Name: Ocena i manipulacja aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj metodę dwufotonowej mikroskopii holograficznej do oceny i manipulacji aktywnością neuronalną w modelach mysich. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów chorób neuropsychiatrycznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (19H04753, 19H05219, and 25110732 to H. W.), Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (A) (20H05899 do H. W., 20H05886 do O. M. i 21H05587 do D. K.), Fostering Joint International Research (B) (20KK0170 do H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (18H02598 do H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (A) (21H04663 do O. M.), Grant-in-Aid dla naukowców na wczesnym etapie kariery (20K15193 do X. Q.), JST CREST Grant Number JPMJCR1755, Japonia oraz JST A-STEP Grant Number JPMJTR204C.

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Medycznej Uniwersytetu Nagoya (numer zatwierdzenia: M220295-003).
1. Implantacja płyty czołowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)
<ol>
	<li>Podawać środek znieczulający (mieszaninę 74 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny) dootrzewnowo w celu znieczulenia myszy. Często sprawdzaj stan znieczulenia myszy, oceniając odruchy pedałowania.</li>
	<li>Po znieczuleniu umieść mysz w instrumencie stereotaktycznym. Nałożyć maść do oczu (patrz Tabela materiałów), aby zapobiec wysychaniu rogówki po wszczepieniu płytki głowy.</li>
	<li>Ogolić obszar operacyjny i zdezynfekować skórę trzema naprzemiennymi rundami peelingów powidonowo-jodowych lub chlorheksydynowych, a następnie chusteczkami nasączonymi 70% alkoholem. Ostrożnie odsłoń czaszkę i wyczyść ją bawełnianymi wacikami. 
	UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne powinny być wysterylizowane, a wszystkie zabiegi powinny być wykonywane odpowiednio. Wszelkie pozostałe zanieczyszczenia (np. włosy lub zaschnięta krew) powodują reakcje zapalne. Dlatego wszelkie zanieczyszczenia należy usunąć pod stereoskopem za pomocą bawełnianych wacików zwilżonych sterylną wodą lub 70% alkoholem.</li>
	<li>Użyj współrzędnych stereotaktycznych - przednich i tylnych = 0,5 mm, przyśrodkowych i bocznych = 1,5 mm od bregmy - aby znaleźć środek kraniotomii i oznaczyć go markerem.</li>
	<li>Umieść wykonaną na zamówienie płytę na głowę na środku czaszki. Następnie nałóż cement dentystyczny (patrz Tabela materiałów), aby mocno przymocować go do czaszki. Wywieraj lekki nacisk, aż płyta głowy mocno zetknie się z przodem i tyłem czaszki. 
	UWAGA: Ten krok zajmuje około 20 minut i ma kluczowe znaczenie dla redukcji artefaktów ruchowych w mózgu podczas obrazowania dwufotonowego. Wymiary płyty czołowej wynoszą 20 mm × 40 mm × 1 mm z otworem w kształcie płyty głównej z jedną krawędzią o długości 15 mm, dwoma sąsiednimi bokami o długości 3 mm i pozostałymi dwoma bokami o długości 10 mm.</li>
	<li>Wymieszaj ze sobą cement z żywicy adhezyjnej na bazie akrylu w następujący sposób: pół łyżki proszku, trzy krople płynu i jedną kroplę katalizatora (patrz Tabela materiałów). Aby zapobiec wysuszeniu, nałóż ten mieszany cement z żywicy adhezyjnej na nienaruszoną powierzchnię czaszki myszy z płytą głowy.</li>
	<li>Umieść mysz w ciepłej klatce, aż wyzdrowieje ze znieczulenia. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.</li>
</ol>
2. Chirurgia i wstrzyknięcie wirusa adenowirusowego (AAV) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Wykonaj kraniotomię lub wstrzyknięcie wirusa bez usuwania cementu z żywicy adhezyjnej z czaszki 1 dzień po implantacji płytki głowy. 
	UWAGA: Podczas tego zabiegu należy podać znieczulenie (mieszaninę 74 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny) dootrzewnowo myszy.</li>
	<li>Aby uniknąć obrzęku mózgu, należy podawać deksametazon fosforanu sodu (1,32 mg/kg) dootrzewnowo na 1 godzinę przed zabiegiem.</li>
	<li>Znieczulij mysz za pomocą płytki czołowej 1% znieczuleniem izofluranem za pomocą waporyzatora (system dostarczania znieczulenia), jednocześnie utrzymując temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Pod stereoskopem wykonaj okrężną kraniotomię o średnicy około 2 mm za pomocą wiertła dentystycznego. Aby zmniejszyć uszkodzenie mózgu, należy ostrożnie obsługiwać wiertło dentystyczne, wykonując stały lekki ruch i lekko naciskając w dół.</li>
	<li>Usuń fragmenty kości kilka razy za pomocą systemu ssącego. Po usunięciu fragmentów kości użyj roztworu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), aby usunąć i zmyć wszelkie zanieczyszczenia pozostałe na powierzchni mózgu. Powtórz tę procedurę czyszczenia kilka razy, aby stłumić reakcje zapalne. 
	UWAGA: Roztwór ACSF (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 2,0 mM CaCl2 i 1,0 mM MgCl2) przechowywano w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc po rozpuszczeniu i przefiltrowaniu odczynnika (wielkość porów = 0,22 μm).</li>
	<li>Za pomocą systemu wtrysku ciśnieniowego (patrz Tabela materiałów) ustaw odpowiednie ciśnienie (około 10 PSI w impulsach o czasie trwania 4 ms), aby wstrzyknąć 500 nL roztworu AAV przez szklaną kapilarnę o średnicy końcówki 10-20 μm (przygotowanej za pomocą ściągacza do mikropipet) przez 10 minut.</li>
	<li>Określ, czy roztwór AAV jest podawany do mózgu, sprawdzając, czy poziom roztworu AAV w szklanej kapilarze stopniowo spada.</li>
	<li>Pozostaw szklaną kapilarnę na miejscu na dodatkowe 10 minut, aby zapobiec przepływowi wstecznemu. Powtórz trzy razy, aby podać w sumie 1,5 μl roztworu AAV do mózgu.</li>
	<li>Aby ocenić i manipulować aktywnością neuronalną w komórkach piramidalnych warstwy 2/3 (L2/3), wstrzyknąć roztwór AAV (do obrazowania Ca2+: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE przy 1,28 ×10 14 genomach wektorowych/ml, rozcieńczony 1:1 w soli fizjologicznej; do obrazowania Ca2+ z optogenetyką: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE w 1,73 ×10 14 genomy wektorowe / ml, rozcieńczone 1:1 w soli fizjologicznej) do tylnej części łapy pierwszorzędowej kory somatosensorycznej myszy typu dzikiego (S1, wyśrodkowany na 0,5 mm z tyłu i 1,5 mm z boku od bregmy, głębokość 150 μm od powierzchni). 
	UWAGA: Roztwór AAV należy wstrzykiwać 2-3 tygodnie i 1-2 tygodnie przed obrazowaniem odpowiednio w celu uzyskania ekspresji jGCaMP8f i GCaMP6m-P2A-ChRmine.</li>
	<li>Po nałożeniu 2% (w/v) niskotopliwej agarozy na powierzchnię mózgu S1 za pomocą mikropipety, umieść szklane okienko nad kraniotomią z dwoma szkłami nakrywkowymi. Przymocuj dwie szklanki nakrywkowe (o małej średnicy 2,0 mm i dużej średnicy 4,5 mm; patrz Tabela materiałów) za pomocą kleju utwardzanego promieniami UV.</li>
	<li>Dociśnij szkło nakrywkowe do agarozy, gdy jest jeszcze płynne; zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza w agarozie. Uszczelnij krawędzie okna czaszki dentystycznym i adhezyjnym cementem żywiczym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego i umieść ją z powrotem w klatce. Umieść mysz w ciepłej klatce i nie wracaj do klatki z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje ze znieczulenia. Ostrożnie utrzymuj sterylne warunki podczas operacji przeżycia.</li>
	<li>Przez pierwsze 72 godziny po zabiegu sprawdzaj stan zdrowia myszy, obserwując ogólne zachowanie. Jeśli występują jakiekolwiek nieprawidłowości w ogólnym zachowaniu, należy wstrzyknąć podskórnie środki przeciwzapalne i przeciwbólowe.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do holograficznego systemu stymulacji lub oświetlenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Skalibruj system stymulacji holograficznej, umieszczając powierzchnię czerwonego szkiełka fluorescencyjnego (odlewane podłoże akrylowe) na płaszczyźnie próbki. Przełącz mikroskop w tryb obrazowania na żywo ze słabym światłem wzbudzenia i uruchom plik calibration_GUI.m. Sprawdź panel parametrów i kliknij przycisk Zapisz.</li>
	<li>Kliknij przycisk Skanowanie z w okienku kroku 1. Automatycznie wygeneruje trzy losowe punkty we wszystkich 21 płaszczyznach osiowych, w odległości 2 μm od każdej płaszczyzny.</li>
	<li>Przesuń suwak i sprawdź obraz na żywo. Znajdź idealną płaszczyznę, na której plamki wydają się najmniejsze i najjaśniejsze, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Spowoduje to automatyczne wygenerowanie przesuniętego sferycznego czoła fali dla hologramu cyfrowego. 
	UWAGA: Jeśli nie uda Ci się znaleźć najjaśniejszych punktów fluorescencji, zmień minimalne i maksymalne wartości zakresu skanowania i spróbuj ponownie.</li>
	<li>Kliknij przycisk Przejdź w okienku kroku 2, a następnie kliknij sześć miejsc w lewym kwadracie. Sprawdź obraz na żywo. Jeśli istnieje sześć rozpoznawalnych plamek fluorescencyjnych, wpisz ich osie x i y w polach edycji i kliknij przycisk Zapisz. Spowoduje to automatyczne wygenerowanie współczynników transformacji afinicznej w celu skoordynowania kalibracji między stymulacją holograficzną a systemem obrazowania. 
	UWAGA: Numer pary osi i numer klikniętego punktu muszą być zgodne w kolejności. Jeśli nie masz pewności lub jeśli na obrazie nie ma plam, spróbuj ponownie i wygeneruj unikalny wzór plamki lub wybierz mniejszy zakres wokół środka pola widzenia (FOV).</li>
	<li>Kliknij przycisk Skanuj w okienku kroku 3. Wygeneruje 441 cyfrowych hologramów, aby wykonać skanowanie pojedynczego punktu w polu widzenia w 21 × 21 krokach.
	<ol>
		<li>Najpierw sprawdź obrazy podczas zmiany wzorów w polu listy. Następnie dostosuj moc lasera, aby uzyskać obrazy punktowe w zakresie dynamicznym urządzenia do obrazowania (na przykład, aby uniknąć nadmiernego nasycenia obrazów).</li>
		<li>Następnie dostosuj czas interwału w polu edycji; czas interwału powinien być więcej niż dwa razy większy niż czas interwału nagrywania. Na koniec przełącz urządzenie do przetwarzania obrazu w tryb nagrywania i kliknij przycisk Odtwórz. Jeśli odtwarzanie zostanie zakończone, w oknie poleceń pojawią się napisy "wyświetl OK". Zatrzymaj nagrywanie i ułóż nagrane obrazy sekwencyjne w stos przy użyciu metody maksymalnej intensywności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij przycisk Generuj WM w okienku kroku 4 i wybierz obraz ułożony w stos z góry. Następnie zamknij okno calibration_GUI. Automatycznie wygeneruje mapę wagi, aby skompensować niezrównoważoną intensywność w każdym miejscu. 
	UWAGA: Bardziej szczegółowy opis można znaleźć w 2; kod Matlaba można pobrać stąd (https://github.com/ZenKG/SLM_control).</li>
</ol>
4. Obrazowanie Ca2+ przy użyciu czujnika obrazu z oświetleniem holograficznym (Rysunek 4)
<ol>
	<li>Umieść mysz z wstrzykniętą krwią przeciwdrobnoustrojową z płytką na głowę pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). 
	UWAGA: Podczas tej procedury mysz jest skrępowana w stanie czuwania, ale jest w stanie uciec przed nieprzyjemnymi bodźcami.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie dwufotonowe (tryb skanowania punktowego) za pomocą mikroskopu holograficznego i lasera Ti:sapphire z blokadą trybu dostrojonego do 920 nm z obiektywem 25x (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Włącz komercyjne oprogramowanie do obrazowania (patrz Spis materiałów). W trybie obrazowania na żywo dostosuj napięcie detektora obrazu (patrz Tabela materiałów) i moc lasera obrazującego, aby zoptymalizować jasność neuronów wyrażających jGCaMP8f. Uchwyć obrazy neuronów wyrażających to białko. 
	UWAGA: Natężenie lasera obrazującego (920 nm) wynosi 20-30 mW. Pole widzenia wynosiło 512 μm × 512 μm na głębokości 100-150 μm od powierzchni kory mózgowej.</li>
	<li>Aby oświetlić określone neurony wyrażające jGCaMP8f za pomocą oświetlenia holograficznego, uruchom plik skryptu SLMcontrol.m. Kliknij obraz referencyjny i wybierz obraz uzyskany powyżej. Następnie kliknij przycisk Spot, aby wybrać określone piksele na neuronach na obrazie, klikając ciągłym myszką (Rysunek 4A). Jeśli wybór jest zakończony, naciśnij przycisk Enter na klawiaturze, aby go sfinalizować. 
	UWAGA: Hologram cyfrowy jest automatycznie obliczany i wyświetlany na SLM. Do tego wzorca można również powrócić, klikając pole listy. Rozdzielczość przestrzenna pojedynczej plamki generowanej przez SLM wynosiła około 1,2 μm wzdłuż kierunku poprzecznego i ~8,3 μm wzdłuż osi optycznej. Użyliśmy soczewki obiektywowej o wysokiej aperturze numerycznej (1,1), aby uzyskać bardziej zlokalizowaną stymulację holograficzną. Tabela 1 podsumowuje poprzednie raporty i ten system w odniesieniu do rozdzielczości przestrzennej stymulacji holograficznej.</li>
	<li>Aby wykryć aktywność neuronalną z wysoką rozdzielczością czasową za pomocą czujnika obrazu (patrz tabela materiałów), ustaw czas ekspozycji, obszar obrazowania i binning (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B) przed wykonaniem akwizycji obrazu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C). 
	UWAGA: Intensywność holograficznego lasera oświetleniowego (920 nm), który w sposób ciągły stymuluje jeden neuron, wynosi 2 mW, co jest wystarczające do wykrycia aktywności neuronalnej. Na przykład, aby osiągnąć częstotliwość odświeżania 100 Hz dla obrazowania, czas ekspozycji wynosi 9 ms, obszar obrazowania wynosi 400 μm × 400 μm, a binning wynosi 4.</li>
	<li>Po eksperymencie przywróć mysz do jej domowej klatki.</li>
</ol>
5. Obrazowanie dwufotonowe (tryb skanowania punktowego) z optogenetyką przy użyciu mikroskopu holograficznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Powtórz kroki 4.1 i 4.2.</li>
	<li>Włącz komercyjne oprogramowanie do obrazowania (patrz Spis materiałów). W trybie obrazowania na żywo dostosuj napięcie detektora obrazu (patrz tabela materiałów) i moc lasera obrazującego, aby zoptymalizować jasność neuronów wyrażających GCaMP6m-P2A-ChRmine. Uchwyć obrazy neuronów wyrażających te białka (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Powtórz krok 4.4.</li>
	<li>Aby zbadać funkcjonalną łączność w neuronach L2/3, użyj SLM do generowania holograficznych wzorców stymulacji optogenetycznej (ChRmine; 1,040 nm) i połącz je z obrazowaniem dwufotonowym Ca2+ (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 pikseli, 2 Hz lub 30 Hz, 2-krotny zoom cyfrowy, tryb skanowania punktowego; <silna klasa="xfig">Rysunek 4D-H).
	<ol>
		<li>Dla tego protokołu ustaw intensywność lasera obrazującego na 920 nm, przy 10-20 mW, a FOV na 256 μm × 256 μm mierzone na głębokości 100-150 μm od powierzchni kory mózgowej. Ustaw czas zatrzymania piksela na 1,5 μs dla 2 Hz lub 100 ns dla 30 Hz.</li>
		<li>Aby sprawdzić, czy pojedynczy bodziec holograficzny spowodował odpowiedź wapniową w neuronach, użyj zarówno 2 Hz, jak i 30 Hz jako częstotliwości obrazowania. Ustaw intensywność lasera do stymulacji holograficznej (1,040 nm), który stymuluje pojedynczy neuron o mocy 10 mW, co jest wystarczające do wywołania aktywności neuronalnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D). 
		UWAGA: Rozdzielczość przestrzenna pojedynczej plamki generowanej przez SLM wynosi około 1,2 μm wzdłuż kierunku poprzecznego i ~8,3 μm wzdłuż osi optycznej. Zakres dostępnej objętości w kierunku poprzecznym wynosi około 500 μm × 500 μm i 100 μm w kierunku osiowym. Ponadto, za pomocą obrazowania Ca2+ przy częstotliwości odświeżania 2 Hz lub 30 Hz, potwierdziliśmy, że nie tylko jeden neuron, ale wiele neuronów może być jednocześnie stymulowanych holograficznie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą następującego protokołu: jednocześnie zobrazuj odpowiedź Ca2+ przy 920 nm z 10 bodźcami holograficznymi przy 1 040 nm w odstępach 8 s (0,125 Hz) przez czas trwania 50 ms po okresie bazowym wynoszącym 10 s. Po zakończeniu wszystkich eksperymentów myszy są poddawane eutanazji. 
	UWAGA: Stan nieustalony Ca2+, jeśli był obecny, był wywoływany przez stymulację holograficzną, a ich szczyt pojawiał się w ciągu 1 sekundy po stymulacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4F-H).</li>
</ol>
6. Analiza obrazu i ocena funkcjonalnej łączności (Rysunek 4)
<ol>
	<li>Otwórz obrazy RAW zapisane w krokach 4.5 lub 5.5 za pomocą ImageJ. Aby skompensować przemieszczenie w płaszczyźnie ogniskowej, należy użyć wtyczki ImageJ TurboReg. 
	UWAGA: Jeśli korekcja za pomocą TurboReg nie jest wystarczająca, zaleca się użycie CaImAn (http://github. com/simonsfoundation) w celu skorygowania przemieszczenia płaszczyzny ogniskowej.</li>
	<li>Aby ocenić aktywność neuronalną, określ obszary zainteresowania (ROI) w L2/3 za pomocą zautomatyzowanego algorytmu (CaImAn). Wykrywaj i analizuj stany nieustalone Ca2+ po zdefiniowaniu podstawowej intensywności fluorescencji (F0) i wartości progowej. 
	UWAGA: F0 to 35. percentyl wartość intensywności fluorescencji uzyskana w okresie obrazowania podstawowego. Stan nieustalony Ca2+ jest oznaczony przez ΔF/F0 (ΔF = F-F0), gdzie F jest chwilowym sygnałem fluorescencji. Jeśli wartość ΔF jest większa niż 2 S.D. od F0, oceniamy znaczący stan nieustalony Ca2+.</li>
	<li>Aby zdefiniować łączność funkcjonalną w neuronach L2/3, stymuluj neurony docelowe i mierz odpowiedzi GCaMP6m w stymulowanych i otaczających neuronach, odpowiednio (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4F-H).</li>
</ol>

<ol><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nature Neuroscience. 17 (7), 987-994 (2014).</li>
<li>Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+reproducible+spatiotemporal+activity+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning.</a> Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).</li>
<li>Kato, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+learning+requires+myelination+to+reduce+asynchrony+and+spontaneity+in+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity in neural activity.</a> Glia. 68 (1), 193-210 (2020).</li>
<li>Busche, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+impairs+neural+circuits%2C+dominating+amyloid-%CE%B2+effects%2C+in+Alzheimer+models+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau impairs neural circuits, dominating amyloid-β effects, in Alzheimer models in vivo.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 57-64 (2019).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Quan, X., Kato, D., Daria, V., Matoba, O., Wake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holographic+microscope+and+its+biological+application%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Holographic microscope and its biological application.</a> Neuroscience Research. 179, 57-64 (2022).</li>
<li>Adesnik, H., Abdeladim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+neural+codes+with+two-photon+holographic+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 24 (10), 1356-1366 (2021).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).</li>
<li>Carrillo-Reid, L., Han, S., Yang, W., Akrouh, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+visually+guided+behavior+by+holographic+recalling+of+cortical+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles.</a> Cell. 178 (2), 447-457 (2019).</li>
<li>Marshel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+layer-specific+critical+dynamics+triggering+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception.</a> Science. 365 (6453), (2019).</li>
<li>Gill, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+holographic+manipulation+of+olfactory+circuits+reveals+coding+features+determining+perceptual+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Precise holographic manipulation of olfactory circuits reveals coding features determining perceptual detection.</a> Neuron. 108 (2), 382-393 (2020).</li>
<li>Robinson, N. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+activation+of+hippocampal+place+cells+drives+memory-guided+spatial+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted activation of hippocampal place cells drives memory-guided spatial behavior.</a> Cell. 183 (6), 1586-1599 (2020).</li>
<li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li>
<li>Mardinly, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+multimodal+optical+control+of+neural+ensemble+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Precise multimodal optical control of neural ensemble activity.</a> Nature Neuroscience. 21 (6), 881-893 (2018).</li>
<li>Yang, W., Carrillo-Reid, L., Bando, Y., Peterka, D. S., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+two-photon+imaging+and+two-photon+optogenetics+of+cortical+circuits+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions.</a> Elife. 7, 32671(2018).</li>
<li>Forli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+bidirectional+control+and+imaging+of+neuronal+excitability+with+high+spatial+resolution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Two-photon bidirectional control and imaging of neuronal excitability with high spatial resolution in vivo.</a> Cell Reports. 22 (11), 3087-3098 (2018).</li>
<li>Pégard, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+scanless+holographic+optogenetics+with+temporal+focusing+%283D-SHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional scanless holographic optogenetics with temporal focusing (3D-SHOT).</a> Nature Communications. 8 (1), 1228(2017).</li>
<li>Dal Maschio, M., Donovan, J. C., Helmbrecht, T. O., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+neurons+to+network+function+and+behavior+by+two-photon+holographic+optogenetics+and+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking neurons to network function and behavior by two-photon holographic optogenetics and volumetric imaging.</a> Neuron. 94 (4), 774-789 (2017).</li>
<li>Russell, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+interrogation+of+neural+circuits+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice.</a> Nature Protocols. 17 (7), 1579-1620 (2022).</li>
<li>Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetics.</a> Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).</li>
<li>Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spatiotemporal+focusing+of+holographic+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns.</a> Nature Communications. 7, 11928(2016).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+induces+stable%2C+active+microcircuits+in+the+somatosensory+cortex+that+provide+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex that provide a therapeutic target.</a> Science Advances. 7 (12), 8261(2021).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition%2C+excitation+and+bistable+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).</li>
<li>Gonçalves, J. T., Anstey, J. E., Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+level+defects+in+the+developing+neocortex+of+Fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).</li>
<li>Akiyoshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+enhance+synapse+activity+to+promote+local+network+synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization.</a> eNeuro. 5 (5), (2018).</li>
<li>Haruwaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+microglia+effects+on+blood+brain+barrier+permeability+induced+by+systemic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced by systemic inflammation.</a> Nature Communications. 10 (1), 5816(2019).</li>
<li>Kishi, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+channel+conduction+in+the+pump-like+channelrhodopsin+ChRmine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine.</a> Cell. 185 (4), 672-689 (2022).</li>
<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%3A+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li>
<li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+functional+microcircuits+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The emergence of functional microcircuits in visual cortex.</a> Nature. 496 (7443), 96-100 (2013).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).</li>
<li>Villette, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ultrafast+two-photon+imaging+of+a+high-gain+voltage+indicator+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ultrafast two-photon imaging of a high-gain voltage indicator in awake behaving mice.</a> Cell. 179 (7), 1590-1608 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Aby zrozumieć funkcjonowanie mózgu, konieczna jest dokładna ocena obwodów neuronalnych leżących u podstaw funkcji mózgu poprzez wyodrębnienie dynamiki aktywności neuronalnej. Ponadto konieczne jest określenie, w jaki sposób te obwody neuronalne są zmieniane, aby wyjaśnić patogenezę zaburzeń neuropsychiatrycznych. Rzeczywiście, wiadomo, że aktywność neuronalna jest podwyższona w mysich modelach choroby Alzheimera4 i zespołu łamliwego chromosomu X26 oraz u myszy z upośledzoną funkcją istoty białej3. Co więcej, w mysim modelu bólu zapalnego zwiększona synchronizacja aktywności neuronalnej i funkcjonalnej łączności między neuronami jest związana z objawami24. Dwufotonowa mikroskopia holograficzna pozwala nam jednocześnie obserwować aktywność poszczególnych neuronów i funkcjonalne połączenia między neuronami, co jest niezbędne do zrozumienia obwodów neuronalnych. Użyliśmy soczewki obiektywowej o powiększeniu 25x z aperturą numeryczną = 1,1 o długości fali 1 040 nm. Teoretyczna funkcja rozpiętości punktowej to rozkład Gaussa o pełnej szerokości w połowie maksimum 0,5 μm w bok i 1,7 μm osiowo. Jednak rzeczywista apertura numeryczna jest mniejsza niż 1,1, a zmierzona wielkość plamki na koraliku fluorescencyjnym wynosi 1,2 μm bocznie i 8,3 μm osiowo. Biorąc pod uwagę, że średnica neuronu wynosi około 15 μm, a błąd kalibracji mieści się w granicach 3 μm, celowanie jest ogólnie dobre. Jednak na komórki w kierunku osiowym może mieć wpływ dłuższy rozmiar plamki6. Tutaj opisaliśmy wstrzykiwanie wirusa, operację, kalibrację stymulacji holograficznej lub systemów oświetlenia oraz protokoły obrazowania do oceny i manipulowania aktywnością neuronalną u żywych myszy za pomocą naszego systemu mikroskopowego.
Wykonanie wszystkich procedur eksperymentalnych zajmuje 2-4 tygodnie, od implantacji płytki głównej i wstrzyknięcia wirusa po pozyskiwanie danych do obrazowania Ca2+ in vivo za pomocą mikroskopii holograficznej. Proces ten jest złożony i pracochłonny, a ostateczny sukces eksperymentu zależy od wielu czynników, w tym od stanu okna czaszkowego, na które wpływa stan zapalny pooperacyjny, właściwego doboru wskaźnika Ca2+ i opsyny oraz od tego, czy artefakty ruchowe w uzyskanych obrazach można skorygować. W szczególności dla pomyślnego wyniku ważne są dwa kroki. Pierwsza dotyczy mocowania płytki głowy i chirurgii; Bardzo ważne jest, aby płyta głowicy była mocno przymocowana do głowy myszy za pomocą cementu dentystycznego. Ponadto ważne jest, aby podczas operacji wielokrotnie czyścić fragmenty kości i zakrzepłą krew za pomocą zimnego ACSF. Ponieważ przestrzeganie tej procedury zmniejsza stan zapalny, z powodzeniem zaobserwowaliśmy dynamikę mikrogleju, komórek odpowiedzialnych za układ odpornościowy mózgu, bez aktywacji ich procesów i kolców lub mikrostruktur neuronów27,28. Drugą kwestią jest ocena i manipulacja aktywnością neuronalną. Wybraliśmy AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 do jednoczesnej ekspresji wskaźnika Ca2 + i opsyny w jednym neuronie. Dzieje się tak, ponieważ trudno jest skutecznie zainfekować jeden neuron różnymi typami AAV. Innym powodem tego wyboru było to, że ChRmine może skutecznie aktywować aktywność neuronalną przy 1040 nm za pomocą lasera dwufotonowego12. Ostatnio doniesiono, że ChRmine, mutując swoją strukturę w oparciu o informacje strukturalne uzyskane za pomocą mikroskopii krioelektronowej, poprawia swoją funkcję29, co jest uważane za przydatne do analizy funkcji docelowych w dziedzinie neuronauki. W świetle tych problemów konieczne jest podzielenie się skutecznymi metodami oceny i manipulowania neuronami podczas odczytywania aktywności neuronalnej i zapisywania informacji za pomocą mikroskopii holograficznej.
Ostatnie postępy w obrazowaniu i optogenetyce ujawniły szczegółową aktywność neuronalną zaangażowaną w funkcje mózgu, takie jak uczenie się i pamięć, i możliwe jest sztuczne manipulowanie tą aktywnością neuronalną w celu wyrażenia funkcji mózgu30. Jednak konwencjonalne metody manipulowania aktywnością neuronalną są wysoce inwazyjne ze względu na wprowadzenie światłowodów do mózgu i dlatego, że grupa komórek wyrażających opsynę jest jednocześnie stymulowana, co uniemożliwia manipulowanie aktywnością neuronalną z precyzją czasową i przestrzenną. Nasza metoda może manipulować aktywnością neuronalną poprzez stymulację tylko określonych neuronów w mózgu, umożliwiając w ten sposób manipulowanie aktywnością neuronalną z określonymi wzorcami stymulacji i wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Ponadto ważne jest, aby zauważyć, że funkcjonalna łączność między neuronami może być oceniona tylko w niewielkiej liczbie neuronów za pomocą eksperymentów z wycinkami mózgu31; Jednak technika ta pozwala na jednoczesną ocenę wielu neuronów u żywych zwierząt.
Jednym z głównych ograniczeń obecnych mikroskopów holograficznych jest konieczność naprawienia głowicy myszy, co ogranicza zachowanie myszy. Niedawno opracowano zminiaturyzowany mikroskop dwufotonowy32, a wraz z dalszą miniaturyzacją urządzenia możliwe może być obrazowanie in vivo Ca2+ ze stymulacją holograficzną u myszy poruszających się swobodnie. Ponadto potencjał tego mikroskopu można rozszerzyć poprzez poprawę rozdzielczości czasowej obrazowania i połączenie go z bardzo czułymi, wrażliwymi na napięcie białkami fluorescencyjnymi33.

Obrazowanie dwufotonowe Ca2+ jest użyteczną techniką do oceny aktywności neuronalnej. Może być używany do identyfikacji nie tylko aktywności neuronalnej wymaganej do zachowania i pamięci u normalnych zwierząt1,2, ale także nieprawidłowej aktywności neuronalnej, która występuje w mysich modelach zaburzeń neuropsychiatrycznych3,4. Technika ta została wykorzystana do wyjaśnienia neuronalnych podstaw funkcji mózgu. Jednakże, chociaż może dostarczać obrazy o wysokiej rozdzielczości i wysokiej jakości, jego rozdzielczość czasowa jest niższa niż w przypadku metody elektrofizjologicznej1,3.
Optogenetyka pomogła unowocześnić sposób, w jaki neuronaukowcy rozumieją funkcjonowanie mózgu5. Biorąc pod uwagę ograniczenia techniczne, w większości badań optogenetycznych wykorzystano schematy aktywacji o niskiej rozdzielczości przestrzennej, ograniczając w ten sposób rodzaje manipulacji aktywnością neuronalną, które można odpowiednio wykonać. Jednak manipulowanie aktywnością neuronalną w subtelniejszych skalach czasoprzestrzennych może być potencjalnie przydatne dla pełniejszego zrozumienia obliczeń neuronalnych i patogenezy zaburzeń neuropsychiatrycznych. Przestrzennie precyzyjna technologia holograficzna, która może kształtować femtosekundowe wiązki laserowe w bliskiej podczerwieni, obiecuje przezwyciężyć to wyzwanie i otwiera kilka nowych klas eksperymentalnych, które wcześniej były niemożliwe6,7. Technologia ta umożliwia neuronaukowcom odkrycie podstawowych aspektów i patologii sensorycznych, poznawczych i behawioralnych kodów neuronowych, które były poza zasięgiem.
Projekcja holograficzna polega na generowaniu pożądanych wzorów świetlnych w celu selektywnego dostępu do poszczególnych komórek i sieci funkcjonalnych. Eksperymenty in vivo wymagają optymalnej transmisji światła do komórek docelowych w żywym mózgu. Światło podczerwone wnika głębiej w żywą tkankę i może być wykorzystane do nieliniowego wzbudzenia dwufotonowego (2PE)8,9,10. W ten sposób dwufotonowa mikroskopia holograficzna, która łączy projekcję holograficzną i 2PE, może być używana do oceny i manipulowania aktywnością neuronalną w celu sondowania sieci komórkowych i funkcjonalnych in vivo. Niedawne biologiczne zastosowania dwufotonowej mikroskopii holograficznej wyjaśniły aktywność neuronalną i obwody wymagane do uczenia się w korze wzrokowej11,12, opuszka węchowa13 i hippocampus14.
Wiele laboratoriów na całym świecie zgłosiło ekscytujące wyniki i ulepszenia dzięki swoim systemom stymulacji holograficznej15,16,17,18,19,20,21,22,23. W opisanym tutaj systemie system stymulacji holograficznej może być zbudowany jako urządzenie dodatkowe do konwencjonalnego mikroskopu. Przestrzenny modulator światła tylko w fazie (SLM) jest kluczowym urządzeniem do modulowania płaskiego czoła fali do dowolnego kształtu, a efekt interferencji służy do kontrolowania intensywności i lokalizacji ognisk. <silna klasa="xfig">Rysunek 2 pokazuje stymulację holograficzną i obrazowanie ścieżek światła. Pierwsza ścieżka światła jest przeznaczona do obrazowania punktowego i składa się z głowicy skanującej i detektorów obrazu. Druga ścieżka światła służy do stymulacji holograficznej o długości fali 1040 nm i składa się z SLM1. Trzecia ścieżka światła służy do oświetlenia holograficznego o długości fali 920 nm i składa się z SLM2 i czujnika obrazu. Tryb obrazowania holograficznego może rejestrować intensywność z wielu obszarów zainteresowania poprzez oświetlenie wielu punktów w próbce. W ten sposób prędkość nagrywania można zwiększyć do kilkuset klatek na sekundę. Aby uzyskać obrazowanie punktowe lub obrazowanie z oświetleniem holograficznym, laser 920 nm został podzielony na dwie ścieżki za pomocą rozdzielacza wiązki o stałym stosunku 3:7. Wszystkie elementy optyczne zostały ustawione na płytki stykowej o wymiarach 600 mm × 600 mm. Modulowane światło wpadało przez port świetlny z boku mikroskopijnego ciała, podczas gdy światło obrazowania punktowego wpadało przez głowicę skanującą w górnej części mikroskopijnego ciała. Światła te zostały zintegrowane tuż nad soczewką obiektywu i tworzyły ogniska w płaszczyźnie próbki. Ponadto oprogramowanie wykonane na zamówienie sprawiło, że regularny przepływ pracy był prosty i spójny.
W tym artykule przedstawiono kompletny protokół użycia stymulacji holograficznej lub oświetlenia do pomiaru aktywności neuronalnej i oceny funkcjonalnej łączności między neuronami. W celach demonstracyjnych opisujemy tutaj operację mózgu ukierunkowaną na obszar kończyn tylnych pierwotnej kory somatosensorycznej (S1HL) mózgu myszy oraz metodę oceny i manipulowania aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej. Procedura eksperymentalna podzielona jest na cztery części. Najpierw płytka głowy została przymocowana do czaszki myszy za pomocą cementu dentystycznego. Po drugie, wektor wirusowy wyrażający jGCaMP8f lub GCaMP6m-P2A-ChRmine został stereotaktycznie wstrzyknięty do S1HL. Po trzecie, skalibrowano holograficzny system stymulacji lub oświetlenia. Po czwarte, po pooperacyjnym powrocie do zdrowia i ekspresji tych dwóch białek, przeprowadzono obrazowanie in vivo Ca2 + w celu oceny aktywności neuronalnej i funkcjonalnej łączności między neuronami za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej.

<table><tbody><tr><td>25x Obiektyw</td><td>Nikon</td><td>N25X-APO-MP</td><td>Obiektyw</td></tr><tr><td>A1MP</td><td>Nikon</td><td>A1MP</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>AnesII</td><td>Biomachinery</td><td>AnesII</td><td>System podawania znieczulenia</td></tr><tr><td>C2 plus</td><td>Nikon</td><td>C2 plus</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop DECADRON&nbsp; Fosforany&nbsp; Iniekcja</td><td>Aspen</td><td>21N024</td><td>Unikaj obrzęku mózgu</td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>Jota</td><td>C1. HP.005</td><td>Wiertarka dentystyczna</td></tr><tr><td>Elektryczny mikrowtryskiwacz</td><td>NARISHIGE</td><td>IM-31</td><td>System wtrysku ciśnieniowego</td></tr><tr><td>FEATHERS</td><td>FEARGER</td><td>FA-10</td><td>Golenie</td></tr><tr><td>G-CEM ONE ADHEZYJNY PODKŁAD WZMACNIAJĄCY KLEJ</td><td>GC</td><td></td> 2110271 <td>Żywica cementowa podkład do adhezji dentystycznej</td></tr><tr><td>G-CEM ONE neo</td><td>GC</td><td>43093</td><td>Cement żywiczny do adhezji dentystycznej</td></tr><tr><td>Kapilara szklana z Filament</td><td>NARISHIGE</td><td>GDC-1</td><td>Szklany</td></tr><tr><td>kapilarny detektor obrazu</td><td>Hamamatsu</td><td>H10770PA-40</td><td>GaAsP fotokatoda fotopowielacza</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Nikon</td><td>NISelements</td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>Roztwór do inhalacji izofluranu</td><td>Pfizer</td><td>229KAR</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>iXon EMCCD Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon Life 888</td><td>Obraz czujnik</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>daiitisannkyou</td><td>s9-018506</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>Leica-M60</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>Stereoskop</td></tr><tr><td>Linicon</td><td>Linicon</td><td>LV-125</td><td>Pompa próżniowa</td></tr><tr><td>z blokadą trybu Ti:szafirowy Chameleon Ultra II&nbsp;</td><td>Koherentny</td><td>Chameleon Discovery NX</td><td>Laser femtosekundowy</td></tr><tr><td>Mos-Cure</td><td>U-VIX</td><td>mini 365</td><td>Przenośne źródło światła LED UV</td></tr><tr><td>PEN Bright</td><td>SHOFU INC.</td><td>PEN Bright</td><td>Dentystyczne urządzenie do utwardzania światłem</td></tr><tr><td>Ściągacz</td><td>SUTTER instaument</td><td>P-97</td><td>Ściągacz</td></tr><tr><td>Przyrząd stereotaktyczny (dla myszy)</td><td>NARISHIGE</td><td>SR-6M-H</td><td>Instrument stereotaktyczny</td></tr><tr><td>Stereotaktyczny mikromanipulator</td><td>NARISHIGE</td><td>SM-15R</td><td>Stereotaktyczny mikromanipulator</td></tr><tr><td>Super-Bond CATALYST V</td><td>SUN MEDICAL</td><td>8070</td><td>Cement z żywicy adhezyjnej dentystycznej</td></tr><tr><td>Super-Bond Dental Adhesive Monomer</td><td>SUN MEDICAL</td><td>8071</td><td>Monomer kleju dentystycznego</td></tr><tr><td>Super-Bond Teeth Color Polymer Powder</td><td>SUN MEDICAL</td><td>145052000</td><td>Kolor zębów w proszku</td></tr><tr><td>polimerowym Tarivid&nbsp; Okulistyka&nbsp; Maść 0,3%</td><td>Santen Pharmaceutical&nbsp;</td><td>TRN3952</td><td>Maść do oczu</td></tr><tr><td>UlTIMATE XL</td><td>NSK</td><td></td> Y141446 <td>Laboratorium dentystyczne Jednostka sterująca mikromotorem</td></tr><tr><td>Kleje optyczne utwardzane promieniami UV</td><td>THORLABS</td><td>NOA61</td><td>Kleje optyczne utwardzane promieniami UV</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Bayer</td><td>KP0F2BK</td><td>Znieczulenie</td></tr></tbody></table>

ocena i manipulacja aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Ostatnie osiągnięcia w bioobrazowaniu optycznym i optogenetyce umożliwiły wizualizację i manipulację zjawiskami biologicznymi, w tym aktywnością komórkową, u żywych zwierząt. W dziedzinie neurobiologii ujawniono szczegółową aktywność neuronalną związaną z funkcjami mózgu, takimi jak uczenie się i pamięć, i możliwe stało się sztuczne manipulowanie tą aktywnością w celu wyrażenia funkcji mózgu. Jednak konwencjonalna ocena aktywności neuronalnej za pomocą obrazowania dwufotonowego Ca2+ ma problem z niską rozdzielczością czasową. Ponadto manipulowanie aktywnością neuronalną przez konwencjonalną optogenetykę za pośrednictwem światłowodu może tylko jednocześnie regulować aktywność neuronów o tym samym tle genetycznym, co utrudnia kontrolowanie aktywności poszczególnych neuronów. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy niedawno mikroskop o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej do zastosowań biologicznych, łącząc optogenetykę z cyfrową technologią holograficzną, która może modyfikować femtosekundowe wiązki laserowe w podczerwieni. W tym miejscu opisujemy protokoły wizualizacji, oceny i manipulacji aktywnością neuronalną, w tym przygotowanie próbek i działanie dwufotonowego mikroskopu holograficznego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Protokoły te dostarczają dokładnych informacji czasoprzestrzennych na temat aktywności neuronalnej, które mogą być przydatne do wyjaśnienia patogenezy zaburzeń neuropsychiatrycznych, które prowadzą do nieprawidłowości w aktywności neuronalnej.

Przedstawiono reprezentatywne nagrania uzyskane za pomocą opisanej tutaj metody. Obrazowanie in vivo Ca2+ z wykorzystaniem mikroskopii holograficznej trwa od 2 do 4 tygodni, licząc od implantacji płytki głownej i iniekcji AAV do akwizycji danych. Dlatego w celu uzyskania stabilnych wyników ważne jest ograniczenie artefaktów ruchowych w mózgu. Implantacja płytki głownej (krok 1.5) oraz umieszczenie okna czaszkowego (krok 2.9) są kluczowymi etapami tego procesu. Ponadto istotny jest wybór AAV (AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1), który jednocześnie wykazuje ekspresję wskaźnika wapnia i opsyny w pojedynczym neuronie (krok 2.8).
Rysunek 4A przedstawia plamkę dla iluminacji holograficznej obrazu nabytego neuronu przy użyciu skryptu MATLAB wykonanego na zamówienie. Jeśli iluminacja holograficzna skutecznie oświetliła neurony wykazujące ekspresję jGCaMP8f, za pomocą czujnika obrazu można było uzyskać przebiegi Ca2+ (Rysunek 4B), jak pokazano na Rysunku 4C.
Łączność funkcjonalna między neuronami została oceniona za pomocą stymulacji holograficznej (Rysunek 4D), zgodnie z przedstawionym na Rysunku 4E. Ponieważ łączność funkcjonalna między neuronami jest jedną z właściwości obwodów neuronalnych ulegających zmianie w patogenezie modelu mysiego bólu24, opisujemy prostą procedurę jej oceny. Rysunek 4F przedstawia typowy obraz neuronów L2/3 w S1HL wizualizowanych przy użyciu GCaMP6m. Gdy jeden neuron (pomarańczowe koło) był stymulowany holograficznie, inny neuron (czerwone koło) był aktywny jednocześnie; w związku z tym liczba połączeń funkcjonalnych między neuronami wynosiła jeden (Rysunek 4G).
<img alt="Płytka głowowa i okno czaszkowe do obrazowania in vivo, iniekcji stereotaktycznej; proces mikroskopowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64205/64205fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna procedura eksperymentalna. (A) Mocowanie płytki głowowej do czaszki. (B) Stereotaktyczna iniekcja AAV do obszaru odpowiadającego tylnej łapie w pierwotnej korze somatosensorycznej (S1HL). (C) Implantacja okna czaszkowego. W celu oceny i manipulacji aktywnością neuronalną u czuwających myszy przeprowadzono obrazowanie Ca2+ in vivo (D) z zastosowaniem stymulacji holograficznej (E). Błyski oznaczają stymulację holograficzną lub oświetlenie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64205/64205fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu obrazowania holograficznego pokazujący wejścia laserowe, przestrzenne modulatory światła i przebiegi wiązek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64205/64205fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: System wykorzystany w mikroskopie holograficznym. (A) Obrazy ścieżek światła stymulacji i iluminacji holograficznej (lewo) w pobliżu mikroskopu (środek) z sensorem obrazu (prawo). (B) Powiększone obrazy ścieżek światła stymulacji i iluminacji holograficznej wokół odpowiednich SLM (lewo i prawo) oraz ścieżki światła skanującego punktowo wokół głowicy skanującej (środek i prawo). (C) Schemat optycznych ścieżek stymulacji i obrazowania. SLM działające tylko na fazie są używane do wyświetlania hologramów cyfrowych, a rozszerzacz wiązki (kombinacja L1 i L2) oraz system przekaźnikowy 4f (kombinacja L3 i L4 dla stymulacji holograficznej oraz L4 i L5 dla iluminacji holograficznej) są rozmieszczone przed i za odpowiednimi SLM, aby zapewnić obrazowanie każdego hologramu cyfrowego w źrenicy wyjścia obiektywu imersyjnego w wodzie, z nieco niedopełnionym rozmiarem obrazu. W celu stłumienia resztkowych komponentów zerowego rzędu, w płaszczyźnie pośredniej umieszczono blokadę wiązki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64205/64205fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat kalibracji mikroskopii fluorescencyjnej; konfiguracja obejmuje obrazowanie na żywo, skan Z, kontrolę intensywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64205/64205fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat kalibracji systemu holograficznej stymulacji lub oświetlenia. Ten schemat opisuje kroki kalibracji systemu holograficznej stymulacji lub oświetlenia względem przestrzeni próbki i systemu obrazowania. Szczegółne instrukcje oraz możliwość pobrania przykładowego programu znajdują się w kroku 3: przygotowanie systemu holograficznej stymulacji lub oświetlenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64205/64205fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Odpowiedź neuronu na stymulację holograficzną; wzbudzenie optyczne; wykresy i schemat aktywności neuronów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64205/64205fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki obrazowania i łączności funkcjonalnej z użyciem mikroskopu holograficznego. (A) W celu oświetlenia konkretnych neuronów wykazujących ekspresję jGCaMP8f lub GCaMP6m-P2A-ChRmine, pobierany jest obraz neuronów, a następnie za pomocą specjalnie przygotowanego skryptu MATLAB na neuronie formowany jest punkt. (B) Ustawienia czujnika obrazu (czas ekspozycji, obszar obrazowania i binning). (C) Reprezentatywny obraz i ślady neuronów wykazujących ekspresję jGCaMP8f podczas obrazowania z częstotliwością 100 Hz z oświetleniem holograficznym i czujnikiem obrazu. (D) Ten wykres przedstawia odpowiedź neuronalną na stymulację holograficzną (1040 nm) przy każdej mocy lasera (dane z neuronów wykazujących ekspresję GCaMP6m-P2A-ChRmine przy częstotliwości klatek obrazowania 2 Hz [n = 16]). Słupki błędu wskazują standardowy błąd średniej. (E) Reprezentatywne ślady Ca2+ podczas stymulacji holograficznej (niebieskie linie pionowe) 10 różnych neuronów przy częstotliwości klatek obrazowania 2 Hz (lewo) i 30 Hz (prawo). Na śladach Ca2+ dla 2 Hz i 30 Hz ten sam kolor oznacza ten sam neuron. (F) Schemat oceniający połączenia funkcjonalne między neuronami. Gdy stymulowany jest pomarańczowy neuron, czerwone neurony odpowiadają w tym samym czasie, co wskazuje na istnienie łączności funkcjonalnej między tymi neuronami. (G) Typowy obraz neuronów S1HL wykazujących ekspresję GCaMP6m w WT. Pasek skali = 10 µm. (H) Typowe ślady Ca2+ podczas stymulacji holograficznej (niebieskie linie pionowe) przy częstotliwości klatek obrazowania 2 Hz (góra) i 30 Hz (dół). Stymulowany neuron jest obwiedziony pomarańczowo, neurony odpowiadające są obwiedzione czerwono, a neurony nieodpowiadające są obwiedzione szaro. Odpowiedź neuronalna na stymulację holograficzną może być wykryta zarówno przy prędkości obrazowania 2 Hz, jak i 30 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64205/64205fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Nasza konfiguracja 6 </td>
			<td>Prakash, R. i wsp. 25 </td>
			<td>Marshel, J. H. i wsp. 12</td>
			<td>Robinson, N. T. M. i in. 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdzielczość boczna</td>
			<td>1.2 μm</td>
			<td>1.27 μm</td>
			<td>―</td>
			<td>2.22 μm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdzielczość osiowa</td>
			<td>8.3 μm</td>
			<td>56.86 μm</td>
			<td>15.5 μm</td>
			<td>10.26 μm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obiektyw/Apertura numeryczna</td>
			<td>25x/1,1</td>
			<td>20x/0,5</td>
			<td>16x/0,8</td>
			<td>16x/0,8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Podsumowanie poprzednich doniesień oraz niniejszego systemu w zakresie rozdzielczości przestrzennej stymulacji holograficznej. Opisano rozdzielczość boczną, rozdzielczość osiową oraz obiektyw użyty podczas pomiaru.

Opracowaliśmy dwufotonowy mikroskop holograficzny, który może wizualizować, oceniać i manipulować aktywnością neuronalną przy użyciu wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, w celu wyjaśnienia patogenezy zaburzeń neuropsychiatrycznych, które są związane z nieprawidłową aktywnością neuronalną.

Ocena i manipulacja aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular ...

Protokół ten zapewnia dokładne informacje przestrzenne i czasowe na temat neuroaktywności. Główną zaletą tej techniki jest możliwość manipulowania i oceny neuroaktywności z wysoką rozdzielczością przestrzenno-czasową. Może być przydatny do zilustrowania patogenów zaburzeń neuropsychiatrycznych, które prowadzą do nieprawidłowości w aktywności neuronalnej.Metodę tę można zastosować do badania neuronów, a także zdrowia w innych narządach. Procedurę zademonstruje Zhongtian Guo, doktorant z naszego laboratorium. Dzień po implantacji płytki głowy należy podać 1,32 miligrama na kilogram deksametazonu fosforanu sodu dootrzewnowo na godzinę przed zabiegiem, aby uniknąć obrzęku mózgu.Pod stereoskopem wykonaj okrężną kraniotomię o średnicy około dwóch milimetrów za pomocą wiertła dentystycznego. Aby zmniejszyć uszkodzenie mózgu, należy ostrożnie obsługiwać wiertło dentystyczne, wykonując stały lekki ruch i lekko naciskając w dół. Usuń fragmenty kości kilka razy za pomocą systemu ssącego.Po usunięciu fragmentu kości użyj sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego lub roztworu ACSF, aby usunąć i zmyć wszelkie zanieczyszczenia pozostające na powierzchni mózgu. Powtórz tę procedurę czyszczenia kilka razy, aby stłumić reakcje zapalne. Za pomocą systemu iniekcji ciśnieniowej ustaw odpowiednie ciśnienie, aby wstrzyknąć 500 nanolitrów roztworu AAV przez szklaną kapilarnę o średnicy końcówki od 10 do 20 mikrometrów przez 10 minut.Jeśli poziom roztworu AAV w szklanej kapilarze stopniowo spada, roztwór AAV jest podawany do mózgu. Pozostaw szklaną kapilę na miejscu na dodatkowe 10 minut, aby zapobiec cofaniu się. Powtórz to trzy razy, aby podać w sumie 1,5 mikrolitra roztworu AAV do mózgu.Nałóż 2% niskotopliwą agarozę na powierzchnię mózgu S1 za pomocą mikropipety, a następnie umieść szklane okienko na kraniotomii z dwoma szkłami nakrywkowymi. Dociśnij szklankę nakrywkową do agarozy, gdy jest jeszcze płynna. Zapobiega to tworzeniu się pęcherzyków powietrza w agarozie.Uszczelnij krawędzie okna czaszki cementem z żywicy adhezyjnej. Aby skalibrować system stymulacji holograficznej, umieść powierzchnię czerwonego szkiełka fluorescencyjnego na płaszczyźnie próbki i ustaw mikroskop w trybie obrazowania na żywo ze słabym światłem wzbudzenia. Uruchom graficzny interfejs użytkownika kalibracji.mfile, sprawdź panel parametrów i kliknij przycisk Zapisz. Kliknij przycisk Skanuj z w kroku pierwszym, aby automatycznie wygenerować trzy losowe punkty w 21 różnych płaszczyznach osiowych oddalone od siebie o dwa mikrometry od każdej płaszczyzny. Przesuń suwak i sprawdź obraz na żywo.Znajdź idealną płaszczyznę, na której plamki wydają się najmniejsze i najjaśniejsze, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Spowoduje to automatyczne wygenerowanie przesuniętego sferycznego czoła fali dla hologramu cyfrowego. Kliknij przycisk Idź w okienku kroku drugiego, a następnie kliknij sześć miejsc w lewym kwadracie.Sprawdź obraz na żywo. Jeśli istnieje sześć rozpoznawalnych punktów fluorescencyjnych, wpisz ich osie x i y w polach edycji i kliknij przycisk Zapisz. Spowoduje to automatyczne wygenerowanie współczynnika drobnej transformacji w celu skoordynowania kalibracji między stymulacją holograficzną a systemem obrazowania.Następnie kliknij przycisk Skanuj w okienku kroku trzeciego. Wygeneruje 441 cyfrowych hologramów, aby wykonać skanowanie pojedynczego punktu w całym polu widzenia w 21 na 21 krokach. Sprawdzaj obrazy podczas zmieniania wzorców w polu listy.Dostosuj moc lasera, aby uzyskać obrazy punktowe w zakresie dynamicznym urządzenia do obrazowania. Przełącz urządzenie do przetwarzania obrazu w tryb nagrywania i kliknij przycisk Odtwórz. Po zakończeniu odtwarzania kliknij przycisk Generuj mapę wagi w okienku kroku czwartego i wybierz obraz ułożony w stos.Następnie zamknij okno graficznego interfejsu użytkownika kalibracji. Automatycznie wygeneruje mapę wagi, aby skompensować niezrównoważoną intensywność w każdym miejscu. Umieść mysz z wstrzykniętą krwią AAV z płytką na głowę pod mikroskopem i wykonaj obrazowanie dwufotonowe za pomocą mikroskopu holograficznego i lasera tytanowo-szafirowego dostrojonego do 920 nanometrów z obiektywem 25x.Otwórz komercyjne oprogramowanie do obrazowania w trybie obrazowania na żywo. Dostosuj napięcie detektora obrazu i moc lasera obrazującego, aby zoptymalizować jasność neuronów wyrażających GCaMP8f. Uchwyć obrazy neuronów wyrażających to białko.Aby oświetlić określone neurony za pomocą oświetlenia holograficznego, uruchom plik skryptu SLMcontrol. m. Kliknij obraz referencyjny i wybierz uzyskany obraz.Następnie kliknij przycisk Spot, aby wybrać określone piksele na neuronach na obrazie i naciśnij przycisk Enter na klawiaturze, aby go sfinalizować. Aby wykryć aktywność neuronalną z wysoką rozdzielczością czasową za pomocą przetwornika obrazu, ustaw czas ekspozycji, obszar obrazowania i binowanie, a następnie wykonaj akwizycję obrazu. Po umieszczeniu myszy pod mikroskopem i wykonaniu obrazowania dwufotonowego otwórz komercyjne oprogramowanie do obrazowania.W trybie obrazowania na żywo dostosuj napięcie detektora obrazu i moc lasera obrazującego, aby zoptymalizować jasność neuronów wyrażających GCaMP-6m-p2A-ChRmine. Uchwyć obrazy neuronów wyrażających te białka, a następnie oświetl określone neurony zgodnie z procedurą pokazaną wcześniej. Aby zbadać funkcjonalną łączność w neuronach warstwy drugiej i trzeciej, użyj przestrzennego modulatora światła do wygenerowania holograficznych wzorców stymulacji optogenetycznej i połącz je z dwufotonowym obrazowaniem wapnia.Ustaw intensywność lasera obrazującego na 920 nanometrów przy 10 do 20 miliwatach, a pole widzenia na 256 mikrometrów na 256 mikrometrów mierzonych na głębokości od 100 do 150 mikrometrów od powierzchni kory mózgowej. Ustaw czas zatrzymania piksela na 1,5 mikrosekundy dla dwóch herców lub 100 nanosekund dla 30 herców. Użyj zarówno dwóch herców, jak i 30 Hz jako częstotliwości odświeżania obrazu, aby sprawdzić, czy pojedynczy bodziec holograficzny spowodował odpowiedź wapniową w neuronach.Ustaw intensywność lasera do stymulacji holograficznej, który stymuluje pojedynczy neuron, na 10 miliwatów, co jest wystarczające do wywołania aktywności neuronalnej. Jednocześnie zobrazuj odpowiedź wapnia i żelaza na 920 nanometrach z 10 bodźcami holograficznymi w odstępach 1040 nanometrów i ośmiu sekund przez czas trwania 50 milisekund po okresie wyjściowym wynoszącym 10 sekund. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej.Reprezentatywny obraz i ślady neuronów wyrażających GCaMP8f w obrazowaniu 100 Hz ze stymulacją holograficzną i czujnikiem obrazu przedstawiono tutaj. Ten wykres przedstawia reakcję neuronalną na stymulację holograficzną przy każdej mocy lasera. Przedstawiono tutaj reprezentatywne ślady wapnia 2+ podczas holograficznej stymulacji 10 różnych neuronów przy dwóch hercach i 30 hercach obrazowania.Ten sam kolor oznacza ten sam neuron. Przedstawiono tutaj schemat ideowy oceniający funkcjonalne połączenia między neuronami. Kiedy pomarańczowy neuron jest stymulowany, czerwone neurony reagują w tym samym czasie, co wskazuje, że istnieje funkcjonalna łączność między tymi neuronami.Pokazano tutaj typowy obraz pierwotnych neuronów kory somatosensorycznej wyrażających GCaMP6m w typie dzikim. Te obrazy graficzne reprezentują typowe ślady wapnia 2 + podczas stymulacji holograficznej przy dwóch hercach i 30 częstotliwościach obrazowania. Neuroreaktywność na stymulację holograficzną można wykryć zarówno przy dwóch hercach, jak i 30 hercach prędkości obrazowania.Te kroki są ważne, aby zmniejszyć ruch mózgu, a po drugie, uzyskać stabilne wyniki. Wierzymy, że ten mikroskop może indukować zachowanie neuronów zapisujących o określonych wzorcach. Dzięki tej technice jesteśmy teraz w stanie ocenić i manipulować aktywnością poszczególnych neuronów oraz szczegółowo scharakteryzować neuropsychiatrię.

evaluation-manipulation-neural-activity-using-two-photon-holographic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zrozumienie funkcji ośrodkowego układu nerwowego kręgowców wymaga rejestracji aktywności wielu neuronów, ponieważ funkcje kory powstają na poziomie populacji neuronów. Opisujemy tutaj optyczną metodę rejestracji nadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów (spikes), zwaną skanowaniem z losowym dostępem z ditherowaniem (dithered random-access scanning). Metoda ta rejestruje somatyczne sygnały fluorescencji wapnia z maksymalnie 100 neuronów z...

Optyczna rejestracja ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Dwufotonowe obrazowanie neuronów korowych u noworodków myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film prezentuje mikroskopię dwufotonową używaną do obrazowania neuronów w mózgu znieczulonego transgenicznego szczeniaka myszy. Laser dwufotonowy pozwala na głębsze obrazowanie z wysoką rozdzielczością przestrzenną i minimalnym rozpraszaniem światła, umożliwiając szczegółowe uchwycenie morfologii neuronów, w tym projekcji dendrytycznych.

Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania morfologii neuronów u szczeniaka myszy

Źródło: Kato, D. et. al., Ocena i manipulacja aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia technikę obrazowania dwufotonowego w połączeniu z optogenetyką przy użyciu mikroskopii holograficznej. Technika ta, wykorzystująca przestrzenny modulator światła, umożliwia precyzyjną stymulację neuronów polegającą na ekspresji białka wrażliwego na światło czerwone i obrazowanie wapnia przy minimalnym fotouszkodzeniu. Takie podejście...

Dwufotonowa mikroskopia holograficzna do badania aktywności neuronalnej i łączności w modelu mysim

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Tutaj opisujemy procedury eksperymentalne związane z dwufotonowym obrazowaniem kory myszy podczas zachowania w środowisku wirtualnej rzeczywistości.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy poruszających się w środowisku rzeczywistości wirtualnej

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Poznaj metodę dwufotonowej mikroskopii holograficznej do oceny i manipulacji aktywnością neuronalną w modelach mysich. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów chorób neuropsychiatrycznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Ocena i manipulacja aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej

Przeglądaj więcej filmów