Ocena i manipulacja aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej

Protokół ten zapewnia dokładne informacje przestrzenne i czasowe na temat neuroaktywności. Główną zaletą tej techniki jest możliwość manipulowania i oceny neuroaktywności z wysoką rozdzielczością przestrzenno-czasową. Może być przydatny do zilustrowania patogenów zaburzeń neuropsychiatrycznych, które prowadzą do nieprawidłowości w aktywności neuronalnej.

Metodę tę można zastosować do badania neuronów, a także zdrowia w innych narządach. Procedurę zademonstruje Zhongtian Guo, doktorant z naszego laboratorium. Dzień po implantacji płytki głowy należy podać 1,32 miligrama na kilogram deksametazonu fosforanu sodu dootrzewnowo na godzinę przed zabiegiem, aby uniknąć obrzęku mózgu.

Pod stereoskopem wykonaj okrężną kraniotomię o średnicy około dwóch milimetrów za pomocą wiertła dentystycznego. Aby zmniejszyć uszkodzenie mózgu, należy ostrożnie obsługiwać wiertło dentystyczne, wykonując stały lekki ruch i lekko naciskając w dół. Usuń fragmenty kości kilka razy za pomocą systemu ssącego.

Po usunięciu fragmentu kości użyj sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego lub roztworu ACSF, aby usunąć i zmyć wszelkie zanieczyszczenia pozostające na powierzchni mózgu. Powtórz tę procedurę czyszczenia kilka razy, aby stłumić reakcje zapalne. Za pomocą systemu iniekcji ciśnieniowej ustaw odpowiednie ciśnienie, aby wstrzyknąć 500 nanolitrów roztworu AAV przez szklaną kapilarnę o średnicy końcówki od 10 do 20 mikrometrów przez 10 minut.

Jeśli poziom roztworu AAV w szklanej kapilarze stopniowo spada, roztwór AAV jest podawany do mózgu. Pozostaw szklaną kapilę na miejscu na dodatkowe 10 minut, aby zapobiec cofaniu się. Powtórz to trzy razy, aby podać w sumie 1,5 mikrolitra roztworu AAV do mózgu.

Nałóż 2% niskotopliwą agarozę na powierzchnię mózgu S1 za pomocą mikropipety, a następnie umieść szklane okienko na kraniotomii z dwoma szkłami nakrywkowymi. Dociśnij szklankę nakrywkową do agarozy, gdy jest jeszcze płynna. Zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza w agarozie.

Uszczelnij krawędzie okna czaszki cementem z żywicy adhezyjnej. Aby skalibrować system stymulacji holograficznej, umieść powierzchnię czerwonego szkiełka fluorescencyjnego na płaszczyźnie próbki i ustaw mikroskop w trybie obrazowania na żywo ze słabym światłem wzbudzenia. Uruchom graficzny interfejs użytkownika kalibracji.

mfile, sprawdź panel parametrów i kliknij przycisk Zapisz. Kliknij przycisk Skanuj z w kroku pierwszym, aby automatycznie wygenerować trzy losowe punkty w 21 różnych płaszczyznach osiowych oddalone od siebie o dwa mikrometry od każdej płaszczyzny. Przesuń suwak i sprawdź obraz na żywo.

Znajdź idealną płaszczyznę, na której plamki wydają się najmniejsze i najjaśniejsze, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Spowoduje to automatyczne wygenerowanie przesuniętego sferycznego czoła fali dla hologramu cyfrowego. Kliknij przycisk Idź w okienku kroku drugiego, a następnie kliknij sześć miejsc w lewym kwadracie.

Sprawdź obraz na żywo. Jeśli istnieje sześć rozpoznawalnych punktów fluorescencyjnych, wpisz ich osie x i y w polach edycji i kliknij przycisk Zapisz. Spowoduje to automatyczne wygenerowanie współczynnika drobnej transformacji w celu skoordynowania kalibracji między stymulacją holograficzną a systemem obrazowania.

Następnie kliknij przycisk Skanuj w okienku kroku trzeciego. Wygeneruje 441 cyfrowych hologramów, aby wykonać skanowanie pojedynczego punktu w całym polu widzenia w 21 na 21 krokach. Sprawdzaj obrazy podczas zmieniania wzorców w polu listy.

Dostosuj moc lasera, aby uzyskać obrazy punktowe w zakresie dynamicznym urządzenia do obrazowania. Przełącz urządzenie do przetwarzania obrazu w tryb nagrywania i kliknij przycisk Odtwórz. Po zakończeniu odtwarzania kliknij przycisk Generuj mapę wagi w okienku kroku czwartego i wybierz obraz ułożony w stos.

Następnie zamknij okno graficznego interfejsu użytkownika kalibracji. Automatycznie wygeneruje mapę wagi, aby skompensować niezrównoważoną intensywność w każdym miejscu. Umieść mysz z wstrzykniętą krwią AAV z płytką na głowę pod mikroskopem i wykonaj obrazowanie dwufotonowe za pomocą mikroskopu holograficznego i lasera tytanowo-szafirowego dostrojonego do 920 nanometrów z obiektywem 25x.

Otwórz komercyjne oprogramowanie do obrazowania w trybie obrazowania na żywo. Dostosuj napięcie detektora obrazu i moc lasera obrazującego, aby zoptymalizować jasność neuronów wyrażających GCaMP8f. Uchwyć obrazy neuronów wyrażających to białko.

Aby oświetlić określone neurony za pomocą oświetlenia holograficznego, uruchom plik skryptu SLMcontrol. m. Kliknij obraz referencyjny i wybierz uzyskany obraz.

Następnie kliknij przycisk Spot, aby wybrać określone piksele na neuronach na obrazie i naciśnij przycisk Enter na klawiaturze, aby go sfinalizować. Aby wykryć aktywność neuronalną z wysoką rozdzielczością czasową za pomocą przetwornika obrazu, ustaw czas ekspozycji, obszar obrazowania i binowanie, a następnie wykonaj akwizycję obrazu. Po umieszczeniu myszy pod mikroskopem i wykonaniu obrazowania dwufotonowego otwórz komercyjne oprogramowanie do obrazowania.

W trybie obrazowania na żywo dostosuj napięcie detektora obrazu i moc lasera obrazującego, aby zoptymalizować jasność neuronów wyrażających GCaMP-6m-p2A-ChRmine. Uchwyć obrazy neuronów wyrażających te białka, a następnie oświetl określone neurony zgodnie z procedurą pokazaną wcześniej. Aby zbadać funkcjonalną łączność w neuronach warstwy drugiej i trzeciej, użyj przestrzennego modulatora światła do wygenerowania holograficznych wzorców stymulacji optogenetycznej i połącz je z dwufotonowym obrazowaniem wapnia.

Ustaw intensywność lasera obrazującego na 920 nanometrów przy 10 do 20 miliwatach, a pole widzenia na 256 mikrometrów na 256 mikrometrów mierzonych na głębokości od 100 do 150 mikrometrów od powierzchni kory mózgowej. Ustaw czas zatrzymania piksela na 1,5 mikrosekundy dla dwóch herców lub 100 nanosekund dla 30 herców. Użyj zarówno dwóch herców, jak i 30 Hz jako częstotliwości odświeżania obrazu, aby sprawdzić, czy pojedynczy bodziec holograficzny spowodował odpowiedź wapniową w neuronach.

Ustaw intensywność lasera do stymulacji holograficznej, który stymuluje pojedynczy neuron, na 10 miliwatów, co jest wystarczające do wywołania aktywności neuronalnej. Jednocześnie zobrazuj odpowiedź wapnia i żelaza na 920 nanometrach z 10 bodźcami holograficznymi w odstępach 1040 nanometrów i ośmiu sekund przez czas trwania 50 milisekund po okresie wyjściowym wynoszącym 10 sekund. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej.

Reprezentatywny obraz i ślady neuronów wyrażających GCaMP8f w obrazowaniu 100 Hz ze stymulacją holograficzną i czujnikiem obrazu przedstawiono tutaj. Ten wykres przedstawia reakcję neuronalną na stymulację holograficzną przy każdej mocy lasera. Przedstawiono tutaj reprezentatywne ślady wapnia 2+ podczas holograficznej stymulacji 10 różnych neuronów przy dwóch hercach i 30 hercach obrazowania.

Ten sam kolor oznacza ten sam neuron. Przedstawiono tutaj schemat ideowy oceniający funkcjonalne połączenia między neuronami. Kiedy pomarańczowy neuron jest stymulowany, czerwone neurony reagują w tym samym czasie, co wskazuje, że istnieje funkcjonalna łączność między tymi neuronami.

Pokazano tutaj typowy obraz pierwotnych neuronów kory somatosensorycznej wyrażających GCaMP6m w typie dzikim. Te obrazy graficzne reprezentują typowe ślady wapnia 2 + podczas stymulacji holograficznej przy dwóch hercach i 30 częstotliwościach obrazowania. Neuroreaktywność na stymulację holograficzną można wykryć zarówno przy dwóch hercach, jak i 30 hercach prędkości obrazowania.

Te kroki są ważne, aby zmniejszyć ruch mózgu, a po drugie, uzyskać stabilne wyniki. Wierzymy, że ten mikroskop może indukować zachowanie neuronów zapisujących o określonych wzorcach. Dzięki tej technice jesteśmy teraz w stanie ocenić i manipulować aktywnością poszczególnych neuronów oraz szczegółowo scharakteryzować neuropsychiatrię.