Organotypowe kultury eksplantatów siatkówki od makaka

Model siatkówki naczelnych ustalony w tym badaniu oferuje badanie kompleksowego mechanizmu i rozwoju terapeutycznego pogorszenia siatkówki zależnego od cGMP-PKG. Ten indywidualny model naczelnych innych niż człowiek rezerwuje potwierdzenie tkanki siatkówki i interakcje międzykomórkowe, co umożliwia lepszą symulację warunków in vivo. Zmniejsza również wykorzystanie zwierząt i skraca czas trwania eksperymentu.

Zapewnienie kontrolnego eksperymentalnego podejścia do badania rozwoju lub zwyrodnienia siatkówki. Przygotowanie eksplantatów siatkówki należy rozpocząć od przemycia gałek ocznych wyizolowanych od makaków typu dzikiego 10 mililitrami 5% jodowidonu przez 30 sekund. Aby uniknąć skażenia bakteryjnego, zanurz gałki oczne w 5% roztworze PBS streptomycyny penicyliny na minutę przed inkubacją w 10 mililitrach pożywki R16 przez pięć minut.

Następnie zanurz gałki oczne w 10 mililitrach roztworu białka Ace-K podgrzanego do 37 stopni Celsjusza i inkubowanego przez dwie minuty. Następną inkubację w 10 mililitrach roztworu surowicy bydlęcej jeden do jednego R16 plus płodu przez pięć minut. Poddaj końcowe mycie w 10 mililitrach świeżego R16.

Po zakończeniu oddziel twardówkę, rogówkę, tęczówkę, soczewkę i ciało szkliste. Następnie odetnij siatkówkę z czterech stron pęsetą i nożyczkami. Następnie użyj cienkiego ostrza z drzewa o grubości czterech mililitrów, aby przeciąć eksplant siatkówki na 1,5 milimetra od strony nosa, cztery milimetry od strony skroniowej i dwa milimetry od górnej i dolnej strony głowy nerwu wzrokowego.

Następnie za pomocą sześciomilimetrowego cienkiego ostrza drzewnego odetnij środkową stronę eksplantatu siatkówki zawierającą tarczę nerwu wzrokowego i plamkę żółtą. Za pomocą szerokiej pipety wyciągnij eksplant siatkówki zawierający siatkówkę i naczyniówkę i umieść go na środku wkładki stroną fotoreceptorową do góry. Całkowicie zanurz siatkówkę w jednym mililitrze całego podłoża na płytce poniżej membrany.

Posadź eksplantaty siatkówki i umieść je w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z nawilżonym 5% dwutlenkiem węgla. Podawaj eksplantatom odpowiednie stężenie leku przez cztery dni. Należy użyć co najmniej trzech eksplantatów na każdy warunek leczenia i użyć eksplantatów bez leku jako kontroli pozytywnej.

W celu utrwalenia i kriosekcji należy potraktować eksplantaty siatkówki jednym mililitrem aldehydu paraform przez 45 minut. Po krótkim spłukaniu jednym mililitrem PBS seryjnie inkubuj eksplantaty w 10% sacharozie przez 10 minut, 20% sacharozie przez 20 minut i 30% sacharozy przez 30 minut. Wytnij eksplantaty siatkówki równomiernie z czterema ćwiartkami na obwodzie i sześcioma milimetrami pośrodku.

Następnie przenieś eksplantaty siatkówki do blaszanego pudełka o wymiarach około 1,5 na 1,5 na 1,5 centymetra ze związkiem o optymalnej temperaturze cięcia, osadzającym podłoże pokrywające eksplantat. Natychmiast zamroź skrawki tkanki w ciekłym azocie i umieść je w lodówce o temperaturze 20 stopni do przechowywania. Następnie przytnij agar do małego bloku zawierającego próbkę tkanki.

Pokrój bloki na bloki 10 mikrometrów i umieść je na szkiełkach mikroskopu adhezyjnego za pomocą miękkiej szczoteczki. Następnie susz skrawki przez 45 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. W przypadku cyklicznego barwienia monofosforanem guanozyny lub cGMP należy narysować hydrofobowy pierścień wokół wysuszonych skrawków siatkówki za pomocą płynnego pisaka blokującego i przykryć próbki.

Zanurz szkiełka w 200 mikrolitrach 0,3% PBS i Triton-X100 lub PBST na 10 minut, a następnie poddaj je godzinnej obróbce w 200 mikrolitrach roztworu blokującego w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować szkiełko z próbką przez noc z 200 mikrolitrami przeciwciała pierwszorzędowego przygotowanego w roztworze blokującym w temperaturze czterech stopni Celsjusza i płukać je trzykrotnie PBS przez 10 minut. Inkubować szkiełko w 200 mikrolitrach przeciwciała wtórnego przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Po trzech przemyciach PBS przez 10 minut, przykryć próbki pożywką mocującą zapobiegającą blaknięciu zawierającą DAPI i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut przed obrazowaniem. Suszyć szkiełko w temperaturze pokojowej przez 15 minut i narysować wodoodporny pierścień barierowy wokół próbki tkanki siatkówki za pomocą płynnego pisaka blokującego. Po inkubacji z 40 mililitrami PBS przez 15 minut potraktuj skrawki 42 mililitrami 0,05 molowego buforu trisowego lub TBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Odessać TBS, inkubować próbki z sześcioma mikrolitrami proteinazy K przez pięć minut i przemywać szkiełka trzykrotnie PBS przez pięć minut każda. Wystaw szkiełka na działanie 40 mililitrów etanolu roztworu kwasu octowego w chplulinie. Przykryj przezroczystym arkuszem i inkubuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Umyj szkiełka trzykrotnie TBS przez pięć minut za każdym razem. Wystawić szkiełka na działanie 200 do 300 mikrolitrów roztworu blokującego lub 1% BSA i inkubować je w komorze wilgotnościowej przez godzinę. W ilości około 130 mikrolitrów czerwonego roztworu TMR na szkiełko i po godzinie należy przeprowadzić dwa płukania po 200 mikrolitrów PBS przez pięć minut każde.

Na próbkach umieścić szkiełka podstawowe zawierające jedną do dwóch kropli podłoża do mocowania zapobiegającego blaknięciu z DAPI i inkubować szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut przed obrazowaniem. Po sekwencyjnym barwieniu za pomocą tunelu i cGMP przystąp do mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej, dostosowując parametry kamery. Uchwyć obrazy czterech pól z każdej sekcji za pomocą oprogramowania z kamerą cyfrową w 20-krotnym powiększeniu.

Uzyskaj reprezentatywne obrazy z centralnych obszarów siatkówki za pomocą DAPI, EGFP i TMR ze skanowaniem stosu z i odstępem jednego mikrometra i opcjonalnie 1,251 mikrometra. W eksplantatach siatkówki traktowanych różnymi stężeniami inhibitorów PDE6 Zaprinast liczba komórek tunelowych i cGMP dodatnich była znacznie zwiększona w zewnętrznej warstwie jądrowej w porównaniu z grupą kontrolną. Wysoki odsetek komórek tunelowo-dodatnich sugeruje, że wzrost aktywności cGMP może nasilać zwyrodnienie komórek siatkówki wywołane przed gniazdem, a akumulacja cGMP odgrywa rolę w zwyrodnieniu fotoreceptorów.

Przygotowanie eksplantatu należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe. Op rozproszenie zwierząt piątki i dowolna akumulacja, ponieważ poprawia to przeżywalność komórek i poprawia status włókna w seriach stosów masowych. W największym stopniu widoczne ciało szkliste powinno być oczyszczone sterydami.

Unikaj kontaktu z warstwami włókien nerwowych siatkówki podczas przenoszenia eksplantatów siatkówki, aby zapobiec mechanicznemu uszkodzeniu komórek. Należy pamiętać, że aby zapewnić płynny transfer eksplantatów siatkówki do wkładek hodowlanych, zwierzę można wstępnie namoczyć w czymś, aby było wilgotne przed przeniesieniem tkanek siatkówki. Dodatkowo, cały proces musi być przeprowadzony w atmosferze sterydowej, aby uniknąć zanieczyszczenia podczas procesu.