Selektywna depolaryzacja mitochondriów aksonalnych wspomagana mikrofluidyką

Mitochondria są niezbędne dla zdrowia neuronów. W wielu chorobach neurodegeneracyjnych mitochondria aksonalne są pierwszymi, które cierpią, ale nie jest jasne, co sprawia, że mitochondria aksonalne są tak wyjątkowe. Gradient ciśnienia płynu w komorach stosowanych w tym protokole pozwala na selektywne traktowanie aksonów mitochondriów.

Pozostawia to procesy zachodzące w organizmie komórki bez zakłóceń i pozwala nam skupić się na biologii aksonalnej. Pokazujemy tutaj depolaryzację mitochondriów za pomocą barwnika wrażliwego na potencjał błonowy, ale metoda ta może być stosowana do wielu różnych typów komórek neuronalnych i odczytów fluorescencyjnych. Na początek umieść zakodowane płytki z sześcioma dołkami w sterylnym kapturze i umyj je dwukrotnie sterylną wodą podwójnie destylowaną.

Pozostaw płytki do wyschnięcia w pozycji pochylonej przez trzy do pięciu minut. Usunąć nadmiar wody przez odsysanie próżniowe lub pipetowanie. Następnie namocz komorę mikroprzepływową w 80% etanolu.

Ponownie osusz komorę mikroprzepływową przez trzy do pięciu minut w pozycji pochylonej i usuń nadmiar etanolu za pomocą końcówki pipety. Po całkowitym wyschnięciu umieść komorę mikroprzepływową na środku studzienki i płytki. Delikatnie postukaj w komorę mikroprzepływową na jej krawędziach i w sekcję mikrorowków pośrodku, aby prawidłowo przymocować do szklanej płytki.

Najpierw zbierz żądaną liczbę zdysocjowanych neuronów hipokampa w 1,5 mililitrowej probówce reakcyjnej. Odwirować probówkę o sile 1000 razy G przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w ośmiu mikrolitrach neuro podstawowej pożywki B-27.

Następnie dozować roztwór komórkowy do wejścia do kanału komory mikroprzepływowej. Stuknij w tylną część płytki, aby wspomóc przepływ przez kanał. Za pomocą pipety odessać pozostałą zawiesinę komórek na wyjściu z kanału.

Inkubuj komorę mikroprzepływową z komórkami przez 15 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie napełnij górną studzienkę aksonalną 50 mikrolitrami pożywki neuropodstawowej B-27 i postukaj w tylną część płytki, aby wspomóc przepływ. Napełnij każdą studzienkę po stronie somy 150 mikrolitrami pożywki neuropodstawowej B-27, tworząc na wierzchu pęcherzyk napięcia.

Napełnij również obie studzienki po stronie aksonalnej po 100 mikrolitrami pożywki neuropodstawowej B-27. Po siedmiu do ośmiu dniach hodowli in vitro upewnij się, że aksony wyrosły przez mikrorowki i rozszerzyły się do przedziału aksonalnego. Umyj urządzenie, usuwając pożywkę neuropodstawową B-27 i dodając 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do obrazowania do górnych studzienek zarówno kanału aksonalnego, jak i somatycznego.

Pozwól, aby medium przepłynęło do dolnych studzienek. Usuń pożywkę z dolnych studzienek i wszelkie pozostałe pożywki z górnych studzienek i powtórz ze świeżą pożywką, pozostawiając studzienki puste pod koniec płukania. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pięciokrotowego rozcieńczenia TMRE do studzienki somatycznej i aksonalnej.

Pozwól medium przepływać przez obie komory, aż we wszystkich studzienkach będzie równa objętość. Napełnić pożywką zawierającą TMRE. Wybierz interesujący Cię obszar w przedziale somatycznym i podążaj za nim przez mikrorowki do przedziału aksonalnego.

Upewnij się, że mikrorowki obrazowane w przedziałach somatycznych i aksonalnych są do siebie dopasowane. Po zmianie nazwy pliku uzyskaj obrazy czerwonej fluorescencji przy użyciu długości fali wzbudzenia 561 nanometrów i emisji 625 nanometrów. Upewnij się, że różnica objętości między komorą soma a komorą aksonalną jest sprawdzana pod kątem obecności pęcherzyka napięcia po stronie somatycznej.

Następnie usuń pożywkę obrazującą z obu studzienek po stronie aksonalnej, z wyjątkiem pożywki wewnątrz kanału. Aby wywołać depolaryzację mitochondriów, dodaj 160 mikrolitrów 20 mikromolowej antymycyny A rozcieńczonej w pożywce do obrazowania do górnej studzienki aksonalnej. Pozwól mu przepłynąć przez kanał, aż w obu studzienkach aksonalnych pojawi się równa objętość.

Powtórz obrazowanie, upewniając się, że obrazowane są te same pozycje, co podczas akwizycji linii bazowej, identyfikując mikrorowki. Korzystając z tego protokołu, pierwotne neurony hipokampa hodowano w urządzeniach mikroprzepływowych, a następnie barwiono mitochondria barwnikiem wrażliwym na błonę, TMRE. Jednorodne zabarwienie mitochondriów zaobserwowano po obu stronach mikrorowków, ale nie w środku.

Po dodaniu antymycyny A do strony aksonalnej, mitochondria somalne zachowały sygnał TMRE, podczas gdy fluorescencja została utracona z mitochondriów aksonalnych Upewnij się, że żadna wilgoć nie pozostała w studni lub na urządzeniu przed montażem urządzenia. W przeciwnym razie komory nie zostaną uszczelnione. Za pomocą tej metody możemy badać skutki utraty funkcji mitochondriów w aksonie i funkcji lokalnych, a także jej wpływ na sygnalizację wsteczną i globalne przeżycie komórek.

Przez długi czas uważano, że biogeneza mitochondriów zachodzi wyłącznie w ciele komórki. Metoda ta pozwoliła nam ujawnić, że uszkodzenie mitochondriów aksonalnych wymagało lokalnej translacji krótkiego białka PINK1.