Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

Nasz protokół jest metodą in vivo do badania autonomicznych funkcji FMRP podczas rozwoju. Może to pomóc w zrozumieniu specyficznej dla typu komórki patofizjologii zespołu łamliwego chromosomu X. Metoda ta wykorzystuje elektroporację specyficzną dla etapu, miejsca i kierunku indukowanego lekiem systemu wektorowego zawierającego małe RNA spinki do włosów Fmr1.

Dzięki tej metodzie uzyskujemy selektywne knockdown FMRP w obwodzie słuchowym. Metoda ta może być również stosowana do badania funkcji innych genów w obwodzie słuchowym lub układzie przedsionkowym. Zacznij od umieszczenia jaj poziomo, aby umieścić zarodek na górze jaja w celu łatwej manipulacji.

Inkubować w temperaturze 38 stopni Celsjusza przez 46 do 48 godzin do stadium Hamburgera i Hamiltona lub HH 12 w przypadku transfekcji cewy nerwowej lub przez 54 do 56 godzin do HH 13 w przypadku transfekcji otocysty. Wyjmij jaja z inkubatora, po jednym tuzinie jaj na raz. Trzymanie jaj poza inkubatorem przez ponad godzinę wprowadza zmiany rozwojowe i zmniejsza żywotność.

Użyj latarki, aby rzucić światło z dna jajka. Lokalizacja zarodka pojawia się jako ciemny obszar na skorupce jaja. Zaznacz ołówkiem położenie zarodka na skorupce jajka.

Wytrzyj jajka gazą zawierającą 75% etanolu i wywierć otwór w spiczastym końcu jajek za pomocą końcówek nożyczek. Następnie usuń dwa mililitry albuminy za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 18G. Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby umożliwić wprowadzenie igły.

Wytrzyj wyciekającą albuminę gazą i uszczelnij otwór przezroczystą taśmą. Przykryj wierzch jaj przezroczystą taśmą, wyśrodkowanie na ciemnym obszarze zaznaczonym ołówkiem, aby zminimalizować pęknięcia i zapobiec spadającym resztkom skorupki podczas okienkowania. Przetrzyj wszystkie narzędzia chirurgiczne gazą zawierającą 75% etanolu i przetrzyj obszar pokryty taśmą 75% etanolem.

Użyj małej pary nożyczek, aby wyciąć okienko o powierzchni od jednego do dwóch centymetrów kwadratowych na obwodzie znaku ołówka. Trzymaj nożyczki płasko, aby uniknąć uszkodzenia zarodka pod spodem. Umieść jajko z okienkiem pod mikroskopem stereoskopowym z 10-krotnym okularem i 2-krotnym zoomem.

Napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra roztworem atramentu, a następnie dopasuj igłę o rozmiarze 27. Zegnij igłę pod kątem 45 stopni za pomocą kleszczy. Pod mikroskopem ostrożnie szturchnij od krawędzi obszaru opaqua i włóż igłę pod zarodek.

Wstrzyknąć około 50 mikrolitrów atramentu, który dyfunduje poniżej obszaru przejrzystego, w celu wizualizacji zarodka. Tusz utworzy ciemne tło dla wyraźnej wizualizacji zarodka. Wciągnij szklane kapilary do pipet za pomocą ściągacza do pipet.

Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie otwórz końcówkę igły kapilarnej o średnicy od 10 do 20 mikrometrów za pomocą kleszczy. Pipety należy przechowywać w pojemniku do przechowywania, aż do użycia. Następnie napełnij pipetę kapilarną 0,5 do 1 mikrolitra mieszaniny plazmidów, stosując podciśnienie przez gumową rurkę na końcu pipety za pomocą strzykawki.

Umieść jajo pod mikroskopem tak, aby zarodek był ustawiony pionowo z ogonem blisko ciebie. Trzymaj pipetę kapilarną jedną ręką lub za pomocą manipulatora trójosiowego i przyłóż końcówkę pipety do rombomeru 5 do 6. w kierunku od ogona do głowy.

Delikatnie przełóż końcówkę przez błonę witelliny do grzbietowej cewy nerwowej, a następnie lekko wyjmij pipetę, tak aby końcówka znalazła się w świetle cewy nerwowej. Wstrzyknąć mieszaninę plazmidu, stosując ciśnienie powietrza, aż zabarwiony plazmid całkowicie dyfunduje do rombomeru 5 do 6 i rozciąga się na rombomer 3 i rombomer 4. Sprawdź, czy wstrzyknięcie się powiodło, co osiąga się, gdy roztwór niebieskiego plazmidu szybko dyfunduje w dół cewy nerwowej bez wycieku.

Kiedy dochodzi do wycieku, niebieski szybko zanika. Natychmiast po wstrzyknięciu należy umieścić platynową elektrodę bipolarną po obu stronach cewy neuronowej. Dostarcz dwa impulsy o napięciu 12 V i czasie trwania 50 milisekund za pomocą elektroporatora.

Obserwuj pęcherzyki powietrza na końcach elektrody bipolarnej, z większą ilością po stronie ujemnej. Sprawdź, czy elektroporacja jest udana, co osiąga się, gdy zabarwiona mieszanina plazmidu dostanie się do tkanki cewy nerwowej w pobliżu dodatniej strony elektrody. Po elektroporacji ostrożnie wyjmij elektrodę bipolarną.

Przykryj okienko na skorupce jajka kawałkiem przezroczystej folii wstępnie przyciętej na dwucalowe kwadraty i spryskanej 75% etanolem. Umieść jajo z powrotem w inkubatorze. Oczyść elektrodę bipolarną, dostarczając od 10 do 20 impulsów o napięciu 12 woltów i czasie trwania 50 milisekund w soli fizjologicznej przed przejściem do następnego jaja.

Pod mikroskopem umieść jajo w taki sposób, aby zarodek był pionowy, a ogon blisko ciebie. Przytrzymaj pipetę kapilarną i delikatnie szturchnij prawą otocystę w kierunku grzbietowo-bocznym. Wstrzyknąć mieszaninę plazmidu pod ciśnieniem powietrza, aż otocysta zostanie wypełniona niebieskim roztworem.

Sprawdź, czy wstrzyknięcie jest udane, co osiąga się, gdy mieszanina niebieskiego plazmidu jest zamknięta w otocyście i nie przecieka. Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy umieścić elektrodę bipolarną na otocyście i ustawić dodatnią i ujemną stronę odpowiednio przed i za otocystą. Za pomocą elektroporatora można dostarczyć dwa impulsy o napięciu 12 woltów i czasie trwania 50 milisekund.

Sprawdź, czy elektroporacja jest udana, co osiąga się, gdy mieszanina niebieskiego plazmidu dostanie się do tkanki otocysty w pobliżu dodatniej strony elektrody. Po elektroporacji ostrożnie wyjmij elektrodę bipolarną i przykryj okienko na skorupce jajka przezroczystą folią. Na koniec włóż jajo z powrotem do inkubatora.

Reprezentatywny obraz przedstawia przykład trzeciego dnia embrionalnego lub E3 po transfekcji rurki nerwowej i leczeniu dox w drugim dniu embrionalnym, czyli E2. Pokazano tutaj transfekowane komórki z Fmr1 shRNA i EGFP na przekroju poprzecznym. Komórki wykazujące ekspresję EGFP były ograniczone do jednej strony cewy nerwowej i pnia mózgu. Przekrój czynny w E15 z jądrem magnocellularis, czyli neuronami NM eksprymującymi EGFP, po stronie transfekowanej.

Po stronie przeciwległej aksony zawierające EGFP zaobserwowano w brzusznej części jądra laminarystycznego lub NL. Efekt knockdown shRNA Fmr1 został potwierdzony przez wyraźne zmniejszenie immunoreaktywności FMRP w transfekowanych neuronach NM w porównaniu z sąsiednimi neuronami nietransfekowanymi. Zwój słuchowy w E19 z immunoreaktywnością FMRP jest pokazany tutaj. Neurony zwojowe słuchowe nie były transfekowane.

Niektóre komórki glejowe pochodzące z komórek grzebienia nerwowego czaszki zostały przetransfekowane. Reprezentatywne obrazy pokazują powalanie FMRP w przewodzie słuchowym po transfekcji otocysty. Przewody słuchowe w E9 wykazywały rozległą fluorescencję EGFP.

Na odcinkach poprzecznych komórki wykazujące ekspresję EGFP znajdowały się w brodawce podstawnej i zwoju słuchowym. Efekt knockdown shRNA Fmr1 został potwierdzony przez zmniejszoną immunoreaktywność FMRP w transfekowanych komórkach rzęsatych w porównaniu z sąsiednimi nietransfekowanymi komórkami rzęsatymi. Podobnie, immunoreaktywność FMRP była znacznie zmniejszona w transfekowanych neuronach zwojowych słuchowych.

Centralna projekcja transfekowanych neuronów zwoju słuchowego była śledzona do pnia mózgu za pośrednictwem nerwu słuchowego z charakterystycznymi zakończeniami opuszki końcowej. Podczas wykonywania tej procedury najważniejsze jest kontrolowanie miejsca i kierunku elektroporacji w celu selektywnej transfekcji. Po tej procedurze można przeprowadzić wypełnianie pojedynczych typów komórek, barwienie immunologiczne, sortowanie komórek, a następnie widmo masowe lub sekwencjonowanie pojedynczych komórek w celu ujawnienia zmian na poziomie morfologicznym i biochemicznym.

Technika ta umożliwia również selektywną edycję innych genów z kontrolą czasową i specyficznością komponentów w uchu słuchowym dla obwodów pnia i może być modyfikowana w celu manipulowania układem przedsionkowym.