Name: Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in ovo do badania autonomicznych funkcji białka FMRP w obwodzie słuchowym zarodków kurzych. Technika umożliwia selektywny knockdown genu Fmr1 w określonych typach komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez: grant Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 32000697); Program Nauki i Technologii w Kantonie (202102080139); Fundacja Nauk Przyrodniczych Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); Fundusze na badania podstawowe dla uniwersytetów centralnych (11620324); grant badawczy Kluczowego Laboratorium Medycyny Regeneracyjnej, Ministerstwo Edukacji, Uniwersytet Jinan (nr ZSYXM202107); Fundusze na badania podstawowe dla Centralnych Uniwersytetów Chin (21621054); oraz Fundacja Medycznych Badań Naukowych prowincji Guangdong w Chinach (20191118142729581). Dziękujemy medycznemu centrum eksperymentalnemu Uniwersytetu Jinan. Dziękujemy dr Terrze Bradley za staranną redakcję manuskryptu.

<ol><li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).</li>
<li>Hinds, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+expression+of+FMR-1+provides+evidence+for+a+functional+role+in+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome.</a> Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).</li>
<li>Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+Syndrome+FMRP+co-localizes+with+regulatory+targets+PSD-95%2C+GABA+receptors%2C+CaMKIIalpha%2C+and+mGluR5+at+fiber+cell+membranes+in+the+eye+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens.</a> Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).</li>
<li>Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+distribution+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Bakker, C. E., Oostra, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+fragile+X+syndrome%3A+insights+from+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding fragile X syndrome: insights from animal models.</a> Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).</li>
<li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li>
<li>Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+presynaptic+short-term+plasticity+and+information+processing+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).</li>
<li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+target+cell-specific+role+for+presynaptic+Fmr1+in+regulating+glutamate+release+onto+neocortical+fast-spiking+inhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li>
<li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li>
<li>Higashimori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+deletion+of+astroglial+FMRP+dysregulates+glutamate+transporter+GLT1+and+contributes+to+Fragile+X+syndrome+phenotypes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).</li>
<li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+contributions+to+synaptic+and+learning+abnormalities+in+a+mouse+model+of+Fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome.</a> Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).</li>
<li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Audiogenic+seizures+in+the+Fmr1+knock-out+mouse+are+induced+by+Fmr1+deletion+in+subcortical%2C+VGlut2-expressing+excitatory+neurons+and+require+deletion+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).</li>
<li>Bland, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+regulates+the+subcellular+distribution+of+cortical+dendritic+spine+density+in+a+non-cell-autonomous+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105253(2021).</li>
<li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+mental+retardation+protein+induces+synapse+loss+through+acute+postsynaptic+translational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+mental+retardation+protein+is+required+for+synapse+elimination+by+the+activity-dependent+transcription+factor+MEF2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2.</a> Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).</li>
<li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li>
<li>Yang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+molecular+locus+for+normalizing+dysregulated+GABA+release+from+interneurons+in+the+Fragile+X+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).</li>
<li>Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+studies+in+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurodevelopmental+Disorders%22%5BJournal%5D)">Developmental studies in fragile X syndrome.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13(2020).</li>
<li>Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+FMRP+regulates+synaptogenesis+in+vivo+in+the+developing+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-specific+roles+of+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+development+of+the+hindbrain+auditory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit.</a> Development. 147 (21), (2020).</li>
<li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+system+development%3A+primary+auditory+neurons+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li>
<li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).</li>
<li>Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+expression+of+Zic+genes+during+vertebrate+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development.</a> Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e56628(2017).</li>
<li>Evsen, L., Doetzlhofer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+the+chicken+auditory+organ+by+in+ovo+micro-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53864(2016).</li>
<li>Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li>
<li>Wang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose+environment+inhibits+cranial+neural+crest+survival+by+activating+excessive+autophagy+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo.</a> Scientific Reports. 5, 18321(2015).</li>
<li>Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+correlates+with+cellular+and+synaptic+properties+in+primary+auditory+neurons+following+afferent+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet-1+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Islet-1 expression in the developing chicken inner ear.</a> Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).</li>
<li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li>
<li>Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochleovestibular+nerve+development+is+integrated+with+migratory+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).</li>
<li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).</li>
<li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).</li>
<li>Curnow, E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+animal+models+for+understanding+FMRP+functions+and+FXS+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology.</a> Cells. 11 (10), 1628(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby określić autonomiczną funkcję FMRP, konieczne jest manipulowanie jego ekspresją w poszczególnych grupach komórek lub typach komórek. Ponieważ jedną z głównych funkcji FMRP jest regulacja powstawania i plastyczności synaptycznej, selektywne manipulowanie każdym składnikiem synaptycznym określonego obwodu jest warunkiem wstępnym pełnego zrozumienia mechanizmu FMRP w komunikacji synaptycznej. Wykorzystując elektroporację in ovo zarodków kurczaków, zademonstrowaliśmy metodę celow...

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS) to zaburzenie neurorozwojowe charakteryzujące się niepełnosprawnością intelektualną, nieprawidłowościami sensorycznymi i zachowaniami autystycznymi. W większości przypadków FXS jest spowodowany globalną utratą białka upośledzenia umysłowego w kształcie litery X (FMRP; kodowane przez gen Fmr1) rozpoczynającego się we wczesnych stadiach embrionalnych1. FMRP to białko wiążące RNA, które normalnie ulega ekspresji w większości neuronów i komórek glejowych w mózgu, a także w narządach zmysłów2,3,4. W mózgach ssaków FMRP jest prawdopodobnie związany z setkami mRNA, które kodują białka ważne dla różnych aktywności neuronalnych5. Badania na konwencjonalnych zwierzętach z nokautem Fmr1 wykazały, że ekspresja FMRP jest szczególnie ważna dla składania i plastyczności neurotransmisji synaptycznej6. Kilka modeli nokautu warunkowego i mozaikowego wykazało ponadto, że działania i sygnały FMRP różnią się w zależności od regionów mózgu, typów komórek i miejsc synaptycznych podczas kilku zdarzeń rozwojowych, w tym projekcji aksonalnej, wzorów dendrytycznych i plastyczności synaptycznej7,8,9,10,11,12,13,14. Ostrą funkcję FMRP w regulacji przekaźnictwa synaptycznego badano poprzez wewnątrzkomórkowe dostarczanie hamujących przeciwciał FMRP lub samego FMRP w wycinkach mózgu lub hodowanych neuronach15,16,17,18. Metody te nie dają jednak możliwości śledzenia konsekwencji spowodowanych błędnym wyrażeniem FMRP podczas opracowywania. W związku z tym opracowanie metod in vivo do badania autonomicznych funkcji komórek FMRP jest bardzo potrzebne i oczekuje się, że pomoże określić, czy zgłaszane anomalie u pacjentów z FXS są bezpośrednimi konsekwencjami utraty FMRP w powiązanych neuronach i obwodach, czy też wtórnymi konsekwencjami wynikającymi ze zmian w całej sieci podczas rozwoju19.
Słuchowy pień mózgu zarodków kurczaków oferuje wyjątkowo korzystny model do dogłębnych analiz funkcjonalnych regulacji FMRP w rozwoju obwodów i synaps. Łatwy dostęp do embrionalnych mózgów kurcząt i dobrze znana technika elektroporacji in ovo do manipulacji genetycznej w znacznym stopniu przyczyniły się do naszego zrozumienia rozwoju mózgu we wczesnych stadiach embrionalnych. W niedawno opublikowanym badaniu technika ta została połączona z zaawansowanymi narzędziami molekularnymi, które umożliwiają czasową kontrolę błędnej ekspresji FMRP20,21. W tym przypadku metodologia jest zaawansowana w celu indukowania selektywnych manipulacji neuronów presynaptycznych i postsynaptycznych oddzielnie. Metoda ta została opracowana w obwodzie słuchowym pnia mózgu. Sygnał akustyczny jest wykrywany przez komórki rzęsate w słuchowym uchu wewnętrznym, a następnie przekazywany do zwoju słuchowego (AG; nazywanego również zwojem spiralnym u ssaków). Neurony dwubiegunowe w AG unerwiają komórki rzęsate swoimi wyrostkami obwodowymi, a następnie wysyłają centralną projekcję (nerw słuchowy) do pnia mózgu, gdzie kończą się w dwóch pierwotnych jądrach ślimakowych, jądrze wielkokomórkowym (NM) i jądrze kątowym (NA). Neurony w NM są strukturalnie i funkcjonalnie porównywalne z kulistymi, krzaczastymi komórkami przednio-brzusznego jądra ślimakowego ssaków. W NM włókna nerwów słuchowych (ANF) synapsują się na somatach neuronów NM za pośrednictwem dużej cebulki końcowej Held terminals22. Podczas rozwoju neurony NM powstają z rombomerów 5 i 6 (r5/6) w tyłomózgowiu23, podczas gdy neurony AG pochodzą z neuroblastów znajdujących się w otocyst24. Tutaj opisujemy procedurę selektywnego obniżania ekspresji FMRP w presynaptycznych neuronach AG i osobno w postsynaptycznych neuronach NM.

<table><tbody><tr><td>Inkubacja jaj</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 &deg; C Lodówka</td><td>MAGAT</td><td></td><td>Służy do przechowywania zapłodnionych jaj</td></tr>.<tr><td>Inkubator do jaj</td><td>SHANGHAI BOXUN</td><td>GZX-9240MBE</td><td></td></tr><tr><td>Zapłodnione jaja</td><td>Farma Uniwersytetu Rolniczego</td><td></td> w Południowych Chinach <td>Aby zapewnić optymalną żywotność, jaja należy zużyć w ciągu jednego tygodnia.</td></tr><tr><td>Preparat plazmidowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sigma</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Solarbio</td><td>G1661</td><td>Przygotować 0,1% roztwór roboczy w wodzie destylowanej i autoklawie.</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania plazmidu Maxi</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td>Rozpuść plazmidowe DNA w buforze Tris-EDTA (TE); zestaw do przygotowania bez endotoksyn</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Przygotować 7,5 M roztwór roboczy w wodzie wolnej od nuklazów.</td></tr><tr><td>Electroporration and Doxycyklin Administration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BTX</td><td>ECM399</td><td></td></tr><tr><td>1 mL / 5 mL Strzykawka</td><td>GUANGZHOU KANGFULAI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>CNOPTEC</td><td>SZM-42</td><td></td></tr><tr><td>Doxcycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Do każdej dawki należy stosować świeże porcje i przechowywać w temperaturze -20 & stopień C.</td></tr><tr><td>Kapilara szklana</td><td>BEIBOBOMEI</td><td>RD0910</td><td>0,9-1,1 mm * 100 mm</td></tr><tr><td>Parafilm laboratoryjny</td><td>PARAFILM</td><td>PM996</td><td>przezroczysta folia</td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td><td>WD-2</td><td>Stan ciągnięcia: 500 &deg; C dla 15 s</td></tr><tr><td>Platynowe elktrody</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Średnica 0,5 mm, odstęp 1,5 mm.</td></tr><tr><td>Rurka gumowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td> Sekcja i utrwalenie tkanek</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td>Rozmiar końcówki: 0,05 * 0,01 mm</td></tr><tr><td>Inne narzędzia chirurgiczne</td><td>RWD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Świeżo przygotowany 4% roztwór PFA w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami może być przechowywany w temperaturze 4 stopni C przez okres do 1 tygodnia.</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>DOW</td><td>01673921</td><td>W przypadku czarnych płyt tła stosuje się proszek węglowy dopuszczony do kontaktu z żywnością.</td></tr><tr><td>Sectioning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>LEICA</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>Ze skóry bydlęcej.</td></tr><tr><td>Przesuwny mikrotom</td><td>LEICA</td><td>SM2010</td><td></td></tr><tr><td>Immunostaining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty-mysz</td><td>Abcam</td><td>ab150113</td><td>1:500 rozcieńczenie, RRID: AB_2576208</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 koza anty-królik</td><td>Abcam</td><td>ab150078</td><td>1:500 rozcieńczenie, RRID: AB_2722519</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab285390</td><td>1: 1000 rozcieńczalnik</td></tr><tr><td>Fluoromount-G podłoże montażowe</td><td>Południowy&nbsp; Biotech</td><td>Sb-0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało FMRP</td><td>Y. Wang, Uniwersytet Stanowy Florydy</td><td>#8263</td><td>Rozcieńczenie 1:1000, RRID: AB_2861242</td></tr><tr><td>Przeciwciało Islet-1</td><td>DSHB</td><td>39.3F7</td><td>Rozcieńczenie 1:100, RRID: AB_1157901</td></tr><tr><td>Płytka Netwella</td><td>Corning</td><td>3478</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało neurofilamentowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4142</td><td>1:1000 rozcieńczenie, RRID: AB_477272</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko parwalbuminie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3088</td><td>Rozcieńczenie 1:10000, RRID: AB_477329</td></tr><tr><td>Przeciwciało SNAP25</td><td>Abcam</td><td>ab66066</td><td>Rozcieńczenie 1:1000, RRID:</td></tr> <tr><td>AB_2192052Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe photoshop</td><td>Oprogramowanie do</td><td>edycji obrazów</td>ADOBE <td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>LEICA</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy fluorescencyjny</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet oprogramowania do komercyjnego przetwarzania obrazów</td> <td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td><td>OlYMPUS</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego fragile x w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) jest białkiem wiążącym mRNA, które reguluje lokalną translację białek. Utrata lub dysfunkcja FMRP prowadzi do nieprawidłowych czynności neuronalnych i synaptycznych w zespole łamliwego chromosomu X (FXS), który charakteryzuje się niepełnosprawnością intelektualną, nieprawidłowościami sensorycznymi i problemami z komunikacją społeczną. Badania funkcji FMRP i patogenezy FXS prowadzono przede wszystkim z nokautem Fmr1 (gen kodujący FMRP) u zwierząt transgenicznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę in vivo do określania autonomicznej funkcji komórki FMRP w okresie składania obwodów i tworzenia synaps przy użyciu zarodków kurzych. Metoda ta wykorzystuje elektroporację specyficzną dla etapu, miejsca i kierunku indukowanego lekiem systemu wektorowego zawierającego małe RNA spinki do włosów Fmr1 (shRNA) i reporter EGFP. Dzięki tej metodzie uzyskaliśmy selektywne knockdown FMRP w zwoju słuchowym (AG) i w jednym z jego celów pnia mózgu, jądrze magnocellularis (NM), zapewniając w ten sposób specyficzną dla komponentu manipulację w obwodzie AG-NM. Dodatkowo, mozaikowy wzór transfekcji umożliwia kontrolę wewnątrz zwierząt i porównania sąsiednich neuronów/włókien w celu zwiększenia niezawodności i czułości w analizie danych. System wektorów indukowalnych zapewnia czasową kontrolę początku edycji genów w celu zminimalizowania kumulujących się efektów rozwojowych. Połączenie tych strategii zapewnia innowacyjne narzędzie do analizy autonomicznej funkcji FMRP w rozwoju synaps i obwodów.

Poprzez przeprowadzenie elektroporacji in ovo w różnych miejscach oraz na różnych etapach rozwojowych, osiągnęliśmy selektywny knockdown FMRP albo w obwodzie słuchowym, albo w pniu mózgu w obszarze słuchowym.
Wyciszenie FMRP w NM 
Krótkie interferencyjne RNA w formie spinki (shRNA) przeciwko kurzemu Fmr1 zostało zaprojektowane i sklonowane do systemu wektorowego Tet-On zgodnie z wcześniejszym opisem20. Układ do elektroporacji in...

Korzystając z elektroporacji in ovo, opracowaliśmy metodę selektywnego transfekowania wewnętrznego ucha słuchowego i jądra ślimakowego w zarodkach kurczaków, aby osiągnąć specyficzne dla danej grupy komórek eliminację delikatnego białka X w upośledzeniu umysłowym podczas dyskretnych okresów składania obwodów.

Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Nasz protokół jest metodą in vivo do badania autonomicznych funkcji FMRP podczas rozwoju. Może to pomóc w zrozumieniu specyficznej dla typu komórki patofizjologii zespołu łamliwego chromosomu X. Metoda ta wykorzystuje elektroporację specyficzną dla etapu, miejsca i kierunku indukowanego lekiem systemu wektorowego zawierającego małe RNA spinki do włosów Fmr1.Dzięki tej metodzie uzyskujemy selektywne knockdown FMRP w obwodzie słuchowym. Metoda ta może być również stosowana do badania funkcji innych genów w obwodzie słuchowym lub układzie przedsionkowym. Zacznij od umieszczenia jaj poziomo, aby umieścić zarodek na górze jaja w celu łatwej manipulacji.Inkubować w temperaturze 38 stopni Celsjusza przez 46 do 48 godzin do stadium Hamburgera i Hamiltona lub HH 12 w przypadku transfekcji cewy nerwowej lub przez 54 do 56 godzin do HH 13 w przypadku transfekcji otocysty. Wyjmij jaja z inkubatora, po jednym tuzinie jaj na raz. Trzymanie jaj poza inkubatorem przez ponad godzinę wprowadza zmiany rozwojowe i zmniejsza żywotność.Użyj latarki, aby rzucić światło z dna jajka. Lokalizacja zarodka pojawia się jako ciemny obszar na skorupce jaja. Zaznacz ołówkiem położenie zarodka na skorupce jajka.Wy

dissecting-cell-autonomous-function-fragile-x-mental-retardation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Migracja neuronów jest regulowana przez liczne czynniki autonomiczne i nieautonomiczne komórki.  Protokół ten pokazuje, w jaki sposób można wykorzystać elektroporację in utero do określenia, czy fenotyp u myszy transgenicznej jest spowodowany zakłóceniem wewnętrznego mechanizmu komórki lub upośledzeniem interakcji między neuronem a jego środowiskiem.

Indukcja delecji białka poprzez elektroporację in utero w celu zdefiniowania deficytów w migracji neuronów w modelach transgenicznych

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Narząd słuchowy pośredniczy w słyszeniu. W niniejszej pracy przedstawiono zmodyfikowaną metodę mikroelektroporacji in ovo zoptymalizowaną do badania proliferacji i różnicowania słuchowych komórek progenitorowych w rozwijającym się narządzie słuchowym kurcząt.

Transfer genów do narządu słuchowego kurczaka za pomocą mikroelektroporacji in ovo

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Neurony słuchowe pnia mózgu ptaków i ssaków są wyspecjalizowane w szybkim kodowaniu neuronalnym, podstawowym procesie dla normalnych funkcji słuchowych. Neurony te powstają z odrębnych prekursorów embrionalnego tyłomózgowia. Przedstawiamy techniki wykorzystujące elektroporację do ekspresji genów w tyłomózgowiu zarodków kurczaków w celu zbadania funkcji genów podczas rozwoju słuchowego.

In Ovo Elektroporacja w słuchowym pniu mózgu kurczaka

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Poznaj metodę elektroporacji in ovo do badania autonomicznych funkcji białka FMRP w obwodzie słuchowym zarodków kurzych. Technika umożliwia selektywny knockdown genu Fmr1 w określonych typach komórek nerwowych.

Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

Przeglądaj więcej filmów