Name: Destabilizacja przyśrodkowego łąkotki i chrząstki rys mysiego modelu przyspieszonej choroby zwyrodnieniowej stawów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj model przyspieszonej choroby zwyrodnieniowej stawów u myszy z uszkodzeniem chrząstki stawowej. Ta metoda umożliwia badanie formowania się osteofitów i bólu w krótkim czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować za pracę Gemmy Charlesworth i Mandie Prior z Uniwersytetu w Liverpoolu, które zdobyły obrazy μCT użyte w tej publikacji. Prace zostały sfinansowane przez Versus Arthritis (granty 20199 i 22483). Lynette Dunning została sfinansowana przez Versus Arthritis (grant 20199). Kendal McCulloch został sfinansowany ze stypendium doktoranckiego UWS. Carmen Huesa została sfinansowana przez Versus Arthritis (granty 20199 i 22483).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Panel Oceny Etyki Uniwersytetu w Glasgow i Uniwersytetu Zachodniej Szkocji, a następnie przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Ustawy o Zwierzętach (Procedury Naukowe) z 1986 roku (UK). Do niniejszego badania wykorzystano 10-tygodniowe samce myszy C57Bl6/J, ważące około 25 g. Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów).
1. Przygotowanie zwierząt
UWAGA: Rozważ płeć myszy w odniesieniu do celu badania, ponieważ modele pourazowej choroby OA wykazują istotne różnice w zależności od płci8,9,10.
<ol>
	<li>Upewnij się, że odczynnik znieczulający (2% izofluranu) jest gotowy. 
	UWAGA: Można również zastosować znieczulenie iniekcyjne11. Ze względu na krótki czas trwania zabiegu zaleca się stosowanie znieczulenia wziewnego.</li>
	<li>Do kontroli chirurgicznej należy użyć oddzielnej grupy operowanej pozorowanej, dopasowanej do wieku. 
	UWAGA: Kolano przeciwległe nie może być używane jako kontrola chirurgiczna (pozorowana operacja na przeciwległej nodze). Może to powodować problemy z dobrostanem zwierząt i prawdopodobnie wpłynie na chód i pomiary chodu. Kolano przeciwległe normalizuje wewnętrzne parametry kości12 i działa jako sparowane porównanie w testach bólu wywołanego13.</li>
	<li>Użyj dojrzałych szkieletowo myszy. 
	UWAGA: Większość literatury inwokuje chorobę zwyrodnieniową stawów w wieku 8-12 tygodni. W obecnym badaniu myszy mają 10 tygodni</li>.
</ol>
2. Opieka przedoperacyjna (prowadzona przez asystenta chirurgicznego)
<ol>
	<li>W przypadku transportu z innej placówki należy odczekać co najmniej 1 tydzień przed interwencją chirurgiczną, aby myszy przystosowały się do nowego środowiska.</li>
	<li>Przeprowadzaj operację w odpowiednio wyznaczonym sterylnym pomieszczeniu, upewniając się, że wszystkie powierzchnie są sterylne (np. użyj sterylnych serwetek do zakrycia obszarów operacji). 
	UWAGA: Zabieg jest aseptyczny.</li>
	<li>Ułóż i umieść sterylne narzędzia na sterylnych serwetach.</li>
	<li>Zważ mysz.</li>
	<li>Wywołać znieczulenie, wprowadzając mysz do klatki znieczulającej, a następnie wprowadzając 2% izofluoranu przez okres do 15 minut przy użyciu standardowego sprzętu do znieczulania (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Klatka nie może mieć "resztkowego" znieczulenia przed wprowadzeniem myszy.</li>
	<li>Po znieczuleniu wyjmij mysz z komory anestezjologicznej i przypnij futro nad kolanem, przednią i boczną stroną od połowy goleni do połowy uda za pomocą małych maszynek do strzyżenia włosów. 
	UWAGA: Wybór kolana kończyny tylnej zależy od preferencji operatora, po której stronie łatwiej jest przeprowadzić operację. Protokół ten operował lewą nogę.</li>
	<li>Upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona (nie reaguje na szczypanie stopy).</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę, nakładając antybakteryjny środek do mycia skóry (np. zawierający chlorheksydynę lub jodofor, patrz Tabela materiałów) na ogoloną, odsłoniętą skórę.</li>
	<li>W przypadku analgezji należy podawać podskórnie 0,05 mg/kg buprenorfiny.</li>
	<li>Umieść mysz po stronie grzbietowej, pozostawiając kolano do operacji do góry, a nos myszy umieść w dyszy podłączonej do zestawu do znieczulenia.</li>
	<li>Przykryj mysz sterylną serwetą z małym otworem w kształcie dziurki od klucza.</li>
	<li>Ustaw nogę przeznaczoną do operacji z kolanem zgiętym pod kątem mniejszym niż 90°, z więzadłem rzepki skierowanym do góry i stopą unieruchomioną taśmą chirurgiczną.</li>
</ol>
3. Destabilizacja zabiegu łąkotki przyśrodkowej, a następnie zadrapanie chrząstki
<ol>
	<li>Dostosuj mikroskop, aby ustawić ostrość na więzadle rzepki.</li>
	<li>Ściśnij skórę kolana po bocznej stronie ząbkowanymi kleszczami (patrz Tabela materiałów), wykonaj małe nacięcie równolegle do dystalnego ścięgna rzepki za pomocą nożyczek chirurgicznych, wprowadź nożyczki i rozszerz nacięcie do około 1 cm. Przesuń skórę na stronę przyśrodkową, odsłaniając więzadło rzepki i bliższy płaskowyż piszczelowy (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Za pomocą ostrza z numerem 11 wykonaj nacięcie wzdłuż przyśrodkowej strony więzadła rzepki, od góry do dołu więzadła (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Po dotarciu do dolnej części więzadła rzepki obróć ostrze o 90° i przedłuż nacięcie od więzadła rzepki w kierunku przyśrodkowym, aby uzyskać dostęp do torebki stawowej. 
	UWAGA: W tym lub kolejnych krokach może wystąpić krwawienie. Jeśli wystąpi krwawienie, użyj sterylnego wacika i uciskaj przez kilka sekund (5 do 30 s).</li>
	<li>Ściśnij więzadło rzepki kleszczami i obróć nadgarstek, aby przesunąć więzadło rzepki na boczną stronę, na tyle, aby odsłonić podrzepkową poduszkę tłuszczową (IFP). 
	UWAGA: Aby zminimalizować uszkodzenie więzadła rzepki, nie trzymaj pęsety zbyt mocno, tylko na tyle, aby więzadło było z boku.</li>
	<li>Trzymając lekko więzadło rzepki, ściśnij IFP mikropęsetą (patrz Tabela materiałów), aby ją podnieść i lekko przesunąć do góry. Pozwala to na uwidocznienie więzadła łąkotki przyśrodkowej.</li>
	<li>Zidentyfikuj więzadło oponowo-piszczelowe przyśrodkowe (MMTL) łąkotki przyśrodkowej, które zakotwicza róg czaszkowy łąkotki przyśrodkowej do przedniego plateau piszczelowego (ryc. 1B).</li>
	<li>Unikaj uszkodzeń i długotrwałego odsłonięcia chrząstki na płaskowyżu piszczelowym lub kłykciu kości udowej.</li>
	<li>Ostrożnie odetnij MMTL małymi nożyczkami sprężynowymi Vannas o średnicy 2 mm, pozostawiając nienaruszoną łąkotkę przyśrodkową i inne więzadła. W tym momencie zabieg chirurgiczny dla modelu DMM jest zakończony (ryc. 1C).</li>
	<li>Za pomocą noża mikrochirurgicznego o średnicy 3 mm zaznacz trzy równomiernie rozmieszczone wgłębienia na chrząstce stawowej piszczelowej w kierunku od tylnej do przedniej części. 
	UWAGA: Nacięcia mają około 1 mm długości i uszkadzają tylko powierzchnię chrząstki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).
	<ol>
		<li>Nie używaj nadmiernej siły z ostrzem na chrząstce (tj. upewnij się, że zadrapania są powierzchowne). Ten dodatkowy krok powoduje uszkodzenie chrząstki, indukując model DCS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknij skórę dwoma lub trzema małymi metalowymi klipsami do zamykania ran o średnicy 7 mm lub wchłanialnymi podskórnymi szwami chirurgicznymi 6-0 (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Podskórne szwy chirurgiczne są lepsze, ponieważ pozwalają uniknąć dalszej interwencji, ale wydłużają czas trwania operacji. Szwy zewnętrzne zwiększają ryzyko otwarcia rany przez gryzienie myszy.</li>
	<li>Zidentyfikuj więzadło łąkotki przyśrodkowej łąkotki przyśrodkowej do operacji pozorowanej, ale nie przecinaj.</li>
	<li>W przypadku myszy otrzymujących tylko zadrapania chrząstki, wykonaj trzy powierzchowne zadrapania bez przecinania więzadła. 
	UWAGA: Pomiędzy każdą myszą zmieniaj rękawiczki i sterylizuj narzędzia w autoklawie. Pamiętaj, aby sprawdzić, czy instrumenty ostygły przed ponownym użyciem.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Jeśli wystąpiło krwawienie (>50 μl), wstrzyknąć podskórnie (na grzbiet myszy) 500 μl ciepłej, sterylnej soli fizjologicznej). 
	UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że chociaż myszy mają niewielkie krwawienia, nigdy nie jest to więcej niż mała kropla, a zatem płyny nie muszą być uzupełniane.</li>
	<li>Po operacji umieść mysz w klatce regeneracyjnej na czystej papierowej chusteczce i pozwól na powrót do zdrowia po znieczuleniu (5-10 min).</li>
	<li>Po operacji przenieś w pełni przytomne myszy do czystej klatki ze świeżą ściółką.</li>
	<li>W ciągu 72 godzin po interwencji chirurgicznej należy obserwować, czy nie ma żadnych oznak bólu lub niepokoju. Zwróć uwagę na:
	<ol>
		<li>Zmiany masy ciała. Chociaż masa ciała może się zmniejszyć w pierwszym i drugim dniu, zwykle nie jest to więcej niż 5% masy ciała sprzed operacji.</li>
		<li>Ogólny brak pielęgnacji lub nadmierna pielęgnacja wokół nacięcia.</li>
		<li>Oznaki ogólnego pogorszenia stanu zdrowia, takie jak zgarbiona postawa, grymas twarzy i/lub nieprawidłowy oddech.</li>
		<li>Zakażenie rany sygnalizowane obrzękiem, upławą lub otwarciem rany. 
		UWAGA: Zakażenie może wystąpić, jeśli rana pooperacyjna się otworzy. Ponieważ chirurgiczne gojenie ran (np. wymiana brakujących metalowych klipsów lub ponowne szycie) jest procedurą regulowaną, przed wykonaniem naprawy należy uzyskać odpowiednią zgodę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń metalowe klipsy między 5-7 dniem po zabiegu.</li>
	<li>Utrzymuj myszy zazwyczaj 2-52 tygodnie po operacji, w zależności od projektu badania.</li>
	<li>Oceń ból/chód w dowolnym momencie badania. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano dynamiczne przenoszenie ciężaru, jak opisano w kroku 5.1.</li>
	<li>Poddać zwierzę eutanazji zatwierdzoną metodą, zgodnie z krajowymi umowami licencyjnymi, lokalnymi wytycznymi i zatwierdzeniem eksperymentalnym. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu zwierzęta zostały poddane eutanazji poprzez wykrwawienie (nakłucie serca) w znieczuleniu końcowym, a następnie zwichnięcie szyjki macicy14.</li>
</ol>
5. Ocena choroby zwyrodnieniowej stawów
<ol>
	<li>Zmierz dynamiczne przenoszenie ciężaru jako zastępczy pomiar bólu, wykonując poniższe czynności. 
	UWAGA: Ponieważ myszy są zwierzętami drapieżnymi, mają tendencję do ukrywania zachowań bólowych. To sprawia, że pomiar bólu jest trudny. Istnieje wiele sposobów mierzenia bólu wywołanego, takich jak Von Frey15 i analiza chodu16. W niniejszym badaniu mierzono obciążenie różnicowe między operowaną nogą z chorobą zwyrodnieniową stawów a nieoperowaną nogą kontrolną na macie uciskowej, podczas gdy mysz znajdowała się w klatce (patrz Tabela materiałów, <silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).
	<ol>
		<li>Zważ mysz. Wytaruj i skalibruj matę dociskową zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Dynamiczne urządzenia nośne w Tabeli materiałów). Wprowadź mysz do klatki.</li>
		<li>Rejestruj ruch i nacisk łapy myszy w klatce przez 5 minut. Analizuj uzyskane dane, aby sprawdzić poprawność przez 1 minutę, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Automatyczna analiza producenta w oprogramowaniu DWB (patrz dynamiczne urządzenia do przenoszenia ciężaru w Tabeli materiałów) zapewnia pomiary każdej łapy proporcjonalnie do całkowitej masy ciała, zatwierdzony czas, w którym każda łapa pozostawała na macie, oraz oszacowanie powierzchni maty zajmowanej przez każdą łapę. Pozwala to na obliczenie obciążenia różnicowego między dwiema tylnymi łapami, obciążenia różnicowego między przednimi i tylnymi łapami, zwiększenia obciążenia przedniej łapy (jeśli ta sama mysz była mierzona przez pewien okres czasu), czasu spędzonego na podnoszeniu nogi OA w porównaniu z nogą przeciwległą i powierzchnią łapy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowe określenie zwapniałej tkanki za pomocą tomografii mikrokomputerowej (μCT). 
	UWAGA: Chociaż podchrzęstną osteosklerozę kości i tworzenie osteofitów można mierzyć w sekcjach histologicznych, μCT oferuje możliwość trójwymiarowego określenia ilościowego. Rozdzielczość przechwytywania obrazu w μCT przy 5 μm jest wystarczająca, ponieważ pozwala to na wizualizację mniejszych struktur, takich jak osteofity, chociaż im wyższa rozdzielczość, tym lepiej.
	<ol>
		<li>Utrwalić stawy kolanowe w 4% roztworze paraformaldehydu przez 24 godziny, a następnie przenieść do 70% EtOH.</li>
		<li>Skanowanie stawów kolanowych w skanerze μCT. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu próbki skanowano na skanerze μCT (patrz tabela materiałów) z filtrem aluminiowym 0,5 ustawionym na napięcie 50 kV i 200 μA. Próbki badano przy wielkości woksela 4,5 μm; Kąt obrotu 2 μm, 0,2° do obrazowania i kąt obrotu 0,5° do oznaczania ilościowego.</li>
		<li>Rekonstruuj skany, aby umożliwić wizualizację 3D. Prezentowane tu skany zostały zrekonstruowane przy użyciu kompatybilnego oprogramowania (patrz Spis materiałów).</li>
		<li>Przeanalizuj stwardnienie podchrzęstne kości (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B) wykonując poniższe czynności.
		<ol>
			<li>Wybierz objętość zainteresowania (VOI) 0,5 mm × 0,9 mm × 0,9 mm w środku obciążenia przyśrodkowej płaskowyżu piszczelowego17.</li>
			<li>Normalizuj w stosunku do wewnętrznego fenotypu kości myszy, analizując nieoperowaną nogę.</li>
			<li>Określ gęstość kości podchrzęstnej i mikroarchitekturę, wybierając obszar zainteresowania (ROI) wyznaczający strukturę beleczkową w nasadzie piszczelowej, płytce podchrzęstnej lub całej kości podchrzęstnej w dwuwymiarowym widoku koronalnym stosu za pomocą oprogramowania CTan (patrz tabela materiałów). 
			UWAGA: W miarę postępu choroby oddzielenie płytki podchrzęstnej od obszaru beleczkowego podchrzęstnego staje się trudniejsze do odróżnienia. Zaleca się wówczas analizę obszaru kości podchrzęstnej wybranego od przestrzeni stawowej do płytki wzrostowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Określ ilościowo osteofity (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C), wykonując poniższe czynności.
		<ol>
			<li>Identyfikacja osteofitów w zrekonstruowanych stosach obrazów trójwymiarowych za pomocą oprogramowania CTvol (patrz tabela materiałów). 
			UWAGA: Zmineralizowane osteofity to wypukłości podobne do tkanej kości widoczne po przyśrodkowej stronie kości podchrzęstnej18. Ich przykład jest oznaczony żółtymi strzałkami w Rysunek 2C.</li>
			<li>Ręcznie policz liczbę zidentyfikowanych osteofitów w przyśrodkowej stronie stawu kolanowego.</li>
			<li>Zmierz objętość osteofitów w sekwencyjnej analizie obrazu 2D (przy użyciu analizatora CT), ręcznie wyznaczając krawędź osteofitów, wystającą z płytki podchrzęstnej jako obszar zainteresowania (ROI) do analizy.</li>
			<li>Oblicz gęstość kości osteofitu jako stosunek objętości kości do objętości osteofitu za pomocą oprogramowania analizatora CT (patrz tabela materiałów).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń uszkodzenie chrząstki i zapalenie błony maziowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D) zgodnie z wynikiem uszkodzenia chrząstki OARSI 19 i wynikiem zapalenia błony maziowej20 na odcinkach 6 μm zatopionych w parafinie.
	<ol>
		<li>Po skanowaniu odwapnić stawy kolanowe w 10% EDTA w temperaturze 4 °C przez minimum 2 tygodnie, zmieniając roztwór dwa razy w tygodniu.</li>
		<li>Zanurz próbki w parafinie. Informacje na temat poddanych zabiegom i okresów inkubacji znajdują się w pliku uzupełniającym 1.</li>
		<li>Wyciąć 5 μm przekroje koronalne próbek zatopionych w parafinie na obrotowym mikrotomie (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Wybierz sekcje w obszarze, w którym spotykają się kłykcie piszczelowe i udowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Wybierz dwie sekcje w trzech jednakowo oddalonych obszarach połączenia. 
		UWAGA: Przekroje ocenione w niniejszym badaniu zostały wybrane w obszarach oddalonych od siebie o 80-100 μm.</li>
		<li>Skrawki bejcowania za pomocą Safranin-O i Fast green (patrz Tabela materiałów), postępując zgodnie z poniższymi krokami.
		<ol>
			<li>Odparafinować odcinki zanurzając je (we wspomnianej kolejności) w ksylenie na 5 min (2x), 100% etanolu na 2 min, 95% etanolu na 2 min, 80% etanolu na 2 min i 70% etanolu na 2 min.</li>
			<li>Barwienie przefiltrowaną hematoksyliną (patrz tabela materiałów) przez 30 s. Następnie płucz w wodzie z kranu przez 5 minut (trzy razy).</li>
			<li>Myć buforem Scotta (2 g wodorowęglanu sodu i 10 g siarczanu magnezu w 1 l wody destylowanej) przez 2 minuty. Płukać w "wodzie z kranu" przez 5 minut (trzy razy).</li>
			<li>Plamić przez 4 minuty 0,2% Fast Green. Zanurz się w 1% lodowatym kwasie octowym pięć razy (świeżo przygotowany podczas każdej sesji). Szybko spłucz w wodzie z kranu.</li>
			<li>Barwieć przez 5 minut 0,5% Safraniną-O. Spłucz w 95% etanolu. Odwadniaj skrawki w 100% etanolu przez 3 minuty, a następnie 3 minuty w ksylenie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sekcje punktacji zgodnie z Glassonem i wsp. dla chrząstki19 i Jackson et al. dla synovitis20. 
		UWAGA: Istnieją inne metody kwantyfikacji, takie jak kwantyfikacja komputerowa autorstwa Pinamont et al.21.</li>
		<li>Zweryfikuj system punktacji z dwoma różnymi punktatorami, ślepymi na eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Arthritis Research UK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+State+of+Musculoskeletal+Health+2018%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+UK%22%5BJournal%5D)">The State of Musculoskeletal Health 2018.</a> Arthritis Research UK. , (2018).</li>
<li>Mahir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+knee+osteoarthritis+on+the+quality+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Physical+and+Rehabilitation+Medicine%22%5BJournal%5D)">Impact of knee osteoarthritis on the quality of life.</a> Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159(2016).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%3A+toward+a+comprehensive+understanding+of+pathological+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.</a> Bone Research. 5, 16044(2016).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>Sophocleous, A., Huesa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+mouse+model+of+destabilization+of+the+medial+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus.</a> Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).</li>
<li>McCulloch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+post+traumatic+osteoarthritis+in+a+dual+injury+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).</li>
<li>Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro%2C+micro%2C+and+molecular+changes+of+the+osteochondral+interface+in+osteoarthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654(2021).</li>
<li>Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+joint+degeneration+and+pain+in+male+and+female+mice+in+DMM+model+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).</li>
<li>Loga, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+pain+at+an+earlier+stage+of+chondropathy+protect+female+mice+against+structural+progression+after+surgically+induced+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis.</a> Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).</li>
<li>Ma, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+severity+is+sex+dependent+in+a+surgical+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).</li>
<li>Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+protocols+in+laboratory+animals+used+for+scientific+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomedica%22%5BJournal%5D)">Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes.</a> Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).</li>
<li>Huesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase-activated+receptor+2+modulates+OA-related+pain%2C+cartilage+and+bone+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).</li>
<li>Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pros+and+cons+of+clinically+relevant+methods+to+assess+pain+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).</li>
<li>Stewart, K., Schroeder, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+animal+research.+blood+withdrawal+I%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Lab animal research. blood withdrawal I.</a> JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
<li>Lakes, E. H., Allen, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gait+analysis+methods+for+rodent+models+of+arthritic+disorders%3A+reviews+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).</li>
<li>Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+automated+imaging+of+mouse+articular+cartilage+by+microCT+for+early+detection+of+osteoarthritis+and+finite+element+modelling+of+joint+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).</li>
<li>vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteophytes%3A+relevance+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteophytes: relevance and biology.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (3), 237-244 (2007).</li>
<li>Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OARSI+histopathology+initiative+-+recommendations+for+histological+assessments+of+osteoarthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 18, SUPPL 3 17-23 (2010).</li>
<li>Jackson, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+protease-activated+receptor+2+but+not+protease-activated+receptor+1+may+confer+protection+against+osteoarthritis+in+mice+through+extracartilaginous+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms.</a> Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).</li>
<li>Pinamont, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+histomorphometric+evaluation+of+osteoarthritis+in+a+surgical+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e60991(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby przeprowadzić chirurgiczną indukcję pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów (PTOA), zdecydowanie zaleca się wsparcie asystenta (np. w celu przygotowania myszy, podczas gdy operator skupia się na operacji). Ułatwia to chirurgię aseptyczną, zmniejszając w ten sposób ryzyko infekcji i zwiększając skuteczność interwencji w dużych eksperymentach. Podczas operacji łatwo jest stracić płaszczyznę ostrości, dlatego mikroskop z pedałami do ustawiania ostrości jest cenną funkcją pomagającą utrzymać sterylność przez cały czas trwania operacji. Pozycja myszy i kolana ma kluczowe znaczenie. Kolano musi być skierowane do góry i wystarczająco zgięte, aby zmaksymalizować otwarcie przestrzeni stawu kolanowego, ułatwiając łatwiejszy dostęp do więzadła w celu wprowadzenia mikroostrza w celu zarysowania powierzchni kłykcia. Identyfikacja MMTL może być trudna, zwłaszcza gdy poduszeczka tłuszczowa jest większa niż zwykle lub występuje niewielkie krwawienie. Aby uniknąć krwawień, popchnij poduszeczkę tłuszczową do góry, aby zapobiec rozdarciom i późniejszemu krwawieniu. Jeśli poduszeczka tłuszczowa jest duża, może to potrwać trochę dłużej, ale cierpliwie kontynuuj popychanie jej do góry.
MMTL znajduje się dość blisko kłykcia piszczelowego, dlatego należy uważać, aby nie uszkodzić chrząstki podczas umieszczania dolnego ostrza zakrzywionych nożyczek sprężynowych pod MMTL. Zakrzywione ostrza powinny być skierowane w stronę przyśrodkową i lekko do góry, równolegle do kłykcia. Aby uzyskać najlepsze przekroje MMTL, upewnij się, że nożyczki są ostre. Sprawdź, czy łąkotka może poruszać się przyśrodkowo po przecięciu więzadła, ponieważ czasami pozostaje mały nasad, który wymaga dalszego cięcia. Podczas wprowadzania mikroostrza do zarysowania kłykcia, musi ono być prostopadłe do kłykcia. Pierwsze zadrapanie należy wykonać bliżej środka stawu, ale należy uważać, aby nie uszkodzić więzadła krzyżowego przedniego. Następnie przejdź w stronę przyśrodkową, a następnie za łąkotkę. Zadrapania mogą być widoczne jako słabe białe linie na chrząstce. Ponieważ najczęściej używamy klipsów, początkowe nacięcie wykonuje się po stronie bocznej, a więc klipsy umieszcza się z boku nogi po zamknięciu rany. Dzięki temu klipsy nie ocierają się o kolano, gdy mysz odzyskuje ruch. W przypadku stosowania szwów zdecydowanie zaleca się stosowanie szwów podskórnych. Jeśli używasz szwów zewnętrznych, myszy prawdopodobnie gryzą szwy i otwierają ranę, co zwiększa ryzyko infekcji. Prawidłowo wykonana operacja nie może trwać dłużej niż 5-10 minut, od nacięcia do zamknięcia rany, minimalizując w ten sposób odsłonięcie chrząstki i wszelkie dodatkowe niekontrolowane uszkodzenia, które mogą wystąpić. Po operacji myszy bardzo szybko wracają do zdrowia i niemal natychmiast mogą wejść do klatki i normalnie się poruszać. Jeśli myszy nie są aktywne, należy skonsultować się z odpowiednim ekspertem w jednostce.
W celu behawioralnej oceny bólu oceniono dynamiczne przenoszenie ciężaru. Jednak ta metoda może być uważana za mniej czułą niż inne testy bólu wywołanego, takie jak test von Freya15. Zaleca się stosowanie więcej niż jednej metody monitorowania i oceny bólu. Zmiany obserwowane 2 tygodnie po interwencji w DCS, mimo że przemijające, wskazują na ogólnie zmniejszone obciążenie nogi zwyrodnieniowej stawów w porównaniu z nogą zdrową. Dlatego 2 tygodnie po interwencji DCS można wykorzystać do oceny wczesnej choroby zwyrodnieniowej stawów lub bólu urazu w modelach mysich. Wizualizacja zmineralizowanych osteofitów za pomocą μCT pozwala na trójwymiarową kwantyfikację, którą można również dopasować do sekcji histologicznych12, dodając kolejny wymiar do badania powstawania i ewolucji osteofitów. W naszej grupie obecność osteofitów była zmienna w modelu DMM między operatorami i w ich obrębie (2,3 ± 1 vs. 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), podczas gdy indukcja DCS zdecydowanie prowadziła do wytwarzania osteofitów we wszystkich przypadkach niezależnie od operatora (2,6 ± 0,7 vs. 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Ponadto w modelu DCS jest znacznie więcej i większych osteofitów w porównaniu z DMM. Tym samym DCS jest idealnym modelem do badania powstawania osteofitów. Kwantyfikacja osteosklerozy ograniczona do obszaru obciążenia kości podchrzęstnej jest również poprawą w wykrywaniu niewielkich zmian. Porównanie przedziału przyśrodkowego operowanej nogi z nogą przeciwległą oferuje również sposób na normalizację w stosunku do wewnętrznego fenotypu kości tej konkretnej myszy12. Dodanie zadrapań chrząstki w modelu DCS jest kontrolowanym sposobem wywoływania skoncentrowanego uszkodzenia chrząstki podczas operacji, co przyspiesza wiele aspektów choroby. Jedną z konsekwencji procedury eksperymentalnej obejmującej celowe uszkodzenie samej chrząstki jest to, że to sztuczne uszkodzenie musi zostać wykluczone lub skorygowane w systemie klasyfikacji chrząstki. Ze względu na to ograniczenie nie zalecamy stosowania tego modelu, jeśli głównym celem badania jest zrozumienie wpływu choroby zwyrodnieniowej stawów na samą chrząstkę. Wreszcie, zdecydowanie zaleca się również, aby co najmniej dwóch zaślepionych strzelców oceniło uszkodzenia chrząstki i wyniki zapalenia błony maziowej. Potwierdza to i wzmacnia standaryzację systemów punktacji.
Ograniczeniem tego badania jest to, że zakres zmienności wszystkich parametrów porównujących modele DCS i DMM nie został w pełni oceniony. Problem ten zostanie rozwiązany w przyszłości w ramach bardziej obszernych badań, które mogłyby również obejmować ocenę zmienności między operatorami z różnych instytucji.
Podsumowując, przyspieszona patogeneza choroby zwyrodnieniowej stawów w obecnym modelu DCS pozwala na odwzorowanie pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów i stanowi potężne i solidne narzędzie badawcze do zbadania i wyjaśnienia mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw tej przewlekłej, wyniszczającej choroby stawów. Dodatkowo umożliwia badanie choroby zwyrodnieniowej stawów w krótszym czasie, koncentrując się na osteofitogenezie, bólu zwyrodnieniowym stawów i wpływie uszkodzenia chrząstki na cały staw.

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą układu mięśniowo-szkieletowego u osób powyżej 45 roku życia, z ponad 8,75 milionami szukających leczenia w Wielkiej Brytanii1. Rosnące rozpowszechnienie choroby doprowadziło do wzrostu kosztów ekonomicznych i społecznych, jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do niepełnosprawności i obniża jakość życia pacjentów1. Ze względu na brak dostępnych metod leczenia istnieje pilna potrzeba przyspieszenia badań, aby zrozumieć rozwój i postęp choroby. Choroba jest złożona, a także ma charakter wieloczynnikowy. Głównymi pomiarami klinicznymi choroby są ból i ruchomość stawów2, a choroba zwyrodnieniowa stawów dotyczy wszystkich tkanek w stawie, nie tylko chrząstki3. Jednym z głównych wyzwań związanych ze zrozumieniem choroby zwyrodnieniowej stawów jest to, że od początkowej prezentacji/urazu do objawowej progresji choroby z bólem i unieruchomieniem mogą minąć lata, a czasem dekady. 
Modelowanie choroby zwyrodnieniowej stawów u gryzoni poszerzyło naszą wiedzę na temat patofizjologii choroby zwyrodnieniowej stawów, pozwalając nam zrozumieć inicjację i progresję w znacznie krótszym czasie i dzięki szczegółowemu badaniu zaangażowanych tkanek. Istnieje wiele mysich modeli choroby zwyrodnieniowej stawów, od genetycznie modyfikowanych zwierząt po modele interwencji chirurgicznej. Najpowszechniej stosowanym mysim modelem pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów jest destabilizacja łąkotki przyśrodkowej (DMM)4,5. Zastrzeżeniem modelu jest zmienność między różnymi operatorami. Doświadczeni chirurdzy mogą wykonać zabieg przy minimalnym uszkodzeniu stawu, podczas gdy niedoświadczeni operatorzy odsłaniają torebkę stawową przez dłuższy czas i powodują uszkodzenia chrząstki. Ta zmienność procesu wpływa na nasilenie modelu, przy czym więcej początkowych uszkodzeń prowadzi do zwiększenia oceny uszkodzenia chrząstki i tworzenia osteofitów. Mając na celu zmniejszenie zmienności między operatorami i naśladowanie uszkodzeń chrząstki spowodowanych interwencją kliniczną, opracowano zmodyfikowaną wersję tego modelu, w której zadawane są kontrolowane dodatkowe uszkodzenia powierzchni chrząstki w postaci trzech powierzchownych zadrapań6. Pozwala to również na modelowanie progresji choroby zwyrodnieniowej stawów wynikającej z uszkodzenia chrząstki spowodowanego niektórymi interwencjami klinicznymi. W porównaniu ze standardowym modelem DMM, bezpośrednio wywołane uszkodzenie chrząstki powoduje konsekwentnie przyspieszone tworzenie wystających osteofitów, zwiększone uszkodzenie chrząstki i stan zapalny oraz mierzalny ból zastępczy u samców myszy. 
Ten model jest szczególnie odpowiedni do badania wczesnego stadium pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów, skupiając się na tworzeniu osteofitów, prezentacji bólu (u samców myszy), zapaleniu błony maziowej i wczesnych zmianach parametrów kostnych. Spójność tworzenia osteofitów w tym modelu sprawia, że istotne jest badanie naprawy kości i kostnienia śródchrzęstnego, ponieważ tworzenie osteofitów jest procesem naprawy poprzez kostnienie śródchrzęstne7. Model naśladuje również uszkodzenia wprowadzane bezpośrednio do chrząstki podczas interwencji klinicznych, takich jak artroskopowe zabiegi chirurgiczne, a zatem nadaje się również do badania wpływu uszkodzenia chrząstki na cały staw.

<table><tbody><tr><td>#11 Ostrze skalpela (i rękojeść skalpela).</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>500240</td><td>uzyskują dostęp do torebki stawowej</td></tr><tr><td>15&deg; Kąt cięcia Nóż mikrochirurgiczny</td><td>MSP</td><td>REF7503</td><td>zarysować chrząstkę</td></tr><tr><td>6-0 vicryl rapide</td><td>Dowolny dostawca materiałów medycznych</td> <td>-</td> <td>alternatywna metoda zamykania rany</td></tr><tr><td>Zestaw anestezjologiczny</td><td>Ogólny (wielu różnych dostawców) -</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Antybakteryjny nakładacz do skóry (hibiskub)</td> <td>Amazonka</td> <td>-</td> <td>Do sterylizacji chirurgicznego obszaru skóry</td></tr><tr><td>Aplikator do klipsów 7 mm</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>500343</td><td>zamknięcia rany</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Generic (wielu różnych dostawców)</td><td>-</td><td>Do ważenia myszy</td></tr><tr><td>zakrzywione kleszcze</td><td>Precyzyjne narzędzia naukowe</td><td>500232</td><td>przesunięcia więzadła rzepki na bok</td></tr><tr><td>Buprenorfina (wetergeza)</td><td>Dostarczana przez jednostkę, ponieważ jest to lek na receptę</td> <td>-</td> <td>Analgezja</td></tr><tr><td>Analizator CT</td><td>Bruker</td><td>3d. Oprogramowanie SUITE</td><td>Ctvol</td></tr><tr><td></td><td>Bruker</td><td>3D. Oprogramowanie SUITE</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Przeglądarka danych</td><td>Bruker</td><td>3D. Oprogramowanie SUITE</td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Dynamiczny sprzęt do przenoszenia ciężarów</td><td>Bioseb</td><td>BIO-DWB-DUAL</td><td>Mierzy obciążenie kończyn i posiada klatkę, matę ciśnieniową i oprogramowanie do analizy</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E9884</td><td>10% roztwór w PBS (lub wodzie) do odwapnienia kości pH 7,4</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Generic (wielu różnych dostawców)</td> <td>-</td> <td>do osadzania odwapnionych kości</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Merck</td><td>F7252</td><td>Do barwienia sekcji</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Merck</td><td>1005706</td><td>Do barwienia przekrojów</td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny</td><td>Merck</td><td>GHS132</td><td>Barwienie jądrowe w sekcjach parafinowych.</td></tr><tr><td>Mikro-pęseta Hoskins #21.</td><td>Cameron chirurgiczny ograniczony</td><td>PHF1085</td><td>przesunąć poduszkę</td></tr><tr><td>tłuszczową Izofluoran</td><td>Dostarczany przez jednostkę, ponieważ jest to lek na receptę-Myszy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Charles</td><td></td> <td>river-C57Bl6/J samiec w wieku 8 tygodni (aby umożliwić aklimatyzację w jednostce)</td></tr><tr><td>Skaner tomografii mikrokomputerowej</td><td>Bruker</td><td>SKYSCAN 1272 CMOS</td><td>&micro; </td></tr><tr><td>Taśma papierowa chirurgiczna CT Micropore</td><td>FisherScientific</td><td>12787597</td><td>przytrzymaj nogę w pozycji</td></tr><tr><td>Wosk parafinowy</td><td>Ogólny (wielu różnych dostawców)</td> <td>-</td> <td>do osadzania odwapnionych kości</td></tr><tr><td>Klipsy do ran ze stali nierdzewnej Reflex 7 mm lub</td><td>narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>12032-07</td><td>zamykanie rany</td></tr><tr><td>Zmywacz do klipsów 7 mm Światowe</td><td>instrumenty precyzyjne</td><td>500347</td><td>usunąć klipsy do ran</td></tr><tr><td>Mikrotom rotacyjny</td><td>Ogólny (wielu różnych dostawców)</td> <td>-</td> <td>Do cięcia sekcji tkanki zatopionej w parafinie.</td></tr><tr><td>Safranin-O</td><td>Merck</td><td>S2255</td><td>Do barwienia sekcji</td></tr><tr><td>Ząbkowane zakrzywione kleszcze</td><td>Precyzyjne narzędzia naukowe</td><td>15915</td><td>trzymają skórę</td></tr><tr><td>Sterylna serweta</td><td>Generic (wielu różnych dostawców)</td><td>-</td><td>Aby zapewnić sterylność obszaru operacyjnego</td></tr><tr><td>Sterylna serweta z otworem na klucz</td><td>Ogólny (wielu różnych dostawców)</td><td>-</td><td>Aby zakryć mysz i odsłonić nogę</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna</td><td>Ogólny (wielu różnych dostawców)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna serweta chirurgiczna</td><td>Ogólna (wielu różnych dostawców)</td> <td>-</td> <td>utrzymuj sterylne środowisko dla narzędzi chirurgicznych</td></tr><tr><td>Sterylna serweta chirurgiczna z otworem na klucz</td><td>Ogólny (wielu różnych dostawców) -</td><td></td> <td>zakryj mysz i trzymaj nogę przez otwór na klucz</td></tr><tr><td>Nożyczki proste</td><td>Instrumenty precyzyjne World</td><td>14393</td><td>otwórz ranę</td></tr><tr><td>Mikroskop operacyjny.</td><td>Ogólny (wielu różnych dostawców)</td><td>-</td><td>Regulowana ostrość.</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas z ostrzami 2 mm.</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>15000-04</td><td>tną generyczny ksylen MMTL</td></tr><tr><td></td><td>(wielu różnych dostawców)</td> <td>-</td> <td>do osadzania odwapnionych kości</td></tr></tbody></table>

destabilizacja przyśrodkowego łąkotki i chrząstki rys mysiego modelu przyspieszonej choroby zwyrodnieniowej stawów

Destabilization of the Medial Meniscus and Cartilage Scratch Murine Model of Accelerated Osteoarthritis

Choroba zwyrodnieniowa stawów jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą układu mięśniowo-szkieletowego u osób powyżej 45 roku życia, co prowadzi do rosnących kosztów ekonomicznych i społecznych. Modele zwierzęce są wykorzystywane do naśladowania wielu aspektów choroby. Niniejszy protokół opisuje model destabilizacji i zadrapania chrząstki (DCS) pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów. Opierając się na szeroko stosowanej destabilizacji modelu łąkotki przyśrodkowej (DMM), DCS wprowadza trzy rysy na powierzchni chrząstki. W niniejszym artykule przedstawiono kroki mające na celu destabilizację kolana poprzez przecięcie przyśrodkowego więzadła łąkotkowego, a następnie trzy celowe powierzchowne zadrapania na chrząstce stawowej. Przedstawiono również możliwe metody analizy za pomocą dynamicznego obciążania, tomografii mikrokomputerowej i histologii. Chociaż model DCS nie jest zalecany w badaniach, które koncentrują się na wpływie choroby zwyrodnieniowej stawów na chrząstkę, umożliwia badanie rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów w krótszym oknie czasowym, ze szczególnym uwzględnieniem (1) tworzenia osteofitów, (2) choroby zwyrodnieniowej stawów i bólu urazu oraz (3) wpływu uszkodzenia chrząstki w całym stawie.

Procentowe obciążenie w stosunku do całkowitej masy ciała tylnej kończyny operowanej/z OA porównano z kończyną przeciwległą/kontrolną. Chociaż inne parametry mogą również wykazywać istotne różnice, takie jak wzrost obciążenia przednich łap po interwencji chirurgicznej, stała zmiana obciążenia tylnych łap wskazuje na preferencję używania jednej kończyny nad drugą i jest bardziej bezpośrednim wskaźnikiem znacznego dyskomfortu myszy wynikającego z rozwoju OA. W modelu DMM nie stwierdzono istotnych zmian w obciążeniu tylnych kończyn w ciągu 8 tygodni po indukcji, podczas gdy myszy DCS znacznie preferują kończynę przeciwległą/kontrolną 2 tygodnie po interwencji (Rysunek 3A).
Kostń podchrzęstną analizowano, koncentrując się na objętości pod przyśrodkowym obszarem obciążenia kłykcia piszczelowego. W tym celu oceniono gęstość kości w tym obszarze poprzez wyznaczenie procentowej zawartości zmineralizowanej tkanki kostnej w obrębie obszaru zainteresowania (ROI), a następnie obliczono stosunek między kończyną przeciwstawną a ipsilateralną. Stosunek ten wskazuje, że w obu modelach gęstość kości w dotkniętej kończynie wzrosła (stosunek powyżej 1) 4 tygodnie po indukcji (Rycina 3B). Powstawanie osteofitów jest bardziej wyraźne w modelu DCS, w którym odnotowano istotny wzrost ich liczby i objętości w porównaniu z modelem DMM 2 tygodnie po interwencji (Rycina 3C,D). W modelu DCS stwierdzono zwiększone uszkodzenie chrząstki w przyśrodkowych przedziałach piszczelowych i udowych oraz zapalenie błony maziowej (Rycina 3E,F) 4 tygodnie po indukcji.
<img alt="Procedura chirurgiczna: odsłonięcie torebki kolanowej, przecięcie więzadła, nacinanie chrząstki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64159/64159fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Interwencja chirurgiczna w celu wywołania POOA (zwyrodnienia stawów po urazie) u myszy. Kolejne obrazy przedstawiają różne etapy procedury. (A) Odsłonięcie torebki stawowej poprzez przecięcie błony powierzchownej wokół kolana za pomocą ostrza skalpela nr 11, wprowadzonego po stronie przyśrodkowej więzadła rzepki i z dala od samego więzadła. Pozwoli to na odsłonięcie podrzepkowego ciała tłuszczowego. (B) Identyfikacja i przecięcie przyśrodkowego więzadła łąkotczułkowo-piszczelowego. Aby zidentyfikować więzadło, należy przesunąć więzadło rzepki w stronę bocznej, a następnie odepchnąć ciało tłuszczowe ku górze. Umożliwia to wizualizację więzadła jako małej poziomej białej linii tuż nad kłykciem piszczelowym (wskazaną tutaj czarną strzałką). W celu przecięcia więzadła dolne ostrze nożyczek sprężynowych umieszcza się pod więzadłem, dbając o to, by nie uszkodzić chrząstki. Przesunąć łąkotkę w stronę przyśrodkową, aby zwizualizować kłykieć piszczelowy. (C) Nacinanie powierzchni odsłoniętej chrząstki i zamknięcie rany. Aby naciąć chrząstkę, mikroostrze wprowadza się w stronę tylną, gdzie styka się ono z chrząstką, a następnie przesuwa do przodu w stronę przedniej części stawu. Po wykonaniu nacięć naciągnąć skórę nad kolanem i zamknąć ranę za pomocą szwów podskórnych lub klipsów chirurgicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy dynamicznej analizy obciążenia, parametrów kostnych i oceny histologicznej w badaniu naukowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64159/64159fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ocena choroby zwyrodnieniowej stawów u myszy. (A) Dynamiczne obciążenie polega na dopasowaniu nacisku na macie pomiarowej do odpowiadającej mu łapy. Obciążenie jest następnie wyrażane jako procent całkowitej masy ciała. (B) Kostny obszar podchrzęstny mierzy się poprzez wybór objętości zainteresowania (volume of interest) w obszarze obciążenia przyśrodkowego kłykcia piszczelowego oraz wybór blaszki podchrzęstnej lub kości beleczkowej. Obrazy te mają rozdzielczość 4.5 µm. (C) Osteofity są identyfikowane i kwantyfikowane w trójwymiarowym widoku uzyskanych obrazów µCT. Objętość osteofitów mierzy się poprzez wybór ROI wyznaczającego krawędź osteofitu. Gęstość kości oblicza się jako objętość kości na objętość osteofitu. Przedstawione tutaj obrazy wykonano w rozdzielczości 2 µm, jednak kwantyfikacja jest zazwyczaj przeprowadzana przy rozdzielczości 4.5 µm. (D) Wyniki oceny chrząstki i zapalenia błony maziowej uzyskano z przekrojów o grubości 6 µm barwionych Safranin-O i Fast green. Przedstawiono przekrój czołowy kolana myszy, w którym wszystkie kwadranty, zaznaczone czarną ramką, są widoczne do oceny, oraz powiększenie strony przyśrodkowej. Widoczne jest również zapalenie błony maziowej otaczające przyśrodkową stronę stawu kolanowego, szczególnie powyżej i poniżej przemieszczonego łąkotki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy dynamicznego obciążenia ciężarem; parametry kostne, oceny histologiczne; wyniki badań DMM i DCS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64159/64159fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywna ocena OA w modelach DMM i DCS. (A) DWB mierzone do 8 tygodni po indukcji w eksperymentach przeprowadzonych przez tego samego doświadczonego operatora. Obciążenie wyrażono jako stosunek obciążenia operowanej strony/OA do obciążenia strony przeciwległej/kontrolnej. Przedstawiono również wyniki testów t dla par obu kończyn w modelach Sham (szary), DMM (niebieski) i DCS (różowy). Analiza µCT 4 tygodnie po interwencji chirurgicznej. (B) Kość podchrzestną analizowano 4 tygodnie po interwencji chirurgicznej, wyrażając wynik jako stosunek wartości %BV/TV strony ipsilateralnej do kontralateralnej. (C) Liczbę osteofitów i (D) objętość osteofitów analizowano 2 tygodnie po indukcji. Ocena histologiczna 4 tygodnie po indukcji (E) uszkodzeń chrząstki stawowej przyśrodkowej części piszczeli i uda oraz (F) zapalenia błony stawowej została przeprowadzona przy użyciu zstandaryzowanych metod19,20. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe, n ≥ 5. Dane porównywano za pomocą ANOVA z powtarzanymi pomiarami z korektą testem Šídáka (A), testem t dla par zależnych (A) lub standardowym testem t Studenta (B-F). *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01, ***P &lt; 0.001, ns = brak istotności statystycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Warunki traktowania i inkubacji dla zatapiania w parafinie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>

Obecny protokół opisuje kontrolowane zadrapania mikroostrza na powierzchni chrząstki stawowej po destabilizacji kolana myszy poprzez przecięcie przyśrodkowego więzadła minipiszczelowego. Ten model zwierzęcy przedstawia przyspieszoną postać choroby zwyrodnieniowej stawów (OA) odpowiednią do badania tworzenia osteofitów, osteosklerozy i bólu we wczesnym stadium.

Destabilizacja przyśrodkowego łąkotki i chrząstki rys mysiego modelu przyspieszonej choroby zwyrodnieniowej stawów

Osteoarthritis is the most prevalent musculoskeletal disease in people over 45, leading to an increasing economic and societal cost. Animal models are ...

Metoda ta modeluje wiele aspektów pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów u ludzi, co pozwala nam na zbadanie choroby i wpływu możliwych terapii w krótszym czasie. Główną zaletą tej techniki jest to, że w krótkim okresie, zaledwie dwa tygodnie po interwencji, myszy wykazywały spójne, mierzalne tworzenie osteofitów, a także zmiany obciążenia w chorej nodze, które wskazują na ból. Zalecamy skorzystanie z tego modelu badania powstawania osteofitów i kostnienia śródchrzęstnego, a także bólu spowodowanego kontuzją.Identyfikacja i przecięcie więzadła łąkotkowego przyśrodkowego może być trudne, dlatego zalecamy ćwiczenie tego na zwłokach, dopóki nie nabierzesz pewności. W zademonstrowaniu procedury pomoże Lynette Dunning, asystentka naukowa w Centrum Nauk o Układzie Mięśniowo-Szkieletowym. Na początek wyznacz sterylne pomieszczenie do przeprowadzenia operacji, upewniając się, że wszystkie powierzchnie są sterylne.Ułóż i umieść sterylne narzędzia na sterylnych serwetach. Następnie zważ mysz. Przytnij futro znieczulonej myszy nad kolanem, przednią i boczną stroną od połowy goleni do połowy uda za pomocą małych maszynek do strzyżenia włosów.Zdezynfekuj skórę, nakładając antybakteryjny środek do mycia skóry na ogoloną, odsłoniętą skórę. W przypadku analgezji należy podawać podskórnie 0,05 miligrama buprenorfiny na kilogram. Umieść mysz po stronie grzbietowej, pozostawiając kolano, na którym ma być operowana, do góry, i umieść nos myszy w dyszy podłączonej do zestawu anestezjologicznego.Przykryj mysz sterylną serwetą z małym otworem w kształcie dziurki od klucza. Ustaw nogę, na której ma być operowana z kolanem zamocowanym pod kątem mniejszym niż 90 stopni, z więzadłem rzepki skierowanym do góry i stopą unieruchomioną taśmą chirurgiczną. Dostosuj mikroskop, aby ustawić ostrość na więzadle rzepki.Ściśnij skórę kolana po bocznej stronie ząbkowanymi kleszczami. Wykonaj małe nacięcie równolegle do dystalnego ścięgna rzepki za pomocą nożyczek chirurgicznych. Wprowadź nożyczki i rozszerz cięcie do około 10 milimetrów.Przesuń skórę na stronę przyśrodkową, odsłaniając więzadło rzepki i bliższy płaskowyż piszczelowy. Używając ostrza numer 11, wykonaj nacięcie od góry do dołu wzdłuż przyśrodkowej strony więzadła rzepki. Po dotarciu do dolnej części więzadła rzepki obróć ostrze o 90 stopni i przedłuż nacięcie od więzadła rzepki w kierunku strony przyśrodkowej, aby uzyskać dostęp do torebki stawowej.Ściśnij więzadło rzepki kleszczami i obróć nadgarstek, aby przesunąć więzadło rzepki na boczną stronę, na tyle, aby odsłonić IFP. Nadal lekko trzymając więzadło rzepki, ściśnij IFP mikropęsetą, aby je podnieść i przesunąć lekko do góry. Jeśli wystąpi krwawienie, dociśnij patyczkiem kosmetycznym.Zidentyfikuj MMTL łąkotki przyśrodkowej, która zakotwicza róg czaszkowy łąkotki przyśrodkowej do przedniego płaskowyżu piszczelowego. Ostrożnie odetnij MMTL małymi, dwumilimetrowymi nożyczkami sprężynowymi, pozostawiając nienaruszoną łąkotkę przyśrodkową i inne więzadła. Trzymilimetrowym nożem mikrochirurgicznym zaznacz trzy, równomiernie rozmieszczone wgłębienia na chrząstce stawowej piszczelowej w kierunku od tylnej do przedniej części.Zamknij skórę dwoma lub trzema małymi, siedmiomilimetrowymi metalowymi klipsami do zamykania ran. Usuń metalowe klipsy między piątym a siódmym dniem po operacji. Następnie oceń ból lub chód w dowolnym momencie badania.Określ ilościowo zwapniałą tkankę, analizując skany mikro-CT stawów kolanowych. Aby przeanalizować stwardnienie kości podchrzęstnej, wybierz VOI w środku obciążenia płaskowyżu piszczelowego przyśrodkowego. Następnie określ gęstość kości podchrzęstnej i mikroarchitekturę, wybierając obszar zainteresowania wyznaczający strukturę beleczkową z nasadą piszczeli, płytką podchrzęstną lub całkowitą kością podchrzęstną w dwuwymiarowym widoku koronalnym stosu, za pomocą oprogramowania do analizy CT.Zidentyfikuj osteofity w zrekonstruowanych, trójwymiarowych stosach obrazów za pomocą oprogramowania CTVol. Oceń uszkodzenie chrząstki i zapalenie błony maziowej zgodnie z wynikiem uszkodzenia chrząstki OARSI 19 i wynikiem zapalenia błony maziowej 20, na zatopionych w parafinie odcinkach o długości pięciu mikrometrów. Nie zaobserwowano znaczących zmian w obciążeniu tylnej nogi w modelu DMM w ciągu ośmiu tygodni po indukcji, podczas gdy myszy DCS znacznie faworyzowały nogę kontralateralną lub kontrolną dwa tygodnie po interwencji.Stosunek między nogą przeciwległą a ipsilateralną wskazywał, że oba modele miały zwiększoną gęstość kości w obszarze podchrzęstnego obciążenia kości dotkniętej kończyny, cztery tygodnie po indukcji. Pojawienie się osteofitów było bardziej widoczne u myszy z DCS, ze znacznym wzrostem liczby i objętości w porównaniu z modelem DMM dwa tygodnie po interwencji. DCS objawia się podwyższonym uszkodzeniem chrząstki w przyśrodkowym przedziale piszczelowym i udowym oraz zapaleniem błony maziowej cztery tygodnie po indukcji.Uszkodzenia powinny być ograniczone do struktur, na które celowo chcemy wpłynąć, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby utrzymać wszystkie inne struktury w stanie nienaruszonym i zminimalizować odsłonięcie chrząstki. Modyfikacja uwzględniająca celowe zadrapania chrząstki pozwala nam zbadać chorobę zwyrodnieniową stawów, koncentrując się na osteofitogenezie, wczesnej chorobie zwyrodnieniowej stawów lub bólu urazu oraz wpływie uszkodzenia chrząstki na cały staw.

destabilization-medial-meniscus-cartilage-scratch-murine-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy protokół destabilizacji modelu łąkotki przyśrodkowej (DMM) u myszy, skuteczne narzędzie do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów (OA). Ponadto wykazaliśmy, że niedobór progranuliny może nasilać rozwój i progresję choroby zwyrodnieniowej stawów przy użyciu tego modelu, co wskazuje, że progranulina odgrywa ochronną rolę w patogenezie choroby zwyrodnieniowej stawów.

Stworzenie chirurgicznie indukowanego modelu u myszy w celu zbadania ochronnej roli progranuliny w chorobie zwyrodnieniowej stawów

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA), czyli choroba zwyrodnieniowa stawów, jest wyniszczającym stanem związanym z bólem, który pozostaje tylko częściowo kontrolowany przez dostępne leki przeciwbólowe. Opracowywane są modele zwierzęce, które mają na celu lepsze zrozumienie mechanizmów bólu związanych z chorobą zwyrodnieniową stawów. W tym miejscu opisujemy metodologię monojodooctanowego modelu bólu zwyrodnieniowego stawów u myszy.

Model monojodooctanu bólu związanego z chorobą zwyrodnieniową stawów u myszy

Przedstawiamy metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych stawów mysich po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób choroba zwyrodnieniowa stawów, czynniki genetyczne i/lub różne schematy obciążenia wpływają na podatność chondrocytów in situ.

Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

Obecny protokół ustanawia rygorystyczną i powtarzalną metodę ilościowego oznaczania zmian morfologicznych stawów, które towarzyszą chorobie zwyrodnieniowej stawów. Zastosowanie tego protokołu może być cenne w monitorowaniu postępu choroby i ocenie interwencji terapeutycznych w chorobie zwyrodnieniowej stawów.

Standaryzowana ocena histomorfometryczna choroby zwyrodnieniowej stawów w chirurgicznym modelu myszy

Tutaj prezentujemy model uszkodzenia chrząstki śródstawowej w kolanie szczura wywołany cyklicznym obciążeniem, generowany przez 60 cyklicznych uciśnięć powyżej 20 N, skutkujących uszkodzeniem chrząstki kłykciowej kości udowej u szczurów.

Nieinwazyjna metoda generowania modelu uszkodzenia chrząstki stawowej w kolanie szczura wywołanego cyklicznym obciążeniem

Ten protokół ustanawia model pełnogrubych wad chrząstki (FTCD) poprzez wiercenie otworów w rowku bloczkowym kości udowej szczurów i mierzenie późniejszego zachowania bólowego i zmian histopatologicznych.

Opracowanie i ocena szczurzego modelu ubytków chrząstki pełnej grubości

Nieinwazyjne uszkodzenie ACL jest niezawodną i klinicznie istotną metodą inicjowania pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów (PTOA) u myszy. Ta metoda uszkodzeń pozwala również na ilościowe określenie in vivo aktywności proteazy w stawie we wczesnych punktach po urazie przy użyciu aktywowanych proteazą sond bliskiej podczerwieni i fluorescencyjnego obrazowania odbicia.

Nieinwazyjne uszkodzenie więzadła krzyżowego przedniego (ACL) wywołane kompresją i obrazowanie in vivo aktywności proteazy u myszy

W niniejszym artykule opisujemy chirurgiczną metodę transekcji więzadła krzyżowego przedniego (ACL) jako wiarygodny model wywoływania choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego u gryzoni oraz metody pobierania płynu maziowego kolana, pomiaru obrzęku kolana i oceny ciężkości choroby zwyrodnieniowej stawów.

Przecięcie więzadła krzyżowego przedniego i płukanie płynu maziowego w modelu gryzoni w celu zbadania zapalenia stawów i pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów

Mysi model gojenia się ran skórnych, który może być używany do oceny związków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Mysi model gojenia się ran

Przedkliniczny, mysi model przerzutów do wątroby wykonany techniką iniekcji hemispleen.

Przedkliniczny mysi model przerzutów do wątroby

Poznaj model przyspieszonej choroby zwyrodnieniowej stawów u myszy z uszkodzeniem chrząstki stawowej. Ta metoda umożliwia badanie formowania się osteofitów i bólu w krótkim czasie.

Destabilizacja przyśrodkowego łąkotki i chrząstki rys mysiego modelu przyspieszonej choroby zwyrodnieniowej stawów

Przeglądaj więcej filmów