Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting

Protokół ten może pomóc w zrozumieniu mechanizmów związanych z regulacją KCC2 poprzez bezpośrednią ocenę fosforylacji wielkości cząsteczkowej kinazy, rzucając w ten sposób światło na jej fizjologiczne funkcje i działania. Może być używany do identyfikacji i charakteryzowania cząsteczek, takich jak białka będące przedmiotem zainteresowania, ze złożonych mieszanin powiązanych cząsteczek, nawet jeśli ekspresja białka jest bardzo mała. Technika ta jest niezbędnym narzędziem do analizy białek w złożonych systemach i identyfikacji potencjalnych mechanizmów leżących u podstaw nieprawidłowych funkcji tkanek lub chorób.

Procedury zademonstruje Sunday Solomon Josiah, doktorant z mojego laboratorium. Zacznij od wstępnego uzbrojenia wszystkich odczynników w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i całkowitego rozmrożenia stabilnie przeciętych ludzkich komórek embrionalnych nerki szczura KCC2b w kąpieli perełkowej. Następnie przenieść komórki z probówki kriofiolki do probówki wirówkowej zawierającej pięć mililitrów świeżej pożywki i odwirować komórki pod ciśnieniem 1,200 G przez trzy do pięciu minut.

Po zaessaniu supernatantu za pomocą pipety aspiratora przymocowanej do pompy próżniowej, ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach świeżej pożywki. Przenieś zawiesinę na 10-centymetrową płytkę talerzową i pozwól jej rosnąć przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną 90% zbieżności, podziel je, odsysając stare podłoże i przepłukując je dwoma mililitrami PBS.

Dodaj dwa mililitry trypsyny i inkubuj je przez około jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Umyj trypsynizowane komórki za pomocą dwóch mililitrów całego podłoża. Dodaj dziewięć mililitrów świeżej pożywki do nowych potraw.

Następnie dodaj jeden mililitr roztworu ze starego naczynia do nowego naczynia. Przenieś szalki z podzielonymi komórkami do inkubatora na 48 godzin, aby osiągnąć ponad 90% zgrywkę. Traktować komórki dimetylosulfotlenkiem, ośmiomikromolową staurosporyną lub 0,5 milimolowym N-etylomaleimidem przez 15 minut przed zbiorem w buforze do lizy.

Odessać pożywkę z przeciętej szalki hodowlanej, umieścić szalki hodowlane na lodzie i umyć komórki lodowatym PBS. Odessać PBS i dodać do naczynia 1,0 mililitra lodowatego buforu do lizy. Po zeskrobaniu komórek z dna naczynia za pomocą zimnego plastikowego skrobaka do komórek, zawiesinę komórek przenieść do probówki mikrowirówkowej umieszczonej na lodzie, a następnie stale mieszać przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu lizatów komórkowych w zimnej wirówce umieść je na lodzie. Zebrać supernatant do wstępnie schłodzonej świeżej probówki i wyrzucić osad. Odpipetować 300 mikrolitrów sefarozy białka G do probówki do mikrowirówki.

Następnie odwirować roztwór o stężeniu 500 G przez dwie minuty. Po odrzuceniu supernatantu dodać 500 mikrolitrów PBS i dobrze odwirować. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i powtórzyć krok.

Następnie wymieszaj jeden miligram przeciwciał anty-KCC2 treoniny 906 i anty-KCC2 treoniny 1007 z 200 mikrolitrami kulek sefarozy białka G przed uzupełnieniem objętości do 500 mikrolitrów za pomocą PBS. Po wytrząsaniu na wibrującej platformie lub obracającym się kole przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, powtórz dwa prania z PBS. Przeprowadzić kwantyfikację białek na lizatach komórkowych i dodać jeden miligram lizatu komórkowego do przemytych kulek i inkubować w rotatorze od końca do końca przed odwirowaniem.

Wykonać trzy przemycia PBS zawierającym 150 milimolowy chlorek sodu, a następnie trzy przepłuczenia 200 mikrolitrami PBS przed ponownym zawieszeniem końcowej osadki w 100 mikrolitrach buforu do próbek LDS. Potrząsaj probówkami w wytrząsarce wirnika w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Inkubować je w bloku grzewczym i odwirować przed użyciem supernatantu do ładowania żelu.

Zmontuj aparat do odlewania Western Blot i wlej świeżo przygotowany 8% żel separacyjny, aby odlać żel, pozostawiając około dwóch centymetrów przestrzeni od górnej części szkła odlewniczego. Dodaj 200 mikrolitrów absolutnego izopropanolu do zestawu i pozostaw w temperaturze pokojowej na 60 minut. Usuń izopropanol za pomocą pipety i ostrożnie spłucz żel około 200 mikrolitrami wody destylowanej.

Po dodaniu świeżo przygotowanego 6% żelu do układania w stosy do zestawu odlewniczego, delikatnie wlej grzebień do studzienki i odstaw w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie umieść odlany żel w zbiorniku do elektroforezy. Po wlaniu buforu do zbiornika załadować pięć mikrolitrów markera masy cząsteczkowej do pierwszego dołka i taką samą ilość białka do każdej studzienki żelu SDS-PAGE.

Napełnij puste studzienki LDS i uruchom żel przez około 90 do 120 minut przy napięciu 120 woltów. Uwodnić membranę nitrocelulozową buforem transferowym zawierającym 20% metanolu. Przepłukać żel i membranę buforem transferowym i delikatnie rozprowadzić je na stosie przygotowawczym.

Ułóż kanapkę do przeniesienia w następującej kolejności: elektroda ujemna, pianka warstwowa, żel płukany bibułą filtracyjną SDS-PAGE, płukana membrana nitrocelulozowa, bibuła filtracyjna, pianka warstwowa, elektroda dodatnia. Po zakończeniu ułóż zmontowaną kanapkę w zbiorniku transferowym i pracuj pod napięciem 90 V przez 90 minut lub 30 V przez 360 minut. Zablokuj suchą membranę na jedną godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą bufora blokującego.

Inkubować błony z odpowiednimi rozcieńczeniami pierwszorzędowego przeciwciała i beta-aktyny w buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie podaj trzy przemycia TBST przez pięć minut każde. Inkubować przemytą błonę z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w buforze blokującym przez 60 minut i powtórzyć trzy przemycia TBST.

Po zakończeniu umieść umytą membranę na tablicy obrazowej. Aby opracować sygnały, rozprowadź przygotowany roztwór, mieszając równe objętości każdego wzmocnionego odczynnika chemiluminescencyjnego na membranie przed przeniesieniem płytki obrazowania do systemu obrazowania w celu obrazowania. Traktowanie komórek HEK293 staurosporyną i N-etylomaleimidem lub NEM spowodowało zmniejszoną fosforylację w miejscach docelowych PAK, treoninie 233 znajdującej się w domenie kinazy T-loop i miejscu fosforylacji pętli S seryny 373 endogennie eksprymowanej SPAK.

Staurosporyna zmniejszała fosforylację seryny 940 w komórkach HEK294 stabilnie eksprymujących KCC2b, ale NEM znacznie zwiększył jej fosforylację. Ponadto staurosporyna zmniejsza fosforylację w miejscu treoniny 505, podczas gdy NEM spowodował niewielki, ale nieznaczny wzrost fosforylacji w tym samym miejscu. Zróżnicowane efekty obu związków na fosforylację kinazy białkowej C w miejscu treoniny 505 i KCC2b w miejscu seryny 940 dobrze korelują.

Reprezentatywny wynik wykazał również, że NEM spowodował istotny wzrost ekspresji całkowitej ilości KCC2, podczas gdy ekspresja całkowitego NKCC1 i SPAK nie uległa istotnej zmianie po potraktowaniu obydwoma związkami. Ponadto oba związki powodowały zmniejszoną fosforylację SPAK w miejscach treoniny 233 i seryny 373, co korelowało ze skróconą fosforylacją treoniny 906/1007 i treoniny 203/207/212 oraz endogenną ekspresją NKCC1. Dodatkowo, staurosporyna i NEM zmniejszały i zwiększały fosforylację kinazy białkowej C odpowiednio w miejscu seryny 940 i stabilnej ekspresji KCC2b, co korelowało ze zmniejszeniem i wzrostem fosforylacji kinazy białkowej C delta w miejscu treoniny 505 po leczeniu odpowiednio staurosporyną i NEM.

Jeśli zostanie użyte niewłaściwe przeciwciało pierwszorzędowe lub drugorzędowe, pasmo nie będzie widoczne podczas obrazowania. Ponadto sygnał może nie być widoczny, jeśli zostanie zastosowane zbyt niskie stężenie przeciwciała. Technika ta jest istotnym narzędziem w ilościowej analizie białka i umożliwiła jej wykorzystanie do wielu celów naukowych i związanych z zasobami, w tym jako skutecznego narzędzia wczesnej diagnostyki.