Name: Identyfikacja kaspaz i ich motywów, które rozszczepiają białka podczas infekcji wirusem grypy A (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji kaspaz i ich motywów rozszczepiających białka w komórkach ssaków zakażonych wirusem grypy A. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów wirulencji i potencjalnych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse van Westrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nowa Zelandia), H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin) oraz Wydział Mikrobiologii i Immunologii oraz Szkoła Nauk Biomedycznych (University of Otago).

Uzyskano zgody regulacyjne od Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Otago na pracę z IAV i komórkami ssaków. W niniejszym badaniu wykorzystano nerki Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) lub ludzkie komórki nabłonka pęcherzyków płucnych A549 i podtypy IAV H1N1. IAV był hodowany w jajach kurzych, jak opisano w innym miejscu17. Do pracy z komórkami ssaków wykorzystano sterylne i aseptyczne warunki, a do pracy z podtypami IAV wykorzystano obiekt o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (lub Physical Containment 2) i szafę bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
1. Ocena rozszczepienia lub degradacji białek w komórkach zakażonych IAV przez kaspazy
<ol>
	<li>Wysiew 3 x 10 5 komórek MDCK lub A549 na basenik w 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. 
	UWAGA: W przypadku korzystania z komórek MDCK należy upewnić się, że przeciwciało przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania rozpoznaje swój gatunek psów.</li>
	<li>Zasiej studzienki parami, tj. parą kontrolną - jedną studzienką dla niezakażonej - próbą makietową i jedną dla zakażonej próbki próbnej - oraz parą testową - jedną studzienką dla próbki niezakażonego inhibitora A i jedną dla próbki zakażonego inhibitora A. Zwiększ liczbę par z każdym dodatkowym inhibitorem (patrz referencje7,8).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia należy zainfekować komórki wirusem IAV (podtyp H1N1 lub inny podtyp).
	<ol>
		<li>W tym celu należy przygotować inokulum wirusa, rozcieńczając zapas wirusa w 400 μl minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) bez surowicy (patrz Tabela Materiałów) przy wielokrotności infekcji (MOI) 0,5-3,0 jednostek tworzących płytkę miażdżycową (pfu)/komórka7,11 (współczynnik podwojenia liczby komórek przy obliczaniu MOI). 
UWAGA: W celu zakażenia komórek MDCK należy uzupełnić inokulum wirusa trypsyną tosyl-fenyloalanylochlorometyloketon (TPCK)-trypsynę w końcowym stężeniu 1 μg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć starą pożywkę hodowlaną z komórek (krok 1.3) i umyć komórki 1 ml/dołek MEM bez surowicy 2x.</li>
	<li>Dodać 400 μl inokulum wirusa (krok 1.4.1) do komórek i inkubować je przez 1 godzinę w temperaturze 35 °C w atmosferze 5% CO2 .</li>
	<li>W międzyczasie rozcieńczyć inhibitor kaspazy (np. Z-DEVD-FMK), inhibitor lizosomów (np. NH4Cl) lub inhibitor proteasomu (np. MG132) (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia odpowiednio 40 μM, 20 mM lub 10 μM w bezsurowicy MEM7 (patrz Tabela materiałów). Te dwa ostatnie inhibitory służą jako kontrola. Rozcieńczyć równą objętość rozpuszczalnika (jeżeli jest inny niż woda) użytego do rozpuszczenia jednego z inhibitorów w podłożu niezawierającym surowicy jako makietę.</li>
	<li>Usuń inokulum wirusa i umyj komórki jak w kroku 1.5 (1x).</li>
	<li>Dodać do komórek bezsurowicowy MEM o stężeniu 1 ml / studzienkę, próbowany lub uzupełniony inhibitorem i inkubować komórki jak w kroku 1.6. Ten punkt czasowy jest uważany za infekcję po 0 godzinach.</li>
	<li>Po 24 godzinach zbierz komórki, zeskrobując je tłokiem strzykawki o pojemności 1 ml (gumowa strona) i przenieś do probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 12 000 x g przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant za pomocą pipety. 
	UWAGA: Ten supernatant może zostać odrzucony lub użyty do testu płytki nazębnej8 w celu zmierzenia miana uwolnionego potomstwa wirusa.</li>
	<li>Przepłukać osad komórkowy 250 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez ponowne odwirowanie, jak w kroku 1.11.</li>
	<li>Usuń supernatant i poddaj komórki lizie, dodając 80-100 μl buforu do lizy komórek (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 0,5% deoksycholanu sodu, 1% Triton X-100 i 1x koktajl inhibitorów proteazy, patrz Tabela materiałów) i wirowanie.</li>
	<li>Podgrzewać probówkę w temperaturze 98 °C przez 10 minut, aby całkowicie uległa lizie i przygotować całkowity lizat komórkowy. Przechowywać lizaty w temperaturze 4 °C do wykonania kroków 1.15-1.17 następnego dnia, ale w celu uzyskania najlepszych wyników należy zakończyć te kroki tego samego dnia.</li>
	<li>Oszacuj ilość białka w każdej próbce za pomocą zestawu do oznaczania BCA (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Rozpuścić równe ilości białka z niezakażonych i zakażonych próbek za pomocą standardowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE)11 wraz z markerami masy cząsteczkowej11.</li>
	<li>Przenieść białko do membrany z nitrocelulozy lub polifluorku winylidenu (PVDF) (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Membrana PVDF może dawać wysokie tło w niektórych obrazownikach western blot; Sprawdź zgodność.</li>
	<li>Wykonaj western blotting w celu wykrycia interesującego białka, korzystając z metody opisanej w innym miejscu11.</li>
	<li>Porównaj poziomy białka w próbkach zakażonych pozorowanych i traktowanych inhibitorami. 
	UWAGA: Jeśli poziom białka powrócił do normy w zakażonym pasie próbki potraktowanym inhibitorem kaspazy, wówczas białko jest rozszczepiane lub degradowane przez kaspazy. W przeciwnym razie jest degradowany przez lizosom lub proteasom.</li>
	<li>Określ ilościowo odzysk białka, mierząc jego intensywność pasma na każdym torze z co najmniej trzech powtórzeń tego samego eksperymentu i normalizując go za pomocą odpowiedniego pasma kontrolnego obciążenia.</li>
	<li>Użyj dowolnego współczesnego imagera i powiązanego oprogramowania (patrz Tabela materiałów), aby zobrazować western blot i określić ilościowo odzysk białka.</li>
</ol>
2. Potwierdzenie rozszczepienia lub degradacji białek za pośrednictwem kaspazy w komórkach zakażonych IAV przez interferencję RNA
<ol>
	<li>Zaprojektuj lub uzyskaj wstępnie zaprojektowany mało-interferujący RNA (siRNA) ukierunkowany na psią lub ludzką kaspazę 3, kaspazę 6 i kaspazę 7 (kaspazy egzekutora1) oraz kontrolne siRNA nieukierunkowane (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dostarcz każde siRNA do komórek MDCK lub A549 przez odwrotną transfekcję8,11.</li>
	<li>W tym celu rozcieńczyć w oddzielnych probówkach 100 nM kontrolnego siRNA lub kaspazy siRNA lub zalecanej objętości odczynnika do transfekcji (patrz Tabela Materiałów) w 100 μL odpowiedniej pożywki (takiej jak OptiMEM, patrz Tabela Materiałów) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować każde rozcieńczenie w dwóch egzemplarzach. 
	UWAGA: Ten duplikat zawiera jedną kontrpróbę do analizy obniżenia ekspresji kaspazy za pomocą RT-qPCR lub western blot (jeśli dostępne są przeciwciała przeciwko kaspazom), a drugą do oceny odzyskiwania białka będącego przedmiotem zainteresowania przez western blot.</li>
	<li>Zmieszać 100 μl każdego roztworu siRNA ze 100 μl roztworu odczynnika do transfekcji (krok 2.3) i inkubować przez 20-45 minut w temperaturze pokojowej w celu utworzenia kompleksu odczynnika siRNA-transfekcja.</li>
	<li>W międzyczasie podzielić i dodać 1 x 105 komórek MDCK lub A549 w 800 μl kompletnej pożywki wzrostowej, wymieszać z 200 μl kompleksu odczynnika do transfekcji siRNA (krok 2.5) i dodać 1 ml zawiesiny do dołka 12-dołkowej płytki hodowlanej. To rozcieńczenie doprowadza końcowe stężenie kontrolnego siRNA lub kaspazy siRNA do 10 nM.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 72 godziny.</li>
	<li>Zbierz komórki z jednej repliki, jak w kroku 1.10, i przetwórz je w celu walidacji lub potwierdzenia obniżenia ekspresji kaspazy 3, kaspazy 6 i kaspazy 7 odpowiednio za pomocą RT-qPCR lub western blotting, przy użyciu standardowych metod i protokołów8,11.</li>
	<li>Zakażone komórki w drugiej próbie należy zainfekować wirusem IAV zgodnie z opisem w krokach 1.4-1.9 (bez inhibitorów).</li>
	<li>Po 24 godzinach zbierz, przetwórz i przeanalizuj komórki za pomocą western blotting, a następnie zmierz i określ ilościowo odzysk białka, jak opisano w krokach 1.10-1.20.</li>
</ol>
3. Mutageneza ukierunkowana na lokalizację miejsca (miejsc) rozszczepienia kaspazy w polipeptydzie
<ol>
	<li>Sklonuj interesujące nas białko kodujące gen w plazmidzie ekspresji ssaków11 lub uzyskaj je z laboratorium badawczego lub źródła komercyjnego (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Preferowane jest, jeśli gen jest klonowany ze znacznikiem epitopu lub jako fuzja GFP, aby odróżnić polipeptyd wyrażany ektopowo od polipeptydu wyrażanego endogennie podczas western blotting.</li>
	<li>Korzystając z baz danych substratów kaspazy4 lub narzędzi do wyrównywania białek, zlokalizuj motywy rozszczepienia kaspazy konsensusu, XXXD i DXXD, na polipeptydzie. Prawie wszystkie motywy rozszczepienia kaspazy zawierają kwas asparaginowy w miejscu rozszczepienia (P1)3,4.</li>
	<li>Zmutuj przypuszczalny kwas asparaginowy P1 do kwasu glutaminowego lub aminokwasu niepolarnego (alanina, walina) poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, a następnie sekwencjonowanie DNA11 przy użyciu standardowych metod i protokołów.</li>
	<li>Dostarcz DNA typu dzikiego (WT) i zmutowanego plazmidu do komórek MDCK lub A549 przez odwrotną transfekcję11.
	<ol>
		<li>W tym celu rozcieńczyć 2 μg plazmidowego DNA lub zalecaną objętość odczynnika do transfekcji w 100 μl odpowiedniej pożywki (patrz krok 2.3 i tabela materiałów) w oddzielnych probówkach i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zmieszać 100 μl każdego roztworu plazmidowego DNA ze 100 μl roztworu odczynnika do transfekcji i inkubować przez 20-45 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć kompleks odczynnika do transfekcji DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W międzyczasie podzielić i dodać 3 x 105 komórek MDCK lub A549 do 800 μl kompletnej pożywki wzrostowej, wymieszać z 200 μl kompleksu odczynnika do transfekcji DNA i dodać zawiesinę o objętości 1 ml do dołka 12-dołkowej płytki hodowlanej.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2</li>.
	<li>Po 48 godzinach należy zainfekować komórki wirusem IAV zgodnie z opisem w krokach 1.4-1.9 (bez dodawania inhibitorów).</li>
	<li>Po 24 godzinach zbierz, przetworzyć i przeanalizować komórki za pomocą western blot (jeśli ma to zastosowanie, przy użyciu przeciwciała przeciwko znacznikowi epitopu lub GFP). Następnie zmierz i określ ilościowo odzysk białka zgodnie z opisem w krokach 1.10-1.20.</li>
</ol>

<ol><li>Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANoptosis+in+microbial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PANoptosis in microbial infection.</a> Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).</li>
<li>Zheng, M., Kanneganti, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+ZBP1-NLRP3+inflammasome+and+its+implications+in+pyroptosis%2C+apoptosis%2C+and+necroptosis+%28PANoptosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis).</a> Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).</li>
<li>Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+hijacking+of+host+caspases%3A+An+emerging+category+of+pathogen-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).</li>
<li>Julien, O., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+and+their+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspases and their substrates.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).</li>
<li>Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benefits+and+perils+of+necroptosis+in+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection.</a> Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).</li>
<li>Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+apoptosis+and+virus+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation.</a> Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).</li>
<li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+degradation+of+host+cortactin+that+promotes+influenza+A+virus+infection+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells.</a> Virology. 497, 146-156 (2016).</li>
<li>Galvin, H. D., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+host+caspase+and+viral+PA-X+antagonize+the+antiviral+host+factor%2C+histone+deacetylase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).</li>
<li>Husain, M., Harrod, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+caspase-3+cleaves+the+histone+deacetylase+6+in+infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells.</a> FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).</li>
<li>Husain, M., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+6+inhibits+influenza+A+virus+release+by+downregulating+the+trafficking+of+viral+components+to+the+plasma+membrane+via+its+substrate%2C+acetylated+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).</li>
<li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+cleavage+of+human+cortactin+during+influenza+A+virus+infection+occurs+in+its+actin-binding+domains+and+is+associated+with+released+virus+titres%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres.</a> Viruses. 12 (1), 87(2020).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+pathogenicity+is+determined+by+caspase+cleavage+motifs+located+in+the+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Genetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins.</a> Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+caspase+cleavage+motifs+of+NP+and+M2+proteins+attenuate+virulence+of+a+highly+pathogenic+avian+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus.</a> Virology. 394 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-dependent+N-terminal+cleavage+of+influenza+virus+nucleocapsid+protein+in+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).</li>
<li>Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+cleavage+of+murine+norovirus+NS1%2F2+potentiates+apoptosis+and+is+required+for+persistent+infection+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells.</a> PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940(2019).</li>
<li>Richard, A., Tulasne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleavage+of+viral+proteins%2C+another+way+for+viruses+to+make+the+best+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis.</a> Cell Death & Disease. 3 (3), 277(2012).</li>
<li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+propagation+in+embryonated+chicken+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52421(2015).</li>
<li>Lüthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+A+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: A searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleavage+sites+in+the+human+proteome%3A+CaspDB%2C+a+database+of+predicted+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates.</a> PLoS One. 9 (10), 110539(2014).</li>
<li>Igarashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CutDB%3A+A+proteolytic+event+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research.+35+%28Database+issue%29%22%5BJournal%5D)">CutDB: A proteolytic event database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).</li>
<li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DegraBase%3A+A+database+of+proteolysis+in+healthy+and+apoptotic+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).</li>
<li>Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+The+peptidase+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MEROPS: The peptidase database.</a> Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).</li>
<li>Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopFIND%2C+a+knowledgebase+linking+protein+termini+with+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function.</a> Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).</li>
<li>Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+TopFIND+3.0+with+TopFINDer+and+PathFINDer%3A+Database+and+analysis+tools+for+the+association+of+protein+termini+to+pre-+and+post-translational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events.</a> Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).</li>
</ol>

Autor nie ma do ujawnienia konfliktu interesów.

Ustalono, że wirusy dostosowują czynniki i szlaki gospodarza na swoją korzyść. Z kolei komórki gospodarza opierają się temu, stosując różne strategie. Jedną z tych strategii jest PANoptosis, którą komórki gospodarza wykorzystują jako strategię przeciwwirusową przeciwko infekcjom wirusowym. Jednak wirusy takie jak IAV rozwinęły własne strategie przeciwdziałania PANoptosis i wykorzystują je na swoją korzyść 1,3,6. Ta interakcja po...

Wirus grypy A (IAV) jest prototypowym członkiem rodziny Orthomyxoviridae i jest znany z wywoływania globalnych epidemii i nieprzewidywalnych pandemii. IAV powoduje chorobę układu oddechowego człowieka, grypę, powszechnie znaną jako "grypa". Grypa jest ostrą chorobą, która powoduje indukcję pro- i przeciwzapalnych wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza oraz śmierć komórek nabłonkowych w drogach oddechowych człowieka. Oba procesy są regulowane przez zjawisko zwane programowaną śmiercią komórki1. Sygnalizacja zaprogramowanej śmierci komórki jest indukowana, gdy tylko różne receptory rozpoznawania patogenów wyczują nadchodzące cząsteczki wirusa w komórkach gospodarza. Prowadzi to do zaprogramowania śmierci zainfekowanych komórek i sygnalizacji do sąsiednich zdrowych komórek za pomocą trzech połączonych ze sobą szlaków zwanych piroptozą, apoptozą i nekroptozą - ostatnio ukutych jako jeden proces, PANoptosis1.
PANoptosis obejmuje proteolityczne przetwarzanie wielu białek gospodarza i wirusa od indukcji do wykonania. Takie przetwarzanie białek jest przede wszystkim inicjowane przez rodzinę proteaz cysteinowych zwanych kaspazami1,2. Znanych jest do 18 kaspaz (od kaspazy 1 do kaspazy 18)3. Większość kaspaz jest wyrażana jako pro-kaspazy i aktywowana przez poddanie ich własnemu procesowi proteolitycznemu przez autokatalizę lub inne kaspazy4 w odpowiedzi na bodziec, taki jak infekcja wirusowa. Uważano, że PANoptoza komórek zakażonych IAV jest mechanizmem obronnym gospodarza, ale IAV wyewoluował sposoby unikania i wykorzystywania go, aby ułatwić jego replikację1,2,5,6. Jednym z nich jest antagonizacja czynników gospodarza poprzez rozszczepienie lub degradację za pośrednictwem kaspazy, które są albo z natury przeciwwirusowe, albo zakłócają jeden z etapów cyklu życiowego IAV. W tym celu odkryto, że czynniki gospodarza, kortaktyna, HDAC4 i HDAC6 ulegają rozszczepieniu lub degradacji za pośrednictwem kaspazy w komórkach nabłonka zakażonych IAV7,8,9. HDAC4 i HDAC6 są czynnikami anty-IAV8,10, a kortaktyna zakłóca replikację IAV na późniejszym etapie infekcji, potencjalnie podczas składania się wirusa i pączkowania11.
Ponadto, aktywowane są również różne kaspazy, które z kolei rozszczepiają wiele białek, aby aktywować reakcję zapalną gospodarza podczas infekcji IAV1,2. Ponadto nukleoproteina (NP), białko kanału jonowego M2 IAV12,13,14, oraz różne białka innych wirusów3,15,16 również ulegają rozszczepieniu za pośrednictwem kaspazy podczas infekcji, co wpływa na patogenezę wirusa. W związku z tym istnieje ciągła potrzeba badania rozszczepienia lub degradacji białek gospodarza i wirusa za pośrednictwem kaspazy podczas IAV i innych infekcji wirusowych, aby zrozumieć molekularne podstawy patogenezy wirusa. W niniejszym artykule przedstawiono metody mające na celu (1) ocenę rozszczepienia lub degradacji takich białek przez kaspazy, (2) identyfikację tych kaspaz oraz (3) zlokalizowanie miejsc rozszczepienia.

<table><tbody><tr><td>Komórki A549</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td>Ludzki, nabłonkowy, płucny</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor kaspazy 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>264156-M</td><td>Znany również jako "InSolution Kaspaza-3 Inhibitor II - Calbiochem'cOmplete</td></tr><tr><td>, Mini Inhibitor Proteazy Koktajl</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-NP przeciwciało</td><td></td><td></td><td>Prezent od Richarda Webby'ego (St Jude Children' s Szpital Badawczy, Memphis, USA) do MH</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine RNAiMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Komórki MDCK</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>Pies, nabłonek, nerka</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7449</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Niezbędne Medium (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11095080</td><td>Dodaj L-glutaminę, antybiotyki lub inne suplementy w razie potrzeby</td></tr><tr><td>MISJA siRNA Uniwersalna kontrola negatywna #1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIC001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc imager z oprogramowaniem Image Studio Lite 5.2&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Odyssey Fc został zastąpiony przez Odyssey XF, a oprogramowanie Image Studio Lite zostało zastąpione oprogramowaniem Empiria Studio.</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid eksprymujący ludzką fuzję kortaktyny i GFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>50728</td><td>Prezent od Kennetha Yamady dla Addgene</td></tr><tr><td>Wstępnie zaprojektowany mały interferujący RNA (siRNA) do kaspazy 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NM_004346</td><td>siRNA ID: SASI_Hs01_00139105</td></tr><tr><td>Wstępnie zaprojektowany mały interferujący RNA do kaspazy 6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>NM_001226 siRNA ID: SASI_Hs01_00019062</td></tr><tr><td>Wstępnie zaprojektowany mały interferujący RNA do kaspazy 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NM_001227</td><td>identyfikator siRNA: SASI_Hs01_00128361</td></tr><tr><td>Wstępnie zaprojektowane pary starterów SYBR Green RT-qPCR</td> Identyfikatory par starterów <td>Sigma-Aldrich</td><td>KSPQ12012</td><td>: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa Protran Premium</td><td>Cytiva (Fomerly GE Healthcare)</td><td>10600003</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-aktynowe</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało antykortaktynowe</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3502</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-GFP</td><td>Takara</td><td>632592</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Wstępnie barwione białko Standard</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC5625</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże transfekcyjne, Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, NaCl, SDS, Deoksycholan Sodu,</td> trypsyna <td>Merck</td><td></td><td></td>Triton X-100</tr><tr>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>4370285</td><td></td> <td>z powłoką TPCK</td></tr></tbody></table>

identyfikacja kaspaz i ich motywów, które rozszczepiają białka podczas infekcji wirusem grypy a

Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection

Kaspazy, rodzina proteaz cysteinowych, zarządzają zaprogramowaną śmiercią komórki w odpowiedzi na różne bodźce, w tym infekcje mikrobiologiczne. Początkowo opisana jako zachodząca w wyniku apoptozy, obecnie wiadomo, że programowana śmierć komórki obejmuje trzy połączone ze sobą szlaki: piroptozę, apoptozę i nekroptozę, razem ukute jako jeden proces, PANoptosis. Zakażenie wirusem Influence A (IAV) indukuje PANoptosis w komórkach ssaków poprzez indukowanie aktywacji różnych kaspaz, które z kolei rozszczepiają różne białka gospodarza i wirusa, prowadząc do procesów takich jak aktywacja wrodzonej odpowiedzi przeciwwirusowej gospodarza lub degradacja antagonistycznych białek gospodarza. W związku z tym w komórkach nabłonka zarówno zwierzęcego, jak i ludzkiego w odpowiedzi na zakażenie IAV odkryto rozszczepienie kortaktyny gospodarza za pośrednictwem kaspazy 3, deacetylazy histonowej 4 (HDAC4) i deacetylazy histonowej 6 (HDAC6). Aby to wykazać, zastosowano inhibitory, interferencję RNA i mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, a następnie zmierzono rozszczepienie lub odporność na rozszczepienie i odzyskiwanie kortaktyny, polipeptydów HDAC4 i HDAC6 za pomocą western blot. Metody te, w połączeniu z RT-qPCR, tworzą prostą, ale skuteczną strategię identyfikacji białka gospodarza oraz białek wirusowych ulegających rozszczepieniu za pośrednictwem kaspazy podczas infekcji IAV lub innymi wirusami ludzkimi i zwierzęcymi. W niniejszym protokole omówiono reprezentatywne wyniki tej strategii, a także sposoby jej zwiększenia skuteczności.

Obróbka z zastosowaniem inhibitora kaspazy 3 
Odkryto, że polipeptydy kortaktyny gospodarza, HDAC4 oraz HDAC6 ulegają degradacji w odpowiedzi na infekcję IAV w komórkach psich (MDCK) oraz ludzkich (A549, NHBE)7,8,9. Wykorzystując powyższe podejścia, ustalono, że indukowane przez IAV kaspazy gospodarza, w szczególności kaspaza 3, powodują ich degradację7,8</...

Zakażenie wirusem grypy A (IAV) aktywuje kaspazy, które rozszczepiają białka gospodarza i wirusa, które z kolei pełnią funkcje pro- i przeciwwirusowe. Stosując inhibitory, interferencję RNA, mutagenezę ukierunkowaną na miejsce oraz techniki western blotting i RT-qPCR, zidentyfikowano kaspazy w zakażonych komórkach ssaków, które rozszczepiają kortaktynę gospodarza i deacetylazy histonowe.

Identyfikacja kaspaz i ich motywów, które rozszczepiają białka podczas infekcji wirusem grypy A

Caspases, a family of cysteine proteases, orchestrate programmed cell death in response to various stimuli, including microbial infections. Initially ...

Metoda ta pomoże określić i potwierdzić, czy białko w komórkach zakażonych wirusem grypy ulega degradacji lub rozszczepieniu przez kaspazy oraz zidentyfikować miejsca rozszczepienia kaspazy. Metoda ta wymaga jedynie podstawowych warunków laboratoryjnych biologii molekularnej i komórkowej oraz umiejętności badawczych i nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu ani szkolenia w zakresie oprogramowania. Metoda ta może być dostosowana do osiągnięcia podobnych celów związanych z zakażeniem innymi wirusami lub drobnoustrojami zwierzęcymi oraz ekspozycją na bodźce zewnętrzne, takie jak toksyny i chemikalia.Na początek wysiewaj komórki MDCK lub A549 na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia usuń starą pożywkę hodowlaną z komórek i umyj komórki w każdej studzience dwukrotnie jednym mililitrem MEM bez surowicy.Następnie zainfekuj komórki, dodając 400 mikrolitrów inokulum wirusa grypy A i umieść płytkę do inkubacji na jedną godzinę. Po inkubacji usunąć inokulum wirusa i umyć komórki MEM. Dodaj jeden mililitr MEM bez surowicy do każdej studzienki i inkubuj komórki, jak pokazano w poprzednim kroku.Po 24 godzinach zbierz komórki, zeskrobując je jednomililitrowym tłokiem strzykawki i przenieś do 1,5 mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o sile 12 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i zebrać supernatant. Przemyć osad komórkowy 250 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i odwirować.Usunąć supernatant i dodać 100 mikrolitrów buforu do lizy komórek. Wymieszaj wirem. Podgrzej probówkę w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby całkowicie zlizować komórki.Następnie rozpuść równe ilości białka z niezakażonych i zakażonych próbek za pomocą standardowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS. Po elektroforezie przenieś żel białkowy na membranę nitrocelulozową lub PVDF i wykonaj Western blot. Porównaj poziomy białka w pasach próbek zakażonych pozorowanych i traktowanych inhibitorem.W 100 mikrolitrach odpowiedniej pożywki, takiej jak Opti-MEM, rozcieńczyć 100 nanomolowców siRNA kontrolnego lub kaspazy lub odpowiednią objętość odczynnika do transfekcji. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Wymieszać 100 mikrolitrów każdego roztworu siRNA ze 100 mikrolitrami roztworu odczynnika do transfekcji i inkubować przez 20 do 45 minut w temperaturze pokojowej.Podziel i dodaj 100 000 komórek MDCK lub A549 w 800 mikrolitrach kompletnej pożywki wzrostowej. Dodać 200 mikrolitrów kompleksu odczynników do transfekcji siRNA i dodać tę zawiesinę do 12-dołkowej płytki hodowlanej. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny.Zakażenie komórek wirusem grypy A, ale bez inhibitorów. Wykonaj Western blot i porównaj poziomy białka, jak pokazano wcześniej. Zlokalizuj motywy rozszczepienia kaspazy XXXD i DXXD na polipeptydzie.Zmutuj kwas asparaginowy P1, kwas glutaminowy lub alaninę przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce i potwierdź przez sekwencjonowanie DNA. W 100 mikrolitrach odpowiedniej pożywki rozcieńczyć dwa mikrogramy DNA osocza typu dzikiego lub zmutowanego lub zalecaną objętość odczynnika do transfekcji i inkubować probówki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zmieszać 100 mikrolitrów roztworu DNA osocza ze 100 mikrolitrami roztworu odczynnika do transfekcji i inkubować przez 20 do 45 minut w temperaturze pokojowej.W międzyczasie podziel i dodaj 300 000 komórek MDCK lub A549 do 800 mikrolitrów kompletnej pożywki wzrostowej. Dodaj 200 mikrolitrów kompleksu odczynników do transfekcji DNA i dodaj tę zawiesinę do 12-dołkowej płytki hodowlanej. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla.Po 48 godzinach należy zainfekować komórki wirusem grypy A bez inhibitorów. Wykonaj Western blot i porównaj poziomy białka, jak pokazano wcześniej. Za pomocą Western blot oceniano degradację kortaktyny gospodarza przez kaspazy gospodarza wywołane grypą.Leczenie komórek zakażonych wirusem grypy inhibitorem kaspazy-3 spowodowało uratowanie kortaktyny i degradację NP wirusa. Kwantyfikacja intensywności prążków kortaktyny i jej normalizacja z odpowiadającym im pasmem aktyny wykazała, że poziom kortaktyny w zakażonych komórkach leczonych inhibitorem kaspazy-3 był wyższy w porównaniu z nieleczonymi zakażonymi komórkami. W komórkach zubożonych w kaspazę-6 lub kaspazę-7.Nie zaobserwowano znaczącej poprawy poziomu polipeptydu kortaktyny, podczas gdy w komórkach zubożonych w kaspazę-3 kortaktyna odzyskana z wirusa grypy indukowała degradację. Kwantyfikacja i porównanie poziomów polipeptydów wykazało, że poziom polipeptydu kortaktyny w zakażonych komórkach ze zubożoną ekspresją kaspazy-3 był wyższy niż w komórkach z normalną ekspresją kaspazy-3. Mutacja kwasu asparaginowego w pozycji 116 do kwasu glutaminowego sprawiła, że polipeptyd kortaktyny stał się odporny na degradację wywołaną wirusem grypy.Kwantyfikacja i porównanie poziomów polipeptydów wykazało, że poziom zmutowanego polipeptydu kortaktyny w zakażonych komórkach był wyższy niż w przypadku polipeptydu kortaktyny typu dzikiego. Wymagane jest wygenerowanie dziesiątek mutantów i wykonanie powtarzającego się Western blot w celu zidentyfikowania miejsca rozszczepienia kaspazy w polipeptydzie. Można by opracować test biochemiczny in vitro zawierający oczyszczoną kaspazę i docelowy polipeptyd w celu potwierdzenia, że białko będące przedmiotem zainteresowania jest bezpośrednim substratem na bazie gazu.Protokół ten pomoże zrozumieć znaczenie, degradację lub rozszczepienie białka docelowego w badanym systemie, takim jak infekcja wirusowa lub choroba.

identifying-caspases-their-motifs-that-cleave-proteins-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wirusy grypy replikują swój genom RNA w powiązaniu z chromatyną komórki gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę oczyszczania nienaruszonych kompleksów wirusowych rybonukleoprotein z chromatyny zainfekowanych komórek. Oczyszczone kompleksy wirusowe można analizować zarówno za pomocą techniki Western blot, jak i metody przedłużania starterów w celu oceny zawartości białek i RNA.

Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Ten film pokazuje ocenę wielokrotnych aktywacji kaspazy w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego poprzez stymulację wirusem grypy. Po lizie makrofagów, inaktywacji termicznej lizatu i odwirowaniu pobiera się kaspazy wewnątrzkomórkowe do późniejszej analizy immunologicznej.

Ocena aktywacji wielu kaspaz w makrofagach

Film demonstruje metodę oceny rozszczepienia białek za pośrednictwem kaspazy w komórkach zainfekowanych wirusem. Po zakażeniu wirusowym kaspazy ulegają aktywacji i degradacji różnych białek komórkowych gospodarza i nukleoprotein wirusowych, podczas gdy specyficzne inhibitory kaspazy zapobiegają tej degradacji, co potwierdza western blotting.

Ocena rozszczepienia białek wirusa i gospodarza za pośrednictwem kaspazy w komórkach zakażonych wirusem

Demontaż rdzeni wirusa grypy A podczas wnikania wirusa do komórek gospodarza jest procesem wieloetapowym. Opisujemy metodę in vitro do analizy wczesnych etapów odsłaniania się wirusa. W tym podejściu wirowanie w gradionym tempie służy do biochemicznej analizy etapów, które inicjują odwarstwianie w określonych warunkach.

In vitro Demontaż kapsydów wirusa grypy A przez wirowanie gradientowe

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Prezentujemy test rozszczepienia peptydów fluorogennych, który pozwala na szybkie badanie przesiewowe aktywności proteolitycznej proteaz na peptydach reprezentujących miejsce cięcia peptydów fuzji wirusów. Metoda ta może być również stosowana na dowolnym innym motywie aminokwasowym w sekwencji białka w celu zbadania aktywności proteazy.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa

Przedstawiamy ogólny protokół identyfikacji krótkich odcinków homologicznych sekwencji białka gospodarz-patogen (SSHHPS) osadzonych w poliproteinie wirusa. SSHHP są rozpoznawane przez proteazy wirusowe i kierują ukierunkowanym niszczeniem określonych białek gospodarza przez kilka wirusów grupy IV.

Analiza wirusowych SSHHPS grupy IV przy użyciu metod in vitro i in silico

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania i oczyszczania rekombinowanych kaspaz Drosophila Dronc i Drice oraz ich zastosowanie w testach rozszczepienia in vitro.

In vitro Testy rozszczepienia przy użyciu oczyszczonych rekombinowanych kaspaz Drosophila do badań przesiewowych substratów

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Poznaj metodę identyfikacji kaspaz i ich motywów rozszczepiających białka w komórkach ssaków zakażonych wirusem grypy A. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów wirulencji i potencjalnych celów terapeutycznych.

Identyfikacja kaspaz i ich motywów, które rozszczepiają białka podczas infekcji wirusem grypy A

Przeglądaj więcej filmów