En Face Przygotowanie poduszki wsierdzia do planarnej analizy morfogenezy u zarodków myszy

Protokół ten pozwala na analizę pierwotnego wsierdzia w orientacji płaskiej. Możemy przeanalizować rozmieszczenie komórek wsierdzia, anizotropię innych nakazów i opisać kształt pojedynczej komórki wsierdzia podczas rozwoju zastawki. W porównaniu z klasycznymi wycinkami tkanek, obrazowanie en face obszaru regeneracyjnego wewnętrznej zastawki pozwala na analizę płaskiej polaryzacji komórek i dynamiki komórek wsierdzia podczas rozwoju zastawki w nienaruszonych zarodkach.

Metoda ta może być wykorzystana do pogłębienia wiedzy na temat płaskiej polaryzacji komórek podczas rozwoju cardio. Zacznij od umieszczenia macicy wyciętej od ciężarnych myszy poddanych eutanazji na szalce Petriego zawierającej lodowaty PBT. Usuń pojedynczą decyzję z macicy pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą drobnych kleszczy.

Za pomocą cienkiej pęsety wykonaj nacięcie w białej części decidua, czyli w miejscu, w którym znajduje się zarodek. Usuń go delikatnie, unikaj ciągnięcia i przenieś zarodki na nową szalkę Petriego ze świeżym PBT za pomocą P-1000 z odciętą końcówką, pozostawiając średnicę wystarczająco dużą, aby zarodek mógł przejść bez pękania. Do genotypowania weź mały kawałek woreczka żółtkowego o powierzchni około 0,5 milimetra kwadratowego lub kawałek ogona od tylnego końca, licząc od pięciu do 10 somitów w kierunku głowy i strawij go w 100 mililitrach odpowiedniego buforu.

Pod wyciągiem przenieś zarodki do lodowatego 4% PFA w dwumililitrowej probówce do mikrowirówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Utrwal zarodki od dwóch godzin do nocy w temperaturze czterech stopni Celsjusza na nutatorze. Pod wyciągiem wyciągowym usuń utrwalacz 4% PFA z probówek do mikrowirówek, nie dotykając zarodków.

Wyrzuć PFA do odpowiedniego pojemnika. Umyj zarodki pięć razy w zimnym PBT przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą cienkich kleszczy wyjmij serce i przenieś je do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej ze świeżym PBT.

Zastąp PBT PBS Triton i umyj próbki trzykrotnie, po pięć minut każda, w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Zastąp PBS Triton roztworem blokującym zawierającym PBS Triton 10% inaktywowaną termicznie surowicą bydlęcą. Inkubować od dwóch godzin do nocy w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej.

Zastąp roztwór blokujący roztworem blokującym zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe o pożądanym stężeniu. Inkubować przez noc na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza inkubować próbki przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.

Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia stosunku sygnału do szumu. Usuń i utrzymuj główny roztwór przeciwciała w temperaturze czterech stopni Celsjusza, do trzech przyszłych eksperymentów. Dodaj azydek sodu do końcowego stężenia 0,02%, aby uzyskać najlepszą ochronę.

Następnie umyj zarodki trzykrotnie PBS Triton przez trzy minuty każdy. Umyj zarodki PBS Triton trzykrotnie przez 30 minut i trzymaj je na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po ostatnim przemyciu dodać jeden mililitr roztworu blokującego zawierającego sprzężone fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała gospodarza.

Następnie dodaj DAPI do roztworu i inkubuj zarodki przez noc na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza inkubuj zarodki przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Ten krok jest niezbędny, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.

Powtórz kroki mycia PBS Triton, jak wspomniano w manuskrypcie tekstowym. Umieść serca na 35-milimetrowej szalce Petriego zawierającej PBS. Za pomocą drutu wolframowego i drobnych kleszczyków odizoluj kanał przedsionkowo-komorowy lub drogę odpływu i przetnij je wzdłużnie.

Przygotuj szkiełka nakrywkowe, szkiełka, kleszcze, pipetę P-200 z odpowiednimi końcówkami, ręcznik papierowy i wszelkie wodne media montażowe na bazie glicerolu do fluorescencji bez DAPI. Przyklej dwa paski taśmy na szkiełku oddalone od siebie o 0,3 do 0,6 centymetra, aby stworzyć przestrzeń 3D, która pozwoli próbkom zachować swój pierwotny kształt bez ich zgniatania. Następnie, używając około 20 mikrolitrów buforu, ostrożnie upuść próbki na szkiełko między paskami taśmy za pomocą przeciętej końcówki pipety P-200.

Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zwiększyć dokładność. Za pomocą cienkich kleszczyków umieść próbki z wsierdziem skierowanym do góry i mięśniem sercowym w dół na szkiełku. Usuń nadmiar PBS ręcznikiem papierowym i unikaj dotykania próbki.

Następnie suszyć próbki przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej, aby próbki przykleiły się do szkiełka. Dodać 40 mikrolitrów wodnego podłoża montażowego do tkanki. Umieść szkiełko nakrywkowe na dwóch kawałkach taśmy i powoli opuść je na chusteczkę za pomocą igły lub kleszczyków.

Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą jednej kropli lakieru do paznokci na każdym wierzchołku szkiełka nakrywkowego. Po wyschnięciu lakieru do paznokci wyczyść nadmiar nośnika montażowego z boków szkiełka nakrywkowego za pomocą chłonnego ręcznika papierowego.

Unikać przesuwania szkiełka nakrywkowego. Dodaj lakier do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby całkowicie go uszczelnić, zapobiegając parowaniu mediów montażowych. Używając pionowego lub odwróconego mikroskopu konfokalnego, rób zdjęcia w 10-krotnym powiększeniu dla widoku ogólnego i 63-krotnym z 3-krotnym zoomem dla szczegółowych obrazów.

Kształt komórek wsierdzia analizowano podczas tworzenia zastawek w rozdzielczości komórkowej. Pojedyncze komórki lub klony kilku komórek wykazywały ekspresję GFP w wsierdziu. Ekspresja GFP i połączenie z lokalizacją subkomórkową VE kadheryny było skutecznym podejściem do badania związku między dynamiką AJ a tworzeniem filopodiów a komórkami pre-EMT, ponieważ komórki te rozwinęły wypukłości błony w miarę rozpuszczania się AJ.

Różnice w intensywności barwienia VE-kadheryny w wsierdziu wskazywały na obecność kurczliwości anizotropowej w zarodkowym wsierdziu kanału przedsionkowo-komorowego w stadiach przedzastawkowych. Całe serce przebarwiono przeciwciałem VE-kadheryny o stężeniach E8,5 i E9,5. W E8.5 wsierdzie kanału przedsionkowo-komorowego miało tendencję do stabilnej organizacji nabłonka, a wierzchołki utworzone przez więcej niż cztery komórki nie zostały wykryte.

W E9.5 zaobserwowano, że wierzchołki do sześciu komórek tworzą struktury przypominające rozety, podobne do organizacji komórkowej opisanej wcześniej w nabłonku ulegającym aktywnym rearanżacjom komórek, co sugeruje, że wsierdzie kanału przedsionkowo-komorowego ulegało dynamicznemu przegrupowaniu komórkowemu podczas rozwoju zastawki. Aby stać się ekspertem w tej technice, niezbędna jest krzywa uczenia się. Ponadto zdecydowanie zaleca się stosowanie kleszczy Sovereign i drutu wolframowego.

Współcześnie wizualizacja wsierdzia przedzastawkowego ograniczała się do przekrojów. Nasze podejście daje możliwość badania zachowania zarodka zastawkowego wsierdzia z płaskiego punktu widzenia.