Platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu "plug-and-display" oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2

Nanonauka może skutecznie wzmocnić specyficzną dla antygenu odpowiedź immunologiczną po wyświetleniu antygenów na powierzchni Główną zaletą tej platformy szczepionkowej może być uzyskanie płytki nazębnej i wyświetlania. Innymi słowy, platforma jest w stanie wyświetlić różnorodność antygenów w Metoda ta może być również stosowana do innych nanocząstek biologicznych w celu wyświetlenia silnika na nośnikach o rozmiarach nano. Aby przeprowadzić transformację cewnika szpiegowskiego cytolizyny A, zacznij od dodania pięciu mikrolitrów roztworu osocza do 50 mikrolitrów kompetentnego szczepu BL 21.

Delikatnie przedmuchaj i pozostaw do ostygnięcia na lodzie przez 30 minut. Umieść roztwór na 90 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza, a następnie natychmiast umieść zmieszany roztwór na lodzie na trzy minuty. Dodać 500 mikrolitrów pożywki luria bertani do zawiesiny bakteryjnej i po wymieszaniu kultury z prędkością 220 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie przez noc umieszczaj na płytce agarowej Luria bertani zawierającej ampicylinę i kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W przypadku produkcji szpiegołapów OMV zacznij od wyizolowania pojedynczej kolonii z płytki do 20 mililitrów pożywki luria bertani i hodowli przez noc w tempie 220 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Inkubować roztwór bakteryjny w dwulitrowym podłożu i hodować z prędkością 220 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć godzin, aż do osiągnięcia logarytmicznego etapu wzrostu.

Dodać izopropyl beta D-IPTG, aby końcowe stężenie roztworu bakteryjnego wynosiło 0,5 milimola, a następnie hodować przez noc z prędkością 220 obrotów na minutę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie wykonaj oczyszczanie OMV spycatcher. Zacznij od odśrodkowego stopienia roztworu bakteryjnego.

Przefiltrować supernatant za pomocą filtra membranowego o średnicy 0,22 mikrometra, a następnie zagęścić go za pomocą kolumny z pustych włókien. Przefiltrować koncentrat przez filtr membranowy o średnicy 0,22 mikrometra, następnie stopić go w temperaturze 150 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny za pomocą bezpiecznika ultra centri i wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Ponownie zawiesić opady za pomocą PBS i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby wykonać transfekcję RBD spytag, zacznij od wyboru odpowiedniego eukariotycznego systemu ekspresji i hoduj komórki przez noc z prędkością 130 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po wyzdrowieniu. Dodaj 20 mikrolitrów HEK 293F roztworu komórkowego do automatycznego licznika komórek. Zapisz liczbę komórek, dostosuj stężenie do jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr.

A następnie hoduj komórki z prędkością 130 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Przefiltruj plazmid znacznika szpiegowskiego RBD przez filtr membranowy o średnicy 0,22 mikrometra i dodaj 300 mikrogramów plazmidów do pożywki do hodowli komórek, aż ostateczna objętość wyniesie 10 mililitrów. Wstrząsaj przez 10 sekund.

Podgrzej PEI do 65 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Wymieszaj 0,7 mililitra PEI z 9,3 mililitra pożywki do hodowli komórkowych i wstrząsaj z przerwami przez 10 sekund. Dodaj roztwór plazmidu do roztworu PEI.

Potrząsaj mieszaniną z przerwami przez 10 sekund i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Dodaj mieszaninę do 280 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych i hoduj w tempie 130 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni. Następnie wykonaj oczyszczanie RBD spytag.

Zacznij od odśrodkowego zespolenia komórek w temperaturze 6 000 razy G w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 20 minut i użyj pipety, aby zebrać supernatant. Napełnij kolumnę dwoma mililitrami agarozy niklowej NTA i przemyj ją trzykrotnie PBS. Dodaj imidazol do supernatantu komórkowego, aby uzyskać końcowe stężenie 20 milimoli i załaduj supernatant komórkowy.

Dodać trzy objętości kolumny PBS zawierającej 20 milimoli imidazolu do przemywania i zebrać frakcję przemywającą. Elucja gradientowa z trzema objętościami kolumnowymi PBS zawierającymi niskie do wysokich stężenia elucji imidazolu dwa razy dla każdego stężenia. Aby określić stężenie białka metodą BCA, należy seryjnie rozcieńczyć standardowy roztwór białka BSA od dwóch do 0,0625 miligrama na mililitr, rozcieńczyć oczyszczony szpiegopat OMV i znacznik szpiegowski RBD 10 razy.

Następnie wymieszaj roztwory robocze BCA A i B w stosunku 50 do jednego. Dodaj rozcieńczony roztwór białka i wymieszaj z roztworem roboczym BCA. Inkubować w temperaturze 37 stopni przez 30 minut.

Zmierz absorbancję w 562 nanometrach każdego dołka i oblicz stężenie białka na podstawie krzywej wzorcowej. Aby przeprowadzić biokoniugację szpiega OMV i znacznika szpiegowskiego RBD, wymieszaj szpiega OMV i spytag RBD i PBS w stosunku 40 do jednego. Obróć w pionie, aby zmiksować mieszaninę przez noc z prędkością 15 obrotów na minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przeprowadzić oczyszczanie OMV RBD za pomocą roztworu PBS, stosując procedurę podobną do oczyszczania OMV spycatcher. Schemat projektowania plazmy pokazuje, że gen spycatcher jest połączony z genem cly A za pomocą elastycznego łącznika, podczas gdy spytag łączy się z pięcioma głównymi końcami genu RBD za pomocą genu hys tag w celu oczyszczenia i weryfikacji. Po ultrawirowaniu prawie cały nieprzereagowany spytag RBD pozostał w supernatancie.

Drugie ultrawirowanie nie przyniosło dalszej znaczącej przewagi w porównaniu z pierwszym razem. Średnia średnica hydrodynamiczna z OMV spycatcher wynosiła 133 nanometry, podczas gdy dla OMV-RBD 152,6 nanometra. Różnice te mogą wynikać z tego, że RBD zwiększa wielkość cząstek OMV po intensywnym wyświetlaniu.

Wyniki TEM są zgodne z rozkładem wielkości cząstek uzyskanym na podstawie wyników DLS. Rotacja do mieszania mieszanki jest bardzo ważna. Wydajność reakcji może być znacznie niższa bez rotacji.