Name: Selektywna depolaryzacja mitochondriów aksonalnych wspomagana mikrofluidyką (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Poznaj metodę selektywnej depolaryzacji mitochondriów aksonalnych przy użyciu mikrofluidyki. Technika ta umożliwia badanie dynamiki mitochondriów w neuronach hipokampalnych bez zakłócania ciała komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Niemiecką Fundację Badawczą (HA 7728/2-1 i EXC2145 Project ID 390857198) oraz Towarzystwo Maxa Plancka.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami rządu Górnej Bawarii. Pierwotne neurony przygotowano z zarodków myszy typu dzikiego E16.5 C57BL/6 obu płci zgodnie ze standardowymi metodami, jak opisano wcześniej6.
1. Montaż urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Pokryć jedną sześciodołkową płytkę do hodowli tkankowej ze szklanym dnem o końcowym stężeniu 20 μg/ml poli-D-lizyny i 3,4 μg/ml lamininy w PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować powlekaną płytkę przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Powlekanie można również wykonywać w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny. Wybór powłoki zależy od zastosowanego typu ogniwa.</li>
	<li>Po powlekaniu przynieś sześciodołkowe płytki do sterylnego kaptura i umyj je dwukrotnie sterylnym ddH2O. 
	UWAGA: Nie myć zawierającymi sól, takimi jak PBS, ponieważ kryształki soli będą przeszkadzać w tworzeniu uszczelnienia.</li>
	<li>Pozostaw płytkę do wyschnięcia w pozycji pochylonej na 3-5 minut. Usuń nadmiar wody przez odsysanie próżniowe lub pipetowanie.</li>
	<li>Namocz komorę mikroprzepływową w 80% etanolu. 
	UWAGA: Komora mikroprzepływowa została pozyskana ze źródeł komercyjnych (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Pozostaw komorę mikroprzepływową do wyschnięcia na 3-5 minut w pozycji przechylonej. Usuń nadmiar etanolu za pomocą próżni, odsysania lub pipetowania.</li>
	<li>Po całkowitym wyschnięciu umieść komorę mikroprzepływową na środku studzienki. 
	UWAGA: Powstawanie uszczelki można zaobserwować jako zmianę właściwości odblaskowych po wykluczeniu powietrza z powierzchni styku między płytą a urządzeniem silikonowym. Zarówno płyta, jak i komora mikroprzepływowa muszą być całkowicie suche przed montażem, aby zapewnić dobre uszczelnienie. Jednak czas schnięcia musi być zminimalizowany tak bardzo, jak to możliwe, aby zapewnić prawidłowe przyleganie do komórek. Dlatego studnie i komory muszą być wizualnie sprawdzone pod kątem pozostałych kropelek cieczy. Jeśli nie widać żadnych kropel, natychmiast zmontuj komory.</li>
	<li>Delikatnie postukaj w komorę mikroprzepływową na jej krawędziach i w sekcję mikrorowków pośrodku, aby prawidłowo przymocować do szklanej płytki.</li>
</ol>
2. Zasiewanie i utrzymywanie neuronów
<ol>
	<li>Zbierz żądaną liczbę zdysocjowanych neuronów hipokampa na komorę w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu 1,5 x 105 neuronów na urządzenie zostało wysianych do zastosowań opartych na obrazowaniu.</li>
	<li>Odwirować neurony przy 1000 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 8 μl pożywki B27-Neurobasel (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Odpipetować roztwór komórkowy do wejścia do kanału komory mikroprzepływowej (b w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Stuknij w tylną część płyty, aby wspomóc przepływ przez kanał. 
	UWAGA: Stukanie można wykonać dość mocno, bez obawy, że uszczelka pęknie.</li>
	<li>Odessać pipetą pozostałą zawiesinę komórek na wyjściu z kanału (g w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A), aby zmniejszyć liczbę komórek na zewnątrz kanału.</li>
	<li>Inkubować komorę mikroprzepływową z komórkami przez 15-20 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Napełnij górną studzienkę aksonalną 50 μl pożywki B27-neurobazalnej w (c w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Stuknij w tylną część płyty, aby wspomóc przepływ przez kanał.</li>
	<li>Napełnij studzienki po stronie somy (a i h w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A) 150 μl pożywki B27-Neurobasel każda, tworząc na wierzchu pęcherzyk napięcia. Objętość pęcherzyka wynosi około 20 μL. 
	UWAGA: Tworzenie pęcherzyka napięcia nie jest konieczne do uzyskania izolacji płynowej, ale zapewnia wyraźny obraz większej objętości po stronie somy.</li>
	<li>Napełnij obie studzienki po stronie aksonalnej (c i i w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A) 100 μl pożywki B27-Neurobasel każda. 
	UWAGA: Aby promować wzrost aksonów przez mikrorowki, zaleca się, aby studzienki po stronie somy zawierały więcej pożywki niż studzienki po stronie aksonów. Jednak aksony przez przypadek wyrosną przez mikrorowki nawet bez różnic objętości.</li>
	<li>Inkubować komorę mikroprzepływową w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7-8 dni. 
	UWAGA: Wzrost aksonów do komory aksonalnej można zwykle zaobserwować począwszy od dnia in vitro (DIV) 5. Dłuższe czasy hodowli są możliwe, jeśli pożądane są bardziej dojrzałe kultury.</li>
	<li>Karmić neurony co 2-3 dni, usuwając pożywkę z dwóch górnych dołków (a i c) i zastępując ją świeżą pożywką B27-Neurobasel, aż utworzy się pęcherzyk napięcia.</li>
</ol>
3. Barwienie barwnikiem wrażliwym na potencjał błony mitochondrialnej
<ol>
	<li>W DIV 7-8 oceń, czy aksony wyrosły przez mikrorowki i rozciągają się do komory aksonalnej pod mikroskopem świetlnym. 
	UWAGA: Możliwe są również różne stopnie DIV w zależności od pożądanego wieku.</li>
	<li>Wykonać dwa płukania wstępnie podgrzanym podłożem do obrazowania (37 °C), usuwając pożywkę B27-Neurobasel ze wszystkich studzienek i dodając około 100 μl pożywki do obrazowania do górnych studzienek zarówno kanału aksonalnego, jak i somowego (a i c). Pozwól, aby medium przepłynęło do dolnych studzienek (h i i).
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę z dolnych studzienek i wszelkie resztki pożywki w górnych studzienkach i powtórz ze świeżą pożywką, pozostawiając studzienki puste pod koniec płukania. 
		UWAGA: Ze względu na dużą siłę kapilarną w kanałach (d i f), w kanałach pozostanie pożywka płucząca, której nie należy usuwać, aby zapobiec wysuszeniu neuronów. Można tu użyć dowolnego podłoża do obrazowania wolnego od czerwieni fenolowej, na przykład Hibernate E (patrz Tabela materiałów). Jeśli mikroskop nie jest wyposażony w źródło CO2 , upewnij się, że podłoże obrazujące wykorzystuje alternatywny system buforowania do węglanu/CO2 (np. HEPES)8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć 1 mM ester etylowy tetrametylorodaminy (TMRE, czerwony, patrz tabela materiałów) do 5 nM w podłożu do obrazowania. 
	UWAGA: Nie przekraczać 1% DMSO w końcowym rozcieńczeniu, aby uniknąć toksyczności.</li>
	<li>Dodać 100 μl rozcieńczenia TMRE 5 nM zarówno do studzienki somatycznej, jak i aksonalnej (a i c) i pozwolić pożywce przepływać zarówno przez przedziały somatyczne, jak i aksonalne, aż we wszystkich studzienkach będzie taka sama objętość. Napełnić pożywką zawierającą TMRE.</li>
	<li>Umieść neurony z powrotem w komorze o kontrolowanym środowisku (37 °C i 5% CO2 ) na 25 minut.</li>
	<li>Wykonać dwa płukania wstępnie podgrzanym podłożem obrazowym (37 °C), jak opisano wcześniej (krok 3.2). Podczas ostatniego płukania napełnij 100 μl w każdym dołku i utwórz pęcherzyk naprężający pożywki na studzienkach somatycznych (a i c).</li>
</ol>
4. Obrazowanie żywych komórek
UWAGA: Pokazane zdjęcia zostały wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, przy użyciu obiektywu o kącie zanurzenia 40x NA 1,25 (patrz Tabela materiałów). Wybrano czas naświetlania 200 ms i 10% mocy lasera dla kanału czerwonego oraz czas ekspozycji 500 ms dla jasnego pola. Jednak zwykłe mikroskopy konfokalne lub odwrócone o szerokim polu widzenia mogą być również używane do badania intensywności TMRE.
<ol>
	<li>Zobrazuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
	<li>Upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w inkubator stopniowy w celu utrzymania kultury neuronalnej w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Wybierz interesujący Cię obszar w przedziale somatycznym i podążaj za nim przez mikrorowki do przedziału aksonalnego. Upewnij się, że obrazowane mikrorowki pasują do tych w przedziałach somatycznych i aksonalnych (dla łatwiejszego porównania wartości wyjściowej i po leczeniu).</li>
	<li>Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą wzbudzenia przy 561 nm i emisji przy 625 nm dla sygnału czerwonej fluorescencji.</li>
	<li>Zdobądź obrazy.</li>
	<li>Aby wywołać depolaryzację mitochondriów, dodaj 20 μM antymycyny A (patrz tabela materiałów) w pożywce do obrazowania do przedziału aksonalnego. Aby zapewnić różnicę objętości między komorą soma a komorą aksonalną, sprawdź, czy po stronie somatycznej znajduje się pęcherzyk naprężający (równy objętości >110 μl).
	<ol>
		<li>Usunąć całą pożywkę obrazową z dolnej studzienki po stronie aksonalnej (i), z wyjątkiem pożywki wewnątrz kanału (f). Dodać 160 μl 20 μM antymycyny A do górnej studzienki aksonalnej (c) i pozwolić jej przepłynąć przez kanał, aż w obu studzienkach aksonalnych będzie równa objętość. Objętości w studzienkach aksonalnych wynoszą około 80 μl na studzienkę. 
		UWAGA: Upewnij się, że objętość w studzienkach aksonalnych jest mniejsza niż w studzienkach somatycznych, aby zapewnić odpowiednie ciśnienie płynu. Zalecana jest różnica co najmniej 10 μl (10% objętości studzienki), ale możliwe są również większe różnice.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować neurony w komorze kontrolowanego środowiska (37 °C) przez 20-30 minut.</li>
	<li>Powtórzyć obrazowanie zgodnie z powyższym opisem (kroki 4.3-4.5). Upewnij się, że te same pozycje są obrazowane (łatwe do zidentyfikowania przez mikrorowki), co podczas akwizycji linii bazowej.</li>
</ol>

<ol><li>Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+neuronal+health%3A+from+energy+metabolism+to+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease.</a> Advanced Biology. 5 (9), 2100663(2021).</li>
<li>Dauer, W., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: mechanisms and models.</a> Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).</li>
<li>Moratalla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+vulnerability+of+primate+caudate-putamen+and+striosome-matrix+dopamine+systems+to+the+neurotoxic+effects+of+1-methyl-4-phenyl-1%2C2%2C3%2C6-+tetrahydropyridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).</li>
<li>Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+progression+in+Parkinson+disease+and+the+neurobiology+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons.</a> Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li>
<li>Harbauer, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+mitochondria+transport+Pink1+mRNA+via+synaptojanin+2+to+support+local+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy.</a> Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).</li>
<li>Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+of+damaged+mitochondria+occurs+locally+in+distal+neuronal+axons+and+requires+PINK1+and+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).</li>
<li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+4-%282-hydroxyethyl%29-1-piperazine%C3%ABthanesulfonic+acid+%28HEPES%29+as+a+tissue+culture+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).</li>
<li>Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondria+by+single-organelle+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondria by single-organelle resolution.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li>
<li>Altman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+TDP-43+condensates+drive+neuromuscular+junction+disruption+through+inhibition+of+local+synthesis+of+nuclear+encoded+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Niniejszy protokół opisuje metodę wysiewu i hodowli zdysocjowanych neuronów hipokampa w urządzeniu mikroprzepływowym do oddzielnego leczenia mitochondriów aksonalnych. Użyteczność tego podejścia z wrażliwym na błonę barwnikiem TMRE i inhibitorem kompleksu III antymycyną A (jak wykazano wcześniej7) została wykazana tutaj, ale metodę tę można łatwo dostosować do innych barwników mitochondrialnych lub genetycznie kodowanych czujników funkcji mitochondriów, które umożliwiają lokalne odczyty oparte na ...

Mitochondria są głównymi dostawcami ATP (adenozynotrójfosforanu) w neuronach. Ponieważ zdrowie neuronów jest ściśle związane z funkcją mitochondriów, nie jest zaskakujące, że dysfunkcyjna regulacja tych organelli jest związana z wystąpieniem różnych chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona1. Co więcej, zatrucie mitochondriami zostało z powodzeniem wykorzystane do modelowania objawów choroby Parkinsona u zwierząt2. Zarówno w modelach zwierzęcych, jak i w chorobach ludzkich, obumieranie neuronów zaczyna się w częściach dystalnych3,4, co sugeruje, że mitochondria aksonalne mogą być bardziej podatne na zniewagi. Jednak biologia mitochondriów w aksonach nie jest dobrze poznana ze względu na trudności związane z celowanym leczeniem i analizą mitochondriów aksonalnych bez jednoczesnego zaburzenia procesów zachodzących w organizmie komórki.
Ostatnie postępy w technikach hodowli zdysocjowanych neuronów in vitro pozwalają teraz na płynne rozdzielanie aksonów i ciał komórkowych za pomocą urządzeń mikroprzepływowych5. Jak pokazano w Rysunek 1A, urządzenia te posiadają cztery studnie dostępowe (a/h i c/i), z dwoma kanałami łączącymi każdą parę (d i f). Duże kanały są połączone ze sobą szeregiem mikrokanałów o długości 450 μm (e). Celowe różnice w poziomach napełnienia między dwiema komorami tworzą gradient ciśnienia płynu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1B), który zapobiega dyfuzji małych cząsteczek z kanału o niższym poziomie płynu na drugą stronę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C, zilustrowany niebieskim barwnikiem trypanowym).
Ostatnio używaliśmy urządzeń mikroprzepływowych do badania lokalnych wymagań translacji w mitofagii aksonalnej, selektywnym usuwaniu uszkodzonych mitochondriów6. W niniejszym protokole przedstawiono różne etapy indukcji miejscowego uszkodzenia mitochondriów poprzez selektywne traktowanie aksonów przy użyciu inhibitora kompleksu mitochondrialnego III Antimycin A6,7.

<table><tbody><tr><td>6-dołkowa szklana płyta dolna</td><td>Cellvis</td><td>P06.1.5H-N</td><td>Urządzenie silikonowe</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>B27</td> Mikroskop szerokokątny <td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M5000</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>EVOS M5000</td><td>w pełni zintegrowany cyfrowy mikroskop szerokokątny</td></tr><tr><td>Hibernate E</td><td>BrainBits</td><td>HE500</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony dysk wirujący konfokalny</td><td>Nikon</td><td>TI2-E + CSU-W1</td><td>Z komorą inkubatora</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia mikroprzepływowe</td><td>XONA mikrofluidyka</td><td>RD450</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Sigma</td><td>87917</td><td></td></tr></tbody></table>

selektywna depolaryzacja mitochondriów aksonalnych wspomagana mikrofluidyką

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria są głównymi dostawcami ATP (adenozynotrójfosforanu) w neuronach. Dysfunkcja mitochondriów jest powszechnym fenotypem w wielu chorobach neurodegeneracyjnych. Biorąc pod uwagę skomplikowaną architekturę i ekstremalną długość niektórych aksonów, nie jest zaskakujące, że mitochondria w aksonach mogą doświadczać różnych środowisk w porównaniu z ich odpowiednikami w ciałach komórkowych. Co ciekawe, dysfunkcja mitochondriów aksonalnych często poprzedza wpływ na organizm komórki. Aby modelować dysfunkcję mitochondriów aksonalnych in vitro, urządzenia mikroprzepływowe umożliwiają leczenie mitochondriów aksonalnych bez wpływu na mitochondria somalne. Gradient ciśnienia płynu w tych komorach zapobiega dyfuzji cząsteczek w kierunku przeciwnym do gradientu, umożliwiając w ten sposób analizę właściwości mitochondriów w odpowiedzi na lokalne wyzwania farmakologiczne w obrębie aksonów. Obecny protokół opisuje wysiewanie zdysocjowanych neuronów hipokampa w urządzeniach mikroprzepływowych, barwienie barwnikiem wrażliwym na potencjał błonowy, leczenie toksyną mitochondrialną, a następnie analizę mikroskopową. Ta wszechstronna metoda badania biologii aksonalnej może być stosowana do wielu zaburzeń farmakologicznych i odczytów obrazowych i jest odpowiednia dla kilku podtypów neuronów.

Pierwotne neurony hipokampa hodowano w urządzeniach mikrofluidycznych przez 7-8 dni, po czym mitochondria barwiono barwnikiem wrażliwym na potencjał błonowy (TMRE) przez 25 min w obu kanałach. Jak pokazano na Rysunku 2A, doprowadziło to do jednorodnego barwienia mitochondriów po obu stronach mikrowżobień, jednak było to niewystarczające do wyrównania barwienia w części środkowej mikrowżobień. Po dodaniu antymycyny A po stronie aksonalnej, mitochondria somatyczne zachowały sygnał TMRE (<stron...

Obecny protokół opisuje zasiewanie i barwienie mitochondriów neuronalnych w komorach mikroprzepływowych. Gradient ciśnienia płynu w tych komorach pozwala na selektywne traktowanie mitochondriów w aksonach w celu analizy ich właściwości w odpowiedzi na wyzwania farmakologiczne bez wpływu na przedział ciała komórki.

Selektywna depolaryzacja mitochondriów aksonalnych wspomagana mikrofluidyką

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Mitochondria są niezbędne dla zdrowia neuronów. W wielu chorobach neurodegeneracyjnych mitochondria aksonalne są pierwszymi, które cierpią, ale nie jest jasne, co sprawia, że mitochondria aksonalne są tak wyjątkowe. Gradient ciśnienia płynu w komorach stosowanych w tym protokole pozwala na selektywne traktowanie aksonów mitochondriów.Pozostawia to procesy zachodzące w organizmie komórki bez zakłóceń i pozwala nam skupić się na biologii aksonalnej. Pokazujemy tutaj depolaryzację mitochondriów za pomocą barwnika wrażliwego na potencjał błonowy, ale metoda ta może być stosowana do wielu różnych typów komórek neuronalnych i odczytów fluorescencyjnych. Na początek umieść zakodowane płytki z sześcioma dołkami w sterylnym kapturze i umyj je dwukrotnie sterylną wodą podwójnie destylowaną.Pozostaw płytki do wyschnięcia w pozycji pochylonej przez trzy do pięciu minut. Usunąć nadmiar wody przez odsysanie próżniowe lub pipetowanie. Następnie namocz komorę mikroprzepływową w 80% etanolu.Ponownie osusz komorę mikroprzepływową przez trzy do pięciu minut w pozycji pochylonej i usuń nadmiar etanolu za pomocą końcówki pipety. Po całkowitym wyschnięciu umieść komorę mikroprzepływową na środku studzienki i płytki. Delikatnie postukaj w komorę mikroprzepływową na jej krawędziach i w sekcję mikrorowków pośrodku, aby prawidłowo przymocować do szklanej płytki.Najpierw zbierz żądaną liczbę zdysocjowanych neuronów hipokampa w 1,5 mililitrowej probówce reakcyjnej. Odwirować probówkę o sile 1000 razy G przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w ośmiu mikrolitrach neuro podstawowej pożywki B-27.Następnie dozować roztwór komórkowy do wejścia do kanału komory mikroprzepływowej. Stuknij w tylną część płytki, aby wspomóc przepływ przez kanał. Za pomocą pipety odessać pozostałą zawiesinę komórek na wyjściu z kanału.Inkubuj komorę mikroprzepływową z komórkami przez 15 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie napełnij górną studzienkę aksonalną 50 mikrolitrami pożywki neuropodstawowej B-27 i postukaj w tylną część płytki, aby wspomóc przepływ. Napełnij każdą studzienkę po stronie somy 150 mikrolitrami pożywki neuropodstawowej B-27, tworząc na wierzchu pęcherzyk napięcia.Napełnij również obie studzienki po stronie aksonalnej po 100 mikrolitrami pożywki neuropodstawowej B-27. Po siedmiu do ośmiu dniach hodowli in vitro upewnij się, że aksony wyrosły przez mikrorowki i rozszerzyły się do przedziału aksonalnego. Umyj urządzenie, usuwając pożywkę neuropodstawową B-27 i dodając 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do obrazowania do górnych studzienek zarówno kanału aksonalnego, jak i somatycznego.Pozwól, aby medium przepłynęło do dolnych studzienek. Usuń pożywkę z dolnych studzienek i wszelkie pozostałe pożywki z górnych studzienek i powtórz ze świeżą pożywką, pozostawiając studzienki puste pod koniec płukania. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pięciokrotowego rozcieńczenia TMRE do studzienki somatycznej i aksonalnej.Pozwól medium przepływać przez obie komory, aż we wszystkich studzienkach będzie równa objętość. Napełnić pożywką zawierającą TMRE. Wybierz interesujący Cię obszar w przedziale somatycznym i podążaj za nim przez mikrorowki do przedziału aksonalnego.Upewnij się, że mikrorowki obrazowane w przedziałach somatycznych i aksonalnych są do siebie dopasowane. Po zmianie nazwy pliku uzyskaj obrazy czerwonej fluorescencji przy użyciu długości fali wzbudzenia 561 nanometrów i emisji 625 nanometrów. Upewnij się, że różnica objętości między komorą soma a komorą aksonalną jest sprawdzana pod kątem obecności pęcherzyka napięcia po stronie somatycznej.Następnie usuń pożywkę obrazującą z obu studzienek po stronie aksonalnej, z wyjątkiem pożywki wewnątrz kanału. Aby wywołać depolaryzację mitochondriów, dodaj 160 mikrolitrów 20 mikromolowej antymycyny A rozcieńczonej w pożywce do obrazowania do górnej studzienki aksonalnej. Pozwól mu przepłynąć przez kanał, aż w obu studzienkach aksonalnych pojawi się równa objętość.Powtórz obrazowanie, upewniając się, że obrazowane są te same pozycje, co podczas akwizycji linii bazowej, identyfikując mikrorowki. Korzystając z tego protokołu, pierwotne neurony hipokampa hodowano w urządzeniach mikroprzepływowych, a następnie barwiono mitochondria barwnikiem wrażliwym na błonę, TMRE. Jednorodne zabarwienie mitochondriów zaobserwowano po obu stronach mikrorowków, ale nie w środku.Po dodaniu antymycyny A do strony aksonalnej, mitochondria somalne zachowały sygnał TMRE, podczas gdy fluorescencja została utracona z mitochondriów aksonalnych Upewnij się, że żadna wilgoć nie pozostała w studni lub na urządzeniu przed montażem urządzenia. W przeciwnym razie komory nie zostaną uszczelnione. Za pomocą tej metody możemy badać skutki utraty funkcji mitochondriów w aksonie i funkcji lokalnych, a także jej wpływ na sygnalizację wsteczną i globalne przeżycie komórek.Przez długi czas uważano, że biogeneza mitochondriów zachodzi wyłącznie w ciele komórki. Metoda ta pozwoliła nam ujawnić, że uszkodzenie mitochondriów aksonalnych wymagało lokalnej translacji krótkiego białka PINK1.

microfluidics-assisted-selective-depolarization-of-axonal-mitochondria

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje metodę śledzenia transportu aksonalnego w neuronach ruchowych za pomocą systemu komór mikroprzepływowych. Polega na hodowli tkanek embrionalnych rdzenia kręgowego myszy w studzienkach pokrytych polimerem z pożywką w celu wywołania wzrostu aksonów. Ruch organelli barwionych barwnikiem fluorescencyjnym w obrazowaniu na żywo potwierdza dwukierunkowy transport aksonalny.

Śledzenie transportu aksonalnego organelli w neuronach ruchowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Opisana tutaj jest metoda wykrywania i ilościowego oznaczania białek zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez immunoznakowanie mitochondriów wyizolowanych z tkanek gryzoni i analizę za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta może być rozszerzona o ocenę funkcjonalnych aspektów subpopulacji mitochondrialnych.

Immunodetekcja białek błony zewnętrznej za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych mitochondriów

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Transport aksonalny jest kluczowym mechanizmem dla zdrowia neuronów ruchowych. W tym protokole przedstawiamy szczegółową metodę śledzenia transportu aksonalnego przedziałów kwasowych i mitochondriów w aksonach neuronów ruchowych za pomocą komór mikroprzepływowych.

Transport aksonalny organelli w kulturach neuronów ruchowych z wykorzystaniem systemu komór mikroprzepływowych

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

Sieć mitochondrialna jest niezwykle złożona, co czyni ją bardzo trudną do analizy. Nowatorskie narzędzie MATLAB analizuje na żywo mitochondria zobrazowane konfokalnie na zdjęciach poklatkowych, ale skutkuje dużą objętością wyjściową wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej. Aby rozwiązać ten problem, opracowano rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików.

Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego

Tutaj opisujemy pomiar szybkości transportu aksonów konstytutywnych stabilizatorów błon retikulum endoplazmatycznego (ER) związanych z mitochondriami (MAM) poprzez zwiększanie lub utrzymywanie neurotoksycznego generowania β-amyloidu (Aβ) z neuronów choroby Alzheimera (AD) w czasie rzeczywistym, aby służyć jako bezpośredni i ilościowy wskaźnik do pomiaru stabilizacji MAM i wspomagania rozwoju terapii AD.

Analiza ilościowa stabilizacji błony retikulum endoplazmatycznego powiązanej z mitochondriami (MAM) w neuronalnym modelu choroby Alzheimera (AD)

Protokół ten opisuje system mikroprzepływowy modelujący dynamikę metaboliczną neuronów po uszkodzeniu aksonalnym, umożliwiając obrazowanie, analizę multiomiczną i mechanistyczne badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej.

Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Przedstawiamy protokół selektywnego przepuszczania błony plazmatycznej, umożliwiając ukierunkowane dostarczanie substratów i inhibitorów do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w hodowanych komórkach, pokonując bariery transportowe błony plazmatycznej, które zazwyczaj utrudniają takie analizy. Stosując tę technikę, wykazaliśmy, jak funkcja OXPHOS jest modulowana przez agonistów muskarynowych i antagonistów.

Modulacja ligandu cholinergiczna sprzężenia fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma BE(2)-C z cyfrytoninami

Poznaj metodę selektywnej depolaryzacji mitochondriów aksonalnych przy użyciu mikrofluidyki. Technika ta umożliwia badanie dynamiki mitochondriów w neuronach hipokampalnych bez zakłócania ciała komórkowego.

Selektywna depolaryzacja mitochondriów aksonalnych wspomagana mikrofluidyką

Przeglądaj więcej filmów