Name: Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj metodę Western blotting do badania fosforylacji kotransportera KCC2 w komórkach neuronalnych. Protokół umożliwia analizę modyfikacji białek i regulacji homeostazy chlorków w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez The Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094) oraz stypendium doktoranckie Wspólnoty Narodów.

UWAGA: Protokół opisuje metodę western blotting do wykrywania konkretnych białek będących przedmiotem zainteresowania.
1. Hodowla komórkowa i transfekcja
<ol>
	<li>Ogrzać wszystkie odczynniki w kąpieli perełkowej (37 °C) przed zabiegiem hodowli komórkowej. Przygotuj pożywkę hodowlaną, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, po 1% 2 mM L-glutaminy, 100 ml aminokwasów endogennych, 100 mM pirogronianu sodu i 100 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Stabilnie transfekowaną nerkę ludzką zarodkową KCC2b szczura rozmrozić 293 komórki (HEK293rnKCC2b)18 całkowicie w kąpieli perełkowej (37 °C). Przenieść komórki z probówki kriowialnej do probówki wirówkowej zawierającej 5 ml świeżej pożywki. Wiruj komórkę w temperaturze 1200 ×g przez 3-5 minut.</li>
	<li>Użyć pipety aspiratora (przymocowanej do pompy próżniowej) do zassania supernatantu i dodać 10 ml świeżej pożywki w celu ponownego zawieszenia komórek. Przenieść zawiesinę komórek na talerz o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Umieścić naczynie w inkubatorze i pozostawić je do wzrostu przez 48 godzin w temperaturze 37 °С w wilgotnej atmosferze 5%CO2. Monitoruj okres inkubacji, aby zapewnić zdrowy wzrost komórek. Dalej dziel komórki, gdy osiągną ponad 90% zbieżności po okresie inkubacji.</li>
	<li>Odessać starą pożywkę z naczynia na komórki i delikatnie spłukać komórki 2 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Dodaj 2 ml trypsyny i inkubuj przez około 1-2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Użyj 2 ml kompletnego podłoża, aby delikatnie umyć trypsynizowane komórki w naczyniu. Dodaj 9 ml świeżej pożywki do nowych naczyń i dodaj 1 ml roztworu ze starego naczynia do każdego z nowych. Przenieś szalki z podzielonymi komórkami z powrotem do inkubatora na 48 godzin, aby osiągnąć ≥ 90% zgrywki.</li>
	<li>Traktować komórki dimetylosulfotlenkiem (DMSO) jako kontrolą, 8 μM staurosporyną lub 0,5 mM N-etylomaleimidem (NEM) przez 15 minut przed zebraniem komórek w buforze do lizy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie lizatów komórkowych i ładowanie próbek
<ol>
	<li>Odessać pożywkę na szalce hodowlanej (z procedur transfekcji). Umieść kulturę komórkową na lodzie i umyj komórki lodowatym PBS.</li>
	<li>Odessać PBS, a następnie dodać 1,0 ml lodowatego buforu do lizy zawierającego 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 1 mM glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego eter)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA), 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 50 mM fluorku sodu, 5 mM pirofosforanu sodu, 10 mM fosforanu β-glicerofosforanu, 1 mM ortowananianu sodu, 1% (m/v) Triton X-100, 0,27 M sacharozy, 1 mM benzaminy, 0,1% (v/v) 2-merkaptoetanolu i 2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) do naczynia. 
	UWAGA: Objętość buforu do lizy podczas zbierania komórek różni się w zależności od wielkości naczynia, na przykład 1 ml buforu do lizy jest odpowiedni na 1 x 10 7 komórek/100 mm szalka/150 cm2 kolba, podczas gdy 0,5 ml jest odpowiednie na 5 x 106 komórek/60 mm talerz/75 cm2 kolba.</li>
	<li>Użyj zimnego plastikowego skrobaka do komórek, aby zeskrobać komórki z dna naczynia, a następnie delikatnie użyj pipety, aby przenieść zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej już na lodzie. Ciągle mieszać probówkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wirować lizaty komórkowe w zimnej wirówce (4 °C) o sile 16 000 x g przez 20 minut, delikatnie wyjąć probówkę z wirówki i umieścić ją na lodzie. Zebrać supernatant do wstępnie schłodzonej świeżej probówki i wyrzucić granulki. 
	UWAGA: Może być konieczne zróżnicowanie siły i czasu wirowania w zależności od typu komórki. Jednak ogólne wytyczne zalecają wirowanie przy 16 000 x g przez 20 minut. Musi to być jednak ustalone dla każdego eksperymentu. Na przykład delikatne komórki, takie jak leukocyty, wymagają bardzo niskiej prędkości wirowania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie leków immunoprecypitacyjnych z lizatów komórkowych
<ol>
	<li>Odpipetować 300 μl białka-G-sefarozy do probówki mikrowirówkowej. Wirować roztwór o sile 500 x g przez 2 minuty i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj 500 μl PBS i dobrze wymieszaj roztwór. Wirować roztwór o sile 500 x g przez 2 minuty i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok.</li>
	<li>Zmieszać 1 mg przeciwciał anty-KCC2 Thr906 i anty-KCC2 Thr1007 z 200 μl kulek białkowych G-sefarozy i uzupełnić objętość do 500 μl PBS. Wstrząsać na platformie wibracyjnej lub obracającym się kole przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Umyć 2x za pomocą PBS.</li>
	<li>Przeprowadzić oznaczanie ilościowe białek na lizatach całych komórek i dodać 1 mg lizatu komórkowego do przemytych kulek. Delikatnie inkubować w rotatorze od końca do końca przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Odwirować kulki i umyć je 3x PBS zawierającym 150 mM chlorku sodu (NaCl).</li>
	<li>Leki immunostrącające (kulki) przemyć 3x 200 μL PBS. Zawiesić końcowe osady w 100 μl 1x buforu próbki dodecylosiarczanu litu (LDS).</li>
	<li>Potrząsać probówkami w wytrząsarce wirnikowej w temperaturze pokojowej przez 5 minut i inkubować je w bloku grzewczym w temperaturze 75 °C przez 10 minut. Odwirować załadowaną próbkę o masie 11 000 x g przez 2 minuty i użyć supernatantu do napełnienia żelem.</li>
</ol>
4. Wykonywanie western blot
<ol>
	<li>Zmontować aparat odlewniczy i wlać świeżo przygotowany 8% żel oddzielający (patrz Tabela 1 w celu uzyskania przepisu/przygotowania), aby odlać żel, pozostawiając około 2 cm wolnej przestrzeni od górnej części szkła odlewniczego. Dodać 200 μl absolutnego izopropanolu do zestawu i odstawić w temperaturze pokojowej na 60 min. 
	UWAGA: Receptura żelu poliakryloamidowego do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE) zależy od wielkości białka będącego przedmiotem zainteresowania (Tabela 2). Dlatego zanotuj wielkość białka przed określeniem pożądanej zawartości procentowej żelu.</li>
	<li>Za pomocą pipety usuń izopropanol i ostrożnie spłucz żel około 200 μl wody destylowanej. Dodaj świeżo przygotowany 6% żel do układania w stosy (patrz Tabela 1 dla przepisu/przygotowania), aby wypełnić około 2 cm przestrzeni na zestawie odlewniczym. Delikatnie włóż grzebień do studzienki i odstaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
	<li>Umieść odlany żel w zbiorniku do elektroforezy.</li>
	<li>Rozpuść 30,3 g zasady Tris, 144,1 g glicyny i 10 g SDS w 1000 ml wody destylowanej, aby przygotować 10-krotny bufor transferowy. Przygotuj 1x bufor do biegania, dodając 10 ml 10% SDS i 100 ml 10x buforu transferowego do 890 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Wlej 1x działający bufor do zbiornika. Załadować 5 μl markera masy cząsteczkowej do pierwszego dołka i taką samą ilość białka do każdego dołka żelu SDS-PAGE (od 18 do 30 μl, w zależności od użytego rozmiaru grzebienia). Napełnij puste studzienki 1x LDS i uruchom żel przez około 90-120 minut przy napięciu 120 V.</li>
	<li>Rozpuścić 58,2 g zasady Tris i 29,3 g glicyny w 1000 ml wody destylowanej, aby przygotować 10-krotny bufor transferowy. Aktywuj membranę nitrocelulozową za pomocą 1x buforu transferowego zawierającego 20% metanolu. Przepłukać żel i membranę buforem transferowym i delikatnie rozprowadzić je na stosie do przygotowania. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby dostosowywania pH biegowych i transferowych, ponieważ powinny one mieć optymalne wymagane pH. Wskazane jest również przygotowanie tych i przechowywanie ich w temperaturze pokojowej przed eksperymentem, aby zaoszczędzić czas.</li>
	<li>Ułóż kanapkę do przeniesienia w następującej kolejności: elektroda ujemna (ramka/koniec) - pianka warstwowa - bibuła filtracyjna - płukany żel SDS-PAGE - płukana membrana nitrocelulozowa - bibuła filtracyjna - pianka warstwowa - elektroda dodatnia (czerwona ramka). Ułóż zmontowaną kanapkę w zbiorniku transferowym i pracuj pod napięciem 90 V przez 90 minut lub 30 V przez 360 minut.</li>
</ol>
5. Barwienie przeciwciał i rozwój obrazu
<ol>
	<li>Zdejmij membranę i pozostaw do wyschnięcia. Zablokuj membranę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą buforu blokującego wykonanego z 5% odtłuszczonego mleka w soli fizjologicznej buforowanej Tris, zawierającej 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).</li>
	<li>Inkubować błony z odpowiednimi rozcieńczeniami przeciwciała pierwszorzędowego8,15,19 i beta-aktyny (kontrola obciążenia) w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Umyj membranę w trzech praniach 1x TBS-T przez 5 minut każde. 
	UWAGA: Inkubacja oddzielnej błony z kontrolami obciążenia, takimi jak beta-aktyna, alfa-tubulina lub przeciwciała przeciwko dehydrogenazie 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego, ma na celu normalizację innych wyników western blot podczas późniejszej kwantyfikacji. Zalecane rozcieńczenie dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego jest dostępne w instrukcji producenta.</li>
	<li>Inkubować przemytą błonę z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym 5000-krotnie w buforze blokującym przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj membranę 3x w 1x TBS-T przez 5 minut każdy. 
	UWAGA: Zdecydowanie zaleca się, aby przeciwciało drugorzędowe zostało podniesione przeciwko gatunkowi, u którego wytwarzane jest przeciwciało pierwszorzędowe. Na przykład, jeśli pierwszorzędowe przeciwciało całkowitego KCC2 jest mysim anty-KCC2, należy użyć przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszy.</li>
	<li>Umieść umytą membranę na tablicy obrazowej. Wymieszaj równe objętości każdego odczynnika do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i delikatnie rozprowadź zmieszany roztwór na membranie, aby uzyskać sygnały.</li>
</ol>
6. Akwizycja obrazu za pomocą systemu obrazowania i kwantyfikacja danych
<ol>
	<li>Przenieś płytę obrazową do odpowiedniej komory w systemie obrazowania w celu obrazowania. Otwórz oprogramowanie do obrazowania na komputerze w celu przetworzenia obrazu.</li>
	<li>Na pasku narzędzi kliknij przycisk Nowy protokół i wybierz opcję Pojedynczy kanał. Kliknij Wybierz w oknie dialogowym Obrazowanie/aplikacja żelu, przewiń do pozycji Blot i wybierz opcję Chemi Hi Sensitivity lub Chemi Hi Resolution. Następnie kliknij Ustawienia akumulacji sygnału, aby ustawić czas trwania i liczbę obrazów do pobrania.</li>
	<li>Kliknij opcję Position Gel (Pozycja żelu) w obszarze protocol setup (Ustawienia protokołu) i w razie potrzeby dostosuj żel w systemie obrazowania. Kliknij przycisk Uruchom protokół, aby pobrać obrazy.</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy jeden z pobranych obrazów w polu katalogu obrazowania, aby zapisać obrazy na komputerze. Przejdź do żądanego obrazu i kliknij Wybierz obraz i kontynuuj w oknie dialogowym uruchamiania.</li>
	<li>Kliknij ikonę Przekształcenia obrazu, aby dostosować kontrast i nasycenie pikseli obrazu. Kliknij ikonę Zrzut ekranu na ogólnym pasku narzędzi, aby zapisać obraz na komputerze w zależności od żądanego formatu obrazu.</li>
	<li>Zmierz gęstości pasma za pomocą oprogramowania ImageJ i przeanalizuj za pomocą odpowiednich narzędzi statystycznych.</li>
</ol>

<ol><li>de Los Heros, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WNK-regulated+SPAK%2FOSR1+kinases+directly+phosphorylate+and+inhibit+the+K%2B-Cl-+co-transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters.</a> Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).</li>
<li>Heubl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor+dependent+synaptic+inhibition+rapidly+tunes+KCC2+activity+via+the+Cl%28-%29-sensitive+WNK1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase.</a> Nature Communications. 8 (-), 1776(2017).</li>
<li>Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+transporters+and+GABA+polarity+in+developmental%2C+neurological+and+psychiatric+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+%26+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions.</a> Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).</li>
<li>Shekarabi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNK+Kinase+Signaling+in+Ion+Homeostasis+and+Human+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).</li>
<li>Rivera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+K%2B%2FCl-+co-transporter+KCC2+renders+GABA+hyperpolarizing+during+neuronal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation.</a> Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).</li>
<li>Kahle, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+neuronal+activity+by+phosphorylation+of+the+K-Cl+cotransporter+KCC2%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2.</a> Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).</li>
<li>Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Therapeutic+Potential+of+Neuronal+K-Cl+Co-Transporter+KCC2+in+Huntington%27s+Disease+and+Its+Comorbidities%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142(2020).</li>
<li>Friedel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNK1-regulated+inhibitory+phosphorylation+of+the+KCC2+cotransporter+maintains+the+depolarizing+action+of+GABA+in+immature+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons.</a> Science Signaling. 8 (383), 65(2015).</li>
<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally+regulated+KCC2+phosphorylation+is+essential+for+dynamic+GABA-mediated+inhibition+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival.</a> Science Signaling. 12 (603), (2019).</li>
<li>Rinehart, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sites+of+regulated+phosphorylation+that+control+K-Cl+cotransporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity.</a> Cell. 138 (3), 525-536 (2009).</li>
<li>Lu, D. C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+WNK+in+modulation+of+KCl+cotransport+activity+in+red+cells+from+normal+individuals+and+patients+with+sickle+cell+anaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv-European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia.</a> Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WNK-SPAK%2FOSR1+Kinases+and+the+Cation-Chloride+Cotransporters+as+Therapeutic+Targets+for+Neurological+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases.</a> Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).</li>
<li>AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Photosensitising+Clinical+Agent+Verteporfin+Is+an+Inhibitor+of+SPAK+and+OSR1+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases.</a> Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+brain+cation-Cl%28-%29+cotransport+via+the+SPAK+kinase+inhibitor+ZT-1a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a.</a> Nature Communications. 11 (1), 78(2020).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staurosporine+and+NEM+mainly+impair+WNK-SPAK%2FOSR1+mediated+phosphorylation+of+KCC2+and+NKCC1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1.</a> PLoS One. 15 (5), 0232967(2020).</li>
<li>Alessi, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WNK-SPAK%2FOSR1+pathway%3A+master+regulator+of+cation-chloride+cotransporters%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters.</a> Science Signaling. 7 (334), 3(2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+kinomics+establishes+a+critical+node+of+volume-sensitive+cation-Cl%28-%29+cotransporter+regulation+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain.</a> Scientific Reports. 6, 35986(2016).</li>
<li>Hartmann, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effect+of+membrane+raft+perturbation+on+transport+activity+of+KCC2+and+NKCC1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1.</a> Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).</li>
<li>Pisella, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+regulation+of+KCC2+phosphorylation+leads+to+neuronal+network+dysfunction+and+neurodevelopmental+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology.</a> Science Signaling. 12 (603), (2019).</li>
<li>Blaesse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+KCC2+correlates+with+development+of+inhibitory+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).</li>
<li>Medina, I., Pisella, L. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMedina%2C+I+%22Neuronal+Chloride+Transporters+in+Health+and+Disease%22">Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease</a>. , Elsevier. 21-41 (2020).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Friedel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+View+on+the+Role+of+Intracellular+Tails+in+Surface+Delivery+of+the+Potassium-Chloride+Cotransporter+KCC2%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2.</a> eNeuro. 4 (4), (2017).</li>
<li>Lee, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+detergents+on+membrane+protein+complex+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of detergents on membrane protein complex isolation.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).</li>
<li>Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+at+the+Molecular+Level+using+Robust+Biochemical+Approaches+of+a+New+Kinase+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820(2019).</li>
<li>Johansen, K., Svensson, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohansen%2C+K+%22Molecular+Diagnosis+of+Infectious+Diseases%22">Molecular Diagnosis of Infectious Diseases</a>. , Springer. 15-28 (1998).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429(2012).</li>
<li>Klein, J. D., O'Neill, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume-sensitive+myosin+phosphorylation+in+vascular+endothelial+cells%3A+correlation+with+Na-K-2Cl+cotransport%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).</li>
<li>Hannemann, A., Flatman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+and+transport+in+the+Na-K-2Cl+cotransporters%2C+NKCC1+and+NKCC2A%2C+compared+in+HEK-293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells.</a> PLoS One. 6 (3), 17992(2011).</li>
<li>Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explicit+representation+of+protein+activity+states+significantly+improves+causal+discovery+of+protein+phosphorylation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks.</a> BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).</li>
<li>Terstappen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonradioactive+rubidium+ion+efflux+assay+and+its+applications+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development.</a> Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).</li>
<li>Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescent-based+NKCC+functional+assay+in+adherent+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells.</a> BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).</li>
<li>Adragna, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+phosphorylation+of+the+K-Cl+cotransporter+KCC3+is+a+molecular+switch+of+intracellular+potassium+content+and+cell+volume+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255(2015).</li>
<li>Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium+transport+FLIPR-based+assay+for+the+identification+of+KCC2-positive+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).</li>
<li>Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+technologies+for+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">High throughput screening technologies for ion channels.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Hill, C. L., Stephens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Patch+Clamp+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22Patch+Clamp+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Patch Clamp Recording.</a> Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).</li>
<li>Conway, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Ethylmaleimide+increases+KCC2+cotransporter+activity+by+modulating+transporter+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).</li>
<li>Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+GABAergic+control+of+action+potential+firing+in+newborn+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).</li>
<li>Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiating+KCC2+activity+is+sufficient+to+limit+the+onset+and+severity+of+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).</li>
<li>Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarizing+GABAA+current+in+the+prefrontal+cortex+is+linked+with+cognitive+impairment+in+a+mouse+model+relevant+for+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia.</a> Science Advances. 7 (14), 5032(2021).</li>
<li>Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+properly+measure+a+current-voltage+relation%3F-interpolation+vs.+ramp+methods+applied+to+studies+of+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10(2016).</li>
<li>Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforated+whole-cell+patch-clamp+technique%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Patch+Clamp+Techniques%22%5BJournal%5D)">Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide.</a> Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).</li>
<li>Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gramicidin-perforated+patch+recording%3A+GABA+response+in+mammalian+neurones+with+intact+intracellular+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride.</a> The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).</li>
<li>Kyrozis, A., Reichling, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforated-patch+recording+with+gramicidin+avoids+artifactual+changes+in+intracellular+chloride+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).</li>
<li>Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+GABAA+activation+inhibits+AMPA-kainate+receptor-mediated+bursting+in+the+newborn+%28P0-P2%29+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Do pomiaru aktywności SLC12 CCC, które ulegają ekspresji w neuronach, zastosowano wiele metod, w tym KCC2. Udowodniono, że wiele z tych technik poszerza wiedzę naukową na temat analizy funkcjonalnego znaczenia tych transporterów i ich wzorców struktura-funkcja w różnych mutacjach związanych z chorobą. Co najważniejsze, istnieją zalety i zastrzeżenia dotyczące różnych metod21. Jednak protokół opisany powyżej nakreślił, w jaki sposób ocenić fosforylację KCC2 w miejscach regulatorowych kinazy, Thr906...

Kotransportery chlorku potasu 2 (KCC2) należą do rodziny nośników substancji rozpuszczonych 12 (SLC12) kotransporterów chlorku kationu (CCC), znajdują się wyłącznie w neuronach i są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania homeostazy Cl-, a w konsekwencji funkcjonalnego hamowania GABA-ergiczne1,2,3,4. Utrzymanie niskiego wewnątrzneuronalnego stężenia Cl- ([Cl-]i) na poziomie 4-6 mM przez KCC2 ułatwia hiperpolaryzację kwasu γ-aminomasłowego (GABA)/glicyny i hamowanie synaps w mózgu i rdzeniu kręgowym5. Niepowodzenie w prawidłowej regulacji KCC2 wiąże się z występowaniem kilku chorób neurologicznych, w tym epilepsji4. Co więcej, zmniejszona ekstruzja Cl− za pośrednictwem KCC2 i upośledzone hiperpolaryzujące prądy GABAA i / lub prądy za pośrednictwem receptora glicyny są związane z padaczką, bólem neuropatycznym i spastycznością6,7. Neuronalny KCC2 jest ujemnie modulowany poprzez fosforylację kluczowych reszt regulatorowych w obrębie C-końcowej domeny wewnątrzkomórkowej przez kompleks sygnalizacyjny kinazy reagującej na stres oksydacyjny (OSR) związany bez lizyny (WNK)-STE20/SPS1 (SPAK)/reagujący na stres oksydacyjny (OSR)1, co ułatwia utrzymanie zdepolaryzowanej aktywności GABA w niedojrzałych neuronach2,8,9. WNK-SPAK/OSR1 fosforyluje reszty treoniny 906 i 1007 (Thr906/Thr1007), a następnie obniża ekspresję genu mRNA KCC2, co w konsekwencji prowadzi do pogorszenia jego funkcji fizjologicznej8,10. Co ważniejsze jednak, faktem jest już, że kompleks kinazy WNK-SPAK/OSR1 jest znany z fosforylacji i hamowania ekspresji KCC21,2,4,11,12, oraz że hamowanie szlaków sygnałowych kompleksu kinazy do fosforylacji Thr906/Thr1007 zostało związane ze zwiększoną ekspresją genu mRNA KCC213,14,15. Ważne jest, aby zauważyć, że regulacja neuronalnej ekspresji kotransporterów KCC2 i Na+-K+-2Cl- 1 (NKCC1) poprzez fosforylację białek działa jednocześnie i w odwrotnych wzorcach1,4,16.
Nastąpił stały i znaczący postęp w zakresie zrozumienia mechanizmów związanych z regulacją KCC2, co przypisuje się rozwojowi technik, które umożliwiają badaczom badanie jego funkcji i aktywności; zarówno poprzez bezpośrednie (ocena fosforylacji miejsc regulatorowych kinazy), jak i pośrednie (obserwowanie i monitorowanie aktywności GABA). Przedstawiony tutaj protokół podkreśla zastosowanie technik western blotting do badania funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K+-Cl- KCC2 poprzez badanie fosforylacji kotransportera w miejscach regulatorowych kinazy Thr906/1007.
Western blot to metoda używana do wykrywania określonych białek z próbki tkanki lub komórki. Ta metoda najpierw rozdziela białka według wielkości za pomocą elektroforezy. Białka są następnie elektroforetycznie przenoszone na stałe podłoże (zwykle błonę), zanim białko docelowe zostanie oznaczone za pomocą specyficznego przeciwciała. Przeciwciała są sprzężone z różnymi znacznikami lub przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem, które są wykrywane za pomocą metod kolorymetrycznych, chemiluminescencyjnych lub fluorescencyjnych. Pozwala to na wykrycie określonego białka docelowego z mieszaniny białek. Technika ta została wykorzystana do scharakteryzowania fosfospecyficznych miejsc KCCs1 i została wykorzystana do identyfikacji inhibitorów kinaz, które hamują fosforylację KCC3 Thr991/Thr104817. Postępując zgodnie z tym protokołem, można specyficznie wykryć całkowitą i ufosforylowaną KCC2 z lizatów komórkowych / tkankowych. Zasadniczo wykrywanie przeciwciał sprzężonych z białkami za pomocą tej techniki jest bardzo istotne, ponieważ pomaga lepiej zrozumieć działania kooperacyjne w fosfomiejscach KCC2, co rzuca światło na mechanizmy molekularne zaangażowane w ich fizjologiczne regulacje. Analiza ilościowa całkowitej ekspresji białka jest reprezentatywna dla funkcji i aktywności KCC2. Istnieją inne klasyczne metody stosowane do bezpośredniego pomiaru aktywności KCC2, takie jak test wychwytu jonów rubidu i talu. Dalsze techniki, takie jak elektrofizjologia patch-clamp-electrophysiolog, są wykorzystywane do pomiaru aktywności GABA; stąd pośrednie odzwierciedlenie aktywowanego i/lub inaktywowanego KCC2 na podstawie oceny homeostazy wewnątrzkomórkowych jonów chlorkowych.

<table><tbody><tr><td>40% akryloamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2917</td><td>Służy do produkcji żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE&nbsp;</td></tr><tr><td>Amon Per Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>248614</td><td>Służy do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE&nbsp;</td></tr><tr><td>anti pSPAK</td><td>Dundee University</td><td>S670B</td><td>Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting</td></tr><tr><td>anty-KCC2</td><td>Dundee University</td><td>S700C Stosowany</td><td>jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting</td></tr><tr><td>anty-KCC2 pSer940</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-95678</td><td>Stosowany jako pierwszorzędowe</td></tr> przeciwciało przeciwko <tr><td>KCC2 pThr1007</td><td>Dundee University</td><td>S961C</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do western blotting</td></tr><tr><td>anty-KCC2 pThr906</td><td>Dundee University</td><td>S959C</td><td>Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting</td></tr><tr><td>anty-mysi</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>66002</td><td>Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe dla western blotting</td></tr><tr><td>anty-NKCC1</td><td>Dundee University</td><td>S841B</td><td>Używany jako pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko</td></tr><tr><td>NKCC1 pThr203/207/212</td><td>Dundee University</td><td>S763B</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do technologii</td></tr><tr><td>sygnalizacji komórkowej</td><td>przeciw królikowi</td><td>Blotting C29F4</td><td>Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe do western blotting</td></tr><tr><td>anty-owczego</td><td>abcam</td><td>ab6900</td><td>Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe do western blotting</td></tr><tr><td>anty-SPAK</td><td>Dundee University</td><td>S669D</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do western blotting</td></tr><tr><td>anty-&beta;-tubulina III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8578</td><td>Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blott</td></tr><tr><td>Benzamine</td><td>Merck UK</td><td>135828</td><td>Stosowany jako składnik buforu do lizy</td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>Stosowany jako składnik buforu ładującego i buforu do lizy</td></tr><tr><td>Bradford Coomasie</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td>Stosowany do ilościowego oznaczania białek lizatu</td></tr><tr><td>Aparatura odlewnicza</td><td>Atto&nbsp;</td><td>WSE-1165W</td><td>Służy do uruchamiania elektroforezy strony SDS</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td>Używana do przygotowania lizatu</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>VWR</td><td>MicroStar 17R</td><td>Używana do przędzenia próbek</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Używany do eksperymentu z hodowlą komórkową</td></tr><tr><td>Suszone mleko odtłuszczone Marvel</td><td></td><td>N/A</td><td>Służy do blokowania bufor</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoki poziom glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>Używany do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Odczynnik ECL</td><td>Perkin Elmer</td><td>ORTT755/2655</td><td>Używany do wywoływania obrazu do western blotting</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0700/53</td><td>Stosowany jako składnik buforu do lizy</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>e4378</td><td>Stosowany jako składnik lizy bufor</td></tr><tr><td>Elektroforeza Zasilacz</td><td>BioRad</td><td>PowerPAC HC</td><td>Do zasilania do uruchomienia elektroforezy stronicowej SDS</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>ThermoFisher</td><td>E/0650DF/17</td><td>Służy do przygotowania wysterylizowanych urządzeń i środowiska</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu -&nbsp; inaktywowana termicznie</td><td>Merck Life Sciences UK</td><td>F9665</td><td>Używana do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Dymnik</td><td>Walker</td><td>A7277</td><td>Używany do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Blotting żelowy - Whatman</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>10426981</td><td>Używany w western blotting do produkcji kanapki transferowej</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15527</td><td>Używany do produkcji</td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad Software, Inc., USA</td><td>Wersja 6.0</td><td>Używany do kreślenia wykresów i analizowania danych dla&nbsp; western blotting</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Acros Organics</td><td>10647282</td><td>Służy do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE&nbsp;</td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Grant</td><td>QBT1</td><td>Służy do podgrzewania próbek ładujących WB</td></tr><tr><td>Ogniwa HEK293</td><td>Merck UK</td><td>12022001-1VL</td><td>Linia komórkowa do eksperymentu hodowlanego</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Wayne Rasband i współpracownicy; NIH, Stany Zjednoczone&nbsp;</td><td>ImageJ 1.53e</td><td>Służy do pomiaru intensywności pasma z obrazów western blotting</td></tr><tr><td>System obrazowania</td><td>BioRad</td><td>ChemiDoc MP</td><td>Służy do wykonywania obrazów western blot</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>LEEC</td><td>LEEC precision 190D</td><td>Używany do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Honeywell</td><td>24137</td><td>Stosowany w żelu odlewniczym do elektroforezy</td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Używany do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan litu (LDS)</td><td>Novex</td><td>NP0008</td><td>Używany jako bufor ładujący do western blotting</td></tr><tr><td>MEM Aminokwas endogenny&nbsp;</td><td>Merck Life Sciences UK</td><td>M7145</td><td>Używany do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td>Używany do przygotowania lizatów do WB</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>BioRad</td><td>iMark</td><td>Używany do odczytu stężenia białka lizatu</td></tr><tr><td>Microsoft Powerpoint</td><td>Microsoft, USA</td><td>PowerPoint2016</td><td>Służy do edycji obrazów western blot</td></tr><tr><td>Marker</td> <td>masy cząsteczkowejBioRad</td><td>1610373</td><td>Używany do western blotting</td></tr><tr><td>N-etylomaleimid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23030</td><td>Używany do eksperymentu z hodowlą komórkową</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>45004091</td><td>Używany do western blot</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Używany do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Mettler Toledo</td><td>Seven compact s210</td><td>Służy do monitorowania pH roztworów buforowych</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>Stosowany jako składnik buforu do lizy</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Stosowany do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>PKC&delta; pThr505</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9374</td><td>Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting</td></tr><tr><td>Sepharose Protein G</td><td>Generon</td><td>PG50-00-0002</td><td>Stosowany do immunoprecypitacji</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Stosowany jako składnik buforu płuczącego</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Używany do przygotowania buforu TBS-T</td></tr><tr><td>Dodecyl Siarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5750</td><td>Służy do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE&nbsp;</td></tr><tr><td>orthovanadan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td>Stosowany jako składnik buforu do lizy</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>Stosowany do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>sod-&beta;-glicerofosforan Merck</td><td>UK</td><td>G9422</td><td>Stosowany jako składnik buforu do lizy</td></tr><tr><td>Staurosporyna (od Streptomyces sp.)</td><td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td><td>S4400-1MG</td><td>Używany do eksperymentu z hodowlą komórkową</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Scientifc Laboratory Supplies</td><td>S0389</td><td>Używany jako składnik buforu do lizy</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7024</td><td>Używany do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE&nbsp;</td></tr><tr><td>Komora transferowa</td><td>BioRad</td><td>1658005EDU</td><td>Stosowana w western blottingu do przenoszenia białka na błonie</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>Stosowana do wytwarzania żelu separacyjnego i układającego w stosy dla SDS-PAGE&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Używany jako składnik buforu do lizy</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA Merck</td><td>Life Sciences UK</td><td>T4049</td><td>Używany do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3179</td><td>Używany jako marka bufora TBS-T</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Charles Austen</td><td>Dymax 5</td><td>Używany do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>K-550-GE</td><td>Używany do przygotowania próbek</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Scientific Industries Ltd</td><td>Vortex-Genie&nbsp; K-550-GE</td><td>Służy do mieszania rozdzielczej próbki</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna Grant</td><td>Instruments Ltd. (JB Academy)</td><td>JBA5</td><td>Służy do inkubacji roztworów</td></tr></tbody></table>

badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera k-cl kcc2 z wykorzystaniem western blotting

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Kotransportery chlorku potasu 2 (KCC2) należą do rodziny nośników substancji rozpuszczonych 12 (SLC12) kotransporterów chlorku kationu (CCC), znajdują się wyłącznie w neuronach i są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania homeostazy Cl-, a w konsekwencji funkcjonalnego hamowania GABA-ergicznego. Niepowodzenie w prawidłowej regulacji KCC2 jest szkodliwe i wiąże się z występowaniem kilku chorób neurologicznych, w tym padaczki. Poczyniono znaczne postępy w zakresie zrozumienia mechanizmów związanych z regulacją KCC2, co przypisuje się rozwojowi technik umożliwiających naukowcom badanie jego funkcji i działania; albo poprzez bezpośrednie (ocena fosforylacji miejsc regulatorowych kinazy), albo pośrednie (obserwacja i monitorowanie aktywności GABA). W tym miejscu protokół podkreśla, w jaki sposób badać fosforylację KCC2 w miejscach regulatorowych kinaz - Thr906 i Thr1007 - przy użyciu techniki western blotting. Istnieją inne klasyczne metody stosowane do bezpośredniego pomiaru aktywności KCC2, takie jak test wychwytu jonów rubidu i talu. Dalsze techniki, takie jak elektrofizjologia patch-clamp-electrophysiolog, są wykorzystywane do pomiaru aktywności GABA; stąd pośrednie odzwierciedlenie aktywowanego i/lub inaktywowanego KCC2 na podstawie oceny homeostazy wewnątrzkomórkowych jonów chlorkowych. Kilka z tych dodatkowych technik zostanie pokrótce omówionych w tym manuskrypcie.

W prezentowanym na Rysunku 1 reprezentatywnym wyniku zbadano wpływ staurosporyny i NEM na pośredniczowaną przez WNK-SPAK/OSR1 fosforylację KCC2 i NKCC1 w liniach komórkowych HEK293 stabilnie ekspresujących KCC2b (HEKrnKCC2b)18 z wykorzystaniem techniki western blotting. Szczegółowe informacje na temat reprezentatywnych wyników omówiono w pracy Zhang i wsp.15. Podobnie jak NEM, staurosporyna jest szerokim inhibitorem kinaz, k...

Obecny protokół podkreśla zastosowanie techniki western blotting do badania funkcji i aktywności kotransportera neuronalnego K-Cl KCC2. Protokół opisuje badanie fosforylacji KCC2 w miejscach regulatora kinazy Thr906/1007 poprzez western blot. W tym tekście pokrótce omówiono również dodatkowe metody potwierdzania aktywności KCC2.

Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Protokół ten może pomóc w zrozumieniu mechanizmów związanych z regulacją KCC2 poprzez bezpośrednią ocenę fosforylacji wielkości cząsteczkowej kinazy, rzucając w ten sposób światło na jej fizjologiczne funkcje i działania. Może być używany do identyfikacji i charakteryzowania cząsteczek, takich jak białka będące przedmiotem zainteresowania, ze złożonych mieszanin powiązanych cząsteczek, nawet jeśli ekspresja białka jest bardzo mała. Technika ta jest niezbędnym narzędziem do analizy białek w złożonych systemach i identyfikacji potencjalnych mechanizmów leżących u podstaw nieprawidłowych funkcji tkanek lub chorób.Procedury zademonstruje Sunday Solomon Josiah, doktorant z mojego laboratorium. Zacznij od wstępnego uzbrojenia wszystkich odczynników w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i całkowitego rozmrożenia stabilnie przeciętych ludzkich komórek embrionalnych nerki szczura KCC2b w kąpieli perełkowej. Następnie przenieść komórki z probówki kriofiolki do probówki wirówkowej zawierającej pięć mililitrów świeżej pożywki i odwirować komórki pod ciśnieniem 1,200 G przez trzy do pięciu minut.Po zaessaniu supernatantu za pomocą pipety aspiratora przymocowanej do pompy próżniowej, ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach świeżej pożywki. Przenieś zawiesinę na 10-centymetrową płytkę talerzową i pozwól jej rosnąć przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną 90% zbieżności, podziel je, odsysając stare podłoże i przepłukując je dwoma mililitrami PBS.Dodaj dwa mililitry trypsyny i inkubuj je przez około jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Umyj trypsynizowane komórki za pomocą dwóch mililitrów całego podłoża. Dodaj dziewięć mililitrów świeżej pożywki do nowych potraw.Następnie dodaj jeden mililitr roztworu ze starego naczynia do nowego naczynia. Przenieś szalki z podzielonymi komórkami do inkubatora na 48 godzin, aby osiągnąć ponad 90% zgrywkę. Traktować komórki dimetylosulfotlenkiem, ośmiomikromolową staurosporyną lub 0,5 milimolowym N-etylomaleimidem przez 15 minut przed zbiorem w buforze do lizy.Odessać pożywkę z przeciętej szalki hodowlanej, umieścić szalki hodowlane na lodzie i umyć komórki lodowatym PBS. Odessać PBS i dodać do naczynia 1,0 mililitra lodowatego buforu do lizy. Po zeskrobaniu komórek z dna naczynia za pomocą zimnego plastikowego skrobaka do komórek, zawiesinę komórek przenieść do probówki mikrowirówkowej umieszczonej na lodzie, a następnie stale mieszać przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu lizatów komórkowych w zimnej wirówce umieść je na lodzie. Zebrać supernatant do wstępnie schłodzonej świeżej probówki i wyrzucić osad. Odpipetować 300 mikrolitrów sefarozy białka G do probówki do mikrowirówki.Następnie odwirować roztwór o stężeniu 500 G przez dwie minuty. Po odrzuceniu supernatantu dodać 500 mikrolitrów PBS i dobrze odwirować. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i powtórzyć krok.Następnie wymieszaj jeden miligram przeciwciał anty-KCC2 treoniny 906 i anty-KCC2 treoniny 1007 z 200 mikrolitrami kulek sefarozy białka G przed uzupełnieniem objętości do 500 mikrolitrów za pomocą PBS. Po wytrząsaniu na wibrującej platformie lub obracającym się kole przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, powtórz dwa prania z PBS. Przeprowadzić kwantyfikację białek na lizatach komórkowych i dodać jeden miligram lizatu komórkowego do przemytych kulek i inkubować w rotatorze od końca do końca przed odwirowaniem.Wykonać trzy przemycia PBS zawierającym 150 milimolowy chlorek sodu, a następnie trzy przepłuczenia 200 mikrolitrami PBS przed ponownym zawieszeniem końcowej osadki w 100 mikrolitrach buforu do próbek LDS. Potrząsaj probówkami w wytrząsarce wirnika w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Inkubować je w bloku grzewczym i odwirować przed użyciem supernatantu do ładowania żelu.Zmontuj aparat do odlewania Western Blot i wlej świeżo przygotowany 8% żel separacyjny, aby odlać żel, pozostawiając około dwóch centymetrów przestrzeni od górnej części szkła odlewniczego. Dodaj 200 mikrolitrów absolutnego izopropanolu do zestawu i pozostaw w temperaturze pokojowej na 60 minut. Usuń izopropanol za pomocą pipety i ostrożnie spłucz żel około 200 mikrolitrami wody destylowanej.Po dodaniu świeżo przygotowanego 6% żelu do układania w stosy do zestawu odlewniczego, delikatnie wlej grzebień do studzienki i odstaw w temperaturze pokojowej na 30 minut. Następnie umieść odlany żel w zbiorniku do elektroforezy. Po wlaniu buforu do zbiornika załadować pięć mikrolitrów markera masy cząsteczkowej do pierwszego dołka i taką samą ilość białka do każdej studzienki żelu SDS-PAGE.Napełnij puste studzienki LDS i uruchom żel przez około 90 do 120 minut przy napięciu 120 woltów. Uwodnić membranę nitrocelulozową buforem transferowym zawierającym 20% metanolu. Przepłukać żel i membranę buforem transferowym i delikatnie rozprowadzić je na stosie przygotowawczym.Ułóż kanapkę do przeniesienia w następującej kolejności: elektroda ujemna, pianka warstwowa, żel płukany bibułą filtracyjną SDS-PAGE, płukana membrana nitrocelulozowa, bibuła filtracyjna, pianka warstwowa, elektroda dodatnia. Po zakończeniu ułóż zmontowaną kanapkę w zbiorniku transferowym i pracuj pod napięciem 90 V przez 90 minut lub 30 V przez 360 minut. Zablokuj suchą membranę na jedną godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą bufora blokującego.Inkubować błony z odpowiednimi rozcieńczeniami pierwszorzędowego przeciwciała i beta-aktyny w buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie podaj trzy przemycia TBST przez pięć minut każde. Inkubować przemytą błonę z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w buforze blokującym przez 60 minut i powtórzyć trzy przemycia TBST.Po zakończeniu umieść umytą membranę na tablicy obrazowej. Aby opracować sygnały, rozprowadź przygotowany roztwór, mieszając równe objętości każdego wzmocnionego odczynnika chemiluminescencyjnego na membranie przed przeniesieniem płytki obrazowania do systemu obrazowania w celu obrazowania. Traktowanie komórek HEK293 staurosporyną i N-etylomaleimidem lub NEM spowodowało zmniejszoną fosforylację w miejscach docelowych PAK, treoninie 233 znajdującej się w domenie kinazy T-loop i miejscu fosforylacji pętli S seryny 373 endogennie eksprymowanej SPAK.Staurosporyna zmniejszała fosforylację seryny 940 w komórkach HEK294 stabilnie eksprymujących KCC2b, ale NEM znacznie zwiększył jej fosforylację. Ponadto staurosporyna zmniejsza fosforylację w miejscu treoniny 505, podczas gdy NEM spowodował niewielki, ale nieznaczny wzrost fosforylacji w tym samym miejscu. Zróżnicowane efekty obu związków na fosforylację kinazy białkowej C w miejscu treoniny 505 i KCC2b w miejscu seryny 940 dobrze korelują.Reprezentatywny wynik wykazał również, że NEM spowodował istotny wzrost ekspresji całkowitej ilości KCC2, podczas gdy ekspresja całkowitego NKCC1 i SPAK nie uległa istotnej zmianie po potraktowaniu obydwoma związkami. Ponadto oba związki powodowały zmniejszoną fosforylację SPAK w miejscach treoniny 233 i seryny 373, co korelowało ze skróconą fosforylacją treoniny 906/1007 i treoniny 203/207/212 oraz endogenną ekspresją NKCC1. Dodatkowo, staurosporyna i NEM zmniejszały i zwiększały fosforylację kinazy białkowej C odpowiednio w miejscu seryny 940 i stabilnej ekspresji KCC2b, co korelowało ze zmniejszeniem i wzrostem fosforylacji kinazy białkowej C delta w miejscu treoniny 505 po leczeniu odpowiednio staurosporyną i NEM.Jeśli zostanie użyte niewłaściwe przeciwciało pierwszorzędowe lub drugorzędowe, pasmo nie będzie widoczne podczas obrazowania. Ponadto sygnał może nie być widoczny, jeśli zostanie zastosowane zbyt niskie stężenie przeciwciała. Technika ta jest istotnym narzędziem w ilościowej analizie białka i umożliwiła jej wykorzystanie do wielu celów naukowych i związanych z zasobami, w tym jako skutecznego narzędzia wczesnej diagnostyki.

study-functions-activities-neuronal-k-cl-co-transporter-kcc2-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W pierwszej kolejności neurony są charakteryzowane elektrofizjologicznie. Następnie z rejestrowanego neuronu aspiruje się cytoplazmę i poddaje ją analizie RT-PCR w celu wykrycia ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neuroprzekaźników, kanałów jonowych oraz receptorów.

Profilowanie ekspresji mRNA napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego RT-PCR

Źródło: Josiah, S. S., et al. Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting.  J. Vis. Exp. (2022). Film przedstawia etapy wykrywania i ilościowego oznaczania fosforylowanego białka kotransportera chlorku potasu 2 (KCC2) w lizacie komórkowym. Proces ten obejmuje immunoprecypitację w celu wyizolowania fosforylowanego KCC2 i chemiluminescencję w celu ilościowego określenia wyizolowanego białka.

Wykrywanie fosforylowanego neuronalnego kotransportera chlorku potasu 2 za pomocą Western Blotting

Dysfunkcja kanału Kv jest związana z zaburzeniami rytmu serca. W celu zbadania mechanizmów molekularnych, które prowadzą do takich arytmii, stosujemy systematyczny protokół izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od myszy z nokautem podjednostki pomocniczej kanału Kv. Wyizolowane kardiomiocyty można następnie natychmiast wykorzystać do komórkowych badań elektrofizjologicznych, testów biochemicznych lub immunofluorescencyjnych (IF).

Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Opisujemy metodę ilościowego określania aktywności przeciwtransportujących K+ ATPaz typu P poprzez heterologiczną ekspresję enzymów w oocytach Xenopus i mierzenie absorpcji Rb+ lub Li+ do pojedynczych komórek za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej. Metoda ta stanowi czułą i bezpieczną alternatywę dla eksperymentów ze strumieniem radioizotopów, ułatwiając złożone badania kinetyczne.

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Metylacja DNA jest w stanie utrzymać stabilny poziom ekspresji genów, a także pozwala na dynamiczne zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na różne bodźce. Szczegółowo opisujemy techniki, które pozwalają na badanie specyficznych dla genów zmian w metylacji DNA i wpływu tych zmian na ekspresję genów.

Korelacja zmian metylacji DNA specyficznych dla genu z ekspresją i aktywnością transkrypcyjną astrocytarnego KCNJ10 (Kir4.1)

Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na+/H+ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Celem tego protokołu jest etykietowanie, wzbogacanie i identyfikowanie substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub homogenat tkankowy. W tym celu metoda ta wykorzystuje unikalne aspekty biologii CK2.

Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Poznaj metodę Western blotting do badania fosforylacji kotransportera KCC2 w komórkach neuronalnych. Protokół umożliwia analizę modyfikacji białek i regulacji homeostazy chlorków w układzie nerwowym.

Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting

Przeglądaj więcej filmów