Pomiar ściśliwości komórki i jądra w oparciu o mikrourządzenie akustyczne

Mechanika komórkowa odgrywa ważną rolę w przerzutach guza, złośliwej transformacji komórek i wrażliwości na promieniowanie . Metoda akustofluidyczna może realizować szybkie i nieniszczące pomiary w stanach zawieszenia. Technika ta może być wykorzystana do odzwierciedlenia zmiany samościśliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego i oddzielenia krążących komórek nowotworowych, co pokazuje perspektywy jej zastosowania w diagnostyce raka.

Aby rozpocząć, zwiąż blok PDMS z chipem, wybijając otwory w bloku PDMS na porty wlotowe i wylotowe za pomocą pustej igły o średnicy jednego milimetra. Następnie umieść bloki PDMS i chip tyłem do góry w myjce plazmowej na jedną minutę. Po wyrównaniu otworów w blokach PDMS z wlotem i wylotem chipa, delikatnie dociśnij bloki PDMS do chipa przez 15 sekund, powodując połączenie między blokami PDMS a powierzchnią chipa.

Aby połączyć cewnik PTFE z chipem, wytnij dwa kawałki cewnika o średnicy wewnętrznej 0,8 milimetra i długości 10 centymetrów. Zegnij igłę ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 0,7 milimetra i długości 1,5 centymetra na 90 stopni w kształt litery L i podłącz ją do jednego końca cewnika. Włóż igły ze stali nierdzewnej do otworów bloków PDMS.

W celu wlotu podłącz igłę dozującą o rozmiarze 19 do drugiego końca cewnika jako łącznik do strzykawki. Następnie wstrzyknij wodę dejonizowaną, aby przetestować szczelność całego kanału. W przypadku piezoelektrycznego zespołu ceramicznego wybierz wstępnie przycięte piezoelektryczne arkusze ceramiczne o szerokości pięciu milimetrów.

Następnie przyspawaj druty po obu stronach ceramiki piezoelektrycznej na jednym końcu. Przyklej ceramikę piezoelektryczną do środka tylnej części chipa, umieszczając kroplę kleju cyjanoakrylowego na ceramice piezoelektrycznej. Wygładź klej wykałaczką i usuń nadmiar kleju.

Następnie szybko dociśnij go do chipa i kontynuuj naciskanie przez około minutę. Aby zamontować mikrourządzenie, wytnij kawałek PDMS jako podstawę mikrourządzenia i przyklej jedną stronę podstawy do bloków wlotowych i wylotowych PDMS, a drugą stronę do przezroczystego szkiełka za pomocą taśmy dwustronnej. Przymocuj całe mikrourządzenie do stolika mikroskopu, aby utrzymać chip w jednej płaszczyźnie ogniskowej.

Aby przygotować roztwory standardowych cząstek polistyrenu, dodaj 0,05 mililitra roztworu cząstek polistyrenu do 10 mililitrów PBS i dobrze wymieszaj. Następnie przygotuj zawiesiny komórek, przemłukując przylegające komórki w 90% zbiegu z PBS. Dodaj 500 mikrolitrów 0,25 trypsyny przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej.

Po usunięciu trypsyny dodać jeden mililitr kompletnej pożywki i uformować zawiesinę komórkową przez pipetowanie. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 100 G przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 0,5 do jednego mililitra PBS w celu uzyskania zawiesiny komórek.

Następnie komórki zliczono za pomocą hemocytometru, a stężenie wynosiło około 300 do 500 000 komórek na mililitr. Po przygotowaniu zawiesiny jądra komórkowego, jak pokazano wcześniej, usunąć supernatant i dodać 200 mikrolitrów odczynnika do ekstrakcji białek cytoplazmatycznych A na 20 mikrolitrów palety komórek i dobrze wymieszać. Następnie wirować powyższą mieszaninę o stężeniu 220 G przez pięć sekund i umieścić w łaźni lodowej na 10 minut.

Następnie po inkubacji dodać 10 mikrolitrów odczynnika do ekstrakcji białek cytoplazmatycznych B do roztworu. Po wirowaniu umieścić w łaźni lodowej na jedną minutę i ponownie wirować w temperaturze 220 G przez pięć sekund. Następnie na koniec odwirować w temperaturze 1000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić paletę w jednym mililitrze PBS. Następnie odwirować w temperaturze 1000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić w 100 mikrolitrach PBS jako zawiesinę jądra komórkowego.

Dodać błękit trypanowy do powyższej zawiesiny jądra komórkowego i barwić w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie policz liczbę jąder pod odwróconym mikroskopem za pomocą obiektywu 10x. Rozcieńczyć powyższą zawiesinę jądra komórkowego buforem PBS do stężenia od 200 do 300 000 jąder na mililitr.

Następnie przefiltruj zawiesinę jądra komórkowego przez sito o średnicy 70 mikrometrów. Aby skonfigurować system pomiarowy, włącz źródło światła w mikroskopie i otwórz oprogramowanie kamery. Użyj obiektywu 4x, aby znaleźć środkową pozycję mikrokanału, czyli pozycję ceramiki piezoelektrycznej.

Po podłączeniu przewodów przyspawaj je odpowiednio do dodatnich i ujemnych zacisków wyjścia generatora sygnału ceramiki piezoelektrycznej. Następnie umieścić strzykawkę na pompie do mikroiniekcji i podłączyć ją do cewnika wlotowego. Aby zebrać płyn z mikrokanału, umieść mały pojemnik na końcu cewnika wylotowego.

Aby określić parametry pomiaru, należy odessać roztwór cząstek polistyrenu za pomocą strzykawki. Następnie wstrzyknij roztwór do mikrokanału chipowego, unikając pęcherzyków powietrza i do mikrokanału chipa, aby zapewnić dokładny pomiar. Ustaw wyjście generatora sygnału na sygnał znakowy o częstotliwości jednego megaherca i napięciu międzyszczytowym 10 woltów, aż zaobserwujesz, że cząstki poruszają się w kierunku linii środkowej mikrokanału i pozostają w ruchu do przodu wzdłuż linii środkowej po osiągnięciu linii środkowej.

Po zmieszaniu jednej mililitrowej zawiesiny komórek lub jądra z roztworem standardowych cząstek w stosunku jeden do jednego, wstrzyknąć go do mikrokanału za pomocą strzykawki w celu pomiaru komórek i jąder. Rozpocznij nagrywanie kamerą CCD, gdy komórki lub jądra wejdą w pole widzenia i włączą generator sygnału. Następnie przepłucz mikrokanalik kolejno wodą dejonizowaną, 75% alkoholem i wodą dejonizowaną do późniejszego użycia.

Ruch komórek i cząstek obserwowano pod wpływem siły pola akustycznego w kierunku linii środkowej mikrokanału w różnych odstępach czasu. Przeprowadzono obliczenia energii, gęstości i ściśliwości ogniwa, a gęstość energii akustycznej i zmierzoną trajektorię ruchu cząstki uzyskano z najlepszego wyniku dopasowania. Jądra o wysokiej czystości i nienaruszone zostały wyizolowane z komórek, a pomiar ściśliwości jądra uzyskano poprzez uzyskanie trajektorii ruchu jądra.

Zmierzono i porównano ściśliwość różnych typów komórek nowotworowych i komórek po indukowanym lekami EMT lub napromieniowaniu rentgenowskim różnymi dawkami. Zmierzone komórki pobrano i stwierdzono, że nie było znaczącej różnicy w proliferacji komórek i żywotności w porównaniu z grupą nieleczoną po 48 godzinach hodowli. Wskazuje to, że pomiar ściśliwości nie ma wpływu na proliferację i przeżycie komórek.

Najważniejszą rzeczą jest precyzyjne dostrojenie częstotliwości sygnału, aż do momentu, gdy zaobserwuje, że cząstki poruszają się w kierunku linii środkowej mikrokanału.