Protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 muszki owocowej Bactrocera dorsalis
28 września 2022
Ten artykuł przedstawia krok po kroku protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 orientalnej muszki owocowej Bactrocera dorsalis. Szczegółowe kroki przewidziane w tym ustandaryzowanym protokole posłużą jako przydatny przewodnik do generowania zmutowanych much do funkcjonalnych badań genów u B. dorsalis.
Orientalna muszka owocowa jest wysoce inwazyjnym i adaptacyjnym gatunkiem szkodnika. Skuteczne metody badań nad genami funkcjonalnymi mogą pomóc nam w opracowaniu przyjaznych dla środowiska strategii ochrony przed szkodnikami. Ta metoda to wysoka wydajność i niski koszt.
Nasz protokół posłuży jako przydatny przewodnik do generowania zmutowanych much dla badaczy orientalnych muszek owocowych. Na początek należy przewidzieć strukturę docelowych genów będących przedmiotem zainteresowania i określić granice między eksonami i intronami za pomocą analizy bioinformatycznej genomu Bactroceras dorsalis. Użyj dostępnego na rynku zestawu do syntezy gRNA, aby wygenerować zaprojektowane sgRNA.
Ponownie zawiesić produkt gRNA w wodzie wolnej od nukleaz. Określ ilościowo stężenie za pomocą spektrofotometru UV i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza przed użyciem. Umieść poczwarki B.dorsalis w plastikowej klatce, w której wilgotność względna wynosi 55%, 26,5 stopni Celsjusza, a cykl światła wynosi 14:10 dzień.
Kiedy dorosłe osobniki się zamykają, podaj mieszaninę cukru i drożdży jako pokarm wraz z wodą. Większość dorosłych osiąga dojrzałość płciową 10 dni po wzejściu. Użyj statywu oświetleniowego ze światłem o natężeniu od 30 do 50 luksów, aby poprawić płodność samic, poprawiając w ten sposób efektywność pobierania zarodków.
Następnie umieść gazę o oczkach 200 w komorze do składania jaj, w odległości około 1 do 2 milimetrów od pokrywy komory. Umieścić nową komorę do składania jaj w klatce, gdy zestaw do mikroiniekcji jest gotowy. Zbieraj zarodki co 10 minut za pomocą cienkiej mokrej szczoteczki i ułóż je na samodzielnie przygotowanej płytce do wstrzykiwań.
Podczas wstrzykiwania zanurz zarodki w oleju halowęglowym, aby uniknąć dalszego wysuszenia. Przygotować roztwór roboczy, mieszając białko Cas9 i odpowiadające mu sgRNA do stężenia 300 nanogramów na mikrolitr każdego z nich. Następnie dodaj 1 mikrolitr czerwieni fenolowej do mieszanki, aby służyła jako wygodny sposób oznaczania wstrzykniętych zarodków.
Przygotuj mieszaninę umieść na lodzie, aby uniknąć degradacji sgRNA. Przygotować szklaną igłę do wstrzykiwań za pomocą ściągacza do mikropipet. Dodać 3 mikrolitry mieszaniny do igły iniekcyjnej bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
Następnie otwórz igłę za pomocą mikromłynka i podłącz ją do mikromanipulatora zgodnie z instrukcją obsługi. Ustaw parametry wtryskiwacza jako Pi na 500 hektopaskalach. Ti do 0,5 sekundy, a PC do 200 hektopaskalów.
Umieść płytkę z ułożonymi w linii zarodkami na stole z obiektywem. Następnie wyreguluj położenie mikropipety pod dokładnym mikroskopem optycznym, ustawiając mikropipetę i zarodek w tej samej płaszczyźnie. Wbić końcówkę igły w tylny biegun lub roślinny zarodka.
Następnie należy nacisnąć pedał na wstrzykiwaczu, aby dostarczyć mieszaniny do zarodka. Pojawienie się lekko czerwonawego koloru wynika z dodania do mieszaniny czerwieni fenolowej. Umieścić płytkę iniekcyjną z wstrzykniętymi zarodkami w komorze klimatycznej ze sztucznym klimatem.
Po 36 godzinach przenieś wyklute larwy do diety larwalnej za pomocą szczoteczki z cienką końcówką. Zbieraj larwy trzy lub cztery razy dziennie, aż nie wyklują się już żadne larwy. Następnie umieść dojrzałe larwy w mokrym piasku, aby się przepoczwarzyły.
Etap przepoczwarzenia trwa 10 dni. Po przepoczwarzeniu przenieś poczwarki do plastikowej klatki, zanim rozpocznie się eklozja. Po wyizolowaniu genomowego DNA ze świeżego poczwarki lub pojedynczej środkowej nogi poszczególnych dorosłych osobników i zaprojektowaniu specyficznych starterów do amplifikacji obszaru docelowego, należy przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy lub PCR, zgodnie z warunkami cyklicznymi opisanymi w manuskrypcie tekstowym.
Następnie zsekwencjonuj oczyszczone produkty PCR. Wykrycie wielu nakładających się pików sąsiadujących z miejscem docelowym sugeruje udaną mutagenezę. W celu podklonowania należy wymieszać oczyszczone produkty PCR z wektorem o końcu i podwiązywać je w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Następnie dodaj komórki trans-T1 i umieść je na lodzie na 30 minut. Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki LB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 godzinę z potrząsaniem. Odwirować i wyrzucić supernatant.
Ponownie zawiesić granulat i rozprowadzić go na talerzu LB. Umieść płytkę do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wybierz poszczególne kolonie bakteryjne do sekwencjonowania, aby zweryfikować genotyp mutantów.
W tym badaniu przykładowe miejsce docelowe wybranego genu znajduje się w trzecim eksonie. Miejsce docelowe jest wysoce konserwatywne, a pojedyncze prążko wykryto za pomocą elektroforezy żelowej dla matrycy DNA do syntetycznej transkrypcji gRNA i gRNA uzyskanej in vitro. Przeżywalność i mutageneza B.dorsalis po mikroiniekcjach są pokazane tutaj.
Po sekwencjonowaniu produktów PCR, 80% osobników G0 to mutanty mozaikowe. W badaniach przesiewowych mutantów mutant z delecją 8 par zasad spowodował przedwczesne zakończenie translacji aminokwasów. Wkłucie igły w tylną część lub biegun roślinny zarodka jest centralnym krokiem, ponieważ bezpośrednio wpływa na przetrwanie komórek jajowych.
Ta technologia stanowi odniesienie do badania obszarów funkcji genów w B.Dorsalis Dzięki tej metodzie mogą szybko uchwycić pożądane mutanty.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zestandaryzowany protokół mutogenezy CRISPR/Cas9 u orientalnej muchówki owocowej, Bactrocera dorsalis. Metoda ma na celu usprawnienie funkcjonalnych badań nad genami u tego inwazyjnego szkodnika, oferując kosztowo efektywne podejście do generowania much mutantów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Badania nad genami funkcjonalnymi
- Zwalczanie inwazyjnych szkodników
- Zastosowanie technologii CRISPR
Wstęp
- Bactrocera dorsalis jest istotnym gatunkiem szkodnika.
- Skuteczne celowanie w geny mogłoby zapewnić przyjazne dla środowiska metody zwalczania szkodników.
- Zrozumienie funkcji genów może mieć kluczowe znaczenie dla zarządzania inwazyjnością.
Zastosowane metody
- Protokoły edycji genów CRISPR/Cas9
- Bactrocera dorsalis jako organizm modelowy
- Techniki mikroiniekcji zarodków i późniejsze genotypowanie
Główne wyniki
- Po mikroiniekcji wygenerowano 80% mutantów mozaikowych.
- Znacząca delecja 8 par zasad doprowadziła do przedwczesnego przerwania translacji aminokwasów.
- Zastosowana metodologia skutecznie oddała funkcję genu w systemie modelowym.
Wnioski
- Niniejszy protokół demonstruje możliwości zastosowania CRISPR/Cas9 w badaniach nad szkodnikami.
- Przedstawione metody są istotne dla badań genetycznych i strategii zwalczania szkodników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mutageneza CRISPR/Cas9 u Bactrocera dorsalis umożliwia systematyczną analizę funkcjonalną genów u wysoce adaptacyjnego szkodnika, wspierając identyfikację celów molekularnych dla nowej generacji metod zwalczania szkodników. Niniejszy protokół zapewnia powtarzalny schemat postępowania w celu generowania i walidacji mutantów z edytowanymi genami, co bezpośrednio przekłada się na walidację celów i minimalizację ryzyka mechanistycznego w rurociągach biotechnologii rolniczej. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną strategii translacyjnych ukierunkowanych na środowiskowo zrównoważoną kontrolę szkodników.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną genów kandydatów, które są kluczowe dla przetrwania i rozmnażania się szkodników.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie zaburzeń genów z efektami fenotypowymi.
- Ułatwia priorytetyzację celów molekularnych dla strategii knockdownu lub wyciszania genów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowany system generowania zwalidowanych linii mutantów do dalszych analiz.
- Gwarantuje powtarzalność i skalowalność w procesach przesiewowych mutantów oraz w procedurach genotypowania.
- Dostarcza wyników ilościowych dzięki wykrywaniu mutacji za pomocą PCR i sekwencjonowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Łączy badania nad funkcją genu z translacyjną identyfikacją biomarkerów w celu zwalczania szkodników.
- Zapewnia ciągłość od odkrycia genu do przedklinicznej walidacji interwencji z wykorzystaniem edycji genów.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne poprzez potwierdzenie istotności celu w modelu szkodnika odpowiadającym danej jednostce chorobowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół CRISPR/Cas9 integruje procesy od wczesnego odkrywania genów, poprzez walidację celu, aż po ocenę przedkliniczną w badaniach i rozwoju biotechnologii rolniczej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera analizę funkcji genów i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w B. dorsalis w oparciu o postawione hipotezy.
- Screening: Ustanawia powtarzalną generację mutantów oraz ilościowe genotypowanie w celu przygotowania do analiz.
- Analityka: Wykorzystuje PCR i sekwencjonowanie do uzyskania jasnych odczytów mutacji na potrzeby analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wiedzę o funkcjach genów z zastosowanymi strategiami zwalczania szkodników.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje reużywalny schemat postępowania, który można dostosować do innych gatunków szkodników i celów genowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowanych, skalowalnych i powtarzalnych protokołów edycji genów.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go w zakresie rozwoju celów i alokacji zasobów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów genowych z uwzględnieniem ryzyka w celu opracowania zrównoważonych rozwiązań w kontroli szkodników.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu CRISPR, mikroiniekcji embrionów oraz genotypowaniu molekularnym.
- Wymaga dostępu do sprzętu do mikroiniekcji, kontrolowanych warunków hodowli oraz infrastruktury sekwencjonowania.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przesiewania mutantów i interpretacji danych.
- Metoda możliwa do adaptacji w innych modelach owadów po optymalizacji protokołu pod kątem biologii konkretnego gatunku.
- Wysoka wydajność mutagenezy jest uzależniona od żywotności embrionów oraz precyzji iniekcji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Target Design and In Vitro Synthesis of sgRNA
1:18
Embryo Collection and Preparation
2:39
Microinjection of Embryos
4:24
Post-Injection Insect Rearing
5:07
Mutant Screening
6:41
Results: Mutant Screening in B. dorsalis
7:39
Conclusion
