Technika iniekcji zarodka do edycji genów u kleszcza czarnonogiego, Ixodes scapularis

Jest to pierwszy protokół wstrzyknięcia zarodka dla gatunku Chelicerata. Możliwość wstrzykiwania zarodków kleszczy otworzy wiele kierunków badań, w szczególności badania nad funkcją genów kleszczy i interakcjami między patogenami kleszczy. Technika ta umożliwia przyszłe prace nad funkcjonalnymi badaniami genów kleszczy i stanowi podstawę do kontroli populacji kleszczy za pomocą systemów napędu genowego.

Metoda ta ułatwi zrozumienie interakcji między kleszczami a patogenami, które są ich siedliskiem na poziomie molekularnym. Pozwoli nam to zidentyfikować białka, które mogą zostać wykorzystane do opracowania szczepionek przeciwko boreliozie i innym patogenom. Z kolei kilka obszarów badawczych, takich jak interakcje patogenów kleszczy i przenoszenie patogenów na żywicieli przez kleszcze podczas żerowania, skorzysta z tych prac.

Bardziej podstawowe pytania, takie jak to, w jaki sposób kleszcze unikają odpowiedzi immunologicznej gospodarza i różnice w mechanizmach naprawy DNA, mogą być również zrozumiałe teraz. Istnieje kilka aspektów biologii kleszczy, które należy zrozumieć przed przeprowadzeniem tej procedury. Wysokie ciśnienie wewnętrzne zarodka prowadzi do pękania po dotknięciu igłą.

Bardzo ważne jest przygotowanie zarodków do wstrzyknięcia. Na początek przenieś samice z inkubatora o temperaturze 4 stopni Celsjusza do inkubatora o temperaturze 27 stopni Celsjusza w celu rozpoczęcia składania jaj na tydzień przed wstrzyknięciami. Po trzech do czterech dniach, gdy samice zaczną składać jaja, usuń je za pomocą pędzla z cienką końcówką, przygotowując samice do ablacji narządów Gene'a.

Aby opróżnić gruczoł, ułóż kleszcza grawitacyjnego na szklanym szkiełku pod mikroskopem w taki sposób, aby części gębowe były widoczne zarówno po stronie brzusznej, jak i grzbietowej. Następnie ostrożnie nakłuj obszar za częściami gębowymi po stronie grzbietowej i uciskaj stronę brzuszną za pomocą kleszczy. Umieść krawędź niestrzępiącej się chusteczki i usuń płynny wosk wychodzący z miejsca nakłucia.

Alternatywnie, zamiast opróżniać gruczoł przez rozwarstwienie, wokół części pyska kleszcza można użyć klejów, takich jak klej tkankowy. Kiedy samice ponownie zaczną składać jaja, użyj drobnego pędzla, aby zebrać świeżo złożone jaja i umieść je w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Dodaj około 200 mikrolitrów 5% wody chlorku benzalkoniowego do probówki zawierającej jaja w wieku od zera do 18 godzin.

Delikatnie obracaj jajka pędzlem przez pięć minut, aby uniknąć osadzania się jaj na dnie probówki, a następnie usuń supernatant za pomocą mikropipety, pozostawiając jaja w probówce. Dodaj około 200 mikrolitrów wody destylowanej do probówki zawierającej jajka. Zakręć pędzlem i usuń wodę z probówki mikrowirówki za pomocą mikropipety.

Po umyciu wodą destylowaną dodaj około 200 mikrolitrów 5% chlorku sodu i delikatnie mieszaj pędzlem przez pięć minut. Następnie po pięciu minutach wyjmij roztwór z probówki i dwukrotnie umyj jajka wodą destylowaną. Następnie dodaj około 100 mikrolitrów 1% roztworu chlorku sodu do probówki mikrowirówki zawierającej jaja.

Najpierw przyklej do siebie dwa szklane szkiełka mikroskopowe, pozostawiając odstęp około 0,5 centymetra, aby ułatwić wyrównanie jaj za pomocą taśmy dwustronnej, a następnie nałóż kawałek przezroczystego opatrunku foliowego na taśmę dwustronną w szczelinie między szkiełkami. Następnie wyrównaj od ośmiu do 10 jajek na raz na szkiełku za pomocą pędzla. Następnie umieść szkiełko z wyrównanymi jajami na stoliku mikroskopu wieloskładnikowego i usuń 1% roztwór chlorku sodu za pomocą kawałka niestrzępiącej się chusteczki, w której są przechowywane.

Podłączyć napełnioną igłę do wstrzykiwacza do mikrowstrzykiwacza podłączonego do mikromanipulatora. Następnie otwórz igłę, delikatnie pocierając ją o powierzchnię jaja, używając ustawienia wysokiego ciśnienia na mikrowstrzykiwaczu. Po otwarciu igły należy zmniejszyć ciśnienie mikrowtryskiwacza w zależności od otwarcia igły.

Następnie wstrzyknij wszystkie jaja na szkiełku pod kątem od 10 do 15 stopni tak szybko, jak to możliwe, szybko naciśnij pedał nożny i natychmiast przesuń szkiełko do warunków wysokiej wilgotności na szalce Petriego wilgotnym ręcznikiem papierowym. Po pięciu do sześciu godzinach od umieszczenia szkiełka zawierającego wstrzyknięte zarodki na dużej szalce Petriego wyłożonej wilgotną bibułą filtracyjną, dodaj niewielką kroplę wody destylowanej do przezroczystego opatrunku filmowego z dołączonymi wstrzykniętymi zarodkami. Następnie delikatnie przesuń jajka za pomocą pędzla.

Następnie przenieś jajka na małą szalkę Petriego i zanurz je w wodzie destylowanej. Trzymaj jaja zanurzone w wodzie, umieść szalkę Petriego w plastikowym pudełku o pojemności sześciu litrów w inkubatorze w temperaturze 27 stopni Celsjusza i wilgotności względnej powyżej 90%. Kiedy larwa zaczyna wylęgać się z wstrzykniętych zarodków od 21 do 25 dni po wstrzyknięciu, należy je codziennie sprawdzać i przenieść wyklute larwy do szklanych fiolek z sitkiem na górze.

Wyniki wykazały, że wstrzyknięcie jaj na wczesnym etapie embriogenezy w wieku od 12 do 18 godzin i ustawienie dłuższej osi jaja prostopadłej do krawędzi szkiełka skutkuje wyższym wskaźnikiem przeżywalności wstrzykniętych jaj. Spośród wszystkich wstrzykniętych jaj przeżyło do 8,5% i wykluły się larwy. Przed rozpoczęciem tej procedury ważne jest, aby pamiętać o krokach 2.4, usunięcie woskowiny z kleszcza matki, oraz krokach od 3.1 do 3.4, zmiękczenie kosmówki zarodka chlorkiem benzalkoniowym i wysuszenie zarodka roztworami chlorku sodu, aby umożliwić udane wstrzyknięcie zarodka.

Ta metoda została opracowana przede wszystkim do edycji genów kleszczy, a to pozwoli nam na wykonanie nokautów i knock-inów, które pomogą nam zrozumieć funkcję genów kleszczy. Technika ta pozwoli na zastosowanie narzędzi do edycji genów dostępnych dla wielu innych organizmów w badaniach nad kleszczami. A to przyspieszy badania biologii molekularnej kleszcza.