizmów w badaniach nad kleszczami. A to przyspieszy badania biologii molekularnej kleszcza.

embryo-injection-technique-for-gene-editing-black-legged-tick-ixodes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie Nijole Jasinskiene prezentuje metodologię wykorzystywaną do tworzenia transgenicznych komarów Aedes aegypti, które są wektorami gorączki Denga. Przedstawione zostają techniki prawidłowego przygotowania igieł do mikroiniekcji, wysuszania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.

Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

W tym filmie pokazujemy dostarczanie konstruktu napędu genowego do zarodka komara Anopheles gambiae za pomocą techniki mikroiniekcji zarodka. Procedura ta pozwala na integrację dostarczonego konstruktu DNA, poprzez rekombinację homologiczną, z komórkami linii rozrodczej w celu wytworzenia przekształconej populacji komarów.

Mikroiniekcja zarodka komara: technika dostarczania egzogennego DNA do żółtka zarodka Anopheles Gambiae w celu wytworzenia mutacji linii zarodkowej

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Produkcja zdrowych kleszczy hodowanych w laboratorium jest niezbędna do badań nad biologią kleszczy i interakcjami kleszcz-patogen. Tutaj pokazujemy prosty protokół karmienia niedojrzałych kleszczy, który jest opłacalny i mniej stresujący dla myszy.

Hodowla Ixodes scapularis, kleszcza czarnonogiego: karmienie niedojrzałych stadiów na myszach

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania jaj świerszczy, technikę, która służy jako podstawowa metoda w wielu eksperymentach na świerszczu, w tym, ale nie tylko, interferencji RNA i manipulacji genomem.

Wstrzykiwanie jaj Gryllus bimaculatus

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Poznaj technikę iniekcji zarodka kleszcza Ixodes scapularis do edycji genów. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów i interakcji z patogenami, wspierając rozwój szczepionek przeciwko chorobom odkleszczowym.

Technika iniekcji zarodka do edycji genów u kleszcza czarnonogiego, Ixodes scapularis

Przeglądaj więcej filmów