Name: Protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 muszki owocowej Bactrocera dorsalis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj protokół mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszki owocowej Bactrocera dorsalis. Ta metoda umożliwia generowanie mutantów z 80% skutecznością, wspierając badania genów i ekologiczną ochronę roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) oraz specjalne fundusze na naukę, technologię, innowacje i rozwój przemysłowy nowego dystryktu Shenzhen Dapeng (grant nr. PT202101-02).

1. Projekt docelowy i synteza in vitro sgRNA
<ol>
	<li>Przewiduj strukturę docelowych genów będących przedmiotem zainteresowania i określ granice między eksonami i intronami za pomocą bioinformatycznej analizy genomu B. dorsalis (używane tutaj aplikacje są wymienione w Tabeli materiałów). 
	UWAGA: BLAT20 został użyty do wyszukiwania potencjalnych loci genów w genomie. Wysokiej jakości odczyty sekwencyjne RNA (transkryptom) zostały dostosowane do nabytych loci genów za pomocą Hisat221. Samtools22 został użyty do wygenerowania posortowanych plików bam. Posortowane pliki bam zostały wprowadzone do klasy Stringtie2<sup="xref">23 w celu dostarczenia transkrypcji zestawu. Zebrane transkrypty i informacje o loci genów zostały połączone za pomocą Transdecoder24. Wyniki uzyskane z Transdekodera zostały zobrazowane w narzędziach IGV tools25 i można było określić granice między eksonami i intronami.</li>
	<li>Zidentyfikuj odpowiednie regiony docelowe w obrębie kandydującego docelowego miejsca genu. Całkowita długość musi być mniejsza niż 750 pz dla wygodniejszego sekwencjonowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Zaprojektuj specyficzne startery do amplifikacji obszaru docelowego z genomowego DNA typu dzikiego metodą PCR (<silna klasa = "xfig" >Figura 1B) (Startery: F-starter: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-starter: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Sklonuj produkty PCR do wektora końcowego26 i wybierz 20 indywidualnych kolonii bakteryjnych do sekwencjonowania, aby określić, jak konserwatywny jest region docelowy w laboratoryjnych populacjach owadów.</li>
	<li>Typowe miejsce docelowe zawiera motyw sekwencji trzech nukleotydów (NGG lub CCN) i sekwencję 20 pz sąsiadującą z motywami NGG lub CCN (20 pz-NGG lub CCN-20 pz). Przesadzić potencjalne miejsca docelowe z genomem B. dorsalis i upewnić się, że przewidywana skuteczność jest wystarczająco wysoka, a wskaźnik niecelowania jest niski; Kilka programów typu open source może to automatycznie przewidzieć. W tym protokole sgRNAcas9 -AI27 służy do wyboru i oceny optymalnych celów. Szczegółowe informacje na temat użytkowania można znaleźć w instrukcji obsługi tego oprogramowania. 
	UWAGA: Preferowane są możliwe miejsca docelowe zamknięte na 5' UTR genu docelowego i 1-2 Gs na początku sekwencji 20 pz. W celu uzyskania dużej delecji, która zostanie zidentyfikowana za pomocą PCR, a następnie elektroforezy w żelu agarozowym, zaleca się zaprojektowanie dwóch celów28 oddalonych od siebie o ponad 100 pz (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Użyj dostępnego na rynku zestawu do syntezy gRNA, aby wygenerować zaprojektowane sgRNA. Wykonaj każdy krok zgodnie z instrukcją obsługi. Ponownie zawiesić produkt gRNA w wodzie wolnej od nukleaz, określić ilościowo stężenie za pomocą spektrofotometru UV-Vis i przechowywać w temperaturze -80 °C przed użyciem (stężenie pomyślnie zsyntetyzowanego pojedynczego gRNA [10 μL] za pomocą użytego tutaj zestawu wynosi około 4000-6000 ng/μL, a nawet więcej). 
	UWAGA: Chociaż generowanie zmutowanych much jest pierwszym krokiem dla każdego badacza, odpowiednia kontrola negatywna dla dalszego eksperymentu/analizy ma kluczowe znaczenie. Generowanie tych kontroli wraz z mutantami oszczędza naukowcom czas i wysiłek. Na przykład ustaw zaszyfrowane sgRNA jako kontrolę negatywną.</li>
</ol>
2. Pobieranie i przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Poczwarki B. dorsalis należy umieścić w plastikowych klatkach. Zapewnij mieszaninę cukru i drożdży (1:1) jako pokarm wraz ze źródłem wody po zamknięciu dorosłych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, B). Warunki chowu to 55% wilgotności względnej (RH), 26,5 °C i cykl L/D 14:10 (światło włącza się o szóstej rano, wyłącza się o ósmej wieczorem).</li>
	<li>Większość dorosłych osiąga dojrzałość płciową 10 dni po wzejściu. Zapewnij odpowiednie środowisko, aby pomóc dorosłym muchom w kojarzeniu się w jak największym stopniu. Najlepiej użyć statywu oświetleniowego o natężeniu 30-50 luksów. Może to poprawić płodność samic, poprawiając w ten sposób efektywność pobierania zarodków. 
	UWAGA: Umieszczenie dorosłych osobników (w wieku 5-6 dni po wzejściu) w słabo oświetlonym (<100 luksów) środowisku może sprzyjać kryciu. Ogólnie rzecz biorąc, szczyt składania jaj przypada na godzinę 15:00 (14:10/L:D, światła włączone o 06:00, światła wyłączone o 20:00); W celu uzyskania wystarczającej liczby zarodków zaleca się umieszczenie komór do składania jaj w klatkach na 30 minut przed godziną 15:00</li>.
	<li>Umieść gazę o oczkach 200 w komorze do składania jaj, w odległości 1-2 mm od pokrywy komory. Pomoże to w uzyskaniu jak największej liczby zarodków. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby zarodki zostały namoczone w soku pomarańczowym lub pocierane gazą, ponieważ może to znacznie zmniejszyć przeżywalność zarodków.</li>
	<li>Umieścić nową komorę do składania jaj w klatce, gdy zestaw do mikroiniekcji jest gotowy. Zbieraj zarodki co 10 minut za pomocą cienkiej mokrej szczoteczki, a następnie ułóż je na samodzielnie wykonanej płytce iniekcyjnej (pleksi o długości 55 mm, szerokości 13,75 mm i wysokości 5 mm, w środku otwiera się płytki rowek o wymiarach 45 mm x 5 mm x 0,3 mm, aby ułatwić umieszczenie jaja). Jeśli zarodki mają wysokie ciśnienie wewnętrzne, lekkie wysuszenie przy wilgotności względnej <10% przez 10 minut jest opcjonalne. Zanurz zarodki w oleju halowęglowym podczas wstrzykiwania, aby uniknąć dalszego wysuszenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
</ol>
3. Mikroiniekcja zarodka
<ol>
	<li>Przygotować szklaną igłę do wstrzykiwań za pomocą ściągacza do mikropipet. 
	UWAGA: Ważne jest ustawienie parametrów zgodnie z instrukcją obsługi. W tych protokołach można wykonać różne kształty igieł przy użyciu parametrów sugerowanych w instrukcji ściągacza do mikropipet. Szklana kapilara musi być tak czysta, jak to możliwe, aby zapobiec zatykaniu igły przez kurz.</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy. Wymieszać białko Cas9 i odpowiadające mu sgRNA do następujących stężeń roboczych: sgRNA, 300 ng/μL; Białko Cas9, 150 ng/μL. Dodać 1 μl czerwieni fenolowej do mieszanki, aby służyło jako wygodny sposób oznaczania wstrzykniętych zarodków. Umieść przygotowaną mieszaninę na lodzie, aby uniknąć degradacji sgRNA. 
	UWAGA: Używaj końcówek do pipet i probówek do PCR bez nukleaz. Stężenie białka Cas9 musi być mniejsze lub równe 150 ng/μl; Wyższe stężenia są toksyczne i znacznie obniżają przeżywalność zarodków. Cas9 może być również dostarczany w formacie DNA lub mRNA, aby osiągnąć pomyślną edycję genów17,19. W tym protokole zalecane jest białko Cas9, ponieważ mRNA są podatne na degradację, a ekspresja białka Cas9 z plazmidowego DNA wymaga czasu na transkrypcję i translację.</li>
	<li>Ustaw parametry wtryskiwacza. Początkowy program to Pi-500 hPa, Ti-0,5 s i PC-200 hPa. Dostosuj te parametry dalej w razie potrzeby podczas mikroiniekcji.</li>
	<li>Dodać 3 μl mieszaniny do igły iniekcyjnej. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, które mogą zatkać igłę. Otwórz igłę za pomocą mikromłynka.</li>
	<li>Podłącz igłę do mikromanipulatora zgodnie z instrukcją obsługi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Połóż płytkę z ułożonymi w linii zarodkami na stole z obiektywami. Wyreguluj położenie mikropipety pod precyzyjnym mikroskopem optycznym, ustawiając mikropipetę i zarodek w tej samej płaszczyźnie. Dostosuj głośność kropli, naciskając pedał; Zalecana jest 1/10 objętości zarodków.</li>
	<li>Wprowadzić końcówkę igły do tylnej części (bieguna roślinnego) zarodka. Dostarczyć mieszaniny do zarodka, naciskając pedał na wstrzykiwaczu. Po dodaniu czerwieni fenolowej natychmiast obserwuje się lekko czerwonawy kolor. 
	UWAGA: Niewielka objętość cytoplazmatycznego przepływu wstecznego z otworu nie zmniejszy przeżywalności zarodka. Wstrzyknięcie 200 zarodków wystarcza do pomyślnej mutagenezy jednego genu. Dodanie większej ilości oleju halowęglowego w celu zanurzenia zarodków może zapobiec dalszemu wysuszeniu. Wstrzyknięcie należy wykonać przed utworzeniem komórek biegunowych, co zapewnia, że każda mutacja może być skutecznie dziedziczona.</li>
</ol>
4. Hodowla owadów po iniekcji
<ol>
	<li>Umieść płytkę iniekcyjną z wstrzykniętymi zarodkami w komorze klimatycznej utrzymywanej w temperaturze 55% wilgotności względnej, 26,5 °C i cyklu 14:10 L/D (światło włącza się o szóstej rano, wyłącza się o ósmej wieczorem).</li>
	<li>Po wstrzyknięciu tworzenie zarodka trwa zwykle 24 godziny i 36 godzin do wyklucia. Użyj pędzla z cienką końcówką, aby przenieść larwy na przygotowaną dietę larwalną. Zbieraj larwy trzy lub cztery razy dziennie, aż przestaną się wykluwać larwy. Ogólnie rzecz biorąc, larwy potrzebują 2-3 dni, aby zakończyć wylęg i przepoczwarzać się w ciągu 7 dni. 
	UWAGA: Do karmienia larw stosowano dietę opartą na kukurydzy. Przepis zawiera 150 g mąki kukurydzianej, 150 g banana, 0,6 g benzoesanu sodu, 30 g drożdży, 30 g sacharozy, 30 g ręcznika papierowego, 1,2 ml kwasu solnego i 300 ml wody29. Zminimalizuj czas pozostawiania larw w oleju (<2 h). Przenieść larwy na dietę natychmiast po wykluciu tak daleko, jak to możliwe. Może to znacznie zwiększyć przeżywalność i wskaźniki przepoczwarzeń. Nie należy stosować zbyt dużej ilości diety (dieta składająca się z 2/3 szalki Petriego o średnicy 90 mm wystarcza na 30 larw); W przeciwnym razie stanie się spleśniały i zmniejszy przeżywalność larw.</li>
	<li>Umieść dojrzałe larwy w mokrym piasku, aby się przepoczwarzyły. Faza przepoczwarzenia trwa około 10 dni. Przenieś poczwarki do plastikowych klatek, zanim rozpocznie się eklozja.</li>
</ol>
5. Badania przesiewowe mutantów
<ol>
	<li>Schemat blokowy badania przesiewowego mutantów jest zilustrowany na Rysunek 3A. Krzyżuj dorosłe osobniki G0 uzyskane przez mikroiniekcję z dorosłymi osobnikami typu dzikiego w celu uzyskania linii heterozygotycznych. Sprawdź rodzaj mutacji, które jest nosicielem potomstwa (G1) za pomocą genotypowania.</li>
	<li>Samokrzyżuj G1 z tym samym zmutowanym genotypem w celu uzyskania linii homozygotycznych w G2. Jeśli genotypy mutantów w G1 są całkowicie różne, skrzyżuj heterozygoty z muchami typu dzikiego. Linie homozygotyczne uzyskuje się zwykle w G3. Utrzymuj dwie lub trzy homozygotyczne linie do kolejnych eksperymentów fenotypowania.</li>
	<li>Do przeprowadzenia genotypowania należy użyć genomowego DNA ze świeżego poczwarki lub pojedynczej środkowej nogi poszczególnych dorosłych osobników. Zaprojektuj specjalne podkłady, aby wzmocnić obszar docelowy; Startery muszą mieć co najmniej 50 punktów bazowych przed i za miejscem docelowym. Zapoznaj się z krokiem 1.2, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat podkładu. 
	UWAGA: Ponieważ ilość DNA w poczwarce jest niezwykle niska, zalecane są dostępne na rynku zestawy do ekstrakcji DNA.</li>
	<li>Przeprowadzić PCR w następujących warunkach cyklicznych: 98 °C przez 3 min, następnie 35 cykli po 98 °C przez 10 s, 15 s w temperaturze wyżarzania odpowiedniej dla zaprojektowanych starterów, 72 °C przez 35 s, a następnie końcowe przedłużenie o 72 °C przez 10 min.</li>
	<li>Sekwencjonuj oczyszczone produkty PCR. Po wykryciu wielu nakładających się pików sąsiadujących z miejscem docelowym (Rysunek 3B), nastąpiła udana mutageneza. Podklonować oczyszczone produkty PCR do wektora o końcu i wybrać 10 pojedynczych kolonii bakteryjnych do sekwencjonowania w celu weryfikacji genotypu mutantów. Utrzymuj linie z mutacjami przesunięcia ramki i przedwczesnymi zakończeniami translacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). 
	UWAGA: Nie ma potrzeby wykonywania sekwencjonowania pojedynczego klonu w celu weryfikacji genotypu osobników G0. Wystarczy zsekwencjonować produkty PCR i utrzymać osobniki z oczywistymi wielokrotnymi nakładającymi się pikami przylegającymi do miejsca docelowego. Po wstępnym wstrzyknięciu zaleca się wybranie 10 zarodków do ekstrakcji genomowego DNA i sekwencjonowanie produktów PCR w oparciu o standardy określone w kroku 5.3. Może to pomóc w przewidywaniu tempa mutacji z wyprzedzeniem. W tym badaniu sekwencjonowanie Sangera w celu określenia genotypu zostało wykonane przez firmę zajmującą się sekwencjonowaniem.</li>
</ol>

<ol><li>Christenson, L. D., Foote, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Biology of fruit flies.</a> Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assessment+of+the+economic+losses+caused+by+Bactrocera+dorsalis%2C+B.+cucurbitae+and+B.+tau+to+Guangdong+province%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Quarantine%22%5BJournal%5D)">The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province.</a> Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).</li>
<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+measures+and+drug+resistance+management+of+Bactrocera+dorsalis%5BTitle%5D)+AND+%22Agrochemicals%22%5BJournal%5D)">Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis.</a> Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).</li>
<li>Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction-based+behaviorally+manipulated+technology+of+pest+insects%3A+research+progress%2C+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+National+Natural+Science+Foundation+of+China%22%5BJournal%5D)">Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges.</a> Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li>
<li>Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPyzocha%2C+NK+%22Gene+Correction%22">Gene Correction</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).</li>
<li>Weiss, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems%3A+new+players+in+gene+regulation+and+bacterial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37(2014).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+the+mouse+and+rat+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system.</a> Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mutant+Aedes+aegypti+mosquitoes+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protocols%22%5BJournal%5D)">Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system.</a> STAR protocols. 2 (2), 100432(2021).</li>
<li>Zhu, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+toolkit+for+genome+editing+in+a+disease+vector%2C+Aedes+aegypti%3A+transgenic+lines+expressing+Cas9+and+single+guide+RNA+induce+efficient+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis.</a> The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+locusts%3A+Successful+establishment+of+an+olfactory+deficiency+line+by+targeting+the+mutagenesis+of+an+odorant+receptor+co-receptor+%28Orco%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+Bombyx+mori+odorant+receptor+co-receptor+%28BmOrco%29+impairs+olfactory+sensitivity+in+silkworms%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms.</a> Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+somatic+and+germline+genome+engineering+of+Bactrocera+dorsalis+by+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system.</a> Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+knockout+of+the+eye+pigmentation+gene+white+leads+to+alterations+in+colour+of+head+spots+in+the+oriental+fruit+fly%2C+Bactrocera+dorsalis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis.</a> Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).</li>
<li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+%28CRISPR%29%2FCRISPR-associated+9-mediated+mutagenesis+of+the+multiple+edematous+wings+gene+induces+muscle+weakness+and+flightlessness+in+Bactrocera+dorsalis+%28Diptera%3A+Tephritidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae).</a> Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).</li>
<li>Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAT-the+BLAST-like+alignment+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">BLAT-the BLAST-like alignment tool.</a> Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).</li>
<li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISAT%3A+A+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li>
<li>Danecek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twelve+years+of+SAMtools+and+BCFtools%5BTitle%5D)+AND+%22Gigascience%22%5BJournal%5D)">Twelve years of SAMtools and BCFtools.</a> Gigascience. 10 (2), (2021).</li>
<li>Kovaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+assembly+from+long-read+RNA-seq+alignments+with+StringTie2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2.</a> Genome Biology. 20 (1), 278(2019).</li>
<li>TransDecoder. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0">https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0</a> (2018).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li>
<li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sgRNAcas9%3A+a+software+package+for+designing+CRISPR+sgRNA+and+evaluating+potential+off-target+cleavage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites.</a> PloS One. 9 (6), 100448(2014).</li>
<li>Zheng, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+gene+deletion+and+replacement+using+the+CRISPR%2FCas9+system+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells.</a> Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).</li>
<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rectal+bacteria+produce+sex+pheromones+in+the+male+oriental+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly.</a> Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).</li>
<li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR%2FCas9-based+gene+editing+in+HIV-1%2FAIDS+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69(2019).</li>
<li>El-Mounadi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles%2C+applications%2C+and+biosafety+of+plant+genome+editing+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 56(2020).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+microinjection+and+knockout+mutant+identification+of+CRISPR%2FCas9+genome-edited+Helicoverpa+armigera+%28H%C3%BCbner%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner).</a> Journal of Visualized Experiments. (173), e62068(2021).</li>
<li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sgRNAcas9%3A+a+software+package+for+designing+CRISPR+sgRNA+and+evaluating+potential+off-target+cleavage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites.</a> PloS One. 9 (6), 100448(2014).</li>
<li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+of+Drosophila+with+the+CRISPR+RNA-guided+Cas9+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease.</a> Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).</li>
<li>Zhu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+juvenile+hormone+receptor%2C+Methoprene-tolerant%2C+induces+black+larval+phenotype+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).</li>
<li>Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transformer-2+and+fruitless+characterisation+with+developmental+expression+profiles+of+sex-determining+genes+in+Bactrocera+dorsalis+and+B.+correcta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Gabrieli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-less+males+modulate+female+behaviour+in+Ceratitis+capitata+%28Diptera%3A+Tephritidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

System CRISPR/Cas9 jest najczęściej używanym narzędziem do edycji genów i ma różne zastosowania, takie jak threpygenów 30, hodowla roślin31 i podstawowe badania funkcji genów32. System ten został już zastosowany do edycji genów u różnych gatunków owadów i posłużył jako skuteczne narzędzie do funkcjonalnych badań genów u szkodników. Przedstawione przez nas protokoły standaryzują procedurę projektowania i syntezy przewodnikowych RNA, pobierania zarodkó...

Orientalna muszka owocowa, Bactrocera dorsalis, to kosmopolityczny gatunek szkodnika, który powoduje szkody w ponad 150 gatunkach upraw owocowych, w tym guawie, mango, Eugenia spp., wiśni surinamskiej, cytrusach, loquat i papai1. Szkody wyrządzone w samej prowincji Guangdong (Chiny) szacuje się na ponad 200 milionów juanów. Dorosłe samice wkładają swoje jaja pod skórkę dojrzewających lub dojrzałych owoców, powodując gnicie i odcięcie owocu, co obniża jakość owoców i ogólny plon plonu2. Ponieważ dorosłe muszki owocowe mają dużą zdolność lotu, a ich larwy wwiercają się w skórkę owocu, insektycydy wymagające bezpośredniego kontaktu ze szkodnikiem słabo sprawdzają się na polu. Dodatkowo, szerokie stosowanie insektycydów zwiększyło odporność B. dorsalis na różne chemikalia rolnicze, co jeszcze bardziej utrudnia zwalczanie tych szkodliwych szkodników3. Dlatego pilnie potrzebne jest opracowanie skutecznych i przyjaznych dla środowiska strategii ochrony przed szkodnikami.
Ostatnio, wraz z rozwojem narzędzi biologii molekularnej i technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, naukowcy próbują opracować przyjazne dla środowiska strategie zwalczania szkodników, takie jak RNAi, które koncentrują się na funkcjonalności ważnych genów (celów molekularnych) różnych szkodników owadzich. Geny, które mają kluczowe znaczenie dla przetrwania i reprodukcji szkodnika, mogą być identyfikowane za pomocą funkcjonalnych badań genów i dalej służyć jako potencjalne cele molekularne do ulepszania specjalnie ukierunkowanych i przyjaznych dla środowiska narzędzi do zwalczania szkodników4. Aby dostosować takie strategie do zwalczania muszek owocowych na Wschodzie, potrzebne są skuteczne metody badań genów funkcjonalnych.
System endonukleazy CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) został początkowo odkryty u bakterii i archeonów i okazało się, że jest to mechanizm adaptacyjny związany z rozpoznawaniem i degradacją obcego wewnątrzkomórkowego DNA, takiego jak ten wprowadzony przez infekowanie bakteriofagów5. W systemie CRISPR typu II endonukleaza Cas9 jest kierowana przez małe powiązane RNA (crRNA i tracrRNA) w celu rozszczepienia wtargnięcia DNA6,7,8 i stała się jednym z najczęściej używanych narzędzi do edycji genów do tej pory9,10,11,12. Ponieważ system CRISPR/Cas9 ma kilka zalet, takich jak wysoka skuteczność wyciszania genów i niski koszt, został już zastosowany do edycji genów u różnych gatunków owadów, w tym Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 i Bombyx mori16. U B. dorsalis geny związane z kolorem ciała, dymorfizmem skrzydeł i determinacją płci zostały pomyślnie wyeliminowane za pomocą CRISPR/Cas917,18,19. Jednak szczegółowe procedury aplikacji CRISPR/Cas9 u tego owada pozostają niekompletne. Co więcej, niektóre kroki przedstawione przez naukowców w zakresie edycji genów B. dorsalis są również zróżnicowane i wymagają standaryzacji. Na przykład formy Cas9 były różne w opublikowanych odwołaniach17,18,19.
Ten artykuł przedstawia systematyczną metodę mutagenezy B. dorsalis za pomocą systemu CRISPR/Cas9, w tym projektowanie i syntezę przewodników RNA, pobieranie zarodków, wstrzykiwanie zarodków, hodowlę owadów i badania przesiewowe mutantów. Protokół ten posłuży jako przydatny przewodnik do generowania zmutowanych much dla badaczy, którzy są zainteresowani badaniami funkcjonalnych genów u B. dorsalis.

<table><tbody><tr><td>6x Bufor ładujący DNA</td><td>TransGen Biotech</td><td>GH101-01</td><td></td></tr><tr><td>Sztuczna komora klimatyczna</td><td>ShangHai BluePard</td><td>MGC-350P</td><td></td></tr><tr><td>AxyPrep Zestaw do miniekstrakcji genomowego DNA</td><td>Axygen</td><td>AP-MN-MS-GDNA-250G</td><td></td></tr><tr><td>BLAT</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Do wyszukiwania potencjalnych loci genów w genomie</td></tr><tr><td>Szkło kapilarne</td><td>WPI&nbsp;</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator Eppendorf InjectMan 4 Eppendorf</td><td></td><td>InjectMan 4</td><td></td></tr><tr><td>GeneArt Precision Zestaw do syntezy gRNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A29377</td><td></td></tr><tr><td>Hisat2</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Do dopasowania transkryptomu do nabytych loci</td></tr><tr><td>genu IGV</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Do wizualizacji wyników z Transdekodera</td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>NARISHIGE</td><td>EG-401</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ2-ILST</td><td></td></tr><tr><td>pEASY-Blunt Zestaw do klonowania</td><td>TransGen Biotech</td><td>CB101-02</td><td>https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf</td></tr><tr><td>Roztwór czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Książka kucharska pipet 2018 P-97 & P-1000 Ściągacze do mikropipet</td><td>Firma przyrządowa&nbsp;</td><td></td><td>https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf</td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS (Premix)</td><td>Takara Biomedical Technology</td><td>R040A</td><td></td></tr><tr><td>SAM NA</td><td></td><td>NA</td><td>DO generowania posortowanych plików bam</td></tr><tr><td>sgRNAcas9-AI</td><td>NA</td><td></td><td>sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet Sutter Sutter&nbsp;</td><td>Firma Instrumentalna&nbsp;</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Trans2K DNA Marker</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM101-02</td><td></td></tr><tr><td>Transdekoder</td><td>NA</td><td>NA Do</td><td>łączenia wyników składania transkryptów i informacji o loci genów https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A36498</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-śladowy biologiczny detektor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000C</td><td></td></tr></tbody></table>

protokoły mutagenezy crispr/cas9 muszki owocowej bactrocera dorsalis

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Orientalna muszka owocowa, Bactrocera dorsalis, jest wysoce inwazyjnym i adaptacyjnym gatunkiem szkodnika, który powoduje szkody w uprawach cytrusów i ponad 150 innych uprawach owocowych na całym świecie. Ponieważ dorosłe muszki owocowe mają dużą zdolność lotu, a samice składają jaja pod skórkami owoców, insektycydy wymagające bezpośredniego kontaktu ze szkodnikiem zwykle słabo radzą sobie na polu. Wraz z rozwojem narzędzi biologii molekularnej i technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, wielu naukowców próbuje opracować przyjazne dla środowiska strategie ochrony przed szkodnikami. Należą do nich RNAi lub pestycydy oparte na edycji genów, które obniżają lub wyciszają geny (cele molekularne), takie jak geny węchowe zaangażowane w zachowanie poszukiwawcze u różnych szkodników owadzich. Aby zaadaptować te strategie do zwalczania muszek owocowych orientalnych, potrzebne są skuteczne metody badań genów funkcjonalnych. Geny pełniące kluczowe funkcje w przetrwaniu i reprodukcji B. dorsalis służą jako dobre cele molekularne do knockdownu i/lub wyciszenia genów. System CRISPR/Cas9 jest niezawodną techniką stosowaną do edycji genów, zwłaszcza u owadów. W artykule przedstawiono systematyczną metodę mutagenezy B. dorsalis metodą CRISPR/Cas9, w tym projektowanie i syntezę przewodników RNA, pobieranie zarodków, wstrzykiwanie zarodków, hodowlę owadów i badania przesiewowe mutantów. Protokoły te posłużą jako przydatny przewodnik do generowania zmutowanych much dla naukowców zainteresowanych badaniami funkcjonalnych genów u B. dorsalis.

Niniejszy protokół przedstawia szczegółowe etapy tworzenia mutantów B. dorsalis z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9, w tym reprezentatywne wyniki selekcji gDNA, pobierania embrionów i mikroiniekcji, hodowli owadów oraz przesiewu mutantów.
Przykład miejsca docelowego wybranego genu znajduje się w trzecim eksonie (Rycyna 1C). Miejsce to jest wysoce konserwatywne, a za pomocą elektroforezy żelowej wykryto pojedynczy prążek dla matrycy DNA do syntetyczne...

Ten artykuł przedstawia krok po kroku protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 orientalnej muszki owocowej Bactrocera dorsalis. Szczegółowe kroki przewidziane w tym ustandaryzowanym protokole posłużą jako przydatny przewodnik do generowania zmutowanych much do funkcjonalnych badań genów u B. dorsalis.

Protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 muszki owocowej Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...

Orientalna muszka owocowa jest wysoce inwazyjnym i adaptacyjnym gatunkiem szkodnika. Skuteczne metody badań nad genami funkcjonalnymi mogą pomóc nam w opracowaniu przyjaznych dla środowiska strategii ochrony przed szkodnikami. Ta metoda to wysoka wydajność i niski koszt.Nasz protokół posłuży jako przydatny przewodnik do generowania zmutowanych much dla badaczy orientalnych muszek owocowych. Na początek należy przewidzieć strukturę docelowych genów będących przedmiotem zainteresowania i określić granice między eksonami i intronami za pomocą analizy bioinformatycznej genomu Bactroceras dorsalis. Użyj dostępnego na rynku zestawu do syntezy gRNA, aby wygenerować zaprojektowane sgRNA.Ponownie zawiesić produkt gRNA w wodzie wolnej od nukleaz. Określ ilościowo stężenie za pomocą spektrofotometru UV i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza przed użyciem. Umieść poczwarki B.dorsalis w plastikowej klatce, w której wilgotność względna wynosi 55%, 26,5 stopni Celsjusza, a cykl światła wynosi 14:10 dzień.Kiedy dorosłe osobniki się zamykają, podaj mieszaninę cukru i drożdży jako pokarm wraz z wodą. Większość dorosłych osiąga dojrzałość płciową 10 dni po wzejściu. Użyj statywu oświetleniowego ze światłem o natężeniu od 30 do 50 luksów, aby poprawić płodność samic, poprawiając w ten sposób efektywność pobierania zarodków.Następnie umieść gazę o oczkach 200 w komorze do składania jaj, w odległości około 1 do 2 milimetrów od pokrywy komory. Umieścić nową komorę do składania jaj w klatce, gdy zestaw do mikroiniekcji jest gotowy. Zbieraj zarodki co 10 minut za pomocą cienkiej mokrej szczoteczki i ułóż je na samodzielnie przygotowanej płytce do wstrzykiwań.Podczas wstrzykiwania zanurz zarodki w oleju halowęglowym, aby uniknąć dalszego wysuszenia. Przygotować roztwór roboczy, mieszając białko Cas9 i odpowiadające mu sgRNA do stężenia 300 nanogramów na mikrolitr każdego z nich. Następnie dodaj 1 mikrolitr czerwieni fenolowej do mieszanki, aby służyła jako wygodny sposób oznaczania wstrzykniętych zarodków.Przygotuj mieszaninę umieść na lodzie, aby uniknąć degradacji sgRNA. Przygotować szklaną igłę do wstrzykiwań za pomocą ściągacza do mikropipet. Dodać 3 mikrolitry mieszaniny do igły iniekcyjnej bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.Następnie otwórz igłę za pomocą mikromłynka i podłącz ją do mikromanipulatora zgodnie z instrukcją obsługi. Ustaw parametry wtryskiwacza jako Pi na 500 hektopaskalach. Ti do 0,5 sekundy, a PC do 200 hektopaskalów.Umieść płytkę z ułożonymi w linii zarodkami na stole z obiektywem. Następnie wyreguluj położenie mikropipety pod dokładnym mikroskopem optycznym, ustawiając mikropipetę i zarodek w tej samej płaszczyźnie. Wbić końcówkę igły w tylny biegun lub roślinny zarodka.Następnie należy nacisnąć pedał na wstrzykiwaczu, aby dostarczyć mieszaniny do zarodka. Pojawienie się lekko czerwonawego koloru wynika z dodania do mieszaniny czerwieni fenolowej. Umieścić płytkę iniekcyjną z wstrzykniętymi zarodkami w komorze klimatycznej ze sztucznym klimatem.Po 36 godzinach przenieś wyklute larwy do diety larwalnej za pomocą szczoteczki z cienką końcówką. Zbieraj larwy trzy lub cztery razy dziennie, aż nie wyklują się już żadne larwy. Następnie umieść dojrzałe larwy w mokrym piasku, aby się przepoczwarzyły.Etap przepoczwarzenia trwa 10 dni. Po przepoczwarzeniu przenieś poczwarki do plastikowej klatki, zanim rozpocznie się eklozja. Po wyizolowaniu genomowego DNA ze świeżego poczwarki lub pojedynczej środkowej nogi poszczególnych dorosłych osobników i zaprojektowaniu specyficznych starterów do amplifikacji obszaru docelowego, należy przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy lub PCR, zgodnie z warunkami cyklicznymi opisanymi w manuskrypcie tekstowym.Następnie zsekwencjonuj oczyszczone produkty PCR. Wykrycie wielu nakładających się pików sąsiadujących z miejscem docelowym sugeruje udaną mutagenezę. W celu podklonowania należy wymieszać oczyszczone produkty PCR z wektorem o końcu i podwiązywać je w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 15 minut.Następnie dodaj komórki trans-T1 i umieść je na lodzie na 30 minut. Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki LB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 godzinę z potrząsaniem. Odwirować i wyrzucić supernatant.Ponownie zawiesić granulat i rozprowadzić go na talerzu LB. Umieść płytkę do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wybierz poszczególne kolonie bakteryjne do sekwencjonowania, aby zweryfikować genotyp mutantów.W tym badaniu przykładowe miejsce docelowe wybranego genu znajduje się w trzecim eksonie. Miejsce docelowe jest wysoce konserwatywne, a pojedyncze prążko wykryto za pomocą elektroforezy żelowej dla matrycy DNA do syntetycznej transkrypcji gRNA i gRNA uzyskanej in vitro. Przeżywalność i mutageneza B.dorsalis po mikroiniekcjach są pokazane tutaj.Po sekwencjonowaniu produktów PCR, 80% osobników G0 to mutanty mozaikowe. W badaniach przesiewowych mutantów mutant z delecją 8 par zasad spowodował przedwczesne zakończenie translacji aminokwasów. Wkłucie igły w tylną część lub biegun roślinny zarodka jest centralnym krokiem, ponieważ bezpośrednio wpływa na przetrwanie komórek jajowych.Ta technologia stanowi odniesienie do badania obszarów funkcji genów w B.Dorsalis Dzięki tej metodzie mogą szybko uchwycić pożądane mutanty.

protocols-for-crisprcas9-mutagenesis-oriental-fruit-fly-bactrocera

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje metodę przesiewową w celu identyfikacji transgenicznych muszek Drosophila, których genom został zmodyfikowany za pomocą CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do edycji genomu, które zrewolucjonizowało sposób, w jaki naukowcy mogą manipulować genomem organizmu. W przykładowym protokole zobaczymy, jak zidentyfikować mutanty generowane przez CRISPR, w których insercja sekwencji transaktywacyjnej zastępuje pierwszy ekson genu bezgałęziowego (bnl), tworząc w ten sposób linię...

Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu: metoda identyfikacji mutantów generowanych przez CRISPR u Drosophila

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół użycia enzymu Cas13D ukierunkowanego na RNA (RfxCas13D) u much.

Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

To badanie dostarcza systematycznie optymalizowanej procedury budowy homozygotycznych mutantów szarańczy opartej na rybonukleazie CRISPR/Cas9, jak również szczegółowej metody kriokonserwacji i resuscytacji jaj szarańczy.

Budowa homozygotycznych mutantów szarańczy wędrownej z wykorzystaniem technologii CRISPR/Cas9

Poznaj protokół mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszki owocowej Bactrocera dorsalis. Ta metoda umożliwia generowanie mutantów z 80% skutecznością, wspierając badania genów i ekologiczną ochronę roślin.

Protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 muszki owocowej Bactrocera dorsalis

Przeglądaj więcej filmów