Name: Organotypowe kultury eksplantatów siatkówki od makaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę kultury eksplantatów siatkówki od makaka do badania zwyrodnienia siatkówki zależnego od szlaku cGMP-PKG. Model ten umożliwia analizę mechanizmów śmierci fotoreceptorów i ocenę terapeutyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81960180), Zinke heritage Foundation oraz Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Dziękujemy prof. Longbao Lv (Instytut Zoologii, Chińska Akademia Nauk, Kunming, Chiny) za podzielenie się małpimi gałkami ocznymi wykorzystanymi w tym badaniu.

Badanie na zwierzętach zostało zrecenzowane i zatwierdzone przez Komitet Oceny Etyki Instytutu Zoologii Chińskiej Akademii Nauk (IACUC-PE-2022-06-002) oraz przegląd etyki zwierząt i protokół na zwierzętach Uniwersytetu Yunnan (YNU20220149).
1. Przygotowanie eksplantatów siatkówki
<ol>
	<li>Pobrać gałki oczne naczelnych od makaków typu dzikiego w wieku od 1 do 3 lat, przechowywać w roztworze do przechowywania tkanek i transportować na lodzie w ciągu 3 godzin od wyłuszczenia po uśmierceniu małp lub po naturalnej śmierci.</li>
	<li>W celu przygotowania roztworu proteinazy K należy rozpuścić 25 mg proteinazy K w 250 μl wody destylowanej, a następnie dodać 225 μl roztworu do 18,5 ml podłoża podstawowego (R16).</li>
	<li>Przemyj gałki oczne w 10 ml 5% jodu powidonu (powidon-jod: woda = 1:19) przez 30 s i zanurz je w 5% penicylinie/streptomycynie (PEN / STREP) :p buforowanej hosfatem soli fizjologicznej = 1:19 przez 1 minutę, aby uniknąć skażenia bakteryjnego. Następnie inkubować gałki oczne w 10 ml pożywki R16 przez 5 minut.</li>
	<li>Wstępnie podgrzać roztwór proteinazy K w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Następnie zanurz gałki oczne w 10 ml roztworu proteinazy K i inkubuj przez 2 minuty. Zanurzyć gałki oczne w 10 ml roztworu R16 + płodowej surowicy bydlęcej (1:1), inkubować przez 5 minut, a następnie przenieść gałki oczne do 10 ml świeżego R16 w celu ostatecznego przemycia.</li>
	<li>Oddziel twardówkę, rogówkę, tęczówkę, soczewkę i ciało szkliste, a następnie odetnij siatkówkę z 4 stron za pomocą pęsety i nożyczek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A-L).</li>
	<li>Pokrój eksplantaty siatkówki za pomocą ostrzy trepanacyjnych na pięć sekcji - 4 mm ostrze trepanacyjne dla strony nosowej/skroniowej/górnej/dolnej i 6 mm ostrze trepanacyjne dla strony środkowej (zawierające tarczę wzrokową i plamkę żółtą; <silna klasa="xfig">Rysunek 1M-O). Wyciąć w następującej odległości od głowy nerwu wzrokowego: 1,5 mm dla nosa, 4 mm dla skroniowej i 2 mm zarówno dla strony górnej, jak i dolnej.</li>
	<li>Przenieś eksplantaty siatkówki (zawierające siatkówkę i naczyniówkę) za pomocą depresora powiek i umieść je na środku wkładki, stroną fotoreceptorową do góry (ryc. 1P). Umieść około 1 ml kompletnego podłoża (R16 uzupełnionego BSA, transferyną, progesteronem, insuliną, T3, kortykosteronem, witaminą B1, witaminą B12, retinolem, octanem retinylu, DL-tokoferolem, octanem tokoferylu, kwasem linolowym, L-cysteiną HCl, glutationem, glutaminą, witaminą C) poniżej membrany na płytce, aby całkowicie pokryć siatkówkę.</li>
</ol>
2. Hodowla eksplantatów siatkówki naczelnych
<ol>
	<li>Hodować eksplantaty siatkówki w kompletnym pożywce i umieszczać w inkubatorze o temperaturze 37 °C, napowietrzonym nawilżonym 5%CO2.</li>
	<li>Zastosować leczenie farmakologiczne w odpowiednim stężeniu do pożywki hodowlanej siatkówki (np. zaprynast w stężeniach 100 μM, 200 μM lub 400 μM). Stosować co najmniej trzy eksplantaty na każdy warunek leczenia i stosować eksplantaty bez leku jako kontrolę. Leczyć lekiem przez 4 dni.</li>
</ol>
3. Utrwalanie i kriosekcja
<ol>
	<li>Inkubować eksplantaty siatkówki z 1 ml paraformaldehydu (PFA) przez 45 minut, przepłukać je krótko 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie inkubować z 10% sacharozą przez 10 minut, 20% sacharozą przez 20 minut i 30% sacharozą przez 30 minut (1 ml na każdy eksplant siatkówki).</li>
	<li>Wytnij eksplantaty siatkówki za pomocą ostrzy trepanowanych, aby zapewnić spójność wielkości eksplantatów uzyskanych z różnych miejsc o następujących cechach: cztery ćwiartki na obrzeżach, 6 mm pośrodku. Następnie przenieś eksplantaty siatkówki do blaszanego pudełka (około 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) z podłożem do zatapiania OCT, aby pokryć tkankę. Natychmiast zamrozić skrawki tkanek w ciekłym azocie i umieścić w lodówce o temperaturze -20 °C do przechowywania.</li>
	<li>Za pomocą ostrego ostrza przyciąć agar do małego bloku zawierającego próbkę tkanki, pociąć bloki próbki na odcinki 10 μm i umieścić je na szkiełkach mikroskopu adhezyjnego za pomocą miękkiej szczoteczki. Następnie suszyć przez 45 minut w temperaturze 40 °C i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
4. Immunohistochemia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Barwienie cGMP
	<ol>
		<li>Wysuszyć szkiełka i narysować hydrofobowy pierścień wokół odcinków siatkówki za pomocą pisaka blokującego płyn, aby pokryć próbki.</li>
		<li>Zanurzyć szkiełka w 200 μl 0,3% buforu fosforanowego soli fizjologicznej i Triton X-100 na szkiełko (PBST) na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie w roztworze blokującym (5% normalnej surowicy osła, 0,3% PBST, 1% BSA, 200 μl na szkiełko) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Próbki inkubować przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym (1:250, anty-cGMP owiec, 200 μl na szkiełko) przygotowanym w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C, a następnie płukać PBS przez 10 minut (200 μl na szkiełko) 3x.</li>
		<li>Inkubować próbki z przeciwciałem drugorzędowym (1:300, Alxea Fluor 488, 200 μl na szkiełko) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie płukać PBS przez 10 minut, 3 razy. Przykryć próbki pożywką do mocowania zapobiegającą blaknięciu zawierającą 4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 minut przed obrazowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie TUNEL
	<ol>
		<li>Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej przez 15 minut i narysować wodoodporny pierścień barierowy wokół próbek tkanki siatkówki za pomocą płynnego nożyka, a następnie inkubować je w 40 ml PBS przez 15 minut.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w 42 ml (na pięć szkiełek) TBS (0,05 M buforu Tris) w temperaturze 37 °C. Odessać TBS i inkubować próbki z 6 μl proteinazy K przez 5 minut. Następnie myj szkiełka 3x TBS przez 5 minut za każdym razem.</li>
		<li>Szkiełka należy wystawić na działanie 40 ml roztworu etanolu i kwasu octowego w choplinie, przykryć przezroczystym arkuszem i inkubować w temperaturze -20 °C przez 5 minut. Myć szkiełka 3x TBS przez 5 minut za każdym razem.</li>
		<li>Wystawić szkiełka na działanie roztworu blokującego (1% BSA; 200-300 μl na szkiełko zgodnie z wymaganiami) i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przygotować roztwór zestawu TUNEL, TMR czerwony, w następującej proporcji: 62,50 μl roztworu blokującego (1% BSA), 56,25 μL roztworu znakującego (TMR-dUTP) i 6,25 μL enzymu (proporcja na każde szkiełko). Dodać około 130 μl tego roztworu na szkiełko podstawowe i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Następnie myć szkiełka PBS przez 5 min (200 μL na szkiełko), 2x.</li>
		<li>Na próbkach umieścić szkiełka podstawowe zawierające 1-2 krople podłoża do mocowania zapobiegającego blaknięciu z DAPI, a następnie inkubować szkiełka w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 minut przed obrazowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie cGMP w połączeniu z barwieniem TUNEL
	<ol>
		<li>Po barwieniu cGMP nastąpiło barwienie TUNEL. Postępuj zgodnie z krokami barwienia TUNEL od kroku 4.2.1 do kroku 4.2.5, a następnie kontynuuj kroki barwienia cGMP od kroku 4.1.2 do kroku 4.1.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj mikroskopię świetlną i fluorescencyjną z parametrami kamery w następujący sposób: czas naświetlania = 125 ms, rozmiar ROI = 2752 x 2208, kolor = B/M. Rób obrazy za pomocą oprogramowania. Wyobraź sobie cztery różne pola za pomocą kamery cyfrowej przy 20-krotnym powiększeniu z każdej sekcji i uzyskaj reprezentatywne obrazy z centralnych obszarów siatkówki za pomocą DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), ze skanowaniem Z-Stack o interwale = 1 μm i opcjonalnie = 1,251 μm.</li>
</ol>

<ol><li>O'Neal, T. B., Luther, E. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Neal%2C+TB+%22StatPearls%22">StatPearls</a>. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).</li>
<li>Power, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+hereditary+photoreceptor+degeneration+-+Focus+on+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772(2020).</li>
<li>Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKG+activity+causes+photoreceptor+cell+death+in+two+retinitis+pigmentosa+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).</li>
<li>Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cGMP+pathway+and+inherited+photoreceptor+degeneration%3A+Targets%2C+compounds%2C+and+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers.</a> Genes (Basel). 10 (6), 453(2019).</li>
<li>Arango-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+common+non-apoptotic+cell+death+mechanism+in+hereditary+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (11), 112142(2014).</li>
<li>Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKG-dependent+cell+death+in+661W+cone+photoreceptor-like+cell+cultures+%28experimental+study%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).</li>
<li>Power, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+spatiotemporal+mapping+reveals+divergent+cell+death+pathways+in+three+mouse+models+of+hereditary+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration.</a> Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).</li>
<li>Sancho-Pelluz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+HDAC+activation+is+critical+for+neurodegeneration+in+the+rd1+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse.</a> Cell Death & Disease. 1 (2), 24(2010).</li>
<li>Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+change+in+degenerating+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors.</a> Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).</li>
<li>Trifunović, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).</li>
<li>Samardzija, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC+inhibition+ameliorates+cone+survival+in+retinitis+pigmentosa+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice.</a> Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).</li>
<li>Schön, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+successfully+delays+degeneration+in+a+mouse+model+of+PDE6A-linked+Retinitis+Pigmentosa+%28RP43%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43).</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).</li>
<li>McGregor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+therapy+restores+retinal+activity+in+primate+for+at+least+a+year+following+photoreceptor+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation.</a> Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).</li>
<li>Lingam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-grade+human+iPSC-derived+retinal+photoreceptor+precursor+cells+rescue+cone+photoreceptor+damage+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464(2021).</li>
<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cGMP-signalling+and+calcium-signalling+in+photoreceptor+cell+death%3A+perspectives+for+therapy+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development.</a> Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).</li>
<li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+retina%3A+Development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li>
<li>Schnichels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+in+a+dish%3A+Cell+cultures%2C+retinal+explants+and+animal+models+for+common+diseases+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880(2021).</li>
<li>Maryam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+human+cGMP+specific+Phosphodiesterase+6+%28PDE6%29%3A+Structural+implications+of+somatic+mutations+in+cancer+and+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).</li>
<li>Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+in+vitro+cellular+model+for+molecular+studies+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440(2021).</li>
<li>Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-PKG+dependent+transcriptome+in+normal+and+degenerating+retinas%3A+Novel+insights+into+the+retinitis+pigmentosa+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology.</a> Experimental Eye Research. 212, 108752(2021).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Fototransdukcja wzrokowa odnosi się do procesu biologicznego, w którym sygnały świetlne są przekształcane w sygnały elektryczne przez komórki fotoreceptorów w siatkówce oka. Komórki fotoreceptorowe są spolaryzowanymi neuronami zdolnymi do fototransdukcji i istnieją dwa różne typy fotoreceptorów nazywane pręcikami i czopkami od kształtów ich zewnętrznych segmentów. Pręciki są odpowiedzialne za widzenie skotopowe, a czopki są odpowiedzialne za widzenie fotopowe i wysokie ostrości. Dziedziczne RD odnosi się do chorób neurod...

Dziedziczne zwyrodnienie siatkówki (RD) charakteryzuje się postępującą śmiercią komórki fotoreceptorowej i jest spowodowane mutacjami w wielu różnych genach chorobotwórczych1. Końcowym skutkiem RD jest utrata wzroku i w zdecydowanej większości przypadków choroba pozostaje nieuleczalna do dziś. Dlatego ważne jest, aby badać mechanizmy komórkowe prowadzące do śmierci fotoreceptorów przy użyciu modeli, które wiernie odwzorowują stan chorobowy człowieka. W tym przypadku szczególnie interesujące są modele oparte na naczelnych ze względu na ich bliskość do ludzi. Warto zauważyć, że takie modele mogą przyczynić się do opracowania odpowiednich interwencji terapeutycznych, które mogą zatrzymać lub opóźnić śmierć komórek fotoreceptorowych.
Poprzednie badania nad mechanizmami śmierci komórek w RD wykazały, że spadek lub utrata aktywności fosfodiesterazy 6 (PDE6) spowodowana mutacjami genu wyzwalającego RD prowadzi do zmniejszonej hydrolizy cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP)2,3. cGMP jest specyficznym agonistą cyklicznych kanałów jonowych bramkowanych nukleotydami (CNGC) w zewnętrznych segmentach pręcików (ROS), a także jest kluczową cząsteczką odpowiedzialną za Konwersja sygnałów świetlnych na sygnały elektryczne w komórkach fotoreceptorów kręgowców<klasa SUP="xref">4. Zmniejszona hydroliza cGMP powoduje akumulację cGMP w ROS, co prowadzi do otwarcia CNGC 5. W konsekwencji aktywowane są szlaki fototransdukcji, co powoduje wzrost stężeń kationów w komórkach fotoreceptorów. Proces ten nakłada obciążenie metaboliczne na fotoreceptory, które nadaktywowane, na przykład przez mutacje PDE6, mogą powodować śmierć komórki.
Wiele badań wykazało, że znaczne nadmierne nagromadzenie cGMP w fotoreceptorach modeli myszy z różnymi mutacjami genu RD może spowodować aktywację kinazy białkowej zależnej od cGMP (PKG)3,6. Prowadzi to do znacznego wzrostu liczby umierających, TUNEL-dodatnich komórek i stopniowego ścieńczenia warstwy komórek fotoreceptorowych. Wcześniejsze badania sugerują, że nadaktywacja PKG spowodowana podwyższonym poziomem cGMP jest koniecznym i wystarczającym warunkiem do indukcji śmierci komórki fotoreceptora2,5. Badania na różnych mysich modelach RD wykazały również, że aktywacja PKG indukowana podwyższonym poziomem cGMP w fotoreceptorach prowadzi do nadmiernej aktywacji dalszych efektorów, takich jak polimeraza poli-ADP-rybozy 1 (PARP1), deacetylaza histonowa (HDAC) i kalpaina2,7,8,9. Implikuje to związki przyczynowo-skutkowe między tymi różnymi białkami docelowymi a śmiercią komórki fotoreceptorowej.
Jednak poprzednie badania nad patologią, toksykofarmakologią i terapią RD opierały się głównie na mysich modelach dla RD10,11,12. Niemniej jednak nadal istnieją ogromne trudności w klinicznym przełożeniu tych wyników. Wynika to ze znacznych różnic genetycznych i fizjologicznych między myszami a ludźmi, zwłaszcza w odniesieniu do budowy siatkówki. W przeciwieństwie do tego, naczelne inne niż ludzie (NHP) mają również wysoki stopień podobieństwa do ludzi pod względem cech genetycznych, wzorców fizjologicznych i regulacji czynników środowiskowych. Na przykład terapia optogenetyczna była badana jako sposób na przywrócenie aktywności siatkówki w modelu NHP13. Lingam i współpracownicy wykazali, że indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki prekursorowe fotoreceptorów siatkówki pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą uratować uszkodzenie fotoreceptorów stożków w NHP14. Dlatego modele NHP są ważne dla badania patogenezy RD i opracowywania skutecznych metod leczenia. W szczególności modele NHP RD, wykazujące mechanizmy chorobotwórcze podobne do tych u ludzi, mogą odegrać kluczową rolę w badaniach nad opracowywaniem i analizą toksykofarmakologiczną in vivo nowych leków.
Ze względu na długi cykl życia, wysoki poziom trudności technicznych i wysokie koszty związane z tworzeniem modeli naczelnych in vivo, stworzyliśmy model in vitro naczelnych (NHP) przy użyciu kultur eksplantowanej siatkówki makaka. Najpierw wyselekcjonowano makaki typu dzikiego w wieku 1-3 lat do hodowli in vitro eksplantatów siatkówki, które obejmowały kompleks siatkówka-RPE-naczyniówka. Eksplantaty poddano następnie działaniu zaprynastu o różnych stężeniach inhibitora PDE6 (100 μM, 200 μM i 400 μM) w celu indukowania szlaku sygnałowego cGMP-PKG. Śmierć komórki fotoreceptorów określono ilościowo i przeanalizowano za pomocą testu TUNEL, a akumulację cGMP w eksplantatach zweryfikowano za pomocą immunofluorescencji. Biorąc pod uwagę wysoki stopień podobieństwa w odniesieniu do rozmieszczenia i morfologii komórek, grubości warstwy siatkówki i innych cech fizjologicznych siatkówki między małpami a ludźmi, ustanowienie szlaku sygnałowego cGMP-PKG w modelu siatkówki in vitro może ułatwić przyszłe badania nad patogenezą RD, a także badania nad rozwojem i toksykofarmakologią nowych leków do leczenia RD.

<table><tbody><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td>Roztwór blokujący</td></tr><tr><td>Kortykosteron</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td>Suplementy kompletnego podłoża</td></tr><tr><td>DL-tokoferolu</td><td>Sigma</td><td>T1539</td><td>Suplementy kompletnego średniego</td></tr><tr><td>osła anty owce, Alxea Fluor 488</td><td>Life technologies corporation</td><td>A11015</td><td>Przeciwciało drugorzędowe cGMP</td></tr><tr><td>Roztwór etanolu i kwasu octowego</td><td>Shyuanye</td><td>R20492</td><td>Płyn utrwalający</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gemini</td><td>900-108</td><td>Roztwór blokujący</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Imager.M2</td><td>Obrazowanie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td>Suplementy kompletnego średniego</td></tr><tr><td>glutationu</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td>Suplementy kompletnego</td></tr><tr><td>zestawu do wykrywania śmierci komórek in situ, test TMR red</td><td>Roche</td><td>12156792910</td><td>TUNEL</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td>Suplementy kompletnego podłoża</td></tr><tr><td>L-cysteiny HCl</td><td>Sigma</td><td>C7477</td><td>Suplementy kompletnego podłoża</td></tr> kwasu <tr><td>linolowego</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td>Suplementy kompletnego podłoża</td></tr><tr><td>MACS Przechowywanie tkanek Rozwiązanie</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-008</td><td>Zoptymalizowane przechowywanie świeżych próbek narządów i tkanek</td></tr><tr><td>Normalne surowice osła</td><td>Solarbio</td><td>SL050</td><td>Roztwór blokujący</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td>Środek utrwalający</td></tr><tr><td>PEN. / PACIORKOWIEC 100 razy;</td><td>Millipore</td><td>TMS-AB2-C</td><td>Penicylina / Streptomycyna</td></tr><tr><td>antybiotyki Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)</td> <td>Solarbio</td><td>P1010</td><td>Roztwór buforowy</td></tr><tr><td>Powidon-jod</td><td>Shanghailikang</td><td>310411</td><td>Środek dezynfekujący</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Suplementy kompletnej</td></tr><tr><td>średniej proteinazy K</td><td>Millpore</td><td>539480</td><td>Rozkład białka</td></tr><tr><td>R16 medium</td><td>Life technologies corporation</td><td>074-90743A</td><td>Podstawowy średni</td></tr><tr><td>retinol</td><td>Sigma</td><td>R7632</td><td>Suplementy kompletnego średniego</td></tr><tr><td>octanu retinylu</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td>Suplementy kompletnego średniego</td>owca</tr><tr><td>anty-cGMP</td><td>Jan de Vente, Uniwersytet w Maastricht, Holandia</td><td></td><td>Pierwszorzędowe przeciwciało cGMP</td></tr><tr><td>sacharozy</td><td>GHTECH</td><td>57-50-1</td><td>Środek odwadniający</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>Suplementy kompletnego podłoża</td></tr><tr><td>Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>Podłoże do zatapiania</td></tr><tr><td>Octan tokoferylu</td><td>Sigma</td><td>T1157</td><td>Suplementy kompletnego</td></tr><tr><td>podłoża Transferyna</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td>Suplementy kompletnego podłoża</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning Incorporated</td><td>3412</td><td>Kultura komórkowa / tkankowa</td></tr><tr><td>Tris-buffer (TBS)</td><td>Solarbio</td><td>T1080</td><td>Bufor blokujący</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>9002-93-1</td><td>Środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Medium z DAPI</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td>Podłoże montażowe</td></tr><tr><td>Witamina B1</td><td>Sigma</td><td>T1270</td><td>Suplementy kompletnego podłoża</td></tr><tr><td>Witamina B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td>Suplementy kompletnej pożywki</td></tr><tr><td>Witamina C</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td>Suplementy kompletnej pożywki</td></tr> inhibitora <tr><td>Zaprinast</td><td>Sigma</td><td>Z0878</td><td>PDE6</td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Imager M2</td><td>  Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td></td> mikroskop <td>pionowy</td></tr><tr><td>LSM 900 Airyscan</td><td></td><td></td><td>laserowy mikroskop skaningowy o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Zeiss Axiocam</td><td>  Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td>aparat cyfrowy</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovision4.7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gałki oczne naczelnych makaków typu dzikiego</td><td>INSTYTUT ZOOLOGII</td> <td>KUNMINGSYXK (<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg" style="margines: auto; ">) K2017 -0008</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche, Niemcy),</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotypowe kultury eksplantatów siatkówki od makaka

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Dziedziczne zwyrodnienie siatkówki (RD) charakteryzuje się postępującą śmiercią komórki fotoreceptorowej. Nadmierna aktywacja szlaku kinazy białkowej zależnej od monofosforanu guanozyny (cGMP) (PKG) w komórkach fotoreceptorowych powoduje śmierć komórki fotoreceptorowej, szczególnie w modelach zawierających mutacje fosfodiesterazy 6b (PDE6b). Wcześniejsze badania nad RD wykorzystywały głównie modele mysie, takie jak myszy rd1 lub rd10. Biorąc pod uwagę genetyczne i fizjologiczne różnice między myszami a ludźmi, ważne jest, aby zrozumieć, w jakim stopniu siatkówki naczelnych i gryzoni są porównywalne. Makaki mają wysoki poziom podobieństwa genetycznego do ludzi. W związku z tym makaki typu dzikiego (w wieku 1-3 lat) wybrano do hodowli in vitro eksplantatów siatkówki, które zawierały kompleks siatkówka-nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE)-naczyniówka. Te eksplantaty traktowano różnymi stężeniami inhibitora PDE6 zaprynastu w celu indukowania szlaku sygnałowego cGMP-PKG i symulacji patogenezy RD. Akumulację cGMP i śmierć komórek w eksplantatach siatkówki naczelnych zweryfikowano następnie za pomocą immunofluorescencji i testu TUNEL. Model siatkówki naczelnych ustalony w tym badaniu może posłużyć do odpowiednich i skutecznych badań nad mechanizmami RD zależnego od cGMP-PKG, a także do opracowania przyszłych podejść do leczenia.

W niniejszym badaniu przeprowadzono hodowlę eksplantów siatkówki małpy makaka, wykorzystując eksplanty zawierające kompleks siatkówka-RPE-naczyniówka (Rycina 1, Rycina uzupełniająca S1). W porównaniu z in vitro W przypadku hodowli komórek siatkówki z wykorzystaniem siatkówki bez przytwierdzonego nabłonka pigmentowego (RPE) i naczyniówki, nasza hodowla eksplantów ułatwia lepsze przeżycie komórek, a w konsekwencji przedłuża przeżycie fotoreceptorów.
<p class="jove...

Eksplantaty siatkówki uzyskane od makaków dzikich były hodowane in vitro. Zwyrodnienie siatkówki i szlak sygnałowy cGMP-PKG indukowano za pomocą inhibitora PDE6 zaprynastu. Akumulację cGMP w eksplantatach przy różnych stężeniach zaprynastów zweryfikowano za pomocą immunofluorescencji.

Organotypowe kultury eksplantatów siatkówki od makaka

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Model siatkówki naczelnych ustalony w tym badaniu oferuje badanie kompleksowego mechanizmu i rozwoju terapeutycznego pogorszenia siatkówki zależnego od cGMP-PKG. Ten indywidualny model naczelnych innych niż człowiek rezerwuje potwierdzenie tkanki siatkówki i interakcje międzykomórkowe, co umożliwia lepszą symulację warunków in vivo. Zmniejsza również wykorzystanie zwierząt i skraca czas trwania eksperymentu.Zapewnienie kontrolnego eksperymentalnego podejścia do badania rozwoju lub zwyrodnienia siatkówki. Przygotowanie eksplantatów siatkówki należy rozpocząć od przemycia gałek ocznych wyizolowanych od makaków typu dzikiego 10 mililitrami 5% jodowidonu przez 30 sekund. Aby uniknąć skażenia bakteryjnego, zanurz gałki oczne w 5% roztworze PBS streptomycyny penicyliny na minutę przed inkubacją w 10 mililitrach pożywki R16 przez pięć minut.Następnie zanurz gałki oczne w 10 mililitrach roztworu białka Ace-K podgrzanego do 37 stopni Celsjusza i inkubowanego przez dwie minuty. Następną inkubację w 10 mililitrach roztworu surowicy bydlęcej jeden do jednego R16 plus płodu przez pięć minut. Poddaj końcowe mycie w 10 mililitrach świeżego R16.Po zakończeniu oddziel twardówkę, rogówkę, tęczówkę,

organotypic-retinal-explant-cultures-from-macaque-monkey

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy artykuł przedstawia metodę preparowania i inkubacji siatkówki królika oraz zapośredniczony przez cząsteczki transfer genów plazmidów kodujących GFP lub różne markery subkomórkowe do komórek zwojowych siatkówki.

Organotypowa hodowla siatkówki dorosłego królika

Niniejszy artykuł wideo demonstruje sposób tworzenia organotypowych kultur całej siatkówki oraz procedurę cytospinową służącą do analizy efektów indukowanych egzogennie. Organotypowe kultury całej siatkówki odwzorowują warunki in vivo i znacząco ułatwiają dostęp do siatkówek myszy w manipulacjach eksperymentalnych, pozwalając jednocześnie uniknąć wad klasycznych modeli zwierzęcych u myszy.

Organotypowa hodowla całego preparatu siatkówki mysiej typu in vivo

W niniejszej pracy opisujemy niskokosztową technikę organotypowej hodowli siatkówki dorosłej świni przez siedem dni. W skrócie, do oddzielenia siatkówki nerwowej od RPE wykorzystano sterylny papier filtracyjny, a następnie umieszczono ją stroną z fotoreceptorami do góry na wkładce uniesionej za pomocą specjalnie wykonanego statywu.

Organotypowa hodowla pełnowartościowej siatkówki dorosłej świni

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Protokół opisuje organotypowe eksplantaty myszy neuroretina, hodowana razem z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE), w pożywce zdefiniowanej przez R16, wolna od surowicy i antybiotyków. Metoda ta jest stosunkowo prosta do wykonania, tańsza i bardziej czasochłonna w porównaniu z eksperymentami in vivo i może być dostosowana do wielu zastosowań eksperymentalnych.

Długotrwała, pozbawiona surowicy hodowla organtypowych eksplantatów siatkówki myszy z nienaruszonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Naczelny (NHP) jest idealnym modelem do badania terapii komórkowej ludzkiej siatkówki ze względu na podobieństwa anatomiczne i genetyczne. W artykule opisano metodę podplamkowego przeszczepu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w oku NHP oraz strategie zapobiegania powikłaniom śródoperacyjnym związanym z manipulacją plamki żółtej.

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Poznaj metodę kultury eksplantatów siatkówki od makaka do badania zwyrodnienia siatkówki zależnego od szlaku cGMP-PKG. Model ten umożliwia analizę mechanizmów śmierci fotoreceptorów i ocenę terapeutyczną.

Organotypowe kultury eksplantatów siatkówki od makaka

Przeglądaj więcej filmów