Name: En Face Przygotowanie poduszki wsierdzia do planarnej analizy morfogenezy u zarodków myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj metodę en face do analizy morfogenezy poduszki wsierdzia u zarodków myszy. Technika ta umożliwia badanie polaryzacji komórkowej i dynamiki endokardu podczas rozwoju zastawek serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty PID2019-104776RB-I00 i CB16/11/00399 (CIBER CV) od MCIN/AEI/10.13039/501100011033 do J. L. P. J.G.-B. zostało sfinansowane przez Programa de Atracción de Talento z Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. został sfinansowany przez Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Dziękujemy Zakładowi Mikroskopii i Obrazowania Dynamicznego CNIC, CNIC, ICTS-ReDib, współfinansowanemu przez MCIN/AEI /10.13039/501100011033 oraz FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Dziękujemy również A. Galicii i L. Méndezowi za hodowlę myszy. Koszt tej publikacji został częściowo pokryty ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego. CNIC jest wspierany przez ISCIII, MCIN i Fundację Pro CNIC i jest Centrum Doskonałości Severo Ochoa (grant CEX2020-001041-S) finansowanym przez MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) oraz przez Wspólnotę Madrytu (ref. PROEX 155.7/20). Wszystkie procedury na zwierzętach są zgodne z Dyrektywą UE 2010/63UE i Zaleceniem 2007/526/WE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych, uchwalonymi w prawie hiszpańskim na mocy Real Decreto 1201/2005.
1. Wykorzystanie AVC i/lub OFT (zaadaptowane z Xiao et al.<klasa sup="odnośnik">25)
<ol>
	<li>Ustaw krzyżówki w godzinach popołudniowych między samicą mTmG a samcem VE-Cadherin-Cre-ERT/+.</li>
	<li>Następnego ranka sprawdź, czy nie ma korka dopochwowego. Jeśli jest czop dopochwowy, policz to jako pół dnia (E0,5). W zależności od interesującego eksperymentu policz 8 dni lub 9 dni.</li>
	<li>Na 24 godziny przed sekcją należy podać ciężarnej samicy doustnie 50 μl 5 mg/ml 4-OH-tamoksyfenu rozcieńczonego w oleju kukurydzianym. 
	UWAGA: Dawka ta wywoła ograniczoną ilość rekombinacji za pośrednictwem CRE, która objawia się obecnością klonów GFP-dodatnich. Odpowiednia dawka będzie musiała być ustalana dla każdej nowej partii 4-OH-tamoksyfenu.</li>
	<li>Uśmierc ciężarną samicę w E8.5 lub E9.5 przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Otwórz brzuch ciężarnych myszy za pomocą nożyczek i usuń macicę zawierającą zarodki za pomocą nożyczek i cienkich kleszczy.</li>
	<li>Umieść macicę na szalce Petriego zawierającej lodowato 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z 0,1% Tween-20 (PBT).</li>
	<li>Usuń poszczególne deciduae z macicy pod mikroskopem preparacyjnym i za pomocą cienkich kleszczy.</li>
	<li>Za pomocą cienkiej pęsety wykonaj nacięcie w białej części decidua, czyli w miejscu, w którym znajduje się zarodek, usuń go delikatnie, unikając ciągnięcia, i przenieś zarodki na nową szalkę Petriego ze świeżym PBT za pomocą P1000 z odciętą końcówką, pozostawiając średnicę wystarczająco dużą, aby zarodek mógł przejść bez pękania.</li>
	<li>Do genotypowania należy pobrać mały kawałek woreczka żółtkowego (0,5 mm2) lub kawałek ogona (od tylnego końca, licząc od 5 do 10 somitów w kierunku głowy) i strawić go w 100 μl odpowiedniego buforu.</li>
	<li>Pod wyciągiem przenosić zarodki do lodowatego 4% paraformaldehydu (4% PFA) w sterylnie przefiltrowanym PBS w probówce do mikrowirówki (2 ml) w temperaturze 4 °C. Utrwalić zarodki od 2 godzin do nocy (O/N) w temperaturze 4 °C na nutatorze.</li>
	<li>Pod wyciągiem wyciągowym usuń 4% utrwalacz PFA z probówek do mikrowirówek, nie dotykając zarodków. Wyrzuć PFA do odpowiedniego pojemnika.</li>
	<li>Myj zarodki 5x w zimnym PBT przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy wyjmij serce i przenieś je do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml ze świeżym PBT.</li>
</ol>
2. Immunofluorescencja całego wierzchowca embrionalnego serca myszy
<ol>
	<li>Zastąp PBT PBSTr (0,4% Triton X-100 w PBS) i przemyj próbki 3 razy po 5 minut każda, w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Zastąp PBSTr roztworem blokującym (PBSTr 10% inaktywowaną termicznie surowicą bydlęcą). Inkubować od 2 godzin do O/N w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Zastąp roztwór blokujący roztworem blokującym zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe o pożądanym stężeniu (w przypadku przeciwciała anty-GFP lub anty-VE-Cadherin należy użyć rozcieńczenia 1:1000). Inkubować O/N na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po inkubacji O/N w temperaturze 4 °C, inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Ten krok jest bardzo ważny, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Usunąć i przechowywać w temperaturze 4 °C główny roztwór przeciwciała do maksymalnie trzech przyszłych eksperymentów (dodać azydek sodu do końcowego stężenia 0,02% w celu uzyskania najlepszej konserwacji).</li>
	<li>Myj zarodki 3x PBSTr przez 3 minuty każdy.</li>
	<li>Przemywać zarodki PBSTr 3x przez 30 minut każdy na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po ostatnim przemyciu dodać 1 ml roztworu blokującego zawierającego 1:1000 sprzężonego z fluorescencją przeciwciała drugorzędowego przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała gospodarza. Dodać również 1:3000 DAPI do roztworu i inkubować zarodki O/N na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po inkubacji O/N w temperaturze 4 °C, inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Ten krok jest bardzo ważny, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Myj zarodki 3x PBSTr przez 3 minuty każdy.</li>
	<li>Umyj zarodki PBSTr 3x-5x przez 30 minut każdy na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Montowanie embrionalnych AVC lub OFT myszy
<ol>
	<li>Umieść serca na szalce Petriego (35 mm) zawierającej PBS.</li>
	<li>Za pomocą drutu wolframowego i cienkich kleszczyków odizoluj AVC lub OFT i przetnij je wzdłużnie26.</li>
	<li>Przygotować szkiełka nakrywkowe (22 mm x 22 mm), szkiełka podstawowe (60 mm x 24 mm), kleszczyki, pipetę P200 z odpowiednimi końcówkami, ręcznik papierowy i wszelkie wodne media montażowe na bazie glicerolu do fluorescencji, bez DAPI.</li>
	<li>Stosując podobne podejście jak w Xiao, C. et al.25, przyklej dwa paski taśmy na szkiełku, oddalone od siebie o 0,3-0,6 cm, aby stworzyć przestrzeń 3D pomieszczenia, która pozwoli próbkom zachować oryginalny kształt bez ich zgniatania.</li>
	<li>Ostrożnie, używając minimalnej objętości buforu, upuść próbki na szkiełko między paskami taśmy za pomocą pipety z przeciętą końcówką P200. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zwiększyć dokładność.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków umieść próbki wsierdziem skierowanym do góry (mięsień sercowy do dołu na szkiełku).</li>
	<li>Usuń nadmiar PBS ręcznikiem papierowym (unikaj dotykania próbki), a następnie susz próbki przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej, aby próbki przykleiły się do szkiełka.</li>
	<li>Dodać 40 μl wodnego podłoża montażowego na tkankę.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na dwóch kawałkach taśmy i powoli opuść je na tkankę za pomocą igły lub kleszczy. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą jednej kropli lakieru do paznokci na każdym wierzchołku szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Po wyschnięciu lakieru do paznokci usuń nadmiar nośnika montażowego z boków szkiełka nakrywkowego za pomocą chłonnego ręcznika papierowego. Unikaj przesuwania szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Dodaj lakier do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby całkowicie go uszczelnić, zapobiegając parowaniu mediów montażowych.</li>
	<li>Używając pionowego lub odwróconego mikroskopu konfokalnego, rób zdjęcia z powiększeniem 10x w widoku ogólnym i z powiększeniem 63x z zoomem 3x w przypadku szczegółowych obrazów.</li>
</ol>

<ol><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li>
<li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbour+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750(2014).</li>
<li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200(2021).</li>
<li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+controlling+second+heart+field+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways controlling second heart field development.</a> Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).</li>
<li>Moorman, A. F., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+chamber+formation%3A+Development%2C+genes%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution.</a> Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).</li>
<li>Timmerman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li>
<li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li>
<li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp2+and+Notch+cooperate+to+pattern+the+embryonic+endocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium.</a> Development. 145 (13), (2018).</li>
<li>MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+cardiac+valve+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in cardiac valve development and disease.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).</li>
<li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+tissue+interactions%3A+Notch+signaling+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease.</a> Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).</li>
<li>Amack, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+of+EMT%3A+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79(2021).</li>
<li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li>
<li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li>
<li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li>
<li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+protein+Par3%2FBazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li>
<li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li>
<li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+moving+cells%3A+Think+globally%2C+act+locally%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li>
<li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034(2016).</li>
<li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li>
<li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li>
<li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+morphodynamics%3A+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li>
<li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Notch1+activity+in+development%3A+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li>
<li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321(2018).</li>
<li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159(2010).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li>
<li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT%2C+the+cytoskeleton%2C+and+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li>
<li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li>
<li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li>
<li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399(2018).</li>
<li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Clinical+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li>
<li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li>
<li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wsierdzie jest monowarstwą nabłonkową, która pokrywa całą wewnętrzną powierzchnię embrionalnej rurki serca. Podczas rozwoju zastawki komórki wsierdzia w prospektywnych obszarach zastawkowych przechodzą EMT, dzięki czemu komórki wsierdzia przekształcają się i przestawiają swój cytoszkielet, aby rozwarstwić się od wsierdzia w kierunku galaretki sercowej. My i inni uzyskaliśmy odpowiednie dane na temat rozwoju zastawek w zarodkach myszy, analizując przekroje poprzeczne serc embrionalnych E8.5 i E9.5, gdzie wsierdzie jest po...

Serce jest pierwszym funkcjonalnym organem embrionu ssaka. Około dnia embrionalnego (E) 7,5 u myszy, obustronne komórki mezodermy przedsercowej tworzą półksiężyc serca po stronie brzusznej1. Półksiężyc serca zawiera dwie populacje komórek przedsercowych, które obejmują komórki progenitorowe mięśnia sercowego i wsierdzia2. Około E8.0 prekursory serca łączą się w linii środkowej, tworząc prymitywną rurkę serca składającą się z dwóch tkanek nabłonkowych, zewnętrznego mięśnia sercowego i wewnętrznego wsierdzia, które jest wyspecjalizowanym śródbłonkiem oddzielonym macierzą zewnątrzkomórkową zwaną galaretką sercową. Później, w E8,5, rurka serca ulega pętli w prawo. Zapętlone serce ma różne obszary anatomiczne ze specyficznymi sygnaturami molekularnymi, takimi jak droga odpływu (OFT), komory i kanał przedsionkowo-komorowy (AVC)3. Chociaż początkowo rurka serca rozszerza się po stronie napływu poprzez dodanie komórek4, przy E9.5, intensywna proliferacja serca powoduje rozdęcie komór i utworzenie sieci beleczkowej5. Tworzenie zastawek odbywa się w AVC (przyszłe zastawki mitralne i trójdzielne) oraz w OFT (przyszłe zastawki aortalne i płucne).
Wsierdzie odgrywa kluczową rolę w rozwoju zastawki. Komórki wsierdzia przechodzą przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) w AVC i OFT, tworząc poduszki wsierdzia, strukturę, która pojawia się na początku rozwoju zastawki. Różne szlaki sygnałowe aktywują ten proces; przy E9.5 u myszy, NOTCH aktywowany w wsierdziu w odpowiedzi na BMP2 pochodzenia mięśniowo-sercowego promuje inwazyjne EMT komórek wsierdzia w regionach AVC i OFT poprzez aktywację TGFβ2 i SNAIL (SNAI1), co bezpośrednio hamuje ekspresję kadheryny śródbłonka naczyniowego (VE-kadheryna), transbłonowego składnika połączeń adherenów (AJs)6,7,8. W OFT aktywacja wsierdzia w celu zainicjowania EMT jest pośredniczona przez FGF8 i BMP4, których ekspresja jest aktywowana przez NOTCH9,10,11,12.
Postęp EMT obejmuje dynamikę komórkową, gdy komórki zmieniają kształt, zrywają i ponownie łączą się ze swoimi sąsiadami, rozwarstwiają się i zaczynają migrować13. Zmiany te obejmują przebudowę AJ i stopniowy demontaż14,15, sygnalizacja polaryzacji komórek planarnych (PCP), utrata polaryzacji apico-podstawowej (ABP), zwężenie wierzchołkowe i organizacja cytoszkieletu16,17. ABP odnosi się do rozmieszczenia białek wzdłuż osi przednio-tylnej komórki. W rozwijającym się sercu regulacja ABP w kardiomiocytach jest niezbędna do rozwoju komór18. PCP odnosi się do spolaryzowanej dystrybucji białek w komórkach na płaszczyźnie tkanki i reguluje dystrybucję komórkową; Nabłonki o stabilnej geometrii składają się z komórek w kształcie sześciokąta, gdzie tylko trzy komórki zbiegają się w wierzchołkach19,20,21,22. Różne procesy komórkowe, takie jak podział komórki, wymiana sąsiadów lub delaminacja zachodząca podczas morfogenezy nabłonka, powodują wzrost liczby komórek, które zbiegają się na wierzchołku i liczby sąsiednich komórek, które ma dana komórka22. Te zachowania komórkowe związane z PCP mogą być regulowane przez różne szlaki sygnałowe, dynamikę aktyny lub transport wewnątrzkomórkowy23.
Dane wygenerowane badające rozwój zastawki u myszy zostały uzyskane z przekrojów poprzecznych, czołowych lub strzałkowych embrionalnych serc E8.5 i E9.5, gdzie wsierdzie jest pokazane jako linia komórek, a nie jako pole komórek - wsierdzie pokrywa całą wewnętrzną powierzchnię rurki serca24. Wycinki zarodkowe nie pozwalają na analizę PCP w wsierdziu zarodków myszy. Nasza nowatorska metoda eksperymentalna pozwala na analizę rozmieszczenia komórek wsierdzia, anizotropii AJ i analizę kształtu pojedynczej komórki, jak pokazano w reprezentatywnych wynikach. Tego typu dane są wymagane do analizy PCP, wraz z opisem innych cząsteczek związanych z PCP, które nie zostały przedstawione w niniejszym raporcie. Immunofluorescencja typu full-mount, specyficzne przygotowanie próbki i zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy umożliwiają analizę płaskiej polaryzacji w wsierdziu na początku rozwoju zastawki u myszy.

<table><tbody><tr><td>4-OH-Tamoxifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H-6278</td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldheyde</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>157-10</td><td>Rozcieńczony do 4% w wodzie</td></tr><tr><td>anty-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>FGP-1010</td><td></td></tr><tr><td>anty-VECadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>555289</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-Kurczak, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-174</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td>A4099,0005</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost PLUS</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td>25 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>A4974,0500</td><td>AppliChem</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Montaż </td><td>Laboratoria Średniowektorowe</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr></tbody></table>

en face przygotowanie poduszki wsierdzia do planarnej analizy morfogenezy u zarodków myszy

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Badanie mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw rozwoju serca ssaków jest niezbędne do rozwiązania problemu wrodzonych wad serca u ludzi. Rozwój prymitywnych zastawek serca obejmuje przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) komórek wsierdzia z obszarów kanału przedsionkowo-komorowego (AVC) i drogi odpływu (OFT) serca w odpowiedzi na lokalne indukcyjne sygnały mięśnia sercowego i wsierdzia. Gdy komórki rozwarstwiają się i atakują macierz zewnątrzkomórkową (galaretę serca) znajdującą się między wsierdziem a mięśniem sercowym, powstają prymitywne poduszki wsierdziowe (EC). Proces ten oznacza, że wsierdzie musi wypełnić luki pozostawione przez rozwarstwione komórki i musi się zreorganizować, aby zbiegać się (zwężać) lub rozciągać (wydłużać) wzdłuż osi. Obecne badania sugerują, że szlak płaskiej polaryzacji komórek (PCP) reguluje subkomórkową lokalizację czynników zaangażowanych w ten proces. Klasycznie początkowe fazy rozwoju zastawek serca badano w przekrojach embrionalnych serc lub w eksplantatach ex vivo AVC lub OFT hodowanych na żelach kolagenowych. Podejścia te pozwalają na analizę polaryzacji wierzchołkowo-podstawnej, ale nie pozwalają na analizę zachowania komórek w płaszczyźnie nabłonka lub zmian morfologicznych migrujących komórek. Tutaj pokazujemy podejście eksperymentalne, które pozwala na wizualizację wsierdzia w regionach walwugennych jako płaskiego pola komórek. To eksperymentalne podejście daje możliwość zbadania PCP, topologii płaskiej i komunikacji międzykomórkowej w obrębie wsierdzia OFT i AVC podczas rozwoju zastawki. Rozszyfrowanie nowych mechanizmów komórkowych zaangażowanych w morfogenezę zastawek serca może przyczynić się do zrozumienia wrodzonych wad serca związanych z ubytkami poduszki wsierdzia.

Dane uzyskane przy użyciu niniejszego protokołu wykazują, że możliwe jest przeprowadzenie en face obrazowanie endokardium kanału przedsionkowo-komorowego (AVC). Pierwszym celem była analiza kształtu komórek endokardium podczas formowania się zastawek w rozdzielczości komórkowej (Rycina 1). Aby wyróżnić pojedyncze komórki endokardium w dniu E9.5, wykorzystaliśmy dwie transgeniczne linie myszy. (1) ROSAmT/mG jest dwukolorowym fluorescencyjnym allelem reporterowym C...

Klasycznie, wsierdzie zarodka zarodka zastawki myszy zostało przeanalizowane za pomocą przekrojów poprzecznych, czołowych lub strzałkowych. Nasze nowatorskie podejście do dwuwymiarowego obrazowania wsierdzia en face w regionach walwugennych umożliwia analizę polaryzacji planarnej i rearanżacji komórek wsierdzia podczas rozwoju zastawki.

En Face Przygotowanie poduszki wsierdzia do planarnej analizy morfogenezy u zarodków myszy

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Protokół ten pozwala na analizę pierwotnego wsierdzia w orientacji płaskiej. Możemy przeanalizować rozmieszczenie komórek wsierdzia, anizotropię innych nakazów i opisać kształt pojedynczej komórki wsierdzia podczas rozwoju zastawki. W porównaniu z klasycznymi wycinkami tkanek, obrazowanie en face obszaru regeneracyjnego wewnętrznej zastawki pozwala na analizę płaskiej polaryzacji komórek i dynamiki komórek wsierdzia podczas rozwoju zastawki w nienaruszonych zarodkach.Metoda ta może być wykorzystana do pogłębienia wiedzy na temat płaskiej polaryzacji komórek podczas rozwoju cardio. Zacznij od umieszczenia macicy wyciętej od ciężarnych myszy poddanych eutanazji na szalce Petriego zawierającej lodowaty PBT. Usuń pojedynczą decyzję z macicy pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą drobnych kleszczy.Za pomocą cienkiej pęsety wykonaj nacięcie w białej części decidua, czyli w miejscu, w którym znajduje się zarodek. Usuń go delikatnie, unikaj ciągnięcia i przenieś zarodki na nową szalkę Petriego ze świeżym PBT za pomocą P-1000 z odciętą końcówką, pozostawiając średnicę wystarczająco dużą, aby zarodek mógł przejść bez pękania. Do genotypowania weź mały kawałek woreczka żółtkowego o powierzchni około 0,5 milimetra kwadratowego lub kawałek ogona od tylnego końca, licząc od pięciu do 10 somitów w kierunku głowy i strawij go w 100 mililitrach odpowiedniego buforu.Pod wyciągiem przenieś zarodki do lodowatego 4% PFA w dwumililitrowej probówce do mikrowirówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Utrwal zarodki od dwóch godzin do nocy w temperaturze czterech stopni Celsjusza na nutatorze. Pod wyciągiem wyciągowym usuń utrwalacz 4% PFA z probówek do mikrowirówek, nie dotykając zarodków.Wyrzuć PFA do odpowiedniego pojemnika. Umyj zarodki pięć razy w zimnym PBT przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą cienkich kleszczy wyjmij serce i przenieś je do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej ze świeżym PBT.Zastąp PBT PBS Triton i umyj próbki trzykrotnie, po pięć minut każda, w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Zastąp PBS Triton roztworem blokującym zawierającym PBS Triton 10% inaktywowaną termicznie surowicą bydlęcą. Inkubować od dwóch godzin do nocy w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej.Zastąp roztwór blokujący roztworem blokującym zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe o pożądanym stężeniu. Inkubować przez noc na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza inkubować próbki przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia stosunku sygnału do szumu. Usuń i utrzymuj główny roztwór przeciwciała w temperaturze czterech stopni Celsjusza, do trzech przyszłych eksperymentów. Dodaj azydek sodu do końcowego stężenia 0,02%, aby uzyskać najlepszą ochronę.Następnie umyj zarodki trzykrotnie PBS Triton przez trzy minuty każdy. Umyj zarodki PBS Triton trzykrotnie przez 30 minut i trzymaj je na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po ostatnim przemyciu dodać jeden mililitr roztworu blokującego zawierającego sprzężone fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała gospodarza.Następnie dodaj DAPI do roztworu i inkubuj zarodki przez noc na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza inkubuj zarodki przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Ten krok jest niezbędny, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.Powtórz kroki mycia PBS Triton, jak wspomniano w manuskrypcie tekstowym. Umieść serca na 35-milimetrowej szalce Petriego zawierającej PBS. Za pomocą drutu wolframowego i drobnych kleszczyków odizoluj kanał przedsionkowo-komorowy lub drogę odpływu i przetnij je wzdłużnie.Przygotuj szkiełka nakrywkowe, szkiełka, kleszcze, pipetę P-200 z odpowiednimi końcówkami, ręcznik papierowy i wszelkie wodne media montażowe na bazie glicerolu do fluorescencji bez DAPI. Przyklej dwa paski taśmy na szkiełku oddalone od siebie o 0,3 do 0,6 centymetra, aby stworzyć przestrzeń 3D, która pozwoli próbkom zachować swój pierwotny kształt bez ich zgniatania. Następnie, używając około 20 mikrolitrów buforu, ostrożnie upuść próbki na szkiełko między paskami taśmy za pomocą przeciętej końcówki pipety P-200.Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zwiększyć dokładność. Za pomocą cienkich kleszczyków umieść próbki z wsierdziem skierowanym do góry i mięśniem sercowym w dół na szkiełku. Usuń nadmiar PBS ręcznikiem papierowym i unikaj dotykania próbki.Następnie suszyć próbki przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej, aby próbki przykleiły się do szkiełka. Dodać 40 mikrolitrów wodnego podłoża montażowego do tkanki. Umieść szkiełko nakrywkowe na dwóch kawałkach taśmy i powoli opuść je na chusteczkę za pomocą igły lub kleszczyków.Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą jednej kropli lakieru do paznokci na każdym wierzchołku szkiełka nakrywkowego. Po wyschnięciu lakieru do paznokci wyczyść nadmiar nośnika montażowego z boków szkiełka nakrywkowego za pomocą chłonnego ręcznika papierowego.Unikać przesuwania szkiełka nakrywkowego. Dodaj lakier do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby całkowicie go uszczelnić, zapobiegając parowaniu mediów montażowych. Używając pionowego lub odwróconego mikroskopu konfokalnego, rób zdjęcia w 10-krotnym powiększeniu dla widoku ogólnego i 63-krotnym z 3-krotnym zoomem dla szczegółowych obrazów.Kształt komórek wsierdzia analizowano podczas tworzenia zastawek w rozdzielczości komórkowej. Pojedyncze komórki lub klony kilku komórek wykazywały ekspresję GFP w wsierdziu. Ekspresja GFP i połączenie z lokalizacją subkomórkową VE kadheryny było skutecznym podejściem do badania związku między dynamiką AJ a tworzeniem filopodiów a komórkami pre-EMT, ponieważ komórki te rozwinęły wypukłości błony w miarę rozpuszczania się AJ.Różnice w intensywności barwienia VE-kadheryny w wsierdziu wskazywały na obecność kurczliwości anizotropowej w zarodkowym wsierdziu kanału przedsionkowo-komorowego w stadiach przedzastawkowych. Całe serce przebarwiono przeciwciałem VE-kadheryny o stężeniach E8,5 i E9,5. W E8.5 wsierdzie kanału przedsionkowo-komorowego miało tendencję do stabilnej organizacji nabłonka, a wierzchołki utworzone przez więcej niż cztery komórki nie zostały wykryte.W E9.5 zaobserwowano, że wierzchołki do sześciu komórek tworzą struktury przypominające rozety, podobne do organizacji komórkowej opisanej wcześniej w nabłonku ulegającym aktywnym rearanżacjom komórek, co sugeruje, że wsierdzie kanału przedsionkowo-komorowego ulegało dynamicznemu przegrupowaniu komórkowemu podczas rozwoju zastawki. Aby stać się ekspertem w tej technice, niezbędna jest krzywa uczenia się. Ponadto zdecydowanie zaleca się stosowanie kleszczy Sovereign i drutu wolframowego.Współcześnie wizualizacja wsierdzia przedzastawkowego ograniczała się do przekrojów. Nasze podejście daje możliwość badania zachowania zarodka zastawkowego wsierdzia z płaskiego punktu widzenia.

en-face-endocardial-cushion-preparation-for-planar-morphogenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Przedstawiamy protokół analizy naczyń wieńcowych w całych embrionalnych sercach myszy do E15.5, przy użyciu standardowych metod barwienia immunologicznego, a następnie klirensu optycznego i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia wizualizację naczyń krwionośnych w całym sercu bez konieczności czasochłonnej analizy odcinków seryjnych.

Analiza naczyń wieńcowych w oczyszczonych sercach embrionalnych

Tutaj opisujemy protokół immunofluorescencji całego wierzchowca i ilościowej analizy objętościowej zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju. Przedstawiamy tę technikę jako potężne podejście do jakościowej i ilościowej oceny struktur serca podczas rozwoju i sugerujemy, że może być ona szeroko adaptowalna do innych układów narządów.

Ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy

Ten protokół opisuje metodę fotokonwersji białka fluorescencyjnego Kaede w komórkach wsierdzia żywego zarodka danio pręgowanego, która umożliwia śledzenie komórek wsierdzia podczas rozwoju kanału przedsionkowo-komorowego i zastawki przedsionkowo-komorowej serca.

Śledzenie ruchów tkanki wsierdzia poprzez fotokonwersję komórek w zarodku danio pręgowanego

Węzeł i płytka struny grzbietowej są przejściowymi organizatorami sygnalizacji w rozwoju mysich embrionów, które można wizualizować za pomocą kilku technik. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wykonać dwie techniki badania ich struktury i morfogenezy: 1) skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM); i 2) immunofluorescencja całej góry (WMIF).

Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Ten artykuł szczegółowo opisuje metody diagnostyki mysiej wrodzonej wady serca (CHD) za pomocą echokardiografii płodu, sekcji zwłok i episkopowego przechwytywania obrazu fluorescencyjnego (EFIC) za pomocą episkopowej mikroskopii konfokalnej (ECM), a następnie trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji.

Linia do charakteryzowania strukturalnych wad serca u płodu myszy

Poznaj metodę en face do analizy morfogenezy poduszki wsierdzia u zarodków myszy. Technika ta umożliwia badanie polaryzacji komórkowej i dynamiki endokardu podczas rozwoju zastawek serca.

En Face Przygotowanie poduszki wsierdzia do planarnej analizy morfogenezy u zarodków myszy

Przeglądaj więcej filmów