Name: Platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu plug-and-display oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj platformę szczepionkową typu "plug-and-display" opartą na pęcherzykach błony zewnętrznej z domeną wiążącą receptor SARS-CoV-2. Ta metoda umożliwia prezentację wielu antygenów i wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kluczowy Program Fundacji Nauk Przyrodniczych Chongqing (nr cstc2020jcyj-zdxmX0027) oraz Projekt Chińskiej Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (nr 31670936, 82041045).

1. Budowa plazmidu
<ol>
	<li>Wstaw sekwencję SpyCatcher kodującą DNA (plik uzupełniający 1) do opornego na ampicylinę plazmidu pThioHisA-ClyA (patrz tabela materiałów) między miejscami BamH I i Sal I, aby skonstruować plazmid pThioHisA ClyA-SC zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem20.</li>
	<li>Zmonopolizuj zsyntetyzowany gen fuzyjny SpyTag-RBD-Histag (plik uzupełniający 1) do plazmidu pcDNA3.1 (patrz tabela materiałów) między miejscami BamH I i EcoR I, aby skonstruować plazmid pcDNA3.1 RBD-ST zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem19.</li>
</ol>
2. Przygotowanie OMV-SC
<ol>
	<li>Wykonaj transformację ClyA-SC, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Dodać 5 μl roztworu plazmidu pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) do 50 μl kompetentnego szczepu BL21, delikatnie przedmuchać i ostudzić na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Umieścić roztwór na 90 s w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, a następnie natychmiast umieścić zmieszany roztwór na lodzie na 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 500 μl pożywki LB do zawiesiny bakteryjnej i po wymieszaniu hodować przy 220 obr./min w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Całą przemianę należy umieścić na płytce agarowej LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml, patrz tabela materiałów) i hodować przez noc w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: W kolejnych eksperymentach ampicylina była utrzymywana w tym samym stężeniu w pożywce. Jeśli nie, może to spowodować utratę plazmidów w bakteriach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku produkcji OMV-SC wykonaj poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Wyizolować pojedynczą kolonię z płytki (etap 2.1.4) do 20 ml pożywki LB (odpornej na ampicylinę) i hodować przez noc przy prędkości 220 obr./min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zaszczepić roztwór bakteryjny (od kroku 2.2.1.) do 2 litrów pożywki, hodować przy 220 obr./min, 37 °C przez 5 godzin, aż do logarytmicznego etapu wzrostu (OD600 nm wynosi od 0,6 do 0,8).</li>
		<li>Gdy OD przy 600 nm roztworu bakteryjnego osiągnie 0,6-0,8, dodać beta-D-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG, patrz tabela materiałów), aby końcowe stężenie roztworu bakteryjnego wynosiło 0,5 mM, a następnie hodować przez noc przy 220 obr./min w temperaturze 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj oczyszczanie OMV-SC.
	<ol>
		<li>Odwirować roztwór bakteryjny o sile 7 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Przefiltrować supernatant za pomocą filtra membranowego 0,22 μm, a następnie zagęścić go za pomocą membrany ultrafiltracyjnej 100 kD lub kolumny z pustych włókien (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przefiltrować koncentrat przez filtr membranowy 0,22 μm, następnie odwirować go przy 150 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 godziny za pomocą ultrawirówki (patrz tabela materiałów) i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
		<li>Zawiesić wytrącanie za pomocą PBS i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Roztwór może utrzymać długotrwałą stabilność w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie RBD-ST
<ol>
	<li>Wykonaj transfekcję RBD-ST, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Wybierz odpowiedni eukariotyczny system ekspresji (np. HEK293F) i hoduj komórki przez noc w temperaturze 130 obr./min w temperaturze 37 °C po wyzdrowieniu.</li>
		<li>Dodać 20 μl roztworu komórek HEK293F do automatycznego licznika komórek (patrz tabela materiałów), zarejestrować liczbę komórek, dostosować stężenie do 1 x 106 komórek/ml, a następnie hodować komórki przy 130 obr./min w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
		<li>Przefiltrować plazmid RBD-ST przez filtr membranowy 0,22 μm i dodać 300 μg plazmidów do pożywki do hodowli komórkowej (patrz tabela materiałów), aż ostateczna objętość wyniesie 10 ml; wstrząsać przez 10 s.</li>
		<li>Podgrzać PEI (1 mg/ml, patrz tabela materiałów) do 65 °C w łaźni wodnej, zmieszać 0,7 ml PEI z 9,3 ml pożywki do hodowli komórkowych i wstrząsać z przerwami przez 10 s. 
		UWAGA: Nie potrząsaj energicznie roztworem. W przeciwnym razie powstałe pęcherzyki mogą wpłynąć na wydajność transfekcji.</li>
		<li>Dodać roztwór plazmidu do roztworu PEI, wstrząsać mieszaniną z przerwami przez 10 s i inkubować ją w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać mieszaninę do 280 ml pożywki do hodowli komórkowych i hodować ją z prędkością 130 obr./min w temperaturze 37 °C przez 5 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj oczyszczanie RBD-ST.
	<ol>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 6 000 x g w temperaturze 25 °C przez 20 minut i użyć pipety do zebrania supernatantu.</li>
		<li>Napełnij kolumnę 2 ml agarozy Ni-NTA (patrz Tabela Materiałów) i przemyj ją 3x 3x PBS.</li>
		<li>Dodać imidazol (patrz tabela materiałów) do supernatantu komórkowego, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mM, i załadować supernatant komórki 2x.</li>
		<li>Dodać 3 objętości kolumn (CV) PBS zawierających 20 mM imidazolu do przemywania i zebrać frakcję płuczącą.</li>
		<li>Elucja gradientowa z 3 CV PBS zawierającego niskie do wysokich stężeń (np. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) imidazolu; eluować 2x dla każdego stężenia.</li>
		<li>Użyj SDS-PAGE21, aby zidentyfikować RBD-ST w różnych gradientach stężeń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Biokoniugacja i oczyszczanie OMV-RBD
<ol>
	<li>Oznaczyć stężenie białka metodą BCA (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Seryjnie rozcieńczyć wzorcowy roztwór białka BSA od 2 mg/ml do 0,0625 mg/ml, rozcieńczyć oczyszczone OMV-SC i RBD-ST 10x, a następnie wymieszać roztwory robocze BCA A i B (dostarczone w zestawie do oznaczania) w stosunku 50:1 (v/v).</li>
		<li>Dodać rozcieńczony roztwór białka (25 μl/basenik) i wymieszać z roztworem roboczym BCA (200 μl/basenik); inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Zmierz absorbancję (OD) przy 562 nm każdego dołka i oblicz stężenie białka z krzywej wzorcowej22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj biokoniugację OMV-SC i RBD-ST, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Wymieszaj OMV-SC i RBD-ST w PBS w proporcji 40:1 (w/w).</li>
		<li>Obrócić w pionie, aby zmiksować mieszaninę przez noc z prędkością 15 obr./min w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Różne antygeny mogą reagować w różnych proporcjach. Można próbować różnych proporcji reakcji w zależności od charakterystyki antygenu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź skuteczność reakcji.
	<ol>
		<li>Przygotować 10 μl OMV-SC, RBD-ST i produkt reakcji (krok 4.2.). Dodać 2,5 μl 5-krotnego buforu ładującego (patrz tabela materiałów) i podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Załadować próbki do żelu (10 μl/basenik). Wykonuj elektroforezę przy napięciu 60 V przez 20 min i zmień stan na 120 V na 1 godzinę.</li>
		<li>Przenieść białko z żelu do membran Western Blot PVDF (patrz tabela materiałów) pod napięciem 100 V przez 70 minut.</li>
		<li>Włożyć membranę do 5% odtłuszczonego mleka w proszku/TBST i wstrząsać przez 1 godzinę. Następnie umyć 3x TBST przez 5 minut na każde mycie z potrząsaniem.</li>
		<li>Umieścić membranę w 0,1% przeciwciałie His-Tag/TBST (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsać przez 1 godzinę, następnie przemywać 3x TBST przez 5 minut na pranie z potrząsaniem.</li>
		<li>Umieścić membranę w 0,02% przeciwciałie anty-mysim IgG1 (HRP)/TBST (patrz Tabela Materiałów) i wstrząsać przez 40 min, a następnie przemywać 3x TBST przez 5 minut na pranie z potrząsaniem.</li>
		<li>Dodać ulepszony roztwór chemiluminescencji (patrz tabela materiałów) i odsłonić membranę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić oczyszczanie OMV-RBD.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 1 ml przereagowanego roztworu OMV-RBD do objętości 10 ml i odwirować rozcieńczenie przy 150 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Za pomocą pipety usunąć supernatant i zawiesić pozostałość w 10 ml PBS. Odwirować zawiesinę o sile 150 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i zawiesić pozostałość w 1 ml PBS. 
		UWAGA: Jeśli rozpuszczalność antygenu jest znacznie niższa, ten sam efekt separacji można osiągnąć za pomocą chromatografii wykluczającej według wielkości19.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Charakterystyka
<ol>
	<li>Wykonaj dynamiczne rozpraszanie światła (DLS).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbki do stężenia 100 μg/ml i dodać 1 ml próbki do celi próbki.</li>
		<li>Wybierz "Rozmiar" dla "Typu pomiaru", "Białko" dla "Materiału próbki", "Woda" dla "Dyspergatora", "25 °C" dla "Temperatury", a następnie załaduj próbki i zmierz automatycznie23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbki do 100 μg/ml. Weź miedzianą siatkę o oczkach 200, dodaj do niej 20 μl próbki i pozostaw do wchłonięcia przez 10 minut.</li>
		<li>Użyj bibuły filtracyjnej, aby odsączyć roztwór, dodaj 20 μl 3% octanu uranylu do folii nośnej i barwij przez 30 s.</li>
		<li>Odsiądź octan uranylu i wysusz film w sposób naturalny w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Załadować próbki do systemu TEM (patrz tabela materiałów) i wykonać obrazy przy napięciu 80 kV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li>
<li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433(2020).</li>
<li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li>
<li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles%3A+From+discovery+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li>
<li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li>
<li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683(2019).</li>
<li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li>
<li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines%3A+A+new+toolkit+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314(2019).</li>
<li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li>
<li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li>
<li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li>
<li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li>
<li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+Structure%2C+Biology%2C+and+Structure-Based+Therapeutics+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+%28ZF2001%29+against+COVID-19+in+adults%3A+Two+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+phase+1+and+2+trials%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li>
<li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD%2C+RBD%2C+and+S2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li>
<li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403(2021).</li>
<li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739(2021).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+%28RBD%29+and+heptad+repeat+%28HR%29+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li>
<li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimer-PAGE%3A+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341(2017).</li>
<li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001(2021).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli%3A+Design%2C+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458(2016).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li>
<li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li>
<li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li>
<li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li>
<li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li>
<li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890(2020).</li>
<li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li>
<li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066(2021).</li>
<li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776(2016).</li>
<li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090(2021).</li>
<li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby stworzyć platformę szczepionkową nanocząsteczkową typu "Plug-and-Display", ClyA z fuzją SC poddano ekspresji w szczepach BL21(DE3), które są jednym z najczęściej stosowanych modeli produkcji białek rekombinowanych ze względu na jego zalety w ekspresji białek24, tak aby podczas procesu namnażania się bakterii na powierzchni OMV wyświetlała się wystarczająca ilość fragmentu SC. W tym samym czasie przygotowano antygen docelowy z fuzją ST do chemicznego sprzężenia między antygenami a OMV. Zalety t...

Jako potencjalna platforma szczepionkowa, pęcherzyki błony zewnętrznej (OMV) przyciągają coraz więcej uwagi w ostatnich latach1,2. OMV, wydzielane głównie naturalnie przez bakterie Gram-ujemne3, to sferyczne nanocząsteczki zbudowane z dwuwarstwy lipidowej, zwykle o wielkości 20-300 nm4. OMV zawierają różne rodzicielskie składniki bakteryjne, w tym antygeny bakteryjne i wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), które służą jako stałe wzmacniacze odporności5. Korzystając z ich unikalnych składników, naturalnej struktury pęcherzyków i doskonałych miejsc modyfikacji inżynierii genetycznej, OMV zostały opracowane do użytku w wielu dziedzinach biomedycznych, w tym w szczepionkach bakteryjnych6, adiuwantach7, lekach do immunoterapii nowotworów8, wektorach dostarczania leków9 i klejach antybakteryjnych10.
Pandemia SARS-CoV-2, która rozprzestrzenia się na całym świecie od 2020 roku, zebrała ogromne żniwo w globalnym społeczeństwie. Domena wiążąca receptor (RBD) w białku kolca (białko S) może wiązać się z ludzkim enzymem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2), który następnie pośredniczy w wejściu wirusa do komórki11,12,13. W związku z tym RBD wydaje się być głównym celem dla odkrycia szczepionki14,15,16. Jednak monomeryczny RBD jest słabo immunogenny, a jego mała masa cząsteczkowa utrudnia rozpoznanie go układowi odpornościowemu, dlatego często wymagane są adiuwanty17.
W celu zwiększenia immunogenności RBD, skonstruowano OMV wykazujące wielowartościowe RBD. Istniejące badania wykorzystujące OMV do wyświetlania RBD zwykle łączą RBD z OMV w celu uzyskania ekspresji w bakteriach18. Jednak RBD jest białkiem pochodzącym z wirusa, a ekspresja prokariotyczna prawdopodobnie wpływa na jego aktywność. Aby rozwiązać ten problem, system SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), pochodzący od Streptococcus pyogenes, został użyty do utworzenia kowalencyjnego izopeptydu z OMV i RBD w konwencjonalnym systemie buforowym19. Domena SC była wyrażana przez cytolizynę A (ClyA) jako białko fuzyjne przez bioinżynieryjną Escherichia coli, a ST była wyrażana przez RBD za pośrednictwem HEK293F komórkowego systemu ekspresji. OMV-SC i RBD-ST mieszano i inkubowano przez noc. Po oczyszczeniu za pomocą ultrawirowania lub chromatografii wykluczającej (SEC) OMV-RBD otrzymano.

<table><tbody><tr><td>Ampicylina sodowa</td><td>Sangon Biotech A610028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Zestaw do</td><td></td> oznaczania ilościowego białek BCA Countstar BioTech <td></td></tr><tr><td></td><td>cwbio</td><td>cw0014s</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Dotykowy system obrazowania</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danamic Rozpraszanie światła</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano S90</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy</td><td>Cavoy</td><td>Power BV</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Buffers H 10X TBST Bufor</td><td>Sangon Biotech</td><td>C520009</td><td></td></tr><tr><td>Kozia pAb do myszy IgG1</td><td>Abcam</td><td>ab97240</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do zamrażania o dużej prędkości</td><td>Bioridge</td><td>H2500R</td><td></td></tr><tr><td>Mysz His-Tag mAb</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2366s</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td>A600277</tr><tr><td>Beta-D-tiogalaktopiranozyd izopropylu</td><td>Sangon Biotech A600118</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td><td>Qiagen</td><td>70691</td><td></td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td></td> Pożywka do hodowli komórkowych <td>Sangon Biotech</td> A600669 <td></td></tr><tr><td>OPM-293</td><td>Opm biosciences</td><td>81075-001</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 Plazmid RBD-ST</td><td>Genekreat z Wuhan technologia</td><td></td><td></td>biologiczna</tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól</td><td>fizjologiczna ZSGB-bio</td><td>ZLI-9061</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenina Linear</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Wstępnie barwiona drabinka białkowa</td><td>Thermo</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>pThioHisA ClyA-SC plazmid</td><td>genecreat Wuhan</td><td></td><td></td>technologia biologiczna</tr><tr><td>PVDF Western Blotting Membranes</td><td>Roche</td><td></td><td></td>03010040001</tr><tr><td>Systemy stołowe Quixstand (kolumna z pustych włókien 100 kD)</td><td></td>Bufor ładowania SDS-PAGE GE healthcare <td></td><td></td></tr><tr><td>(5x)</td><td>Beyotime</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal west pico PLUS (ulepszony roztwór chemiluminescencyjny)</td><td>Thermo</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do zawieszania</td><td>Life Technology</td><td>Mikser</td><td></td>Hula</tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>Hitachi</td><td>HT7800</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr ultrafioletowy</td><td>Hitachi</td><td>U-3900</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610961</td><td></td></tr></tbody></table>

platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu "plug-and-display" oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor sars-cov-2

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Biomimetyczne nanocząstki uzyskane z bakterii lub wirusów wzbudziły duże zainteresowanie badaniami i rozwojem szczepionek. Pęcherzyki błony zewnętrznej (OMV) są wydzielane głównie przez bakterie Gram-ujemne podczas średniego wzrostu, o średnicy nano i aktywności samoadiuwantowej, które mogą być idealne do podawania szczepionek. OMV funkcjonują jako wieloaspektowy system dostarczania białek, kwasów nukleinowych i małych cząsteczek. Aby w pełni wykorzystać biologiczne cechy OMV, bioinżynieryjne OMV pochodzące z Escherichia coli wykorzystano jako nośnik i domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2 (RBD) jako antygen w celu skonstruowania platformy szczepionkowej "Plug-and-Display". Domeny SpyCatcher (SC) i SpyTag (ST) w Streptococcus pyogenes zastosowano do sprzężonych OMV i RBD. Gen cytolizyny A (ClyA) uległ translacji z genem SC jako białko fuzyjne po transfekcji plazmidu, pozostawiając reaktywne miejsce na powierzchni OMV. Po zmieszaniu RBD-ST w konwencjonalnym systemie buforowym przez noc, powstało kowalencyjne wiązanie między OMV a RBD. W ten sposób uzyskano szczepionkę OMV z wielowalentnym wyświetlaczem. Zastępując je różnymi antygenami, platforma szczepionek OMV może skutecznie wyświetlać różnorodne heterogeniczne antygeny, co potencjalnie szybko zapobiega epidemiom chorób zakaźnych. Protokół ten opisuje precyzyjną metodę konstruowania platformy szczepionki OMV, w tym produkcję, oczyszczanie, biokoniugację i charakterystykę.

Schemat blokowy tego protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Niniejszy protokół może stanowić ogólne podejście do wykorzystania OMV jako platformy szczepionkowej; należy jedynie dobrać odpowiednie systemy ekspresyjne w zależności od rodzaju antygenów.
Rysunek 2 przedstawia możliwy schemat konstrukcji plazmidu. Gen SC jest połączony z genem ClyA za pomocą elastycznego łącznika, natomiast ST łączy się z końcem 5' genu RBD wraz z genem His...

Obecny protokół opisuje bioinżynierię pęcherzyków błony zewnętrznej jako platformę szczepionki typu "Plug-and-Display", obejmującą produkcję, oczyszczanie, biokoniugację i charakterystykę.

Platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu "plug-and-display" oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

Nanonauka może skutecznie wzmocnić specyficzną dla antygenu odpowiedź immunologiczną po wyświetleniu antygenów na powierzchni Główną zaletą tej platformy szczepionkowej może być uzyskanie płytki nazębnej i wyświetlania. Innymi słowy, platforma jest w stanie wyświetlić różnorodność antygenów w Metoda ta może być również stosowana do innych nanocząstek biologicznych w celu wyświetlenia silnika na nośnikach o rozmiarach nano. Aby przeprowadzić transformację cewnika szpiegowskiego cytolizyny A, zacznij od dodania pięciu mikrolitrów roztworu osocza do 50 mikrolitrów kompetentnego szczepu BL 21.Delikatnie przedmuchaj i pozostaw do ostygnięcia na lodzie przez 30 minut. Umieść roztwór na 90 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza, a następnie natychmiast umieść zmieszany roztwór na lodzie na trzy minuty. Dodać 500 mikrolitrów pożywki luria bertani do zawiesiny bakteryjnej i po wymieszaniu kultury z prędkością 220 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Następnie przez noc umieszczaj na płytce agarowej Luria bertani zawierającej ampicylinę i kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W przypadku produkcji szpiegołapów OMV zacznij od wyizolowania pojedynczej kolonii z płytki do 20 mililitrów pożywki luria bertani i hodowli przez noc w tempie 220 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Inkubować roztwór bakteryjny w dwulitrowym podłożu i hodować z prędkością 220 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć godzin, aż do osiągnięcia logarytmicznego etapu wzrostu.Dodać izopropyl beta D-IPTG, aby końcowe stężenie roztworu bakteryjnego wynosiło 0,5 milimola, a następnie hodować przez noc z prędkością 220 obrotów na minutę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie wykonaj oczyszczanie OMV spycatcher. Zacznij od odśrodkowego stopienia roztworu bakteryjnego.Przefiltrować supernatant za pomocą filtra membranowego o średnicy 0,22 mikrometra, a następnie zagęścić go za pomocą kolumny z pustych włókien. Przefiltrować koncentrat przez filtr membranowy o średnicy 0,22 mikrometra, następnie stopić go w temperaturze 150 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny za pomocą bezpiecznika ultra centri i wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Ponownie zawiesić opady za pomocą PBS i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby wykonać transfekcję RBD spytag, zacznij od wyboru odpowiedniego eukariotycznego systemu ekspresji i hoduj komórki przez noc z prędkością 130 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza po wyzdrowieniu. Dodaj 20 mikrolitrów HEK 293F roztworu komórkowego do automatycznego licznika komórek. Zapisz liczbę komórek, dostosuj stężenie do jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr.A następnie hoduj komórki z prędkością 130 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Przefiltruj plazmid znacznika szpiegowskiego RBD przez filtr membranowy o średnicy 0,22 mikrometra i dodaj 300 mikrogramów plazmidów do pożywki do hodowli komórek, aż ostateczna objętość wyniesie 10 mililitrów. Wstrząsaj przez 10 sekund.Podgrzej PEI do 65 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Wymieszaj 0,7 mililitra PEI z 9,3 mililitra pożywki do hodowli komórkowych i wstrząsaj z przerwami przez 10 sekund. Dodaj roztwór plazmidu do roztworu PEI.Potrząsaj mieszaniną z przerwami przez 10 sekund i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Dodaj mieszaninę do 280 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych i hoduj w tempie 130 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni. Następnie wykonaj oczyszczanie RBD spytag.Zacznij od odśrodkowego zespolenia komórek w temperaturze 6 000 razy G w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 20 minut i użyj pipety, aby zebrać supernatant. Napełnij kolumnę dwoma mililitrami agarozy niklowej NTA i przemyj ją trzykrotnie PBS. Dodaj imidazol do supernatantu komórkowego, aby uzyskać końcowe stężenie 20 milimoli i załaduj supernatant komórkowy.Dodać trzy objętości kolumny PBS zawierającej 20 milimoli imidazolu do przemywania i zebrać frakcję przemywającą. Elucja gradientowa z trzema objętościami kolumnowymi PBS zawierającymi niskie do wysokich stężenia elucji imidazolu dwa razy dla każdego stężenia. Aby określić stężenie białka metodą BCA, należy seryjnie rozcieńczyć standardowy roztwór białka BSA od dwóch do 0,0625 miligrama na mililitr, rozcieńczyć oczyszczony szpiegopat OMV i znacznik szpiegowski RBD 10 razy.Następnie wymieszaj roztwory robocze BCA A i B w stosunku 50 do jednego. Dodaj rozcieńczony roztwór białka i wymieszaj z roztworem roboczym BCA. Inkubować w temperaturze 37 stopni przez 30 minut.Zmierz absorbancję w 562 nanometrach każdego dołka i oblicz stężenie białka na podstawie krzywej wzorcowej. Aby przeprowadzić biokoniugację szpiega OMV i znacznika szpiegowskiego RBD, wymieszaj szpiega OMV i spytag RBD i PBS w stosunku 40 do jednego. Obróć w pionie, aby zmiksować mieszaninę przez noc z prędkością 15 obrotów na minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przeprowadzić oczyszczanie OMV RBD za pomocą roztworu PBS, stosując procedurę podobną do oczyszczania OMV spycatcher. Schemat projektowania plazmy pokazuje, że gen spycatcher jest połączony z genem cly A za pomocą elastycznego łącznika, podczas gdy spytag łączy się z pięcioma głównymi końcami genu RBD za pomocą genu hys tag w celu oczyszczenia i weryfikacji. Po ultrawirowaniu prawie cały nieprzereagowany spytag RBD pozostał w supernatancie.Drugie ultrawirowanie nie przyniosło dalszej znaczącej przewagi w porównaniu z pierwszym razem. Średnia średnica hydrodynamiczna z OMV spycatcher wynosiła 133 nanometry, podczas gdy dla OMV-RBD 152,6 nanometra. Różnice te mogą wynikać z tego, że RBD zwiększa wielkość cząstek OMV po intensywnym wyświetlaniu.Wyniki TEM są zgodne z rozkładem wielkości cząstek uzyskanym na podstawie wyników DLS. Rotacja do mieszania mieszanki jest bardzo ważna. Wydajność reakcji może być znacznie niższa bez rotacji.

a-plug-display-nanoparticle-vaccine-platform-based-on-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy protokół opisuje ogólną procedurę badania subunitowych szczepionek opartych na rekombinowanym domenie wiążącej receptor (RBD) przeciwko SARS. Obejmuje on metody transfekcji i ekspresji białka RBD w komórkach 293T, immunizację myszy białkiem RBD oraz wykrywanie aktywności neutralizacji w surowicach mysich przy użyciu uznanego testu neutralizacji pseudowirusa SARS. <br...

Protokół dla rekombinowanych szczepionek przeciwko SARS opartych na RBD: przygotowanie białka, szczepienie zwierząt i detekcja neutralizacji

Ten film demonstruje metodę generowania szczepionek przeciwko pęcherzykom błony zewnętrznej (OMV) wyświetlającym wiele wartości. Komórki ssaków są transfekowane w celu ekspresji i wydzielania antygenów wirusowych połączonych ze znacznikiem SpyTag i znacznikiem polihistydyny. Antygeny te są następnie oczyszczane przy użyciu kolumny powinowactwa do kwasu niklowo-nitrylotryoctowego (Ni-NTA). Oczyszczony antygen miesza się z pęcherzykami błony zewnętrznej wykazującymi ekspresję powierzchniowego...

Wytwarzanie wielowalentnej szczepionki pęcherzykowej z błoną zewnętrzną

Zaprojektowaliśmy białko kapsydu wirusa zapalenia wątroby typu E jako nanocząstkę teranostyczną (HEVNP). HEVNP samoorganizuje się w stabilną klatkę dwudziestościenną podczas dostarczania błony śluzowej. W tym miejscu opisujemy modyfikację HEVNP do celowania w guz poprzez mutację reszt wystawionych na powierzchni do cystein, które sprzęgają syntetyczne ligandy, które specyficznie wiążą komórki nowotworowe.

Funkcjonalizacja powierzchni nanocząstek wirusa zapalenia wątroby typu E przy użyciu metod koniugacji chemicznej

Tutaj prezentujemy protokół generowania pseudotypowanych cząstek w ustawieniu BSL-2 zawierających białko kolca wysoce patogennych wirusów bliskowschodniego zespołu oddechowego i koronawirusów zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej. Te pseudotypowane cząstki zawierają gen reporterowy lucyferazy, który umożliwia ilościowe określenie wnikania wirusa do docelowych komórek gospodarza.

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

Szczegółowa metoda jest tutaj opisana jako oczyszczanie, ponowne fałdowanie i charakterystyka samoorganizujących się nanocząstek białkowych (SAPN) do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek.

Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia...

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

W tym protokole, kropki kwantowe sprzężone z rekombinowanym kolcem SARS-CoV-2 umożliwiają testom komórkowym monitorowanie wiązania kolców z hACE2 na błonie plazmatycznej i późniejszej endocytozy białek związanych z cytoplazmą.

Wysokoprzepustowe obrazowanie konfokalne trymerów kolców SARS-CoV-2 sprzężonych z kropkami kwantowymi w celu śledzenia wiązania i endocytozy w komórkach HEK293T

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Prezentujemy zoptymalizowany protokół in vitro do wytwarzania cząsteczek podobnych do wirusa SARS-CoV-2, które ściśle naśladują autentycznego wirusa. Takie podejście umożliwia badanie mechanizmów infekcji wirusowej, montażu i wychodzenia bez ograniczeń związanych z koniecznością posiadania laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3.

Produkcja systemu cząstek wirusopodobnych SARS-CoV-2 do badania cykli życiowych wirusa in vitro

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Poznaj platformę szczepionkową typu "plug-and-display" opartą na pęcherzykach błony zewnętrznej z domeną wiążącą receptor SARS-CoV-2. Ta metoda umożliwia prezentację wielu antygenów i wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej.

Platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu plug-and-display oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2 (Wideo) | JoVE Journal

Platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu "plug-and-display" oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2

Przeglądaj więcej filmów