Identyfikacja kaspaz i ich motywów, które rozszczepiają białka podczas infekcji wirusem grypy A

Metoda ta pomoże określić i potwierdzić, czy białko w komórkach zakażonych wirusem grypy ulega degradacji lub rozszczepieniu przez kaspazy oraz zidentyfikować miejsca rozszczepienia kaspazy. Metoda ta wymaga jedynie podstawowych warunków laboratoryjnych biologii molekularnej i komórkowej oraz umiejętności badawczych i nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu ani szkolenia w zakresie oprogramowania. Metoda ta może być dostosowana do osiągnięcia podobnych celów związanych z zakażeniem innymi wirusami lub drobnoustrojami zwierzęcymi oraz ekspozycją na bodźce zewnętrzne, takie jak toksyny i chemikalia.

Na początek wysiewaj komórki MDCK lub A549 na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia usuń starą pożywkę hodowlaną z komórek i umyj komórki w każdej studzience dwukrotnie jednym mililitrem MEM bez surowicy.

Następnie zainfekuj komórki, dodając 400 mikrolitrów inokulum wirusa grypy A i umieść płytkę do inkubacji na jedną godzinę. Po inkubacji usunąć inokulum wirusa i umyć komórki MEM. Dodaj jeden mililitr MEM bez surowicy do każdej studzienki i inkubuj komórki, jak pokazano w poprzednim kroku.

Po 24 godzinach zbierz komórki, zeskrobując je jednomililitrowym tłokiem strzykawki i przenieś do 1,5 mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o sile 12 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i zebrać supernatant. Przemyć osad komórkowy 250 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i odwirować.

Usunąć supernatant i dodać 100 mikrolitrów buforu do lizy komórek. Wymieszaj wirem. Podgrzej probówkę w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby całkowicie zlizować komórki.

Następnie rozpuść równe ilości białka z niezakażonych i zakażonych próbek za pomocą standardowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS. Po elektroforezie przenieś żel białkowy na membranę nitrocelulozową lub PVDF i wykonaj Western blot. Porównaj poziomy białka w pasach próbek zakażonych pozorowanych i traktowanych inhibitorem.

W 100 mikrolitrach odpowiedniej pożywki, takiej jak Opti-MEM, rozcieńczyć 100 nanomolowców siRNA kontrolnego lub kaspazy lub odpowiednią objętość odczynnika do transfekcji. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Wymieszać 100 mikrolitrów każdego roztworu siRNA ze 100 mikrolitrami roztworu odczynnika do transfekcji i inkubować przez 20 do 45 minut w temperaturze pokojowej.

Podziel i dodaj 100 000 komórek MDCK lub A549 w 800 mikrolitrach kompletnej pożywki wzrostowej. Dodać 200 mikrolitrów kompleksu odczynników do transfekcji siRNA i dodać tę zawiesinę do 12-dołkowej płytki hodowlanej. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny.

Zakażenie komórek wirusem grypy A, ale bez inhibitorów. Wykonaj Western blot i porównaj poziomy białka, jak pokazano wcześniej. Zlokalizuj motywy rozszczepienia kaspazy XXXD i DXXD na polipeptydzie.

Zmutuj kwas asparaginowy P1, kwas glutaminowy lub alaninę przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce i potwierdź przez sekwencjonowanie DNA. W 100 mikrolitrach odpowiedniej pożywki rozcieńczyć dwa mikrogramy DNA osocza typu dzikiego lub zmutowanego lub zalecaną objętość odczynnika do transfekcji i inkubować probówki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zmieszać 100 mikrolitrów roztworu DNA osocza ze 100 mikrolitrami roztworu odczynnika do transfekcji i inkubować przez 20 do 45 minut w temperaturze pokojowej.

W międzyczasie podziel i dodaj 300 000 komórek MDCK lub A549 do 800 mikrolitrów kompletnej pożywki wzrostowej. Dodaj 200 mikrolitrów kompleksu odczynników do transfekcji DNA i dodaj tę zawiesinę do 12-dołkowej płytki hodowlanej. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla.

Po 48 godzinach należy zainfekować komórki wirusem grypy A bez inhibitorów. Wykonaj Western blot i porównaj poziomy białka, jak pokazano wcześniej. Za pomocą Western blot oceniano degradację kortaktyny gospodarza przez kaspazy gospodarza wywołane grypą.

Leczenie komórek zakażonych wirusem grypy inhibitorem kaspazy-3 spowodowało uratowanie kortaktyny i degradację NP wirusa. Kwantyfikacja intensywności prążków kortaktyny i jej normalizacja z odpowiadającym im pasmem aktyny wykazała, że poziom kortaktyny w zakażonych komórkach leczonych inhibitorem kaspazy-3 był wyższy w porównaniu z nieleczonymi zakażonymi komórkami. W komórkach zubożonych w kaspazę-6 lub kaspazę-7.

Nie zaobserwowano znaczącej poprawy poziomu polipeptydu kortaktyny, podczas gdy w komórkach zubożonych w kaspazę-3 kortaktyna odzyskana z wirusa grypy indukowała degradację. Kwantyfikacja i porównanie poziomów polipeptydów wykazało, że poziom polipeptydu kortaktyny w zakażonych komórkach ze zubożoną ekspresją kaspazy-3 był wyższy niż w komórkach z normalną ekspresją kaspazy-3. Mutacja kwasu asparaginowego w pozycji 116 do kwasu glutaminowego sprawiła, że polipeptyd kortaktyny stał się odporny na degradację wywołaną wirusem grypy.

Kwantyfikacja i porównanie poziomów polipeptydów wykazało, że poziom zmutowanego polipeptydu kortaktyny w zakażonych komórkach był wyższy niż w przypadku polipeptydu kortaktyny typu dzikiego. Wymagane jest wygenerowanie dziesiątek mutantów i wykonanie powtarzającego się Western blot w celu zidentyfikowania miejsca rozszczepienia kaspazy w polipeptydzie. Można by opracować test biochemiczny in vitro zawierający oczyszczoną kaspazę i docelowy polipeptyd w celu potwierdzenia, że białko będące przedmiotem zainteresowania jest bezpośrednim substratem na bazie gazu.

Protokół ten pomoże zrozumieć znaczenie, degradację lub rozszczepienie białka docelowego w badanym systemie, takim jak infekcja wirusowa lub choroba.