Name: Pomiar ściśliwości komórki i jądra w oparciu o mikrourządzenie akustyczne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę pomiaru ściśliwości komórek i jąder za pomocą mikrourządzenia akustycznego. Technika ta umożliwia szybkie, nieinwazyjne badanie właściwości mechanicznych komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Granty numery 12075330 i U1932165) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong, Chiny (numer grantu 2020A1515010270).

1. Wytwarzanie i montaż akustofluidycznego mikrourządzenia
<ol>
	<li>Wytwarzanie układu mikroprzepływowego.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj chip jednokanałowy z tylko jednym wlotem i wylotem, jak pokazano w Rysunek 1Do pomiaru komórek należy zachować prostokątny przekrój poprzeczny mikrokanału na poziomie 740 µm szeroki i 100 µm głębokie. W celu pomiaru jądra komórkowego należy zmienić szerokość i głębokość mikrokanału na 250 µm i 100 µmodpowiednio.</li>
		<li>Przygotowanie mikrokanału na waflu krzemowym poprzez reaktywne trawienie jonowe. Zamknąć górną część mikrokanału za pomocą kawałka przezroczystego szkła żaroodpornego poprzez wiązanie anodowe15Myć płytki w myjce ultradźwiękowej przez 10 min. Suszyć je w suszarce w temperaturze 50 °C do późniejszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytworzenie bloków z polidimetylosiloksanu (PDMS).
	<ol>
		<li>Do szklanej szalki o średnicy 100 mm wlej 30 ml prepolimeru. Za pomocą strzykawki dodaj do prepolimeru 3 ml utwardzacza. 
		UWAGA: Stosunek objętościowy utwardzacza do prepolimeru wynosi 1:10.</li>
		<li>Intensywnie wymieszaj prepolimer PDMS z utwardzaczem za pomocą szklanej rurki przez około 10 min. Pojawienie się w roztworze małych i równomiernie rozłożonych pęcherzyków powietrza świadczy o prawidłowym wymieszaniu prepolimeru PDMS z utwardzaczem.</li>
		<li>Umieść szalkę szklaną w deskryptorze próżniowym i odsysaj powietrze przez 15–25 s. Powtarzaj ten proces do momentu, aż w mieszaninie nie będzie pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Umieść szalkę szklaną w suszarce ustawionej na 50 °C przez 1 h, aby umożliwić utwardzenie mieszaniny. Po inkubacji należy użyć skalpela, aby wyciąć PDMS w bloki o odpowiedniej wielkości, około 1,2 cm długości i 1 cm szerokości. 
		UWAGA: Długość bloku PDMS jest zgodna z szerokością chipa, a szerokość została dobrana tak, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń w środku na ceramikę piezoelektryczną w przypadku przyklejenia dwóch bloków PDMS do chipa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj blok PDMS do chipa.
	<ol>
		<li>W bloku PDMS należy wykonać otwory dla portów wlotowego i wylotowego za pomocą pustej igły o średnicy 1 mm. Bloki PDMS oraz chip (stroną tylną do góry) należy umieścić w oczyszczaczu plazmowym na 1 min.</li>
		<li>Dopasuj otwory w blokach PDMS do wlotu i wylotu chipa. Delikatnie dociśnij bloki PDMS do chipa przez 15 s. Powinno to spowodować połączenie bloków PDMS z powierzchnią chipa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz cewnik z politetrafluoroetylenu (PTFE) do chipa (Rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Odetnij dwa kawałki cewnika PTFE o średnicy wewnętrznej 0,8 mm i długości 10 cm. Zegnij igłę ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 0,7 mm i długości 1,5 cm poprzez 90° w kształt litery L. Połącz go z jednym końcem cewnika. Przygotuj dwa takie cewniki z igłami.</li>
		<li>Wprowadź igły ze stali nierdzewnej do otworów w blokach z PDMS. W przypadku wlotu połącz igłę dozującą 19 G z drugim końcem cewnika, aby służyła jako łącznik dla strzykawki.</li>
		<li>Po wykonaniu powyższych kroków należy wstrzyknąć wodę dejonizowaną, aby sprawdzić szczelność całego kanału. Brak przecieków wody oznacza prawidłowe uszczelnienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>zestaw ceramiczny piezoelektryczny (Rycina 2C)
	<ol>
		<li>Użyj diamentowej przecinarki drutowej, aby pociąć arkusze ceramiki piezoelektrycznej o średnicy 2 cm na cztery paski o szerokości 5 mm.</li>
		<li>Należy upewnić się, że częstotliwość rezonansowa ceramiki piezoelektrycznej jest zgodna z szerokością mikrokanału w chipie. Dla 740 µm i 250 µm szeroki mikrokanał, zastosowano ceramikę piezoelektryczną o częstotliwościach rezonansowych odpowiednio 1 MHz i 3 MHz.</li>
		<li>Przylutuj przewody po obu stronach ceramiki piezoelektrycznej na jednym z jej końców.</li>
		<li>Przykleić ceramikę piezoelektryczną do środka tylnej części chipa za pomocą kleju cyjanoakrylowego.</li>
		<li>Aby równomiernie rozprowadzić klej, nanieś jego kroplę na ceramikę piezoelektryczną, wygładź klej wykałaczką i usuń jego nadmiar. Następnie szybko dociśnij ceramikę do chipa i kontynuuj nacisk przez około 1 min. Upewnij się, że ceramika piezoelektryczna i chip są mocno zespolone i przylegają do siebie równomiernie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamocuj mikrourządzenie (Rysunek 2D).
	<ol>
		<li>Wytnij kawałek PDMS (o długości około 1,5 cm i szerokości 1 cm), który posłuży jako podstawa mikrourządzenia. Za pomocą dwustronnej taśmy przyklej jedną stronę podstawy do bloków PDMS wlotowego i wylotowego, a drugą stronę do przezroczystego szkiełka przedmiotowego. Przymocuj całe mikrourządzenie do stolika mikroskopu, aby utrzymać chip w jednej płaszczyźnie ogniskowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów standardowych cząsteczek polistyrenowych.
	<ol>
		<li>Dodać 0,05 mL roztworu cząsteczek polistyrenowych (o średnicy 6 µm) (2,1 x 108 cząsteczek/mL) do 10 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i dokładnie wymieszać. 
		UWAGA: Aby zmniejszyć błąd pomiaru spowodowany zmianą gęstości energii akustycznej, w każdym eksperymencie roztwór cząsteczek polistyrenowych mieszano z roztworem próbki w celu kalibracji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zawiesin komórkowych.
	<ol>
		<li>Przemyć komórki adherentne (np. MCF7, MDA-MB-231, HCT116) przy 90% konfluencji (~5 x 105 komórek) przy użyciu PBS. Dodać 500 µL 0,25% trypsyny (1x) na 1-2 min w temperaturze pokojowej (25 °C). Usunąć trypsynę, dodać 1 mL pożywki kompletnej i utworzyć zawiesinę komórkową poprzez pipetowanie.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową przy 100 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i resuspender w 0,5-1 mL PBS w celu uzyskania zawiesiny komórkowej. Komórki policzono za pomocą hemocytometru, a stężenie wynosiło około 3-5 x 105 komórek/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zawiesiny jąder komórkowych
	<ol>
		<li>Wykonać krok 2.2. Następnie usunąć supernatant i dodać 200 µL odczynnika A do ekstrakcji białek cytoplazmatycznych (z dodatkiem 1% PMSF) na każde 20 µL osadu komórkowego (około 5 milionów komórek) i dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Wymieszać powyższą mieszaninę na vortexu przy 220 x g przez 5 s, a następnie umieścić w kąpieli lodowej na 10 min. Po inkubacji dodać do roztworu 10 µL odczynnika B do ekstrakcji białek cytoplazmatycznych.</li>
		<li>Wymieszać na vortexu przy 220 x g przez 5 s. Umieścić w kąpieli lodowej na 1 min i ponownie wymieszać na vortexu przy 220 x g przez 5 s. Następnie odwirować przy 1 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Stosunek objętości odczynników A i B do ekstrakcji białek cytoplazmatycznych wynosi 20:1.</li>
		<li>Usunąć supernatant i resuspender osad w 1 mL PBS. Następnie odwirować przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 4 min. Usunąć supernatant i resuspender w 100 µL PBS, tworząc zawiesinę jąder komórkowych.</li>
		<li>Dodać błękit trypanu do powyższej zawiesiny jąder komórkowych i barwić w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 4 min. Stosunek objętości roztworu błękitu trypanu do zawiesiny jąder wynosi 1:1. Policzyć liczbę jąder pod mikroskopem odwróconym z obiektywem 10x. 
		UWAGA: Aby wyraźnie zidentyfikować jądra komórkowe pod mikroskopem, wymagane jest barwienie błękitem trypanu. Dla skutecznego barwienia roztwór błękitu trypanu musi być trzymany w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 min przed użyciem.</li>
		<li>Rozcieńczyć powyższą zawiesinę jąder komórkowych buforem PBS do stężenia 2-3 x 105 jąder/mL. Przefiltrować zawiesinę jąder komórkowych przez sito 70 µm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiar ściśliwości komórki i jądra
<ol>
	<li>Konfiguracja systemu pomiarowego (Rysunek 3)
	<ol>
		<li>Włączyć źródło światła mikroskopu i uruchomić oprogramowanie kamery. Użyć obiektywu 4x, aby zlokalizować środkową pozycję mikrokanału, tj. pozycję ceramiki piezoelektrycznej.</li>
		<li>Podłączyć przewody i przylutować je odpowiednio do bieguna dodatniego i ujemnego wyjścia generatora sygnałów na ceramice piezoelektrycznej.</li>
		<li>Umieścić strzykawkę w pompie mikroiniekcyjnej i podłączyć ją do cewnika wlotowego. Umieścić niewielki pojemnik na końcu cewnika wylotowego, aby zbierać ciecz wypływającą z mikrokanału.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczenie parametrów pomiarowych
	<ol>
		<li>Nabrać roztwór cząstek polistyrenowych do strzykawki i wstrzyknąć go do mikrokanału w chipie. Należy unikać pęcherzyków powietrza w mikrokanale chipu, aby zapewnić dokładność pomiaru. Upewnić się, że cząstki są równomiernie rozłożone w mikrokanale chipu. 
		UWAGA: Pomiar może być przeprowadzony bez przepływu lub pompy strzykawkowej. W razie potrzeby prędkość przepływu pompy mikroiniekcyjnej należy ustawić na odpowiednią wartość. W tym przypadku zakres prędkości przepływu wynosi 0-20 µL/h.</li>
		<li>Ustawić wyjście generatora sygnałów na sygnał sinusoidalny o częstotliwości 1 MHz (3 MHz dla pomiaru jąder komórkowych) i napięciu szczyt-szczyt (Vpp) wynoszącym 10 V.</li>
		<li>Dokładnie dostroić częstotliwość sygnału, aż zaobserwuje się, że cząstki poruszają się w kierunku linii środkowej mikrokanału i po osiągnięciu linii środkowej kontynuują ruch w przód wzdłuż niej (Rysunek 4). 
		UWAGA: Prędkość poruszania się cząstek w stronę linii środkowej jest określona przez amplitudę napięcia, którą można regulować w zakresie od 5 Vpp do 20 Vpp.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar komórek i jąder
	<ol>
		<li>Zmieszać 1 mL zawiesiny komórek lub jąder z roztworem standardowych cząstek w stosunku 1:1 i wstrzyknąć do mikrokanału za pomocą strzykawki.</li>
		<li>Rozpocząć rejestrację kamerą CCD w momencie, gdy komórki lub jądra wejdą w pole widzenia. Następnie włączyć generator sygnałów. Przerwać rejestrację, gdy komórki lub jądra osiągną linię środkową.</li>
		<li>Przepłukać mikrokanał kolejno wodą dejonizowaną, 75% alkoholem oraz wodą dejonizowaną w celu późniejszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Wyznacz trajektorie cząstek lub komórek.
	<ol>
		<li>Zaimportuj zarejestrowane wideo do oprogramowania ImageJ: Plik &gt; Otwórz&gt; Wybierz folderKliknij kształt elipsy na pasku narzędzi oprogramowania ImageJ, aby wybrać interesującą komórkę oraz przylegającą do niej cząstkę (Rysunek 5).</li>
		<li>Jak pokazano w Rycina 5skonfigurowano parametry pomiarowe w oprogramowaniu ImageJ jako Analiza→ Ustawienia pomiaru → Pole, Środek ciężkości, Etykieta wyświetlania.</li>
		<li>Przyjmując za klatkę początkową tę, w której docelowa komórka lub cząsteczka ulega przemieszczeniu wzdłużnemu, należy rejestrować pozycję w pikselach oraz rozmiar komórki lub cząsteczki w każdej kolejnej klatce, aż do momentu osiągnięcia przez nią linii środkowej mikrokanału. Dane należy wyeksportować do pliku arkusza kalkulacyjnego, a następnie powtórzyć tę czynność do czasu uzyskania trajektorii dla wszystkich analizowanych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształcenie i korekcja współrzędnych.
	<ol>
		<li>Zapisz współrzędne pikselowe czterech narożników mikrokanału w tym polu widzenia jako (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). Przy czym x3 = x4.</li>
		<li>Dla każdego punktu pomiarowego (xi, yi) oblicz nową współrzędną (xi', yi') po korekcji rotacji, korzystając z następujących wzorów: 
		<img alt="Równanie trygonometryczne θ = atan((y1-y3)/x3) + atan((y2-y4)/x4) schemat, obliczanie kąta." src="/files/ftp_upload/64225/64225eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		<img alt="Równanie transformacji współrzędnych 2D, xi&#x27;=xi×cosθ+yi×sinθ, do analizy rotacji." src="/files/ftp_upload/64225/64225eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> 
		<img alt="Równanie transformacji, \(y&#x27; = yi \times \cos\theta - xi \times \sin\theta\), wzór matematyczny." src="/files/ftp_upload/64225/64225eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"></li>
		<li>Przelicz współrzędne pikselowe na współrzędne rzeczywiste. Współrzędne rzeczywiste można uzyskać poprzez pomnożenie współrzędnych pikselowych przez przelicznik. Przelicznik stanowił iloraz rzeczywistej szerokości mikrokanału i szerokości w pikselach (H) tego mikrokanału.</li>
		<li>Przekształć i skoryguj współrzędne pikselowe komórek i cząstek uzyskane w kroku 4.1, aby otrzymać końcowe dane dotyczące trajektorii ruchu. Od wszystkich współrzędnych odejmij współrzędne lewego dolnego narożnika, tj. (0, y2). Częstotliwość klatek wideo wynosi 40 klatek na sekundę, zatem pomnóż liczbę klatek odpowiadającą każdej współrzędnej przez 0,025 s, aby wyznaczyć czas ruchu cząstki, uzyskując w ten sposób zmianę położenia w kierunku y w czasie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz gęstość energii akustycznej (Rycina 6A,B).
	<ol>
		<li>Ruch komórki lub cząsteczki w kierunku Y jest napędzany przez siłę akustyczną Fac oraz siła hydrodynamiczna FDOblicz trajektorię ruchu, korzystając z następujących wzorów: 
		<img alt="Równanie oscylatora harmonicznego; m(d²y/dt²)=F_ac(y,t)+F_D(y,t); dynamika; wzór." src="/files/ftp_upload/64225/64225eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 4">     (1) 
		<img alt="Schemat równania siły promieniowania akustycznego, kluczowy wzór w badaniach nad ultradźwiękową manipulacją cząstkami." src="/files/ftp_upload/64225/64225eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 5">     (2) 
		<img alt="Równanie siły oporu w dynamice płynów, \(\vec{F}_D=3\pi\mu D(\vec{v}_f-\vec{v}_c)\), reprezentacja symboli." src="/files/ftp_upload/64225/64225eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 6">     (3) 
		gdzie r i D promień i średnica komórki lub cząsteczki, ρ i β czy gęstość i ściśliwość, ν jest wektorem prędkości. Indeksy dolne c i f oznaczają odpowiednio komórkę i płyn. d jest odległością od najbliższego węzła ciśnienia akustycznego, μ jest lepkością dynamiczną cieczy, k jest liczbą falową, a E jest gęstością energii akustycznej. 
		UWAGA: Gęstość komórek MCF7, HCT116, A549 oraz jąder komórkowych wynosiła 1068 kg/m³3, 1077 kg/m3, 1073 kg/m³3, oraz 1155 kg/m³3odpowiednio 12,16,17.</li>
		<li>Zgodnie z formułami opisanymi w kroku 4.3.1, należy wykorzystać oprogramowanie MATLAB do uzyskania numerycznego rozwiązania dla standardowej trajektorii cząstki w polu akustycznym przy użyciu metody różnic skończonych.</li>
		<li>W obrębie zapisanego zakresu pola akustycznego należy zmienić gęstość energii akustycznej i dopasować rozwiązanie numeryczne (uzyskane w kroku 4.3.2) oraz zmierzoną trajektorię ruchu (uzyskaną w kroku 4.2) dla cząstki wzorcowej. Należy wybrać wynik o najlepszym dopasowaniu na podstawie średniokwadratowego błędu dopasowania. Uzyskana w ten sposób gęstość energii akustycznej służy jako parametr do późniejszego obliczenia ściśliwości komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz ściśliwość komórek (Rysunek 6C,D).
	<ol>
		<li>Ustaw gęstość energii akustycznej na wartość uzyskaną w kroku 4.3.3.</li>
		<li>Zgodnie z formułami opisanymi w kroku 4.3.1, należy wykorzystać oprogramowanie MATLAB, aby uzyskać rozwiązanie numeryczne dla trajektorii komórki w polu akustycznym przy użyciu metody różnic skończonych.</li>
		<li>Podobnie jak w kroku 4.3.3, w obrębie zaprogramowanego zakresu ściśliwości, należy zmieniać wartość ściśliwości i dopasowywać rozwiązanie numeryczne (uzyskane w kroku 4.4.2) do zmierzonej trajektorii ruchu komórki (uzyskanej w kroku 4.2). Współczynnik ściśliwości odpowiadający najlepszemu dopasowaniu należy przyjąć jako zmierzoną ściśliwość komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+cancer%3A+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li>
<li>Frame, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC+inhibitor+confers+radiosensitivity+to+prostate+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells.</a> British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).</li>
<li>Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+mapping+of+live+cells+by+multiple-particle-tracking+microrheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).</li>
<li>Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafine+particles+cause+cytoskeletal+dysfunctions+in+macrophages%3A+role+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium.</a> Particle and Fibre Toxicology. 2, 7(2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+magnetic+tweezer+system+for+intraembryonic+navigation+and+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Robotics%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement.</a> IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).</li>
<li>Machida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+manipulation+of+intracellular+stress+fibres+using+a+hook-shaped+AFM+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe.</a> Nanotechnology. 21 (38), 385102(2010).</li>
<li>Bufi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+immune+cells+exhibit+distinct+mechanical+properties+that+are+modified+by+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation.</a> Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).</li>
<li>Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+cell+adhesion+by+using+micropipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration.</a> Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).</li>
<li>Jung, J. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionising+radiation+induces+changes+associated+with+epithelial-mesenchymal+transdifferentiation+and+increased+cell+motility+of+A549+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells.</a> European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).</li>
<li>Hartono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+measurements+of+cell+compressibility+via+acoustic+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-a-Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation.</a> Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).</li>
<li>Sitters, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Acoustic force spectroscopy.</a> Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).</li>
<li>Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -W., Bruus, H., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iso-acoustic+focusing+of+cells+for+size-insensitive+acousto-mechanical+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping.</a> Nature Communications. 7 (1), 11556(2016).</li>
<li>Cushing, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+characterization+of+microbead+and+cell+suspensions+by+speed+of+sound+measurements+of+neutrally+buoyant+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples.</a> Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).</li>
<li>Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+of+cells+and+microspheres+sorted+by+acoustophoresis+with+in-line+resistive+pulse+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Applied%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing.</a> Physical Review Applied. 13 (3), 034058(2020).</li>
<li>Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -M., Free Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((flow+acoustophoresis%3A+microfluidic-based+mode+of+particle+and+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation.</a> Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).</li>
<li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li>
<li>Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+gradient+centrifugation%3A+a+flexible+method+for+the+isolation+of+nuclei+from+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).</li>
<li>Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+compressibility+changes+during+epithelial-mesenchymal+transition+based+on+acoustofluidic+microdevice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice.</a> Biomicrofluidics. 15 (6), 064101(2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+DNA+damage+responses+affect+cell+compressibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+single+cells%3A+Measurement+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications.</a> Biotechnology Advances. 45, 107648(2020).</li>
<li>Yousafzai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+neighboring+cells+on+cell+stiffness+measured+by+optical+tweezers+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004(2016).</li>
<li>Wei, M. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+living+cell+micromechanical+properties+by+oscillatory+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers.</a> Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).</li>
<li>Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanical+properties+of+brain+cancer+cells+using+a+microfluidic+cell+squeezer+device%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device.</a> Biomicrofluidics. 7 (1), 011806(2013).</li>
<li>Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+recognition+of+counterions+in+ion-exchange+resins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins.</a> Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).</li>
<li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection%2C+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+the+mobilization+of+circulating+tumour+cells+during+cancer+therapy+cause+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Powszechnie stosowanymi metodami pomiaru mechaniki komórek są AFM, aspiracja mikropipet, metody mikrofluidyczne, technika płytek równoległych, pęseta optyczna, napinacz optyczny i metody akustyczne20. Metody mikrofluidyki mogą działać z trzema podejściami: mikrozwężeniem, przepływem rozciągliwym i przepływem ścinającym. Wśród nich napinacz optyczny, pęseta optyczna, metody akustyczne, przepływ rozciągliwy i podejścia ścinające są pomiarami bezkontaktowymi. W przeciwieństwie do pomiarów kontaktowyc...

Właściwości mechaniczne komórek odgrywają ważną rolę w przerzutach nowotworowych, złośliwych transformacjach komórek i wrażliwości na radio1,2. Aby uzyskać dogłębne zrozumienie roli właściwości mechanicznych komórek w powyższym procesie, dokładny pomiar mechaniki komórkowej ma kluczowe znaczenie, a pomiar nie powinien powodować uszkodzenia komórek w celu późniejszej hodowli i analizy. Proces pomiaru powinien być tak szybki, jak to możliwe, w przeciwnym razie żywotność komórek może być zaburzona, jeśli komórki są usuwane ze środowiska hodowli przez długi czas.
Istniejące metody pomiaru mechaniki komórek napotykają pewne ograniczenia. Niektóre metody, takie jak magnetyczna cytometria skrętna, pęseta magnetyczna i mikroreologia śledząca cząstki, powodują uszkodzenie komórek w wyniku wprowadzenia cząstek do komórek3,4,5. Metody, które mierzą przez kontakt z komórkami, takie jak mikroskop sił atomowych (AFM), aspiracja mikropipet, mikrozwężenie i technika równoległej płytki, są również podatne na uszkodzenia komórek, a przepustowość jest trudna do zwiększenia6,7,8. Ponadto promieniowanie jonizujące spłaszczy komórki i zwiększy ich adhezję9; Dlatego konieczne jest zmierzenie mechaniki całych komórek w zawiesinie.
W odpowiedzi na powyższe wyzwania, opracowano system pomiaru mechaniki komórkowej oparty na metodzie akustofluidycznej10,11,12,13,14. Szerokość kanału jest dopasowana do połowy długości fali akustycznej, tworząc w ten sposób węzeł fali stojącej na linii środkowej mikrokanału. Pod działaniem siły promieniowania akustycznego ogniwa lub standardowe kulki mogą przemieszczać się do węzła ciśnienia akustycznego. Ponieważ właściwości fizyczne standardowych kulek (rozmiar, gęstość i ściśliwość) są znane, można określić gęstość energii akustycznej. Następnie ściśliwość ogniwa można uzyskać, rejestrując trajektorie ruchu komórek w polu akustycznym. Można uzyskać nieniszczący, wysokoprzepustowy pomiar ogniw w stanie zawiesiny. W tym artykule przedstawiono konstrukcję chipa mikroprzepływowego, ustanowienie systemu i etapy pomiaru. Przeprowadzono pomiar różnych typów komórek nowotworowych w celu zweryfikowania dokładności metody. Zakres zastosowania tej metody został rozszerzony na struktury subkomórkowe (takie jak jądro) poprzez dostosowanie częstotliwości rezonansowej ceramiki piezoelektrycznej i szerokości mikrokanału. Ponadto zbadano zmiany w ściśliwości komórek po napromieniowaniu EMT lub promieniowaniem rentgenowskim wywołanym przez lek różnymi dawkami. Wyniki wskazują na szerokie zastosowanie tej metody jako potężnego narzędzia do badania korelacji między zmianami biochemicznymi a właściwościami mechanicznymi komórek.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna (1x)</td> <td>GIBCO</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>502 klej</td><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Evo-bond</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>gruczolakorak płuc</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji cytonukleoprotein i białek cytoplazmatycznych</td><td>Beyotime</td><td>P0027</td><td>Zawiera odczynniki do ekstrakcji białek cytoplazmatycznych A i B</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle medium (DMEM)&nbsp;</td><td>corning</td><td>10-013-CVRC</td><td></td></tr><tr><td>Płodowy krąg bydlęcy (FBS)</td> <td>AUSGENEX</td><td>FBS500-S</td><td></td></tr><tr><td>HCT116</td><td>ATCC</td><td>CCL247</td><td>rak jelita grubego</td></tr><tr><td>Szkło żaroodporne</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 średni&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22&nbsp;</td><td>Gruczolakorak piersi</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26&nbsp;</td><td>Gruczolakorak piersi</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>corning</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy</td><td>corning</td><td>21-040-cvc</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Beyotime</td><td>ST506</td><td>100mM</td></tr><tr><td>Polistyren Barwiony na czerwono Barwiony Mikrosfera&nbsp;</td><td>polysciences</td><td>15714</td><td>Średnica mikroshpere wynosi 6,00&micro; m</td></tr><tr><td>jodek propidium (PI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184Elastomer silikonowy</td><td>Dow-Corning</td><td>1673921</td><td>Zawiera prepolimery i utwardzacze</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Beyotime</td><td>C0011</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar ściśliwości komórki i jądra w oparciu o mikrourządzenie akustyczne

Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

Mechanika komórkowa odgrywa ważną rolę w przerzutach nowotworowych, złośliwych transformacjach komórek i wrażliwości na radio. Podczas tych procesów badanie właściwości mechanicznych komórek jest często trudne. Konwencjonalne metody pomiarowe oparte na kontakcie, takie jak ściskanie lub rozciąganie, są podatne na uszkodzenia komórek, wpływając na dokładność pomiaru i późniejszą hodowlę komórek. Pomiary w stanie przylegającym mogą również wpływać na dokładność, zwłaszcza po napromieniowaniu, ponieważ promieniowanie jonizujące spłaszcza komórki i zwiększa przyczepność. Opracowano tu system pomiaru mechaniki komórkowej oparty na metodzie akustofluidycznej. Ściśliwość ogniwa można uzyskać, rejestrując trajektorię ruchu komórki pod działaniem siły akustycznej, która może realizować szybki i nieniszczący pomiar w stanie zawieszenia. W tym artykule szczegółowo opisano protokoły projektowania układów scalonych, przygotowania próbek, rejestrowania trajektorii, ekstrakcji i analizy parametrów. Na podstawie tej metody mierzono ściśliwość różnych typów komórek nowotworowych. Pomiar ściśliwości jądra uzyskano również poprzez dostosowanie częstotliwości rezonansowej ceramiki piezoelektrycznej oraz szerokości mikrokanału. W połączeniu z weryfikacją na poziomie molekularnym eksperymentów immunofluorescencyjnych porównano ściśliwość komórek przed i po indukowanym lekiem przejściu nabłonkowym do mezenchymalnego (EMT). Ponadto ujawniono zmianę ściśliwości komórek po napromieniowaniu rentgenowskim różnymi dawkami. Zaproponowana w artykule metoda pomiaru mechaniki komórki jest uniwersalna i elastyczna oraz ma szerokie perspektywy zastosowania w badaniach naukowych i praktyce klinicznej.

W niniejszej pracy przedstawiono protokół konstrukcji szybkiego i niedestrukcyjnego systemu pomiaru ściśliwości komórek w oparciu o mikro urządzenie akustofluidyczne oraz zaprezentowano jego zalety w pomiarach komórek i jąder komórkowych w różnych warunkach. Rysunek 1 przedstawia schemat kanału mikrofluidycznego. Komponenty i montaż mikro urządzenia akustofluidycznego pokazano na Rysunku 2. Rysunek 3 przedstawia konfigurację systemu...

Tutaj przedstawiono protokół do budowy szybkiego i nieniszczącego systemu pomiaru ściśliwości komórki lub jądra w oparciu o mikrourządzenie akustyczne. Zbadano zmiany właściwości mechanicznych komórek nowotworowych po przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym lub promieniowaniu jonizującym, wykazując perspektywę zastosowania tej metody w badaniach naukowych i praktyce klinicznej.

Pomiar ściśliwości komórki i jądra w oparciu o mikrourządzenie akustyczne

Cell mechanics play an important role in tumor metastasis, malignant transformation of cells, and radiosensitivity. During these processes, studying the ...

Mechanika komórkowa odgrywa ważną rolę w przerzutach guza, złośliwej transformacji komórek i wrażliwości na promieniowanie . Metoda akustofluidyczna może realizować szybkie i nieniszczące pomiary w stanach zawieszenia. Technika ta może być wykorzystana do odzwierciedlenia zmiany samościśliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego i oddzielenia krążących komórek nowotworowych, co pokazuje perspektywy jej zastosowania w diagnostyce raka.Aby rozpocząć, zwiąż blok PDMS z chipem, wybijając otwory w bloku PDMS na porty wlotowe i wylotowe za pomocą pustej igły o średnicy jednego milimetra. Następnie umieść bloki PDMS i chip tyłem do góry w myjce plazmowej na jedną minutę. Po wyrównaniu otworów w blokach PDMS z wlotem i wylotem chipa, delikatnie dociśnij bloki PDMS do chipa przez 15 sekund, powodując połączenie między blokami PDMS a powierzchnią chipa.Aby połączyć cewnik PTFE z chipem, wytnij dwa kawałki cewnika o średnicy wewnętrznej 0,8 milimetra i długości 10 centymetrów. Zegnij igłę ze stali nierdzewnej o średnicy wewnętrznej 0,7 milimetra i długości 1,5 centymetra na 90 stopni w kształt litery L i podłącz ją do jednego końca cewnika. Włóż igły ze stali nierdzewnej do otworów bloków PDMS.W celu wlotu podłącz igłę dozującą o rozmiarze 19 do drugiego końca cewnika jako łącznik do strzykawki. Następnie wstrzyknij wodę dejonizowaną, aby przetestować szczelność całego kanału. W przypadku piezoelektrycznego zespołu ceramicznego wybierz wstępnie przycięte piezoelektryczne arkusze ceramiczne o szerokości pięciu milimetrów.Następnie przyspawaj druty po obu stronach ceramiki piezoelektrycznej na jednym końcu. Przyklej ceramikę piezoelektryczną do środka tylnej części chipa, umieszczając kroplę kleju cyjanoakrylowego na ceramice piezoelektrycznej. Wygładź klej wykałaczką i usuń nadmiar kleju.Następnie szybko dociśnij go do chipa i kontynuuj naciskanie przez około minutę. Aby zamontować mikrourządzenie, wytnij kawałek PDMS jako podstawę mikrourządzenia i przyklej jedną stronę podstawy do bloków wlotowych i wylotowych PDMS, a drugą stronę do przezroczystego szkiełka za pomocą taśmy dwustronnej. Przymocuj całe mikrourządzenie do stolika mikroskopu, aby utrzymać chip w jednej płaszczyźnie ogniskowej.Aby przygotować roztwory standardowych cząstek polistyrenu, dodaj 0,05 mililitra roztworu cząstek polistyrenu do 10 mililitrów PBS i dobrze wymieszaj. Następnie przygotuj zawiesiny komórek, przemłukując przylegające komórki w 90% zbiegu z PBS. Dodaj 500 mikrolitrów 0,25 trypsyny przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej.Po usunięciu trypsyny dodać jeden mililitr kompletnej pożywki i uformować zawiesinę komórkową przez pipetowanie. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 100 G przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 0,5 do jednego mililitra PBS w celu uzyskania zawiesiny komórek.Następnie komórki zliczono za pomocą hemocytometru, a stężenie wynosiło około 300 do 500 000 komórek na mililitr. Po przygotowaniu zawiesiny jądra komórkowego, jak pokazano wcześniej, usunąć supernatant i dodać 200 mikrolitrów odczynnika do ekstrakcji białek cytoplazmatycznych A na 20 mikrolitrów palety komórek i dobrze wymieszać. Następnie wirować powyższą mieszaninę o stężeniu 220 G przez pięć sekund i umieścić w łaźni lodowej na 10 minut.Następnie po inkubacji dodać 10 mikrolitrów odczynnika do ekstrakcji białek cytoplazmatycznych B do roztworu. Po wirowaniu umieścić w łaźni lodowej na jedną minutę i ponownie wirować w temperaturze 220 G przez pięć sekund. Następnie na koniec odwirować w temperaturze 1000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić paletę w jednym mililitrze PBS. Następnie odwirować w temperaturze 1000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery minuty. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić w 100 mikrolitrach PBS jako zawiesinę jądra komórkowego.Dodać błękit trypanowy do powyższej zawiesiny jądra komórkowego i barwić w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie policz liczbę jąder pod odwróconym mikroskopem za pomocą obiektywu 10x. Rozcieńczyć powyższą zawiesinę jądra komórkowego buforem PBS do stężenia od 200 do 300 000 jąder na mililitr.Następnie przefiltruj zawiesinę jądra komórkowego przez sito o średnicy 70 mikrometrów. Aby skonfigurować system pomiarowy, włącz źródło światła w mikroskopie i otwórz oprogramowanie kamery. Użyj obiektywu 4x, aby znaleźć środkową pozycję mikrokanału, czyli pozycję ceramiki piezoelektrycznej.Po podłączeniu przewodów przyspawaj je odpowiednio do dodatnich i ujemnych zacisków wyjścia generatora sygnału ceramiki piezoelektrycznej. Następnie umieścić strzykawkę na pompie do mikroiniekcji i podłączyć ją do cewnika wlotowego. Aby zebrać płyn z mikrokanału, umieść mały pojemnik na końcu cewnika wylotowego.Aby określić parametry pomiaru, należy odessać roztwór cząstek polistyrenu za pomocą strzykawki. Następnie wstrzyknij roztwór do mikrokanału chipowego, unikając pęcherzyków powietrza i do mikrokanału chipa, aby zapewnić dokładny pomiar. Ustaw wyjście generatora sygnału na sygnał znakowy o częstotliwości jednego megaherca i napięciu międzyszczytowym 10 woltów, aż zaobserwujesz, że cząstki poruszają się w kierunku linii środkowej mikrokanału i pozostają w ruchu do przodu wzdłuż linii środkowej po osiągnięciu linii środkowej.Po zmieszaniu jednej mililitrowej zawiesiny komórek lub jądra z roztworem standardowych cząstek w stosunku jeden do jednego, wstrzyknąć go do mikrokanału za pomocą strzykawki w celu pomiaru komórek i jąder. Rozpocznij nagrywanie kamerą CCD, gdy komórki lub jądra wejdą w pole widzenia i włączą generator sygnału. Następnie przepłucz mikrokanalik kolejno wodą dejonizowaną, 75% alkoholem i wodą dejonizowaną do późniejszego użycia.Ruch komórek i cząstek obserwowano pod wpływem siły pola akustycznego w kierunku linii środkowej mikrokanału w różnych odstępach czasu. Przeprowadzono obliczenia energii, gęstości i ściśliwości ogniwa, a gęstość energii akustycznej i zmierzoną trajektorię ruchu cząstki uzyskano z najlepszego wyniku dopasowania. Jądra o wysokiej czystości i nienaruszone zostały wyizolowane z komórek, a pomiar ściśliwości jądra uzyskano poprzez uzyskanie trajektorii ruchu jądra.Zmierzono i porównano ściśliwość różnych typów komórek nowotworowych i komórek po indukowanym lekami EMT lub napromieniowaniu rentgenowskim różnymi dawkami. Zmierzone komórki pobrano i stwierdzono, że nie było znaczącej różnicy w proliferacji komórek i żywotności w porównaniu z grupą nieleczoną po 48 godzinach hodowli. Wskazuje to, że pomiar ściśliwości nie ma wpływu na proliferację i przeżycie komórek.Najważniejszą rzeczą jest precyzyjne dostrojenie częstotliwości sygnału, aż do momentu, gdy zaobserwuje, że cząstki poruszają się w kierunku linii środkowej mikrokanału.

measurement-compressibility-cell-nucleus-based-on-acoustofluidic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiamy dwa niezależne narzędzia oparte na mikroskopii, służące do pomiaru indukowanych odkształceń jądra i cytoszkieletu w pojedynczych, żywych komórkach przylegających w odpowiedzi na globalne lub lokalne przyłożenie naprężenia. Techniki te są wykorzystywane do określenia sztywności jądra (tj. odkształcalności) oraz do badania wewnątrzkomórkowej transmisji sił pomiędzy jądrem a cytoszkieletem.

Analizy biofizyczne służące do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształcenia podłoża i manipulacja mikroiłką

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Pokazujemy test oparty na mikrofluidyce do pomiaru skali czasowej dla komórek do przejścia przez sekwencję zwężeń w skali mikronów.

Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

Ten protokół opisuje architekturę systemu do wykonywania automatycznych separacji cząstek o małej objętości (0,15–1,5 ml) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i omawia metody optymalizacji wydajności i działania urządzenia akustycznego.

Platforma mikroprzepływowa do precyzyjnego przetwarzania próbek o małej objętości i jej wykorzystanie do wymiarowania oddzielnych cząstek biologicznych za pomocą mikrourządzenia akustycznego

W tym protokole opisujemy metodę mikropipet, która bezpośrednio przykłada kontrolowaną siłę do jądra w żywej komórce. Test ten pozwala na zbadanie właściwości mechanicznych jądra w żywej, przylegającej komórce.

Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem

Ten protokół opisuje montaż i działanie taniego urządzenia akustofluidycznego do szybkiego dostarczania molekularnego do komórek poprzez sonoporację wywołaną przez ultradźwiękowe środki kontrastowe.

Montaż i eksploatacja urządzenia akustyczno-fluidycznego w celu lepszego dostarczania związków molekularnych do komórek

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Prezentujemy metodę wstrzykiwania komórek za pomocą technologii strumienia wody bez użycia igieł w połączeniu z kontynuacją badań po porodzie pod kątem żywotności komórek, proliferacji i pomiarów elastyczności.

Iniekcja komórek zrębu tkanki tłuszczowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej świń za pomocą technologii strumienia wody

To badanie przedstawia nowy protokół bezpośredniego przykładania siły mechanicznej do jądra komórkowego za pomocą mikrokulek magnetycznych dostarczanych do cytoplazmy i jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek.

Połączenie siłownika siły magnetycznej 3D i wielofunkcyjnego obrazowania fluorescencyjnego w celu badania mechanobiologii jądra

Ilościowe określenie powierzchni styku i siły wywieranej przez końcówkę sondy mikroskopu sił atomowych (AFM) na powierzchnię próbki umożliwia określenie właściwości mechanicznych w nanoskali. Omówiono najlepsze praktyki w zakresie wdrażania nanotwardości opartej na wspornikach AFM w powietrzu lub płynie na miękkich i twardych próbkach w celu pomiaru modułu sprężystości lub innych właściwości nanomechanicznych.

Mikroskopia sił atomowych Nanotwardość oparta na wspornikach: pomiary właściwości mechanicznych w nanoskali w powietrzu i płynie

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Poznaj metodę pomiaru ściśliwości komórek i jąder za pomocą mikrourządzenia akustycznego. Technika ta umożliwia szybkie, nieinwazyjne badanie właściwości mechanicznych komórek nowotworowych.

Pomiar ściśliwości komórki i jądra w oparciu o mikrourządzenie akustyczne

Przeglądaj więcej filmów