Name: Przemiana indukowana mediatorem fosfolipidowym w kulturach trójwymiarowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowych kultur MCF10A do badania przemiany indukowanej PAF w badaniach nad rakiem piersi. Ta technika umożliwia identyfikację nowych biomarkerów i celów lekowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy IISER Pune Microscopy Facility za dostęp do sprzętu i infrastruktury oraz wsparcie dla eksperymentów. Badanie to było wspierane przez grant z Departamentu Biotechnologii (DBT), rządu Indii (BT/PR8699/MED/30/1018/2013), Science and Engineering Research Board (SERB), rządu Indii (EMR/2016/001974) oraz częściowo z IISER, Pune Core funding. A. K. był finansowany przez stypendium CSIR-SRF, L.A. był finansowany przez stypendium DST-INSPIRE, V.C był finansowany przez DBT (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).

1. Umieszczanie komórek MCF10A w lrECM
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki MCF10A (przylegające komórki nabłonka piersi) w pożywce wzrostowej. Przenikaj komórki co 4 dni. 
	UWAGA: Skład pożywki: DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu zawierający surowicę końską (5%), insulinę (10 μg/ml), hydrokortyzon (0,5 μg/ml), naskórkowy czynnik wzrostu, EGF (20 ng/ml), toksyny (100 ng/ml) i penicylinę-streptomycynę (100 jednostek/ml) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Rozmrozić lrECM (patrz tabela materiałów) na lodzie 20 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Dzień wysiewu komórek jest ogólnie uważany za Dzień 0.</li>
	<li>W celu trypsynizacji komórek odessać pożywkę i przemyć 2 ml PBS. Dodać 900 μl 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez ~15 minut lub do momentu, gdy komórki zostaną całkowicie trypsynizowane.</li>
	<li>Przygotować złoże lrECM w ośmiu studzienkach szklanego szkiełka nakrywkowego z komorą (patrz Tabela Materiałów).
	<ol>
		<li>Gdy komórki trypsynizują, pokryj każdą studzienkę 60 μl lrECM i umieść w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C na maksymalnie 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórkową, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Po całkowitym usunięciu komórek dodać 5 ml pożywki do reparacji w celu wygaszenia aktywności trypsyny i wirować komórki w temperaturze 112 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C. 
		UWAGA: Skład pożywki do re-zawiesiny: DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu, uzupełniony surowicą końską (20%) i penicyliną-streptomycyną (100 jednostek/ml).</li>
		<li>Odessać zużytą pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki testowej. Dobrze wymieszać zawiesinę, aby zapewnić utworzenie zawiesiny jednokomórkowej. 
		UWAGA: Skład pożywki testowej: DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu, uzupełniony surowicą końską (2%), hydrokortyzonem (0,5 μg/ml), toksyną (100 ng/ml), insuliną (10 μg/ml) i penicyliną-streptomycyną (100 jednostek/ml).</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną do wysiewu 6 x 103 komórek w każdym dołku. 
		UWAGA: Generalnie zaleca się uwzględnienie w obliczeniach jednego dodatkowego dołka w celu uwzględnienia ewentualnych błędów pipetowania.</li>
		<li>W zależności od wymaganej liczby studzienek rozcieńczyć zawiesinę komórek w podłożu nakładkowym. 
		UWAGA: Skład pożywki nakładającej dla pojedynczego dołka jest następujący: 400 μl pożywki testowej, 8 μl lrECM (2% final) i 0,02 μl 100 μg/ml EGF (5 ng/ml final).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj wysiew komórek.
	<ol>
		<li>Dodać 400 μl rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do przygotowanych łóżek lrECM (krok 1.4), uważając, aby nie naruszyć złoża lrECM. Inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Leczenie PAF
<ol>
	<li>Dodać PAF 3 godziny po wysianiu komórek. Przygotować 100 μM zapasu PAF w PBS i dodać wymaganą objętość 0,2 μl do każdej studzienki (co odpowiada 200 nM).</li>
	<li>Dodawaj takie samo stężenie PAF przy każdej zmianie pożywki.</li>
</ol>
3. Ponowne karmienie świeżymi pożywkami
<ol>
	<li>Uzupełniaj komórki świeżą pożywką co 4 dni (tj. Dzień 4, Dzień 8, Dzień 12 i Dzień 16).</li>
</ol>
4. Badanie immunofluorescencyjne w celu wykrycia zmian fenotypowych wywołanych długotrwałą ekspozycją na PAF
<ol>
	<li>Po 20 dniach hodowli ostrożnie odpipetować pożywkę z każdej studzienki i umyć studzienki 400 μl wstępnie podgrzanego PBS.</li>
	<li>Utrwal struktury groniaste dodając 400 μl 4% paraformaldehydu (świeżo przygotowanego przez rozcieńczenie 16% paraformaldehydu w 1x PBS) i inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać studzienki raz lodowatym PBS i przepuszczać PBS zawierającym 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po 10 minutach natychmiast, ale ostrożnie, odpipetować roztwór Triton-X 100 i spłukać 400 μl PBS-glicyny (świeżo przygotowanej przez dodanie szczypty glicyny do 1x PBS). Powtarza się to trzykrotnie po 15 minut.</li>
	<li>Dodać 400 μl podstawowego roztworu blokującego składającego się z 10% surowicy koziej (patrz tabela materiałów) w buforze immunofluorescencyjnym (IF) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 min. 
	UWAGA: Skład buforu IF: 0,05% azydku sodu, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 i 0,05% Tween (20 w 1 PBS).</li>
	<li>Usunąć pierwszorzędowy roztwór blokujący, dodać 200 μl 2% wtórnego przeciwciała blokującego (F(ab')2 fragment przeciwciała wyhodowanego w kozie przeciwko antygenowi myszy, patrz tabela materiałów) przygotowanego w pierwotnym roztworze blokującym i pozostawić na 45-60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe (patrz tabela materiałów) w 2% roztworze przeciwciała blokującego w rozcieńczeniu 1:100. Po usunięciu wtórnego roztworu blokującego dodać świeżo przygotowane przeciwciało i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Poprzedni krok może wywołać upłynnienie błony podstawnej. Przed przystąpieniem do eksperymentu poczekaj, aż szkiełko osiągnie temperaturę pokojową. Ostrożnie odpipetować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć go trzykrotnie 400 μl buforu IF.</li>
	<li>Podczas ostatniego przemywania buforem IF przygotować rozcieńczenie 1:200 przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem (patrz tabela materiałów) w pierwszorzędowym roztworze blokującym. Inkubować szkiełka w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 40-60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka 400 μl buforu IF przez 20 minut, a następnie dwukrotnie przepłukać PBS przez 10 minut każde.</li>
	<li>Przeciwbarwienie jąder PBS zawierającym 0,5 ng/ml barwienia jądrowego (patrz Tabela materiałów) przez 5-6 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka trzykrotnie 400 μl PBS, aby usunąć nadmiar plam</li>.
	<li>Ostrożnie odpipetować cały PBS i upewnić się, że pozostał roztwór. Dodaj jedną kroplę odczynnika montażowego (patrz Tabela materiałów) do każdej studzienki i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przechowuj szkiełka w temperaturze pokojowej i zobrazuj je tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Obraz w powiększeniu 40x lub 63x w mikroskopie konfokalnym (patrz tabela materiałów), przyjmując optyczne przekroje Z o wielkości kroku 0,6 mm (NA = 1,4).</li>
	<li>Otwórz uzyskane obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz tabela materiałów). Zademonstruj różnice morfologiczne za pomocą rzutów 3D. 
	UWAGA: Najbardziej środkowy optyczny przekrój Z może być najlepiej wykorzystany do pokazania różnic w lokalizacji znaczników polaryzacji. Można je określić ilościowo ręcznie, aby przedstawić procent sferoid wykazujących ten konkretny wzór barwienia.</li>
	<li>Aby zilustrować różnice w ekspresji białek, należy przeprowadzić analizę półilościową mierzącą średnią wartość szarości lub obliczając skorygowaną całkowitą fluorescencję komórek (CTCF)23. Przedstaw dane jako wykresy skrzypiec lub kropkowe.</li>
</ol>

<ol><li>Lacroix, M., Leclercq, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+breast+cancer+cell+lines+as+models+for+breast+tumours%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).</li>
<li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li>
<li>Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmosomal+adhesion+regulates+epithelial+morphogenesis+and+cell+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning.</a> Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).</li>
<li>Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+mammary+epithelial+differentiation%3A+basement+membrane+induces+tissue-specific+gene+expression+in+the+absence+of+cell-cell+interaction+and+morphological+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity.</a> Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).</li>
<li>Streuli, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+mediates+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia.</a> Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).</li>
<li>Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulators+of+tissue+structure+and+function+also+regulate+tumor+induction+and+progression%3A+the+role+of+extracellular+matrix+and+its+degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).</li>
<li>Heinrich, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+tumor+microenvironment%2C+epithelial+mesenchymal+transition+and+lung+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis.</a> Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).</li>
<li>Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation%2C+the+tumor+microenvironment+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis.</a> Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).</li>
<li>Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PAF+receptors+results+in+enhanced+synthesis+of+2-arachidonoylglycerol+%282-AG%29+in+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells.</a> The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).</li>
<li>Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+gene+regulation+by+PGE%282%29%2C+LTB%284%29+and+PAF%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF.</a> Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).</li>
<li>Bussolati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAF+produced+by+human+breast+cancer+cells+promotes+migration+and+proliferation+of+tumor+cells+and+neo-angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis.</a> The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).</li>
<li>Chakravarty, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exposure+to+platelet+activating+factor+transforms+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells.</a> Frontiers in Genetics. 12, 634938(2021).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-activating+factor+receptor-mediated+PI3K%2FAKT+activation+contributes+to+the+malignant+development+of+esophageal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma.</a> Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed-forward+reciprocal+activation+of+PAFR+and+STAT3+regulates+epithelial-mesenchymal+transition+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).</li>
<li>Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+of+human+breast+epithelial+cells%3A+the+how+and+the+why%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differentiation+and+alveolar+morphogenesis+of+primary+mammary+cultures+on+reconstituted+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane.</a> Development. 105 (2), 223-235 (1989).</li>
<li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li>
<li>Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+three-dimensional+basement+membrane+cultures+to+model+oncogene-induced+changes+in+mammary+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).</li>
<li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li>
<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14, 287(2014).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rhodamine+derivative+as+a+%26%2334%3Block%26%2334%3B+and+SCN%E2%88%92+as+a+%26%2334%3Bkey%26%2334%3B%3A+visible+light+excitable+SCN%E2%88%92+sensing+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">A rhodamine derivative as a &#34;lock&#34; and SCN− as a &#34;key&#34;: visible light excitable SCN− sensing in living cells.</a> Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).</li>
<li>Ren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+basal+nitric+oxide+production+induces+precancerous+mammary+lesions+via+ERBB2+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6688(2019).</li>
<li>Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-dependent+protein+kinase+plays+a+central+role+in+transformation+of+breast+epithelial+cells+following+alkylation+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage.</a> Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).</li>
<li>Sonnenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha+6%2Fbeta+4+complex+is+located+in+hemidesmosomes%2C+suggesting+a+major+role+in+epidermal+cell-basement+membrane+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).</li>
<li>Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+their+accessory+adhesion+molecules+in+mammary+carcinomas%3A+loss+of+polarization+in+poorly+differentiated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors.</a> Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).</li>
<li>Natali, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+expression+of+alpha+6%2Fbeta+4+integrin+heterodimer+in+primary+and+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer.</a> British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).</li>
<li>Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+expression+pattern+of+the+alpha6beta4+integrin+and+laminin-5+in+human+prostate+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma.</a> Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).</li>
<li>Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell-to-cell+variability+in+Ras+activity+triggers+emergent+behaviors+during+mammary+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis.</a> Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).</li>
<li>Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+contributes+to+epithelial-mesenchymal+transition+cancer+cell+mechanics+by+mediating+cytoskeletal+organization+and+focal+adhesion+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation.</a> Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).</li>
<li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures-a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+transcriptional+program+induced+by+Raf+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells.</a> Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).</li>
<li>McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+of+heparin-binding+epidermal+growth+factor%2Fdiphtheria+toxin+receptor+expression+by+Raf+and+Ras+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes.</a> Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).</li>
<li>Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p53+exerts+a+dominant+negative+effect+by+preventing+wild-type+p53+from+binding+to+the+promoter+of+its+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes.</a> Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).</li>
<li>Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p53+drives+cancer+by+subverting+multiple+tumor+suppression+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways.</a> Frontiers in Oncology. 6, 12(2016).</li>
<li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+A+powerful+tool+in+tumor+research+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery.</a> Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).</li>
<li>Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+3D+co-culture+with+MDA-MB-231+breast+cancer+cell+line+and+patient-derived+immune+cells+for+application+in+the+development+of+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies.</a> Frontiers in Oncology. 10, 1543(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Sprawdzone modele oparte na liniach komórkowych są szeroko stosowane do badania procesu kancerogenezy. Jednowarstwowe hodowle komórek nadal dostarczają informacji na temat różnych molekularnych szlaków sygnałowych, które pośredniczą w charakterystycznych zmianach w komórkach nowotworowych32. Badania nad rolą dobrze znanych onkogenów, takich jak Ras, Myc i zmutowany p53, zostały po raz pierwszy opisane przy użyciu kultur jednowarstwowych jako systemu modelowego 33,34,35,36.<...

Dostępnych jest niezliczona liczba modeli służących do badania progresji nowotworów, z których każdy jest unikalny i reprezentuje podtyp tej złożonej choroby. Każdy model dostarcza wyjątkowych i cennych informacji na temat biologii nowotworów oraz usprawnił metody naśladowania rzeczywistego stanu chorobowego. Ugruntowane linie komórkowe hodowane w monowarstwie dostarczyły cennych informacji na temat procesów życiowych in vitro, takie jak proliferacja, inwazyjność, migracja i apoptoza1Choć dwuwymiarowe (2D) hodowle komórkowe stanowią tradycyjne narzędzie do badania odpowiedzi komórek ssaków na szereg zaburzeń środowiskowych, ekstrapolacja tych wyników w celu przewidywania odpowiedzi na poziomie tkanki nie wydaje się wystarczająco przekonująca. Głównym ograniczeniem hodowli 2D jest fakt, że stworzone w nich mikrośrodowisko znacznie różni się od mikrośrodowiska tkanki piersi.2Hodowla 2D nie zapewnia interakcji komórek z macierzą pozakomórkową, która jest niezbędna dla wzrostu każdej tkanki. Ponadto siły rozciągające, którym poddawane są komórki w hodowlach monowarstwy, utrudniają ich polaryzację, co prowadzi do zmiany sygnalizacji i zachowania komórek.3,4,5Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli otworzyły nową drogę w badaniach nad rakiem dzięki swojej zdolności do naśladowania in vivo warunki in vitro Wiele kluczowych sygnałów mikrośrodowiskowych, które ulegają utracie w dwuwymiarowych (2D) hodowlach komórkowych, można odtworzyć, stosując trójwymiarowe (3D) hodowle w macierzy zewnątrzkomórkowej bogatej w lamininę (lrECM).6.
Różne badania wykazały znaczenie mikrośrodowiska guza w kancerogenezie7,8. Czynniki związane ze stanem zapalnym stanowią główną część mikrośrodowiska. Czynnik aktywujący płytki krwi (PAF) jest fosfolipidowym mediatorem wydzielanym przez różne komórki odpornościowe, który pośredniczy w wielu odpowiedziach immunologicznych9,10. Wysokie poziomy PAF są wydzielane przez różne linie komórkowe raka piersi i wiążą się ze zwiększoną proliferacją11. Badania prowadzone w naszym laboratorium wykazały, że przedłużona obecność PAF w kulturach acynarnych prowadzi do transformacji komórek nabłonkowych piersi12. PAF aktywuje receptor PAF (PAFR), co prowadzi do aktywacji osi sygnalizacyjnej PI3K/Akt13. Doniesiono również, że PAFR jest powiązany z EMT, inwazją i przerzutowaniem14.
Niniejszy protokół prezentuje model systemu do badania transformacji indukowanej przez PAF, z wykorzystaniem hodowli 3D komórek nabłonkowych piersi, zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej przez Chakravarty i wsp.12. Komórki nabłonka piersi hodowane na macierzy zewnątrzkomórkowej (hodowle 3D) wykazują tendencję do tworzenia spolaryzowanych sferoidów z zahamowanym wzrostem. Struktury te nazywane są acini i ściśle przypominają acini tkanki piersi, czyli najmniejszą funkcjonalną jednostkę gruczołu mlekowego in vivo15. Sferoidy te (Rysunek 1A,B) składają się z warstwy pojedynczych, gęsto upakowanych, spolaryzowanych komórek nabłonkowych otaczających pusty lumen i przytwierdzonych do błony podstawnej (Rysunek 1C). Proces morfogenezy ten został dobrze opisany w literaturze16. Po wysianiu na lrECM komórki ulegają podziałom i różnicowaniu, tworząc skupisko komórek, które następnie polaryzują się od 4. dnia hodowli. Do 8. dnia acini składają się z grupy spolaryzowanych komórek będących w bezpośrednim kontakcie z macierzą zewnątrzkomórkową oraz grupy komórek niespolaryzowanych zamkniętych wewnątrz zewnętrznych komórek spolaryzowanych, bez kontaktu z macierzą. Wiadomo, że komórki niespolaryzowane ulegają apoptozie do 12. dnia hodowli, tworząc pusty lumen. Do 16. dnia powstają struktury o zahamowanym wzroście16.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64146/64146fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Jądra komórek w acynusach zabarwione barwnikiem jądrowym. (A) Rekonstrukcja 3D acynusów. (B)&#160;Obraz w kontraście fazowym acynusów MCF10A hodowanych na Matrigelu przez 20 dni. (C) Najbardziej centralny przekrój wykazuje obecność pustego światła. Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64146/64146fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W przeciwieństwie do kultur 2D, kultury acinarne pomagają w rozróżnieniu komórek prawidłowych i przekształconych poprzez wyraźne zmiany morfologiczne. Nieprzekształcone komórki nabłonka piersi tworzą acini z pustym światłem, naśladując prawidłowe acini piersi człowieka. Sferoidy te, po transformacji, wykazują zaburzoną morfologię charakteryzującą się znaczną utratą polarności (jedną z cech charakterystycznych dla nowotworów), brakiem światła lub zaburzeniem pustego światła (wynikającym z unikania apoptozy), co może być indukowane przez deregulację różnych genów17,18,19,20. Transformacje te można badać przy użyciu powszechnie stosowanych technik, takich jak immunofluorescencja. Zatem model 3D hodowli komórkowej może służyć jako prosta metoda badania procesu morfogenezy acinarnej piersi oraz kancerogenezy piersi. Ustanowienie systemu hodowli 3D w celu zrozumienia efektu mediatora fosfolipidowego, PAF, pomoże w wysokoprzepustowym przesiewaniu leków w badaniach przedklinicznych.
W niniejszej pracy zaadaptowano protokół hodowli 3D „on top”16,21 do badania transformacji indukowanej przez PAF22. Zmiany fenotypowe wywołane ekspozycją acini na mediator fosfolipidowy badano przy użyciu immunofluorescencji. W badaniu wykorzystano różne markery polarności oraz przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT)12,16. W Tabeli 1 wskazano ich normalną lokalizację oraz oczekiwany fenotyp po transformacji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Przeciwciała</td>
			<td>Znaczniki</td>
			<td>Prawidłowa lokalizacja</td>
			<td>Fenotyp transformowany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;6-Integryna</td>
			<td>Bazolateralny</td>
			<td>Podstawne z niemal nieobecnym barwieniem bocznym</td>
			<td>Silne barwienie lateralne / apikalne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;$\beta$-katenina</td>
			<td>Złącze międzykomórkowe</td>
			<td>Bazolateralny</td>
			<td>Nieprawidłowa lokalizacja jądrowa lub cytoplazmatyczna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wimentyna</td>
			<td>EMT</td>
			<td>Brak / słaba obecność</td>
			<td>Up-regulacja</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Markery użyte w badaniu. Różne markery wraz z ich lokalizacją w obecności i przy braku traktowania PAF.
Niniejszą metodę można najlepiej wykorzystać do badania i przesiewania potencjalnych leków oraz genów docelowych dla różnych podtypów raka piersi. Pozwala to na uzyskanie danych dotyczących odpowiedzi na leki, które są bliższe scenariuszowi in vivo, co wspomaga szybszy i bardziej niezawodny rozwój leków. Ponadto system ten może być wykorzystywany do badania sygnalizacji molekularnej związanej z odpowiedzią na leki oraz z lekoopornością.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA433689M</td><td></td></tr><tr><td>Anti Mouse Mąka Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Anti Rabbit Alexa Mąka 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Komora Coverglass</td><td>Nunc</td><td></td><td></td>155409</tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma</td><td>C8052-1MG</td><td>1 mg / ml w dH2O</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644-0.2MG</td><td>100 mg / ml w dH2O</td></tr><tr><td>F(ab')2 Fragment przeciwciała wyhodowanego u kozy przeciwko mysiemu antygenowi</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-006</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało GM130</td><td>Abcam</td><td>ab52649</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>33258</td><td></td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>1 mg/ml w etanolu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td>10 mg/ml zapas dH2O</td></tr><tr><td>lrECM (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik montażowy (Slow fade Gold Anti-blade)</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Stain&nbsp; (Hoechst)</td><td>Invitrogen</td><td>33258</td><td></td></tr><tr><td>PAF</td><td>Cayman Chemicals</td><td>91575-58-5</td><td>Metylokarbamyl PAF C-16, pozyskiwany jako 10 mg/ml w etanolu</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Vimentin</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; Przeciwciało 6-integrynowe</td><td>Millipore</td><td>MAB1378</td><td></td></tr></tbody></table>

przemiana indukowana mediatorem fosfolipidowym w kulturach trójwymiarowych

Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures

Do badania raka opracowano kilka modeli, takich jak modele gryzoni i ustalone linie komórkowe. Badania z wykorzystaniem tych modeli dostarczyły cennych informacji na temat kancerogenezy. Linie komórkowe pozwoliły zrozumieć deregulację sygnalizacji molekularnej związanej z nowotworzeniem piersi, podczas gdy modele gryzoni są szeroko stosowane do badania komórkowych i molekularnych cech raka piersi in vivo. Ustanowienie hodowli 3D komórek nabłonkowych i nowotworowych piersi pomaga w wypełnieniu luki między modelami in vivo i in vitro poprzez naśladowanie warunków in vivo in vitro. Model ten można wykorzystać do zrozumienia deregulacji złożonych zdarzeń sygnalizacji molekularnej i charakterystyki komórkowej podczas kancerogenezy piersi. W tym przypadku system hodowli 3D jest modyfikowany w celu zbadania przemiany indukowanej mediatorem fosfolipidowym (czynnik aktywujący płytki krwi, PAF). Immunomodulatory i inne wydzielane cząsteczki odgrywają główną rolę w inicjacji i progresji guza w piersi. W niniejszym badaniu 3D hodowle groniaste komórek nabłonka piersi są wystawione na działanie PAF, wykazywały cechy transformacji, takie jak utrata polarności i zmienione cechy komórkowe. Ten system hodowli 3D pomoże rzucić światło na genetyczne i/lub epigenetyczne perturbacje wywołane przez różne małe cząsteczki w mikrośrodowisku guza. Dodatkowo, system ten będzie również stanowił platformę do identyfikacji nowych, a także znanych genów, które mogą być zaangażowane w proces transformacji.

Komórki MCF10A, po ekspozycji na PAF, tworzą struktury pęcherzykowate o bardzo wyraźnych fenotypach. Stwierdzono błędną lokalizację α6-integryny, z silniejszym barwieniem w części apikalnej. W kilku pęcherzykach zaobserwowano również barwienie nieciągłe (Rycina 2A). Oba te fenotypy wskazują na utratę polarności bazalnej, co potwierdzają doniesienia literaturowe24,25. Wcześniejsze raporty wskazują na kontrowersyjną rolę α6-integryny w...

Obecny protokół opisuje tworzenie 3D 'na wierzchu' hodowli nieprzekształconej linii komórek nabłonka piersi, MCF10A, która została zmodyfikowana do badania transformacji indukowanej przez czynnik aktywujący płytki krwi (PAF). Do oceny przemiany wykorzystano immunofluorescencję, która została szczegółowo omówiona.

Przemiana indukowana mediatorem fosfolipidowym w kulturach trójwymiarowych

Several models have been developed to study cancer, such as rodent models and established cell lines. Valuable insights into carcinogenesis have been ...

Nasze zmodyfikowane kultury testowe 3D mogą być wykorzystywane do badania roli różnych składników w mikrośrodowisku nowotworu, prowadząc do identyfikacji nowych biomarkerów i celów leków. Metoda ta umożliwia badanie zmian w fenotypie komórkowym i sygnalizacji molekularnej, które bardzo przypominają układ odpornościowy. Może być również modyfikowany w celu spełnienia określonych wymagań badania.Metoda ta może pomóc w identyfikacji nowych biomarkerów, które mogą pomóc we wczesnym wykrywaniu raka piersi. Wgląd molekularny może być również wykorzystany do identyfikacji nowych celów leków. Metoda ta może być stosowana do badania zarówno nowotworzenia, jak i morfogenezy po zaburzeniach genu lub genów, które mogą dostarczyć informacji na temat roli odgrywanej przez gen lub geny.Na początek trypsynizuj komórki, zasysając pożywkę i przemując 2 mililitrami PBS. Dodaj 900 mikrolitrów 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 15 minut lub do momentu, gdy komórki zostaną całkowicie trypsynizowane. Przygotować złoże lrECM w ośmiu dołkach szklanego szkiełka nakrywkowego z komorą, pokrywając każdą studzienkę 60 mikrolitrami lrECM.Umieść go w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na maksymalnie 15 minut. Aby przygotować zawiesinę komórkową, dodaj 5 mililitrów pożywki do re-zawiesiny, aby ugasić aktywność trypsyny i obracaj komórki z prędkością 112 razy g przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Odessać zużytą pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 2 mililitrach pożywki testowej.Dobrze wymieszać zawiesinę, aby zapewnić utworzenie zawiesiny jednokomórkowej. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną do zasiania 6 000 komórek w każdym dołku. W zależności od wymaganej liczby studzienek rozcieńczyć zawiesinę komórek w podłożu nakładkowym.Dodać 400 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do przygotowanych łóżek lrECM, uważając, aby nie naruszyć złoża lrECM. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Po 3 godzinach dodaj 200 nanomoli PAF do każdej studzienki.Dodawaj takie samo stężenie PAF przy każdej zmianie pożywki i uzupełniaj komórki świeżą pożywką co 4 dni. Po 20 dniach hodowli ostrożnie odpipetować pożywkę z każdej studzienki i umyć studzienki 400 mikrolitrami wstępnie podgrzanego PBS. Utrwal struktury groniaste, dodając 400 mikrolitrów świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu i inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Przepłukać studzienki raz lodowatym PBS i przepuszczalnie PBS zawierającym 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po 10 minutach ostrożnie odpipetować roztwór Triton X-100 i spłukać 400 mikrolitrami świeżo przygotowanej glicyny PBS. Dodać 400 mikrolitrów pierwotnego roztworu blokującego zawierającego 10% surowicy koziej w buforze immunofluorescencyjnym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut.Usuń pierwotny roztwór blokujący, dodaj 200 mikrolitrów 2% wtórnego przeciwciała blokującego przygotowanego w pierwotnym roztworze blokującym i pozostaw w temperaturze pokojowej na 45 do 60 minut. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe w 2% roztworze przeciwciała blokującego wtórnego w rozcieńczeniu 1:100. Usuń wtórny roztwór blokujący, dodaj świeżo przygotowane przeciwciało i inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Ostrożnie odpipetować roztwór przeciwciała pierwotnego i przemyć go trzykrotnie 400 mikrolitrami buforu immunofluorescencyjnego. Następnie należy przygotować rozcieńczenie 1:200 przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem w pierwszorzędowym roztworze blokującym i inkubować szkiełka w roztworze przeciwciała drugorzędowego przez 40 do 60 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełka 400 mikrolitrami buforu immunofluorescencyjnego przez 20 minut, a następnie dwa przemycia PBS przez 10 minut każde.Przeciw barwieniu jąder za pomocą PBS zawierającego 0,5 nanograma na mililitr barwienia jądrowego przez 5 do 6 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka trzykrotnie 400 mikrolitrami PBS, aby usunąć nadmiar plamy. Ostrożnie odpipetować cały PBS i upewnić się, że pozostał roztwór.Następnie dodaj jedną kroplę odczynnika montażowego do każdej studzienki i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej. Na koniec zobrazuj szkiełka pod powiększeniem 40x lub 63x pod mikroskopem konfokalnym, biorąc optyczne przekroje Z o rozmiarze kroku 0,6 milimetra. Obrazy przedstawiają jądra komórek w acini barwione barwieniem jądrowym.Konstrukcja 3D acini i obraz kontrastu fazowego acini MCF10A hodowanego na lrECM przez 20 dni są pokazane tutaj. Najbardziej środkowa sekcja pokazuje obecność pustego światła. PAF zaburza polaryzację i indukuje zmiany podobne do EMT w MCF10A piersi.Komórki MCF10A hodowano w 3D na górnych kulturach w lrECM. Kultury traktowano PAF w dniach 0, 4, 8, 12 i 16. Hodowle utrzymywano przez 20 dni, a następnie wybarwiono immunologicznie pod kątem alfa6-integryny i barwienia jądrowego, GM130, markera polarności wierzchołkowej i wimentyny, markera EMT.Najbardziej środkowy stos odpowiednich acini został pokazany tutaj. Reprezentatywne dane dotyczą 40-50 acini z trzech biologicznie niezależnych eksperymentów. Łóżko lrECM musi być wykonane ostrożnie, tak aby było równomiernie rozłożone bez pęcherzyków powietrza.Ponadto zawiesinę komórkową należy równomiernie wymieszać i dodawać powoli, aby uniknąć zbrylania. Z kultur 3D można uzyskać białka i RNA, które można następnie wykorzystać do badania różnych szlaków molekularnych.

phospholipid-mediator-induced-transformation-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Opisano metodę przetwarzania materiału chirurgicznego ludzkiego sutka. Przetworzona tkanka, w postaci organoidów, może być przechowywana w stanie zamrożonym w nieskończoność lub umieszczona w kulturze w celu długotrwałego wzrostu.  Metoda ta umożliwia eksperymentalne badanie prawidłowej biologii komórek nabłonkowych człowieka oraz skutków zaburzeń egzogennych.

Przetwarzanie tkanek ludzkiej mammoplastyki redukcyjnej i mastektomii do hodowli komórkowych

Trójwymiarowa hodowla komórek nabłonka sutka na odtworzonej błonie podstawnej jest użyteczną metodą do podsumowania in vivo architektury łagodnej piersi i odróżnienia złośliwego fenotypu od łagodnego fenotypu piersi. Co ważne, system ten może być stosowany do badania raków inwazyjnych w innych tkankach.

Hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Tutaj pokazujemy, jak komórki nabłonkowe hodowane z fibroblastami w dwuwarstwowym systemie opartym na błonie nanowłóknistej mogą stabilnie przylegać do błony i rosnąć na niej.

Stworzenie trójwymiarowego modułu kokultury komórek nabłonkowych z wykorzystaniem błon nanowłóknistych

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Poznaj metodę trójwymiarowych kultur MCF10A do badania przemiany indukowanej PAF w badaniach nad rakiem piersi. Ta technika umożliwia identyfikację nowych biomarkerów i celów lekowych.

Przemiana indukowana mediatorem fosfolipidowym w kulturach trójwymiarowych

Przeglądaj więcej filmów