Izolacja warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych myszy z fluorescencyjnymi mitochondriami

Unieśmiertelnione komórki śródbłonka kłębuszków nerkowych ze stabilnymi fluorescencyjnymi mitochondriami są doskonałym narzędziem do badania wpływu różnych bodźców na strukturę mitochondriów in vitro. Metoda opisana w niniejszym artykule pozwala uzyskać dużą liczbę komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych. Testując małe cząsteczki na GEC, mogliśmy przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku monoterapii w cukrzycowej chorobie nerek, w której GEC są dotknięte chorobą.

Opisana metoda jest łatwa do wykonania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Jednak ważne jest, aby postępować zgodnie z opisanymi krokami i wysterylizować sprzęt, aby uniknąć zanieczyszczenia. Na początek umieść materiały perfuzyjne i izolacyjne wymagane do wyizolowania komórek kłębuszków nerkowych w przestrzeni roboczej.

Przefiltruj świeżo przygotowany zrównoważony roztwór soli Hanksa lub HBSS za pomocą filtra 0,2 mikrona i trzymaj go pod maską, aby uniknąć zanieczyszczenia. Następnie wymieszaj 200 mikrolitrów kulek magnetycznych z 20 mililitrami HBSS. Rozgrzej RPMI za pomocą 10% FCS i pożywki do hodowli komórek śródbłonka w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie wstępnie pokryj dwie studzienki sześciodołkowej płytki dwoma mililitrami po 10 mikrogramów na mililitr kolagenu IV przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Umyj płytkę dwukrotnie PBS, aby usunąć kwas octowy użyty do rozcieńczenia kolagenu. Powlekane płytki należy zużyć natychmiast lub przechowywać je w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza przez okres do czterech tygodni.

Wyczyść narzędzia chirurgiczne i miejsce pracy 70% etanolem. Następnie sterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie przez 30 minut. Po otwarciu brzucha znieczulonej myszy włóż igłę motylkową do lewej komory.

Aby wstrzyknąć 100 mikrolitrów roztworu kulek w celu rozszerzenia krążenia krwi, ostrożnie przełam żyłę główną dolną poniżej nerek za pomocą igły o rozmiarze 19 i kontynuuj perfuzję roztworu kulek. Następnie delikatnie usuń tkankę tłuszczową pęsetą, wytnij obie nerki cienkimi nożyczkami chirurgicznymi C i połóż je na talerzu z jednym mililitrem HBSS na lodzie. Zmiel nerkę sterylnym skalpelem na jednomilimetrowe kawałki.

Inkubować zmieloną nerkę z jednym milimetrem świeżo przygotowanej kolagenazy typu II przez 35 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie przechylając na poziomym wytrząsarce. Po strawieniu dodaj cztery mililitry RPMI z 10% FBS, aby zneutralizować kolagenazę. Przefiltruj strawioną tkankę przez sterylne sitko do komórek o średnicy 100 mikronów do 50-mililitrowej probówki.

Użyj dna sterylnej 1,5-mililitrowej probówki, aby wymieszać strawioną tkankę z sitkiem, umożliwiając przejście kłębuszków nerkowych. Przepłucz sitko komórkowe 15 mililitrami HBSS. Następnie odwirować przepływ o stężeniu 200 XG przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Na tym etapie tuba składa się z trzech warstw. Górna warstwa zawiera mniejsze struktury, takie jak kanaliki, środkowa warstwa to koraliki z kłębuszkami nerkowymi, a dolna warstwa zawiera gruz. Ostrożnie zassać supernatant i górną białą warstwę.

Następnie ponownie zawieś granulkę zawierającą kulki zawierające kłębuszki nerkowe i zanieczyszczenia w 1,5 mililitra HBSS i przenieś ją do dwumililitrowej probówki. Umieścić probówkę w koncentratorze magnetycznym i odessać supernatant przed dwukrotnym umyciem kulek jednym mililitrem HBSS. Umieścić 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na szkiełku.

Następnie obserwuj szkiełko pod mikroskopem pod kątem obecności kłębuszków nerkowych. Następnie ponownie zawieś osad w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka i przenieś zawiesinę do dwumililitrowej probówki. Dodaj jeden mikrolitr interferonu gamma na każde trzy mililitry pożywki i umieść komórki na sześciodołkowej płytce do inkubacji w temperaturze 33 stopni Celsjusza.

Po trzech dniach hodowli ostrożnie zastąp jednomililitrową pożywkę świeżą pożywką. Na tym etapie komórki są niejednorodne z mieszaniną komórek kłębuszkowych. Po siedmiu dniach zastąp pożywkę dwoma mililitrami świeżej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka, uzupełnionej interferonem gamma, aby rozpocząć proliferację komórek.

Po 10 dniach, gdy komórki osiągną 80% zbieżności, należy je przepuścić za pomocą trypsyny i przenieść do kolby T-25 pokrytej kolagenem IV. Po 21 dniach hodowli przenieś komórki do kolby T-75. Dodaj trzy mililitry 0,25% trypsyny do kolby T-75 i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie zneutralizuj trypsynę trzema mililitrami śródbłonkowej pożywki wzrostowej i przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej probówki w celu odwirowania przy 200 XG przez pięć minut.

Odessać supernatant i przemyć komórki w jednym mililitrze PBS zawierającym 1% BSA, dwumilimolowy EDTA, 1% penicyliny/streptomycyny. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach kulek pokrytych przeciwciałem CD31 i 800 mikrolitrach PBS. Inkubuj komórki przez 45 minut, ciągle wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnie umieść probówkę w koncentratorze magnetycznym i przemyj komórki czterokrotnie PBS zawierającym BSA, EDTA i penicylinę/streptomycynę. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach śródbłonkowej pożywki wzrostowej, uzupełnionej interferonem gamma. Płytka 1,5 mililitra komórek na studzienkę w dołkach pokrytych kolagenem IV na sześciodołkowej płytce i hodowla w dopuszczalnych warunkach w temperaturze 33 stopni Celsjusza.

Po czterech dniach zastąp 750 mikrolitrów pożywki świeżą pożywką wzrostową śródbłonka, uzupełnioną interferonem gamma. Po 10 do 14 dniach hodowli, używając mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrem 488 nanometrów, obserwuj wzrost CD31 dodatnich komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych lub GEC, kolonii, które wyrażają fluorescencyjne mitochondria. Po 21 dniach lub gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 90%, przenieś je do kolby T-25.

Utrzymuj kulturę za pomocą pożywki wzrostowej RPMI zawierającej 10% FCS. Alternatywnie komórki mogą być kriokonserwowane. Pasaż komórek za pomocą trypsyny, jak wykazano wcześniej.

Następnie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach pożywki do zamrażania. Podwielokrotnić komórki w krioprobówkach i przechowywać je w ciekłym azocie o temperaturze pary. Protokół ten opisywał metodę izolacji komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych.

Z wyizolowanych kłębuszków nerkowych komórki zaczęły powoli rosnąć po trzech dniach hodowli. Po siedmiu dniach komórki wydawały się niejednorodne i wykazywały inne typy komórek kłębuszków nerkowych, takie jak podocyty, komórki okładzinowe, nabłonkowe i mezangialne. Po osiągnięciu 70 do 80% konfluencji, inne komórki kłębuszków nerkowych zostały usunięte przy użyciu pozytywnej selekcji komórek śródbłonka.

GEC MitoDendra2 wykazywały ekspresję CD31 i były ujemne dla markera podocytów, jak wykazano w barwieniu ujemnym synaptopodynami. Zbadano wpływ stężenia glukozy na strukturę mitochondriów. W porównaniu z wydłużonymi mitochondriami widocznymi w komórkach przy normalnym poziomie glukozy, wysoki poziom glukozy indukował fragmentację lub rozszczepienie mitochondriów, co obserwuje się w przypadku wybitnych mitochondriów w kształcie sferoidalnym.

Co więcej, 405-nanometrowy laser został wykorzystany do fotokonwersji wybranej subpopulacji mitochondriów w pojedynczym żywym GEC MitoDendra2. Pokazano udane fotoprzełączanie mitochondriów z zielonego na czerwony w wybranym obszarze dla komórek traktowanych z normalnym i wysokim stężeniem glukozy. To przełączanie pozwoliło na obserwację zdarzeń fuzji w GEC MitoDendra2.

Przy prawidłowym poziomie glukozy obserwowano żółtą, połączoną zieloną i czerwoną fluorescencję z powodu fuzji macierzy mitochondriów. Natomiast w GEC poddanych działaniu wysokiego poziomu glukozy mitochondria były głównie rozdrobnione. Umieszczenie komórek w jednym dołku na sześciodołkowej płytce z niewielką objętością pożywki wzrostowej jest niezbędne, aby komórki mogły przyczepić się do naczynia.

Wyizolowane komórki śródbłonka mogą być wykorzystane do przeprowadzenia badań funkcji mitochondriów i badań strukturalnych. Wykorzystanie unieśmiertelnionych komórek śródbłonka o cechach fluorescencyjnych mitochondriów utoruje drogę do odkrycia leków. Małe cząsteczki można testować na komórkach, a obrazowanie na żywo przeprowadza się w celu zbadania ich wpływu na funkcjonowanie mitochondriów.