Przemiana indukowana mediatorem fosfolipidowym w kulturach trójwymiarowych

Nasze zmodyfikowane kultury testowe 3D mogą być wykorzystywane do badania roli różnych składników w mikrośrodowisku nowotworu, prowadząc do identyfikacji nowych biomarkerów i celów leków. Metoda ta umożliwia badanie zmian w fenotypie komórkowym i sygnalizacji molekularnej, które bardzo przypominają układ odpornościowy. Może być również modyfikowany w celu spełnienia określonych wymagań badania.

Metoda ta może pomóc w identyfikacji nowych biomarkerów, które mogą pomóc we wczesnym wykrywaniu raka piersi. Wgląd molekularny może być również wykorzystany do identyfikacji nowych celów leków. Metoda ta może być stosowana do badania zarówno nowotworzenia, jak i morfogenezy po zaburzeniach genu lub genów, które mogą dostarczyć informacji na temat roli odgrywanej przez gen lub geny.

Na początek trypsynizuj komórki, zasysając pożywkę i przemując 2 mililitrami PBS. Dodaj 900 mikrolitrów 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 15 minut lub do momentu, gdy komórki zostaną całkowicie trypsynizowane. Przygotować złoże lrECM w ośmiu dołkach szklanego szkiełka nakrywkowego z komorą, pokrywając każdą studzienkę 60 mikrolitrami lrECM.

Umieść go w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na maksymalnie 15 minut. Aby przygotować zawiesinę komórkową, dodaj 5 mililitrów pożywki do re-zawiesiny, aby ugasić aktywność trypsyny i obracaj komórki z prędkością 112 razy g przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Odessać zużytą pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 2 mililitrach pożywki testowej.

Dobrze wymieszać zawiesinę, aby zapewnić utworzenie zawiesiny jednokomórkowej. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną do zasiania 6 000 komórek w każdym dołku. W zależności od wymaganej liczby studzienek rozcieńczyć zawiesinę komórek w podłożu nakładkowym.

Dodać 400 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do przygotowanych łóżek lrECM, uważając, aby nie naruszyć złoża lrECM. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Po 3 godzinach dodaj 200 nanomoli PAF do każdej studzienki.

Dodawaj takie samo stężenie PAF przy każdej zmianie pożywki i uzupełniaj komórki świeżą pożywką co 4 dni. Po 20 dniach hodowli ostrożnie odpipetować pożywkę z każdej studzienki i umyć studzienki 400 mikrolitrami wstępnie podgrzanego PBS. Utrwal struktury groniaste, dodając 400 mikrolitrów świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu i inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Przepłukać studzienki raz lodowatym PBS i przepuszczalnie PBS zawierającym 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po 10 minutach ostrożnie odpipetować roztwór Triton X-100 i spłukać 400 mikrolitrami świeżo przygotowanej glicyny PBS. Dodać 400 mikrolitrów pierwotnego roztworu blokującego zawierającego 10% surowicy koziej w buforze immunofluorescencyjnym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut.

Usuń pierwotny roztwór blokujący, dodaj 200 mikrolitrów 2% wtórnego przeciwciała blokującego przygotowanego w pierwotnym roztworze blokującym i pozostaw w temperaturze pokojowej na 45 do 60 minut. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe w 2% roztworze przeciwciała blokującego wtórnego w rozcieńczeniu 1:100. Usuń wtórny roztwór blokujący, dodaj świeżo przygotowane przeciwciało i inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Ostrożnie odpipetować roztwór przeciwciała pierwotnego i przemyć go trzykrotnie 400 mikrolitrami buforu immunofluorescencyjnego. Następnie należy przygotować rozcieńczenie 1:200 przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem w pierwszorzędowym roztworze blokującym i inkubować szkiełka w roztworze przeciwciała drugorzędowego przez 40 do 60 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełka 400 mikrolitrami buforu immunofluorescencyjnego przez 20 minut, a następnie dwa przemycia PBS przez 10 minut każde.

Przeciw barwieniu jąder za pomocą PBS zawierającego 0,5 nanograma na mililitr barwienia jądrowego przez 5 do 6 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka trzykrotnie 400 mikrolitrami PBS, aby usunąć nadmiar plamy. Ostrożnie odpipetować cały PBS i upewnić się, że pozostał roztwór.

Następnie dodaj jedną kroplę odczynnika montażowego do każdej studzienki i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej. Na koniec zobrazuj szkiełka pod powiększeniem 40x lub 63x pod mikroskopem konfokalnym, biorąc optyczne przekroje Z o rozmiarze kroku 0,6 milimetra. Obrazy przedstawiają jądra komórek w acini barwione barwieniem jądrowym.

Konstrukcja 3D acini i obraz kontrastu fazowego acini MCF10A hodowanego na lrECM przez 20 dni są pokazane tutaj. Najbardziej środkowa sekcja pokazuje obecność pustego światła. PAF zaburza polaryzację i indukuje zmiany podobne do EMT w MCF10A piersi.

Komórki MCF10A hodowano w 3D na górnych kulturach w lrECM. Kultury traktowano PAF w dniach 0, 4, 8, 12 i 16. Hodowle utrzymywano przez 20 dni, a następnie wybarwiono immunologicznie pod kątem alfa6-integryny i barwienia jądrowego, GM130, markera polarności wierzchołkowej i wimentyny, markera EMT.

Najbardziej środkowy stos odpowiednich acini został pokazany tutaj. Reprezentatywne dane dotyczą 40-50 acini z trzech biologicznie niezależnych eksperymentów. Łóżko lrECM musi być wykonane ostrożnie, tak aby było równomiernie rozłożone bez pęcherzyków powietrza.

Ponadto zawiesinę komórkową należy równomiernie wymieszać i dodawać powoli, aby uniknąć zbrylania. Z kultur 3D można uzyskać białka i RNA, które można następnie wykorzystać do badania różnych szlaków molekularnych.