Name: In vivo (in vivo) Wykrywanie przepuszczalności naczyń krwionośnych w mysim gruczole podżuchwowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę wykrywania przepuszczalności naczyń krwionośnych in vivo w mysim gruczole podżuchwowym przy użyciu mikroskopii laserowej dwufotonowej. Technika ta pozwala ocenić funkcję ścisłych połączeń śródbłonka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (granty 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 i 81974151) oraz Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (grant 7202082).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań nad Zwierzętami, Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Pekińskiego i były zgodne z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (publikacja NIH nr 85-23, poprawiona w 1996 roku). Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy typu dzikiego (WT) w grupie wiekowej 8-10 tygodni. Zwierzęta doświadczalne były starannie traktowane, aby zminimalizować ich ból i dyskomfort.
1. Procedury na zwierzętach
<ol>
	<li>Przygotuj i podaj środki znieczulające i znacznikowe.
	<ol>
		<li>Utrzymuj sterylne warunki przez cały czas trwania badania i sterylizuj narzędzia przez autoklawowanie. Podziel myszy na dwie grupy. 
		UWAGA: Grupa kontrolna pozostała nieleczona, a druga grupa z jednostronnym podwiązaniem przewodu SMG przez 1 dzień służyła jako grupa eksperymentalna. Podczas grupowania należy wybrać myszy o podobnej masie ciała i wieku, aby zmniejszyć wpływ masy i wieku na przepuszczalność naczyń krwionośnych.</li>
		<li>Należy wybrać odpowiednie znaczniki, takie jak dekstran znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (masa cząsteczkowa: 4 kDa; FD4) i dekstran znakowany rodaminą B (masa cząsteczkowa: 70 kDa; RD70) (patrz tabela materiałów) z wyraźnymi widmami wzbudzenia/emisji w celu zminimalizowania interferencji między sygnałami fluorescencji (przy użyciu odpowiednio filtra FITC lub rodaminy B) do testu przepuszczalności. 
		UWAGA: Długości fal wzbudzenia FD4 i RD70 wynoszą odpowiednio 488 nm i 594 nm, a wybrane długości fal emisji to odpowiednio 511-564 nm i 617-669 nm.</li>
		<li>Rozcieńczyć znaczniki w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (1x PBS) do 100 mg/ml i przechowywać podwielokrotności chronione przed światłem w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Dekstran o masie cząsteczkowej takiej jak 4 kDa szybko wycieka z krwi w mysich pistoletach maszynowych nawet bez stanów patologicznych10.</li>
		<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć tribromoetanol (dawka dla myszy 25 g wynosiła około 600 μl) w celu znieczulenia myszy. Zastosuj środek przeciwbólowy zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etycznej ds. zwierząt. 
		UWAGA: Po indukcji znieczulenia należy użyć maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Dbaj o zwierzęta11. Poczekaj, aż mysz zatoleruje stymulację mechaniczną, np. szczypanie palca u nogi bez reakcji motorycznej.</li>
		<li>Wstrzyknąć mieszaninę dwóch znaczników przepuszczalności parakomórkowej o różnych masach cząsteczkowych (FD4 i RD70) do żyły kątowej (0,5 mg/g masy ciała). Wstrzyknąć każdej myszy mieszaninę 100 μl roztworu znacznikowego, z 50 μl każdego barwnika zmieszanym w stosunku 1:1.
		<ol>
			<li>Po znieczuleniu delikatnie przytrzymaj głowę i szyję myszy, aby jedna strona gałki ocznej lekko wystawała. Włożyć strzykawkę insulinową zawierającą znaczniki fluorescencyjne (należy uważać, aby nie wprowadzić powietrza do strzykawki) wzdłuż kącika oka pod kątem prostym do oka. 
			UWAGA: Jeśli żyła kątowa zostanie wprowadzona prawidłowo, roztwór barwnika zostanie łatwo wstrzyknięty do żyły i nie będzie oporu podczas wstrzyknięcia. Ponadto wstrzyknięcie żyły ogonowej u myszy może być również kandydatem na dożylne cząsteczki znacznikowe.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj izolację pistoletu maszynowego, wykonując poniższe czynności. 
	UWAGA: Do operacji należy używać sterylnych narzędzi, w tym nożyczek do tkanek i nikli separacyjnych.
	<ol>
		<li>Ostrożnie oddziel jednostronny gruczoł, aby nie uszkodzić otaczających naczyń krwionośnych i nerwów pod mikroskopem stereoskopowym.
		<ol>
			<li>Po wstrzyknięciu znaczników przepuszczalności parakomórkowej szybko połóż myszy na kartonie i ułóż je w pozycji leżącej z kończynami i głowami zaklejonymi taśmą. Nałóż krem do depilacji na skórę szyi, aby usunąć sierść myszy. Użyj 75% etanolu do dezynfekcji skóry przed zabiegiem.</li>
			<li>Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, przeciął naskórek szyi ogólnymi nożyczkami do tkanek, aby odsłonić obie strony pistoletów maszynowych (w tym eksperymencie leczono prawy gruczoł). Następnie użyj niklu do separacji tkanek (patrz Tabela materiałów), aby delikatnie oddzielić kapsułkę od powierzchni gruczołu, uważając, aby nie uszkodzić tkanki gruczołu i naczyń krwionośnych.</li>
			<li>Oddzielić kapsułkę od powierzchni gruczołu, nie uszkadzając struktury gruczołowej. Ponadto upewnij się, że cały proces unieruchamiania myszy i oddzielania gruczołów został zakończony w ciągu 10 minut.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ustawienie mikroskopu dwufotonowego
<ol>
	<li>Podłącz niestandardowy uchwyt do urządzenia podciśnieniowego i sprawdź wcześniej, czy efekt podciśnienia został prawidłowo osiągnięty. 
	UWAGA: Uchwyt ma kształt miniaturowego szkła powiększającego z płaskim kawałkiem okrągłego szkła pośrodku (średnica: 4,32 mm, <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Urządzenie podciśnieniowe zostało zaprojektowane we własnym zakresie w taki sposób, że uchwyt jest połączony z gumową rurką, która jest połączona z butelką drenażową, a butelka jest przymocowana do regulatora podciśnienia za pomocą krótkiej gumowej rurki. W ten sposób regulator podciśnienia może regulować ciśnienie, aby zapewnić, że tkanka jest zasysana do uchwytu.
	<ol>
		<li>Połącz jedną stronę uchwytu z urządzeniem podciśnieniowym. Aby sprawdzić, czy urządzenie podciśnieniowe jest nienaruszone i odpowiednie, odwróć uchwyt do góry nogami, dodaj kroplę wody i ustaw wartość podciśnienia na 20 jednostek. Jeśli woda zostanie całkowicie i szybko odessana, urządzenie podciśnieniowe jest pomyślnie instalowane z uchwytem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie umieść odsłonięty pistolet maszynowy myszy na niestandardowym uchwycie i zassaj tkankę przez ssanie podciśnieniowe jak najdalej od ciała myszy, aby zmniejszyć artefakty ruchu spowodowane oddychaniem i innymi warunkami.</li>
	<li>Zobrazuj materiał nośny przymocowany do dławika pod obiektywem zanurzonym w wodzie 25x/NA 1.0 (specjalnie dla NIR). 
	UWAGA: W tym eksperymencie użyj pionowego mikroskopu dwufotonowego (patrz Tabela materiałów). Naczynia krwionośne muszą być widoczne natychmiast po wstrzyknięciu znacznika z wyraźną fluorescencją.</li>
</ol>
3. Obrazowanie naczyń i wykrywanie przepuszczalności
<ol>
	<li>Rozpocznij obrazowanie wkrótce po wybraniu wzroku gruczołu. 
	UWAGA: Zazwyczaj szeregi czasowe składające się z 45-50 obrazów w ciągu 20 s lub dłużej są zazwyczaj rejestrowane w zależności od projektu eksperymentalnego.</li>
	<li>Uzyskuj sekwencyjne obrazy wzdłuż osi Z, w odstępach 2 μm, od powierzchni gruczołu do 70-140 μm w głąb tkanki, aby wygenerować trójwymiarową (3D) konstrukcję.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie poklatkowe naczyń krwionośnych w celu pomiaru przepuszczalności naczyń krwionośnych w SMG. 
	UWAGA: Po uruchomieniu oprogramowania mikroskopu należy ustawić warunki w menu programu w następujący sposób (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>W oknie dialogowym Eksploratora kliknij Dodaj nowy folder i zmień nazwę pliku.</li>
		<li>Wróć do kolumny Pozyskiwanie. W XY format to 512 x 512, a prędkość to 400 Hz. Włącz opcję Dwukierunkowy X.</li>
		<li>Ustaw współczynnik powiększenia na 0,75 i 1,5 dla powiększenia.</li>
		<li>Aby uzyskać obrazowanie poklatkowe, wybierz xyt w trybie akwizycji. Ustaw czas trwania na 20 s, 30 minut lub dłużej, w zależności od potrzeb eksperymentu.</li>
		<li>Aby wykonać konstrukcję 3D, ustaw tryb akwizycji na xyz. Rozmiar Z-Step można ustawić zgodnie z rzeczywistą sytuacją.</li>
		<li>Po ustawieniu warunków kliknij na Na żywo, aby obserwować obrazowanie naczyniowe dwóch kanałów i nakładających się kanałów w ramce do tworzenia zdjęcia i wybierz obszary zainteresowania.</li>
		<li>Kliknij Start, aby rozpocząć obrazowanie. 
		UWAGA: Mysz nie może być pozostawiona bez opieki podczas procesu obrazowania w znieczuleniu. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Aby ocenić przepuszczalność naczyń, użyj oprogramowania Image J, aby obliczyć stosunek intensywności fluorescencji FD4 i RD70 między naczyniami zewnętrznymi i wewnętrznymi i oznaczyć je jako intensywność zewnątrz- i wewnątrznaczyniową4. 
	UWAGA: Zmiana przepuszczalności naczyń krwionośnych poprzez śledzenie transportu dekstransu odzwierciedla zmianę funkcji bariery śródbłonkowej. Ponadto obserwuj morfologię i gęstość naczyń, obliczając średnicę i liczbę zmian naczyń.
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie Image J (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Kliknij Plik i wybierz Otwórz, aby otworzyć obrazy naczyń krwionośnych uchwycone pod mikroskopem dwufotonowym.</li>
		<li>Wybierz opcję Obraz i ustaw Typ na 16-bitowy, aby przekonwertować format obrazu.</li>
		<li>Wybierz opcję Analizuj i wybierz opcję Obszar, Średnia, IntDen w obszarze Ustaw pomiary. Kliknij OK, aby potwierdzić.</li>
		<li>W obszarze Analizuj wybierz pozycję Narzędzia, otwórz Menedżer zwrotu z inwestycji, a następnie wybierz pozycję Pokaż wszystko i etykiety.</li>
		<li>Zmierz wartość intensywności fluorescencji wewnątrznaczyniowej: kliknij narzędzie lasso w głównym interfejsie, aby naszkicować kontur naczynia krwionośnego. Kliknij Dodaj w Menedżerze ROI. Wykonaj ten krok, aby kontynuować wybieranie wielu statków. Zaznacz wszystkie obiekty Menedżera ROI i kliknij Zmierz.</li>
		<li>Zmierz całkowitą wartość intensywności fluorescencji: obrysuj cały obraz, kliknij przycisk Zmierz, a wynikiem będzie całkowita wartość intensywności fluorescencji obrazu.</li>
		<li>Obliczyć wartość intensywności fluorescencji zewnątrznaczyniowej. Skopiuj dane do programu Excel w celu obliczenia. Współczynnik intensywności fluorescencji zewnątrznaczyniowej = (1 − wartość intensywności fluorescencji wewnątrznaczyniowej/całkowita wartość intensywności fluorescencji) × 100%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Aplikacje podrzędne
<ol>
	<li>Podczas eksperymentu oblicz natężenie przepływu krwi, mierząc odległość, jaką pokonuje czerwona krwinka (pokazana jako kropka pod mikroskopem dwufotonowym)4 w określonym czasie.</li>
	<li>Aby zobrazować ruch komórek krwi przez komórki śródbłonka, oznacz komórki krwi za pomocą fluorescencji. Następnie wstrzyknij do komórek znakowanych fluorescencją FD4 lub RD70 przez żyłę ogonową myszy. Po krążeniu przez 5 minut śledź interesujące komórki przez pewien czas. 
	UWAGA: W sumie 2 x 106 CFSE (ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny, przepuszczalny dla błony barwnik fluorescencyjny) limfocyty pochodzące ze śledziony myszy dawców przeniesiono do biorców przez wstrzyknięcie żyły ogonowej, a infiltrację limfocytów do SMG zbadano w eksperymentalnych modelach zwierzęcych4.</li>
</ol>
6. Opieka nad zwierzętami i ich regeneracja
<ol>
	<li>Dbaj o zwierzęta podczas całego eksperymentu. 
	UWAGA: Upewnij się, że zwierzę, które przeszło operację, nie zostanie zwrócone do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone podczas eksperymentu.</li>
	<li>Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności. 
	UWAGA: Stale obserwuj stan oddychania myszy i utrzymuj je w cieple, kładąc je na poduszce grzewczej dla zwierząt. Zapewnij zakwaterowanie po leczeniu bólu pooperacyjnego i analgezję, zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etyki zwierząt.</li>
</ol>

<ol><li>Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretion%2C+components%2C+and+properties+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The secretion, components, and properties of saliva.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).</li>
<li>Garrett, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proper+role+of+nerves+in+salivary+secretion%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">The proper role of nerves in salivary secretion: A review.</a> Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).</li>
<li>Berndt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+proteins+at+the+blood-brain+barrier%3A+Far+more+than+claudin-5%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).</li>
<li>Cong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+endothelial+barrier+function+is+linked+with+hyposecretion+and+lymphocytic+infiltration+in+salivary+glands+of+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren's syndrome.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+Multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis+of+the+apical+plasma+membrane+during+regulated+exocytosis+in+the+salivary+glands+of+live+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents.</a> Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li>
<li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).</li>
<li>Enis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction%2C+differentiation%2C+and+remodeling+of+blood+vessels+after+transplantation+of+Bcl-2-transduced+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+digital+subtraction+angiography+in+canine+hindlimb+arteriography%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography.</a> Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).</li>
<li>Trani, M., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+in+the+control+of+vascular+permeability%3A+vascular+endothelial-cadherin+and+other+players%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players.</a> Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).</li>
<li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability%2C+blood+pressure%2C+and+organ+damage+in+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension+Research%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).</li>
<li>Scheppke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2%2FSrc+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).</li>
<li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CD34+leads+to+exacerbated+autoimmune+arthritis+through+increased+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability.</a> Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).</li>
<li>Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging+of+vascular+permeability+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).</li>
<li>Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+in+the+regulation+of+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).</li>
<li>Schulte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).</li>
<li>Uhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+experimental+approach+for+in+vivo+analyses+of+the+salivary+gland+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature.</a> Frontiers in Immunology. 11, 604470(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Utrzymanie i regulacja funkcji bariery śródbłonkowej są niezbędne dla homeostazy naczyń krwionośnych. Komórki śródbłonka i ich połączenia międzykomórkowe odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu i kontrolowaniu integralności naczyń krwionośnych12. Siła ścinająca przepływu krwi, czynniki wzrostu i czynniki zapalne mogą powodować zmiany przepuszczalności naczyń, a tym samym uczestniczyć w występowaniu i rozwoju chorób ogólnoustrojowych, takich jak nadciśnienie, cukrzyca, choroby autoimmunologiczne 13,14...

Różne gruczoły ślinowe produkują ślinę, która przede wszystkim działa jako pierwsza linia obrony przed infekcjami i wspomaga trawienie, odgrywając tym samym istotną rolę w zdrowiu jamy ustnej i ogólnym zdrowiu1. Ukrwienie ma kluczowe znaczenie dla wydzielania gruczołów ślinowych, ponieważ stale dostarcza wodę, elektrolity i cząsteczki, które tworzą ślinę pierwotną. Funkcja bariery śródbłonkowej, regulowana przez kompleks ścisłego połączenia (TJ), ściśle i delikatnie ogranicza przenikanie naczyń włosowatych, które są wysoce przepuszczalne dla wody, substancji rozpuszczonych, białek, a nawet komórek przemieszczających się z krążących naczyń krwionośnych do tkanek gruczołów ślinowych 2,3. Wcześniej odkryliśmy, że otwarcie śródbłonka TJ w odpowiedzi na bodziec cholinergiczny ułatwia wydzielanie śliny, podczas gdy upośledzenie funkcji bariery śródbłonkowej jest powiązane z hipowydzielaniem i naciekaniem limfocytarnym w gruczołach podżuchwowych (SMG) w zespole Sjögrena4. Dane te sugerują, że należy zwrócić wystarczającą uwagę na wpływ funkcji bariery śródbłonkowej w odniesieniu do różnych chorób gruczołów ślinowych.
Dwufotonowy laserowy mikroskop skaningowy to potężne narzędzie do obserwacji dynamiki komórek w nienaruszonej tkance in vivo. Jedną z zalet tej techniki jest to, że światło bliskiej podczerwieni (NIR) ma głębszą penetrację tkanek niż światło widzialne lub ultrafioletowe, gdy próbki są wzbudzane przez NIR i nie powoduje oczywistych uszkodzeń tkanek światłem w odpowiednich warunkach5,6. Rzeczywiście, gruczoły ślinowe są bardzo jednorodną i powierzchowną tkanką, w której powierzchniowe komórki groniaste są oddalone od powierzchni gruczołu tylko około 30 μm7,8. Wykazano, że przyżyciowy mikroskop konfokalny może badać wydzielanie zewnątrzwydzielnicze i cytoszkielet aktynowy w żywych mysich gruczołach ślinowych w rozdzielczości subkomórkowej8. Dwufotonowa laserowa mikroskopia skaningowa ma jednak nie tylko przewagę nad konwencjonalną mikroskopią konfokalną, ale może być również wykorzystywana do wykrywania głębszych tkanek i wyraźniejszego obrazu. W tym przypadku znakowane fluorescencyjnie dektransy, które są często używane jako znaczniki przepuszczalności parakomórkowej i mają przewagę w postaci różnych rozmiarów, mogą być używane do testowania wielkości pore9. W niniejszym badaniu ustalono technikę dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej w czasie rzeczywistym do oceny in situ funkcji bariery śródbłonkowej w mysich SMG. Każdy etap prac nad wykrywaniem przepuszczalności naczyń krwionośnych in vivo w mysich SMG jest opisany w aktualnym protokole. Oto przykład wykrywania funkcji bariery śródbłonkowej w mysim modelu podwiązania przewodu SMG.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop 2-fotonowy (TCS-SP8 DIVE)</td><td>Leica, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 kDa dekstran znakowany FITC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>70 kDa rodamina znakowana B dekstran</td><td>Sigma</td><td>Aldrich R9379</td><td></td></tr><tr><td>separacja tkanek nikiel</td><td>Bejinghuabo Company</td><td>NZW28</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa sterylna strzykawka</td><td>Zhiyu Company</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Image J</td><td>oprogramowanie National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>0253316</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Leica Application Suite X</td><td>Mikroprobówki Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>buforowane fosforanem sól fizjologiczna 1x</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tkanek</td><td>Bejinghuabo Company</td><td>M286-05</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>JITIAN Bio</td><td>JT0781</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) wykrywanie przepuszczalności naczyń krwionośnych w mysim gruczole podżuchwowym

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

Ślina odgrywa ważną rolę w zdrowiu jamy ustnej i ogólnym zdrowiu. Nienaruszona funkcja bariery śródbłonkowej naczyń krwionośnych umożliwia wydzielanie śliny, podczas gdy dysfunkcja bariery śródbłonka jest związana z wieloma zaburzeniami wydzielniczymi gruczołów ślinowych. Niniejszy protokół opisuje metodę wykrywania przepuszczalności parakomórkowej in vivo w celu oceny funkcji ścisłych połączeń śródbłonka (TJ) w mysich gruczołach podżuchwowych (SMG). Najpierw znakowany fluorescencyjnie dektrans o różnych masach cząsteczkowych (4 kDa, 40 kDa lub 70 kDa) wstrzyknięto do żył kątowych myszy. Następnie jednostronny pistolet maszynowy został wypreparowany i umieszczony w dostosowanym uchwycie pod dwufotonowym mikroskopem skaningowym laserowym, a następnie zarejestrowano obrazy naczyń krwionośnych, acini i przewodów. Wykorzystując tę metodę, monitorowano dynamiczny wyciek w czasie rzeczywistym znaczników różnej wielkości z naczyń krwionośnych do podstawowych stron acini, a nawet przez nabłonek zrazikowy do przewodów, aby ocenić zmianę funkcji bariery śródbłonkowej w warunkach fizjologicznych lub patofizjologicznych.

Zgodnie z protokołem, jednostronnie wyizolowany SMG przymocowano do specjalnie wykonanego uchwytu, a gruczoł oddalono jak najdalej od ciała myszy, aby zapobiec powstawaniu artefaktów ruchowych wywołanych oddychaniem. Pod mikroskopem obserwowano szybki przepływ erytrocytów (czarne kropki) w naczyniach krwionośnych. Po zlokalizowaniu obszaru tkanki przez okular, należy przełączyć się na sterowanie oprogramowaniem mikroskopu. W grupie kontrolnej oba znaczniki znajdowały się w naczyniach krwionośnych SMG myszy. W szczególnoś...

W obecnym protokole, funkcja bariery śródbłonkowej gruczołu podżuchwowego (SMG) została oceniona poprzez wstrzyknięcie różnych molekularnych znaczników fluorescencyjnych do żył kątowych badanych modeli zwierzęcych in vivo pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym.

In vivo (in vivo) Wykrywanie przepuszczalności naczyń krwionośnych w mysim gruczole podżuchwowym

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

Niniejszy protokół opisuje pomiar przepuszczalności parakomórkowej in vivo w celu oceny funkcji ścisłych połączeń śródbłonkowych w gruczołach podżuchwowych myszy. Dwufotonowa laserowa mikroskopia skaningowa ma jednak nie tylko zalety konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej, ale może być również wykorzystywana do wykrywania głębszych tkanek i wyraźniejszego obrazu. Eksperyment ten stanowi dobrą metodę oceny przepuszczalności naczyń krwionośnych różnych tkanek, zwłaszcza tkanek powierzchniowych i narządów zwierząt.Zacznij od wyboru odpowiednich znaczników, takich jak fluoresceina, izotiocyjanian, znakowany dekstran i rodamina B, znakowany dekstran z wyraźnymi widmami emisji wzbudzenia, aby zminimalizować interferencję między sygnałami fluorescencji dla testu przepuszczalności. Rozcieńczyć śladowe ilości w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem w ilości 100 miligramów na mililitr i przechowywać podwielokrotności chronione przed światłem w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po znieczuleniu 8-10 tygodniowego samca myszy typu dzikiego, delikatnie przytrzymaj głowę i szyję myszy, aby jedna strona gałki ocznej lekko wystawała.Włożyć strzykawkę insulinową zawierającą 100 mikrolitrów fluorescencyjnego roztworu znacznikowego wzdłuż kącika oka pod kątem prostym do oka. Po wstrzyknięciu należy szybko ułożyć mysz na tekturze w pozycji leżącej na plecach, z kończynami i głową zaklejonymi taśmą. W celu izolacji gruczołu podżuchwowego lub SMG, pod mikroskopem stereoskopowym, przeciąć naskórek szyi ogólnymi nożyczkami do tkanek, aby odsłonić obie strony SMG.Następnie użyj igły do separacji tkanek, aby delikatnie oddzielić kapsułkę od powierzchni gruczołu, nie uszkadzając tkanki gruczołu, naczyń krwionośnych i struktury gruczołowej. Podłącz niestandardowy uchwyt do urządzenia podciśnieniowego i wcześniej sprawdź, czy efekt podciśnienia został prawidłowo osiągnięty. Delikatnie umieść odsłonięty pistolet maszynowy na dostosowanym uchwycie i zassaj tkankę przez ssanie podciśnieniowe, jak najdalej od ciała myszy, aby zmniejszyć artefakty ruchu spowodowane oddychaniem i innymi warunkami.Obrazowanie należy rozpocząć wkrótce po wybraniu miejsca gruczołu. Uzyskuj sekwencyjne obrazy wzdłuż osi Z odstępując dwa mikrony od powierzchni gruczołu do 70 do 140 mikronów w głąb tkanki, aby wygenerować trójwymiarową konstrukcję. Następnie wykonaj obrazowanie poklatkowe naczyń krwionośnych, aby zmierzyć przepuszczalność naczyń krwionośnych w SMG.W oknie dialogowym Eksploratora kliknij Dodaj nowy folder" i zmień nazwę pliku. Następnie wróć do kolumny pozyskiwanie. W XY format to 512 na 512, a prędkość to 400 herców.Włącz dwukierunkowy X, ustaw współczynnik powiększenia na 0,75 i 1,5 dla powiększenia. Następnie wybierz XYT w trybie akwizycji"aby uzyskać obrazowanie poklatkowe. Ustaw czas trwania na 20 sekund, 30 minut lub dłużej, w zależności od potrzeby eksperymentu.Po ustawieniu warunków kliknij na Na żywo", aby obserwować obrazowanie naczyniowe dwóch kanałów i nakładających się kanałów w ramce do tworzenia zdjęcia i wybierz obszary zainteresowania. Kliknij Start"aby rozpocząć obrazowanie. Test przepuszczalności naczyń krwionośnych in vivo i trójwymiarowe obrazy naczyń krwionośnych u myszy.Pokazano tutaj gruczoły podżuchwowe. W grupie kontrolnej oba znaczniki występowały w naczyniach krwionośnych pistoletu oddechowego. Ze względu na małą masę cząsteczkową FD4 był w stanie wyciekać z naczyń krwionośnych do podstawowych stron acini i przewodów, wyraźnie przedstawiając w ten sposób kształt acini i przewodów.RD70 był rozprowadzany w dużych naczyniach krwionośnych i mikronaczyniach. W grupie podwiązania przewodów zarówno FD4, jak i RD70 zostały wynaczynione do podstawowych stron acini, co wskazywało, że podwiązanie przewodów może zakłócić funkcję bariery śródbłonkowej i zwiększyć przepuszczalność dużych cząsteczek. Co więcej, półilościowe wyniki intensywności fluorescencji FD4 i RD70 potwierdziły te obserwacje.Trójwymiarowe obrazy wykazały znacznie bardziej przesłoniętą fluorescencję FD4 i RD70 wokół naczyń krwionośnych w grupie podwiązanej w porównaniu z grupą kontrolną. Staranna izolacja SMG i odpowiednie umieszczenie oraz mikroskop są niezbędnymi warunkami wstępnymi skutecznego wykrywania. Po zabiegach można obliczyć szybkość przepływu krwi, łącząc ruch czerwonych krwinek i można ścigać infiltrację komórek krwi znakowanych fluorescencją.

in-vivo-vascular-permeability-detection-in-mouse-submandibular-gland

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prezentujemy test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych. Test ten opiera się na dożylnym wstrzyknięciu barwnika, a następnie wizualizacji jego dyfuzji do przestrzeni śródmiąższowych.

Test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.

Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Ten artykuł wyjaśnia zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego za pomocą aktywowanej sondy do obrazowania optycznego do wizualizacji in vivo aktywności kluczowych metaloproteinaz macierzy w dwóch różnych eksperymentalnych modelach zapalenia.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne fluorescencji in vivo zapalnej aktywności MMP przy użyciu aktywowalnego środka do obrazowania fluorescencyjnego

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Opisujemy protokół chirurgicznego odsłaniania i stabilizacji mysiego podżuchwowego gruczołu ślinowego do obrazowania przyżyciowego za pomocą pionowej mikroskopii przyżyciowej. Protokół ten można łatwo dostosować do innych gruczołów zewnątrzwydzielniczych okolicy głowy i szyi myszy i innych małych gryzoni.

Przygotowanie mysiego śliniaka podżuchwowego do pionowej mikroskopii przyżyciowej

Miejscowe dostarczanie leków do gruczołów podżuchwowych jest interesujące dla zrozumienia biologii gruczołów ślinowych i dla rozwoju nowych terapii. Przedstawiamy zaktualizowany i szczegółowy protokół iniekcji retrodukcyjnej, zaprojektowany w celu poprawy dokładności podawania i odtwarzalności eksperymentalnej. Przedstawione w niniejszym artykule zastosowanie polega na dostarczaniu nanocząstek polimerowych.

Wsteczne wstrzyknięcie nanocząstek do mysiego gruczołu podżuchwowego

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru przecieku naczyniowego wywołanego śródskórnym podawaniem środków zwiększających przepuszczalność do skóry myszy. Technika ta może być wykorzystana do określenia zdolności cząsteczek do promowania lub hamowania przecieku naczyniowego lub do badania mechanizmów molekularnych regulujących przepuszczalność naczyń.

Ocena czynników indukujących nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w skórze za pomocą testu Milesa

Niniejszy protokół opisuje łatwą technikę obrazowania gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji za pomocą skaningu laserowego, mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Obrazowanie immunofluorescencyjne jest ograniczone przez możliwość obserwacji złożonych, zależnych od czasu procesów biologicznych w zaledwie jednej migawce w czasie. Badanie to przedstawia podejście do obrazowania na żywo przeprowadzone na precyzyjnie wyciętych wycinkach gruczołu podżuchwowego myszy. Takie podejście pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórka-komórka podczas homeostazy oraz procesów regeneracji i naprawy.

Badanie interakcji komórka-komórka w gruczole ślinowym za pomocą obrazowania żywych komórek ex vivo

Celem niniejszego protokołu jest zapewnienie standaryzowanego podejścia do ilościowej oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł u myszy poprzez miejscowe nałożenie fluoroforowo oznaczonych dektranów o różnej wielkości cząsteczkowої na powierzchnię dziąseł in vivo, z późniejszym obrazowaniem ex vivo za pomocą systemu mikroskopu jednofotonowego.

Ocena funkcjonalności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników

Poznaj metodę wykrywania przepuszczalności naczyń krwionośnych in vivo w mysim gruczole podżuchwowym przy użyciu mikroskopii laserowej dwufotonowej. Technika ta pozwala ocenić funkcję ścisłych połączeń śródbłonka.

In vivo (in vivo) Wykrywanie przepuszczalności naczyń krwionośnych w mysim gruczole podżuchwowym

Przeglądaj więcej filmów