Izolacja mysiej mezenchymy jelitowej skutkująca wysoką wydajnością telocytów

Nasz protokół izolacji mezenchymy jelitowej skutkuje wysoką wydajnością telocytów. Metoda ta stanowi wstępną platformę do badania interakcji komórka-komórka z udziałem telocytów w homeostazie i chorobie. Telocyty to unikalne komórki wrażliwe na dostępne protokoły dysocjacji tkanek.

Dlatego główną zaletą tej techniki jest izolacja mezenchymy, w tym wzbogaconych żywotnych telocytów. Mezenchyma, w tym telocyty, może służyć jako źródło cząsteczek sygnałowych i czynników wzrostu wymaganych do zorganizowanego wzrostu ex vivo. Na początek umyj jelito, oddzielone od myszy poddanej eutanazji, na szalce Petriego zawierającej zimny, sterylny PBS.

Umieść jelito na szalce Petriego. Za pomocą nożyczek z końcówką kulową otwórz rurkę jelitową wzdłużnie i zmyj kał. Przenieś jelito do nowego naczynia zawierającego świeży, zimny PBS.

Po ponownym umyciu jelita pokrój jelito cienkie na jednocentymetrowe segmenty i przenieś je do 15-mililitrowej stożkowej rurki wypełnionej ośmioma mililitrami PBS. Potrząsaj probówką ręcznie w jednym lub dwóch cyklach na sekundę przez jedną minutę. Wlej roztwór na szalkę Petriego.

Za pomocą kleszczy przenieś segment do 50-mililitrowej stożkowej rurki wypełnionej 20 mililitrami roztworu A. Umieść probówki w inkubatorze wytrząsarki orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut. Po inkubacji energicznie potrząsać probówką ręcznie w czterech lub pięciu cyklach na sekundę przez jedną minutę, aby oddzielić nabłonek. Powtórz ten krok jeszcze raz.

Po pocięciu i umyciu fragmentów, jak pokazano wcześniej, przenieś je do nowej 50-mililitrowej probówki wypełnionej 10 mililitrami sterylnego PBS i odwróć probówkę w jednym lub dwóch cyklach na sekundę przez jedną minutę. Wlej roztwór na szalkę Petriego. Przenieś segmenty do nowej 15-mililitrowej probówki wypełnionej 10 mililitrami sterylnego PBS i delikatnie przechylaj w górę iw dół w jednym lub dwóch cyklach na sekundę przez dwie minuty.

Pod szafką bezpieczeństwa biologicznego użyj kleszczy, aby umieścić segmenty na sterylnej chusteczce laboratoryjnej, aby je wysuszyć. Po wysuszeniu pokrój segmenty dalej na kawałki. Przenieś pokrojone kawałki za pomocą kleszczy na sześciodołkową płytkę wypełnioną czterema mililitrami wstępnie podgrzanego roztworu do wytrawiania na dołek.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 50 minut i delikatnie potrząsaj płytką ręcznie co 20 minut. Następnie przenieś kawałki za pomocą pipety Pasteura do 15-mililitrowej stożkowej rurki wypełnionej czterema mililitrami DMEM. Potrząsaj probówką ręcznie z prędkością czterech lub pięciu cykli na sekundę przez jedną minutę, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.

Przefiltruj zawiesinę przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Odwirować filtrat o sile 700 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach 2% FBS/PBS.

Po ponownym odwirowaniu zawiesiny przy 700 g przez pięć minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 12 mililitrach pożywki hodowlanej. Na koniec wysiewaj zawiesinę komórkową na płytkach sześciodołkowych. Po dysocjacji mezenchymy telocyty tracą swoje cechy komórkowe, wykazując okrągłą morfologię komórkową i odzwierciedlają mniejszą liczbę komórek GFP-dodatnich w pierwszym dniu w porównaniu z kolejnymi dniami.

Kilka dni później telocyty wykazują małą, rozciągniętą morfologię komórek z krótkimi procesami komórkowymi. Po siedmiu do 10 dniach wysiewu telocyty odzyskują swoje cechy komórkowe, wykazując dużą, rozciągniętą morfologię komórek z długimi procesami cytoplazmatycznymi. Cytometria przepływowa ujawnia skład komórek.

Ogólnie rzecz biorąc, 69% wyizolowanych komórek było żywotnych w oparciu o barwienie DAPI. Spośród nich 60,9% reprezentowało zanieczyszczenie nabłonka oraz komórki odpornościowe i śródbłonka. Frakcja telocytów rozproszyła się odpowiednio powyżej 100 tys. i 70 tys. FSC i SSC i stanowiła prawie 10% bramkowanej mezenchymy.

Analiza FACS wykazała, że podzbiór telocytów można zdefiniować przez dodatnie barwienie do CD201 i GP38. Barwienie immunologiczne mezenchymy z jednodniowej hodowli przy użyciu tych markerów wykazało ekspresję tych markerów molekularnych, mimo że komórki nie wykazywały swoich cech komórkowych. Procedura ta skutkuje żywotną jednokomórkową zawiesiną komórek zrębu, która może być wykorzystana nie tylko do hodowli 2D, ale do dowolnego innego zastosowania, takiego jak kohodowla 3D z organoidami lub biodruk.