Izolacja warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych myszy z fluorescencyjnymi mitochondriami
September 13th, 2022
Artykuł opisuje metodę izolowania warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych z nerek transgenicznych myszy wykazujących ekspresję termolabilnego wirusa małp 40 i fotoaktywowalnych mitochondriów,PhAM wyciętych. Opisujemy procedurę izolacji kłębuszków nerkowych z całych nerek za pomocą kulek, etapów trawienia, wysiewu i hodowli GECs-CD31 dodatnich.
Unieśmiertelnione komórki śródbłonka kłębuszków nerkowych ze stabilnymi fluorescencyjnymi mitochondriami są doskonałym narzędziem do badania wpływu różnych bodźców na strukturę mitochondriów in vitro. Metoda opisana w niniejszym artykule pozwala uzyskać dużą liczbę komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych. Testując małe cząsteczki na GEC, mogliśmy przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku monoterapii w cukrzycowej chorobie nerek, w której GEC są dotknięte chorobą.
Opisana metoda jest łatwa do wykonania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Jednak ważne jest, aby postępować zgodnie z opisanymi krokami i wysterylizować sprzęt, aby uniknąć zanieczyszczenia. Na początek umieść materiały perfuzyjne i izolacyjne wymagane do wyizolowania komórek kłębuszków nerkowych w przestrzeni roboczej.
Przefiltruj świeżo przygotowany zrównoważony roztwór soli Hanksa lub HBSS za pomocą filtra 0,2 mikrona i trzymaj go pod maską, aby uniknąć zanieczyszczenia. Następnie wymieszaj 200 mikrolitrów kulek magnetycznych z 20 mililitrami HBSS. Rozgrzej RPMI za pomocą 10% FCS i pożywki do hodowli komórek śródbłonka w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie wstępnie pokryj dwie studzienki sześciodołkowej płytki dwoma mililitrami po 10 mikrogramów na mililitr kolagenu IV przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Umyj płytkę dwukrotnie PBS, aby usunąć kwas octowy użyty do rozcieńczenia kolagenu. Powlekane płytki należy zużyć natychmiast lub przechowywać je w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza przez okres do czterech tygodni.
Wyczyść narzędzia chirurgiczne i miejsce pracy 70% etanolem. Następnie sterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie przez 30 minut. Po otwarciu brzucha znieczulonej myszy włóż igłę motylkową do lewej komory.
Aby wstrzyknąć 100 mikrolitrów roztworu kulek w celu rozszerzenia krążenia krwi, ostrożnie przełam żyłę główną dolną poniżej nerek za pomocą igły o rozmiarze 19 i kontynuuj perfuzję roztworu kulek. Następnie delikatnie usuń tkankę tłuszczową pęsetą, wytnij obie nerki cienkimi nożyczkami chirurgicznymi C i połóż je na talerzu z jednym mililitrem HBSS na lodzie. Zmiel nerkę sterylnym skalpelem na jednomilimetrowe kawałki.
Inkubować zmieloną nerkę z jednym milimetrem świeżo przygotowanej kolagenazy typu II przez 35 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie przechylając na poziomym wytrząsarce. Po strawieniu dodaj cztery mililitry RPMI z 10% FBS, aby zneutralizować kolagenazę. Przefiltruj strawioną tkankę przez sterylne sitko do komórek o średnicy 100 mikronów do 50-mililitrowej probówki.
Użyj dna sterylnej 1,5-mililitrowej probówki, aby wymieszać strawioną tkankę z sitkiem, umożliwiając przejście kłębuszków nerkowych. Przepłucz sitko komórkowe 15 mililitrami HBSS. Następnie odwirować przepływ o stężeniu 200 XG przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Na tym etapie tuba składa się z trzech warstw. Górna warstwa zawiera mniejsze struktury, takie jak kanaliki, środkowa warstwa to koraliki z kłębuszkami nerkowymi, a dolna warstwa zawiera gruz. Ostrożnie zassać supernatant i górną białą warstwę.
Następnie ponownie zawieś granulkę zawierającą kulki zawierające kłębuszki nerkowe i zanieczyszczenia w 1,5 mililitra HBSS i przenieś ją do dwumililitrowej probówki. Umieścić probówkę w koncentratorze magnetycznym i odessać supernatant przed dwukrotnym umyciem kulek jednym mililitrem HBSS. Umieścić 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na szkiełku.
Następnie obserwuj szkiełko pod mikroskopem pod kątem obecności kłębuszków nerkowych. Następnie ponownie zawieś osad w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka i przenieś zawiesinę do dwumililitrowej probówki. Dodaj jeden mikrolitr interferonu gamma na każde trzy mililitry pożywki i umieść komórki na sześciodołkowej płytce do inkubacji w temperaturze 33 stopni Celsjusza.
Po trzech dniach hodowli ostrożnie zastąp jednomililitrową pożywkę świeżą pożywką. Na tym etapie komórki są niejednorodne z mieszaniną komórek kłębuszkowych. Po siedmiu dniach zastąp pożywkę dwoma mililitrami świeżej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka, uzupełnionej interferonem gamma, aby rozpocząć proliferację komórek.
Po 10 dniach, gdy komórki osiągną 80% zbieżności, należy je przepuścić za pomocą trypsyny i przenieść do kolby T-25 pokrytej kolagenem IV. Po 21 dniach hodowli przenieś komórki do kolby T-75. Dodaj trzy mililitry 0,25% trypsyny do kolby T-75 i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie zneutralizuj trypsynę trzema mililitrami śródbłonkowej pożywki wzrostowej i przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej probówki w celu odwirowania przy 200 XG przez pięć minut.
Odessać supernatant i przemyć komórki w jednym mililitrze PBS zawierającym 1% BSA, dwumilimolowy EDTA, 1% penicyliny/streptomycyny. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach kulek pokrytych przeciwciałem CD31 i 800 mikrolitrach PBS. Inkubuj komórki przez 45 minut, ciągle wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Następnie umieść probówkę w koncentratorze magnetycznym i przemyj komórki czterokrotnie PBS zawierającym BSA, EDTA i penicylinę/streptomycynę. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach śródbłonkowej pożywki wzrostowej, uzupełnionej interferonem gamma. Płytka 1,5 mililitra komórek na studzienkę w dołkach pokrytych kolagenem IV na sześciodołkowej płytce i hodowla w dopuszczalnych warunkach w temperaturze 33 stopni Celsjusza.
Po czterech dniach zastąp 750 mikrolitrów pożywki świeżą pożywką wzrostową śródbłonka, uzupełnioną interferonem gamma. Po 10 do 14 dniach hodowli, używając mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrem 488 nanometrów, obserwuj wzrost CD31 dodatnich komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych lub GEC, kolonii, które wyrażają fluorescencyjne mitochondria. Po 21 dniach lub gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 90%, przenieś je do kolby T-25.
Utrzymuj kulturę za pomocą pożywki wzrostowej RPMI zawierającej 10% FCS. Alternatywnie komórki mogą być kriokonserwowane. Pasaż komórek za pomocą trypsyny, jak wykazano wcześniej.
Następnie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach pożywki do zamrażania. Podwielokrotnić komórki w krioprobówkach i przechowywać je w ciekłym azocie o temperaturze pary. Protokół ten opisywał metodę izolacji komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych.
Z wyizolowanych kłębuszków nerkowych komórki zaczęły powoli rosnąć po trzech dniach hodowli. Po siedmiu dniach komórki wydawały się niejednorodne i wykazywały inne typy komórek kłębuszków nerkowych, takie jak podocyty, komórki okładzinowe, nabłonkowe i mezangialne. Po osiągnięciu 70 do 80% konfluencji, inne komórki kłębuszków nerkowych zostały usunięte przy użyciu pozytywnej selekcji komórek śródbłonka.
GEC MitoDendra2 wykazywały ekspresję CD31 i były ujemne dla markera podocytów, jak wykazano w barwieniu ujemnym synaptopodynami. Zbadano wpływ stężenia glukozy na strukturę mitochondriów. W porównaniu z wydłużonymi mitochondriami widocznymi w komórkach przy normalnym poziomie glukozy, wysoki poziom glukozy indukował fragmentację lub rozszczepienie mitochondriów, co obserwuje się w przypadku wybitnych mitochondriów w kształcie sferoidalnym.
Co więcej, 405-nanometrowy laser został wykorzystany do fotokonwersji wybranej subpopulacji mitochondriów w pojedynczym żywym GEC MitoDendra2. Pokazano udane fotoprzełączanie mitochondriów z zielonego na czerwony w wybranym obszarze dla komórek traktowanych z normalnym i wysokim stężeniem glukozy. To przełączanie pozwoliło na obserwację zdarzeń fuzji w GEC MitoDendra2.
Przy prawidłowym poziomie glukozy obserwowano żółtą, połączoną zieloną i czerwoną fluorescencję z powodu fuzji macierzy mitochondriów. Natomiast w GEC poddanych działaniu wysokiego poziomu glukozy mitochondria były głównie rozdrobnione. Umieszczenie komórek w jednym dołku na sześciodołkowej płytce z niewielką objętością pożywki wzrostowej jest niezbędne, aby komórki mogły przyczepić się do naczynia.
Wyizolowane komórki śródbłonka mogą być wykorzystane do przeprowadzenia badań funkcji mitochondriów i badań strukturalnych. Wykorzystanie unieśmiertelnionych komórek śródbłonka o cechach fluorescencyjnych mitochondriów utoruje drogę do odkrycia leków. Małe cząsteczki można testować na komórkach, a obrazowanie na żywo przeprowadza się w celu zbadania ich wpływu na funkcjonowanie mitochondriów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę izolowania warunkowo uwiecznionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych (GECs) od myszy transgenicznych, umożliwiającą badanie struktur mitochondriów w odpowiedzi na różne bodźce. Wykorzystując wysokie plony GECs, metoda służy jako podstawa do przesiewowych badań potencjalnych terapii przeciwko cukrzycowej chorobie nerek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Badania nad cukrzycową chorobą nerek
- Biologia komórek śródbłonkowych
Tło
- Uwiecznione GECs zapewniają model do badania funkcji nerek.
- Zastosowanie fluorescencyjnych mitochondriów pomaga w obserwowaniu zmian wewnątrzkomórkowych.
- Zrozumienie reakcji GECs na bodźce może informować o strategiach terapeutycznych.
Stosowane metody
- Procedury izolacji i hodowli komórek śródbłonka kłębuszków
- Transgeniczne myszy ekspresujące fluorescencyjne markery
- Zastosowanie kolagenu IV i magnesycznych perełek do selekcji komórek
Główne wyniki
- Sukcesywny protokół izolacji dający żywe GECs.
- Weryfikacja tożsamości komórek poprzez dodatni wynik CD31 i fluorescencja mitochondriów.
- Demonstracja zastosowania metody do przesiewowych badań leków w chorobie nerek.
Wnioski
- Badanie ilustruje prostą metodę uzyskania GECs od myszy.
- Wyniki są istotne dla zrozumienia funkcji śródbłonka i opracowania terapii chorób nerek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells (GECs) with fluorescent mitochondria provide a robust, scalable platform for dissecting mitochondrial dynamics in disease-relevant endothelial systems. This capability enables predictive interrogation of mitochondrial structure-function relationships under pathophysiological stimuli, directly supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in renal drug discovery. The approach enhances portfolio confidence by enabling high-content screening and live-cell imaging for candidate evaluation in diabetic kidney disease and related indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of mitochondrial dysfunction in GECs under disease-relevant conditions.
- Supports functional target validation by linking mitochondrial phenotypes to cellular responses.
- Facilitates predictive confidence in pathway selection for renal disease programs.
Screening & Assay Development
- Provides a renewable source of validated GECs for compound screening and phenotypic assays.
- Enables quantitative, live-cell imaging of mitochondrial fission, fusion, and distribution events.
- Supports assay standardization and reproducibility through stable fluorescent markers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mitochondrial phenotypes with disease-relevant cellular endpoints.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting functional studies of candidate molecules.
- Reduces translational risk by modeling key aspects of glomerular endothelial dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a platform for hypothesis testing, compound screening, and mechanistic studies in renal endothelial biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of mitochondrial dynamics and their impact on GEC function.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell systems for evaluating small molecule effects on mitochondrial structure.
- Analytics: Enables quantitative measurement of mitochondrial morphology and live imaging outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant mechanisms in glomerular pathophysiology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable cell platform for ongoing renal and mitochondrial research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial targets and reduces mechanistic ambiguity in renal disease models.
- Operational Value: Standardizes cell sourcing and imaging workflows, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of renal drug candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, disease-relevant cellular readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, transgenic mouse handling, and live-cell imaging.
- Needs access to fluorescence microscopy and cell culture infrastructure.
- Demands rigorous sterilization and workflow standardization to prevent contamination.
- Adaptation to other endothelial or disease models may require protocol optimization.
- Cell heterogeneity and selection steps must be carefully managed for assay consistency.
