Izolacja i bezpośrednie przeprogramowanie neuronów astrocytów myszy

Astrocyty są interesującą autogenną populacją, która może być celem bezpośredniego programowania neuronalnego. Protokół ten zapewnia niezawodną technikę izolowania astrocytów hodowlanych o wysokiej czystości z różnych regionów lub ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten został zaprojektowany i zoptymalizowany w celu zbadania zdolności astrocytów do przeprogramowania w funkcjonalne neurony bez czynników zakłócających, takich jak różnice w czystości astrocytów w różnych populacjach startowych.

Demonstracja procedury zostanie przeprowadzona przez Boba Hersbacha, postdoca w laboratorium, oraz Tatianę Simon, pomoc techniczną w naszym laboratorium. Na początek umieść tułów uświęconej myszy na 35-milimetrowej szalce Petriego i trzymaj ją na lodzie. Otwórz skórę nożyczkami i usuń kręg małymi nożyczkami.

Następnie wydobądź rdzeń kręgowy i umieść go w buforze preparacyjnym na lodzie. Pod stereotaktycznym mikroskopem preparacyjnym z dwukrotnym powiększeniem usuń opony mózgowe z izolowanego rdzenia kręgowego za pomocą kleszczy i przenieś wypreparowaną i oczyszczoną tkankę rdzenia kręgowego do rurki C. Do każdej probówki C dodać 50 mikrolitrów enzymu P z zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych i 30 mikrolitrów wcześniej przygotowanej mieszanki enzymatycznej.

Odwróć probówki C i umieść je na podgrzanym dysocjacji, upewniając się, że cała tkanka została zebrana w wieczku probówki. Unikaj komórek, wyjmując kolumnę z separatora, dodając 800 mikrolitrów pożywki do hodowli astrocytów i wypychając komórki z kolumny za pomocą dołączonego tłoka. Płytki komórkowe w wcześniej przygotowanych kolbach hodowlanych poprzez dodanie 4,2 mililitra pożywki do hodowli astrocytów uzupełnionej 10 nanogramami na mililitr EGF i bFGF.

Nie jest konieczne powlekanie kolb hodowlanych dla astrocytów wyizolowanych z innych obszarów mózgu, ale zapewnia to lepszy substrat dla astrocytów wyizolowanych z rdzenia kręgowego. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Wykonać osadzenie astrocytów w komorze bezpieczeństwa biologicznego z pierwszym poziomem bezpieczeństwa i przygotować 24-dołkowe płytki z szkiełkami nakrywkowymi ze szkła pokrytego poli-D-lizyną, jak opisano w manuskrypcie tekstowym.

W przypadku posiewu wyizolowanie sześciu rdzeni kręgowych od myszy P2 daje około 1 miliona komórek. Odessać pożywkę z kolb hodowlanych T-12,5 zawierających wyhodowane astrocyty i przemyć raz 1x PBS. Odłącz astrocyty od kolby hodowlanej, dodając 0,5 mililitra 0,05% trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Delikatnie postukaj w bok kolby, aby uwolnić komórki z powierzchni kolby hodowlanej i sprawdź oderwanie pod mikroskopem jasnego pola przy użyciu 10-krotnego powiększenia. Przerwij trypsynazację za pomocą 2,5 mililitra pożywki do hodowli astrocytów i zbierz zawiesinę komórek w 15-mililitrowych probówkach. Wirować w temperaturze 300 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odessać supernatant i ponownie wysłać komórki w jednym mililitrze pożywki do hodowli astrocytów. Oblicz stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego systemu zliczania komórek. W zależności od liczby komórek rozcieńczyć zawiesinę komórkową świeżą pożywką astrocytów uzupełnioną EGF i bFGF w ilości 10 nanogramów na mililitr na czynnik.

Dodać 500 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka z wcześniej przygotowanych 24-dołkowych płytek i komórek hodowlanych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przygotuj pożywkę do różnicowania neuronów, dodając jeden mililitr suplementu B27 do 49 mililitrów podstawowej pożywki hodowlanej. Po 24 do 48 godzinach, w zależności od tego, czy komórki zostały transdukowane, czy transfekowane, zastąp pożywkę astrocytów jednym mililitrowym pożywką różnicującą neurony na studzienkę.

Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 9% dwutlenkiem węgla. Aby zwiększyć skuteczność przeprogramowywania, należy uzupełnić pożywkę różnicowania neuronów forskoliną i dorsomorfiną do końcowego stężenia odpowiednio 30 mikromolów i jednego mikromola podczas zastępowania pożywki astrocytów pożywką różnicującą. Decydując się na leczenie komórek forskoliną i dorsomorfiną, należy podać drugą dawkę dorsomorphiny dwa dni po początkowym leczeniu.

Dodaj ten drugi zabieg bezpośrednio do pożywki hodowlanej. Pierwotne hodowle astrocytów osiągnęły 80 do 90% zbieżności między siedmioma a 10 dniami po magnetycznym sortowaniu i posiewaniu komórek. Dzień po posiewie komórki zwykle pokrywały od 50 do 60% powierzchni szkiełka nakrywkowego.

Na tym etapie hodowle składały się głównie z astrocytów, podczas gdy inne typy komórek, takie jak neuroblasty, były praktycznie nieobecne. Po siedmiu dniach od transdukcji lub transfekcji indukowane komórki neuronalne były wyraźnie odróżnialne od astrocytów. Soma komórki neuronalnej była mniejsza niż nieprzeprogramowana Astrocyty miały długie procesy i były dodatnie dla markera neuronalnego, tubuliny beta trzech i ujemne dla markera astrocytów GFAP.

Po 21 dniach od transdukcji lub transfekcji wiele indukowanych neuronów było zdolnych do wystrzeliwania potencjałów czynnościowych i było dodatnich dla dojrzałego markera neuronalnego NeuN i białka synaptycznego Synaptophysin. Niezbędne jest prawidłowe przeanalizowanie obszaru zainteresowania. Unikanie zanieczyszczenia otaczającymi tkankami.

Należy zachować ostrożność w celu usunięcia opon mózgowo-rdzeniowych i zwojów korzenia grzbietowego z izolowanego rdzenia kręgowego. Metoda ta może być stosowana do izolowania astrocytów z różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego, w tym kory mózgowej, grzbietowego śródmózgowia i móżdżku. W przyszłości technika ta pozwoli nam poszerzyć naszą wiedzę na temat regionalnych astrocytów i ich potencjału do przeprogramowania w funkcjonalne neurony.