Name: Określanie asocjacji termodynamicznej i kinetycznej aptameru DNA i tetracykliny za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Poznaj metodę ITC do badania wiązań aptameru DNA z tetracykliną. Technika izotermicznej kalorymetrii miareczkowej pozwala określić powinowactwo wiązania bez konieczności etykietowania próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundusze na Rozwój i Rozwój od Aptagen LLC.

UWAGA: Rysunek 2 pokazuje główne etapy eksperymentu ITC w celu określenia termodynamicznego i kinetycznego związku aptameru DNA i tetracykliny.
1. Przygotowanie próbek
UWAGA: Próbki do ITC muszą być przygotowane w tym samym buforze zarówno dla aptameru, jak i liganda, aby uniknąć wydzielania ciepła spowodowanego mieszaniem różnych z celi próbki i strzykawki. Zazwyczaj osiąga się to poprzez dializę wszystkich materiałów do tego samego buforu. Bufor jest wymieniany przy użyciu protokołu zaadaptowanego z protokołu koncentratora o masie cząsteczkowej 3 kDa (MWC) z pewnymi modyfikacjami, jak poniżej:
<ol>
	<li>Aktywować membranę kolumny dializacyjnej (3 kDa MWC) 1x PBS o pH 7,4, zakupionym od producenta, wykonując następujące czynności: napełnić 1x buforem (PBS), zrównoważyć przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odwirować przy 5 000 x g przez 15 min.</li>
	<li>Usunąć bufor i załadować 500 μl próbek aptamerów do kolumny, odwirować przy 5 000 x g i powtórzyć to 4 razy, aby wymienić oryginalny bufor na 1 x PBS. Gdy bufor przejdzie przez membranę, wszystkie cząsteczki o masie mniejszej niż 3 kDa przejdą przez membranę, a aptamer pozostanie na górnej stronie membrany.</li>
	<li>Pobrać dializowany aptamer DNA za pomocą pipety i przenieść go do nowej probówki (probówek) o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zebrać ostatni bufor przepływowy, aby rozpuścić tetracyklinę. Tetracyklina w proszku jest czysta i mała, więc dializa nie jest potrzebna. Należy jednak użyć poprzedniego dializowanego buforu DNA jako celu, aby upewnić się, że bufor do eksperymentu w strzykawce pasuje do buforu w komórce referencyjnej.</li>
	<li>Ponownie oznaczyć stężenie aptamerów za pomocą spektrometru widzialnego w promieniowaniu UV. Użyć ostatniego buforu wymiennego, aby dostosować stężenie do 40 μM tetracykliny i 2 μM aptameru.</li>
	<li>Złożyć aptamer DNA, ogrzewając w temperaturze 90 °C przez 10 minut, schładzając w temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie wracając do temperatury pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Odgazowuje złożony aptamer i dializowaną tetracyklinę za pomocą stacji odgazowującej lub pompy próżniowej ustawionej na 600 mmHg w temperaturze 25 °C przez 25 minut w celu wyeliminowania rozpuszczonych gazów.</li>
</ol>
2. Mycie instrumentu i uruchamianie zestawu testowego
<ol>
	<li>Wyczyść porty rozpuszczalnika, aby upewnić się, że cała ścieżka próbki jest czysta. Oczyścić, wyrzucając roztwór odpadowy i ładując je czystym metanolem, wodą i buforem. Każdy port zawiera ponad 250 ml, aby zapewnić wystarczającą ilość roztworu do czyszczenia. 
	UWAGA: Proces czyszczenia jest automatycznie kończony przez programowalne przez użytkownika oprogramowanie sterujące ITC.</li>
	<li>Przetestuj czystość maszyny, uruchamiając ITC za pomocą bufora do bufora (tj. 1x PBS do 1x PBS). 
	UWAGA: Normalna linia bazowa szumu jest widoczna między małym buforem a pikami wtrysku buforu. Gdy strzykawka do miareczkowania i kaniule zostaną odpowiednio oczyszczone i całkowicie suche, linia podstawowa będzie stabilna; Wzrost lub spadek linii podstawowej odzwierciedla brudne oprzyrządowanie lub pęcherzyki wewnątrz urządzenia, które należy skorygować przed uruchomieniem rzeczywistych próbek.</li>
	<li>Przetestuj dokładność maszyny za pomocą standardowego zestawu, który zawiera EDTA i CaCl2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3), używając domyślnego programu i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
3. Badanie próbki w celu określenia wiązania między aptamerem a tetracykliną
<ol>
	<li>Ustaw parametry pracy: szybkość mieszania 200 obr./min, praca w temperaturze 25 °C, 2 μM aptamer i 40 μM tetracyklina, 30 wstrzyknięć po 2,0 μl każde, czas opóźnienia 180 s.</li>
	<li>Sprawdź wymagane woluminy za pomocą uruchomionego kalkulatora programów. Przy tym parametrze pracy należy wykonać pomiar ITC za pomocą 230 μl 40 μM tetracykliny w strzykawce ITC i 485 μl aptameru 2 μM w celi próbki ITC za pomocą ITC.</li>
	<li>Załadować dializowane płytki strzykawki z tetracykliną i złożony aptamer do celi próbki, unikając pęcherzyków, za pomocą pipety.</li>
	<li>Uruchom instrument ITC, klikając przycisk Start w oprogramowaniu. 
	UWAGA: Proces uruchamiania przyrządu ITC jest w pełni zautomatyzowany po ręcznym napełnieniu celi referencyjnej i płytek z próbkami titranta.</li>
</ol>
4. Analiza danych za pomocą oprogramowania
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy danych, klikając dwukrotnie, aby rozpocząć analizę danych.</li>
	<li>Otwórz ścieżkę zapisanych nieprzetworzonych danych, aby poznać tendencję wiązania.</li>
	<li>Otwórz kartę modelowania i użyj różnych modeli powiązań, aby znaleźć najlepsze dopasowanie do krzywej danych. Następnie oprogramowanie automatycznie oblicza termogram ITC i różne parametry termodynamiczne, w tym entalpię (ΔH), entropię (ΔS), energię swobodną (ΔG), stałą wiązania równowagi (Ka) i stechiometrię.</li>
	<li>Zbierz parametry termodynamiczne wyznaczone na podstawie danych i informacji o modelu dopasowania.</li>
	<li>Utwórz raport, zawierający zdjęcia termogramu ITC i różnych parametrów termodynamicznych, jak pokazano na Rysunek 4 i Tabela 1.</li>
</ol>

<ol><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li>
<li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptasensors+for+environmental+monitoring+of+contaminants+in+water+and+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Environmental+Science+%26+Health%22%5BJournal%5D)">Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil.</a> Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).</li>
<li>Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aptamer+discovery+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of aptamer discovery and technology.</a> Nature Reviews Chemistry. 1, 0076(2017).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX--A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li>
<li>Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+kinetics+by+isothermal+titration+calorimetry%3A+Allostery%2C+inhibition%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826(2020).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).</li>
<li>Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+aptamers+specific+for+antibiotics+tetracyclines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).</li>
<li>Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+and+Biosystems+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li>
<li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272(2017).</li>
<li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+and+thermodynamics+of+2%27%2C5%27+RNA+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li>
<li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li>
<li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt-mediated+two-site+ligand+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).</li>
<li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+value+of+c%3A+Can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).</li>
<li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Przedstawiona tutaj metoda została zmodyfikowana zgodnie z instrukcją TA Instruments i jest wystarczająca do określenia powinowactwa wiązania i termodynamiki wielu wybranych aptamerów i tarcz w naszym centrum. Kluczowe kroki tej procedury obejmują wymianę buforu w celu dopasowania celu do liganda, uruchomienie próbek z odpowiednimi parametrami i znalezienie odpowiedniego modelu dopasowania wiązania do analizy danych. Ciągłe rejestrowanie wydzielania ciepła wymaga wyeliminowania wszelkich zakłóceń cieplnych, takich jak ni...

Aptamery to fragmenty ssDNA lub RNA wybrane w procesie ewolucji o wysokim powinowactwie wiązania i specyficzności do pożądanych celów1,2, które mogą działać jako zaawansowane elementy rozpoznające lub chemiczne przeciwciała3,4,5. W związku z tym powinowactwo wiązania i swoistość aptamerów z ich celami odgrywają kluczową rolę w doborze i zastosowaniu aptameru, a kalorymetria miareczkowa izotermiczna (ITC) jest szeroko stosowana do celów charakterystyki. Do określenia powinowactwa aptamerów zastosowano wiele podejść, w tym ITC, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), miareczkowanie kolorymetryczne, termoforezę w mikroskali (MST) i interferometrię biowarstwową (BLI). Wśród nich ITC jest jedną z najnowszych technik określania asocjacji termodynamicznej i kinetycznej dwóch cząsteczek w fazie roztworu. Podejście to polega na ciągłym miareczkowaniu przy użyciu cząsteczek bezznacznikowych i rejestrowaniu ciepła uwalnianego w czasie podczas zdarzeń wiązania wytwarzanych przez każde miareczkowanie6,7. W przeciwieństwie do innych metod, ITC może oferować powinowactwo wiązania, kilka miejsc wiązania oraz asocjację termodynamiczną i kinetyczną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Na podstawie tych parametrów początkowych zmiany energii swobodnej Gibbsa i zmiany entropii są określane za pomocą następującej zależności:
ΔG = ΔH-TΔS
Oznacza to, że ITC oferuje kompletny profil termodynamiczny oddziaływania molekularnego, aby wyjaśnić mechanizmy wiązania (Rysunek 1B). Określenie powinowactwa wiązania małych cząsteczek z aptamerem jest trudne ze względu na drastycznie różne rozmiary między aptamerem a celem. Tymczasem ITC może zapewnić czuły pomiar bez znakowania i unieruchamiania cząsteczek, co zapewnia sposób na utrzymanie naturalnej struktury aptameru i celu podczas pomiaru. Dzięki wymienionym atrybutom, ITC może być stosowany jako standardowa metoda charakterystyki wiązania między aptamerem a małymi celami.
Po wyborze przez grupę Gu, ten aptamer został zintegrowany z różnymi platformami, w tym z elektrochemicznymi biosensorami opartymi na aptamerach, konkurencyjnym testem aptamerowym połączonym z enzymem oraz płytką mikromiareczkową, która może osiągnąć wysoką przepustowość wykrywania tetracykliny8,9,10. Jednak jego charakterystyka wiązania nie została wyjaśniona na tyle dobrze, aby wybrać odpowiednią platformę8; warto scharakteryzować wiązanie aptameru z tetracykliną za pomocą ITC.

<table><tbody><tr><td>5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCGGG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies, Inc</td><td></td><td>Sekwencja została zaczerpnięta z badań Gu, które nie zidentyfikowały Kd za pomocą ITC (patrz referencje 8 i 9)</td></tr><tr><td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &micro; L) System kompletny&ndash; Gold Cells</td><td>TA Instruments</td><td>61000.901</td><td>System kalorymetrii miareczkowej</td></tr><tr><td>CasCl2</td><td>Avantor (VWR)</td><td>E506-100ML</td><td>Chlorek wapnia 1 M w roztworze wodnym, klasa biotechnologiczna, sterylna</td></tr><tr><td>wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Eppendorf 5417R jest niezrównany pod względem bezpieczeństwa, niezawodności i łatwości obsługi. Bardzo łatwy w utrzymaniu dzięki bezszczotkowemu silnikowi, który obraca się do 16 400 obr./min z maksymalnym RCF do 25 000 x g.</td></tr><tr><td>Kompletna stacja odgazowująca (110/230V)</td><td>TA Instruments</td><td>6326</td><td>Ten odgazowywacz zapewnia niezależną platformę mieszającą, komorę próżniową, port próżniowy, kontrolę temperatury i elektroniczny zegar do prawidłowego przygotowania próbki.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TekNova</td><td>E0375</td><td>EDTA 500 mM, pH 7,5</td></tr><tr><td>NanoDrop One Spektrofotometr UV-VIS o mikroobjętości</td><td>ThermoFisher</td><td>Spektrofotometr ND-ONE-W UV-VIS</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep, Nanosep MF i NAB Urządzenia odśrodkowe</td><td>Pall Laboratory</td><td>OD030C34</td><td>3 kDa koncentrator odcięcia masy cząsteczkowej</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70165</td><td>Bufor zawierający fosforan sodu, chlorek sodu, fosforan potasu i chlorek potasu Ultra-Pure Grade Sterylne przefiltrowane przy użyciu 0,2 &mikro; m filtr. Autoklawizowane w temperaturze 121 & deg; C przez ponad 20 min.</td></tr><tr><td>Posi-Click 1,7 ml probówki wirówkowe z dużą nasadką</td><td>labForce (marka Thomas Scientific)</td><td>1149K01</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina, hydrochoride</td><td>EMD Millipore Corperation</td><td>CAS64-75-5</td><td></td></tr></tbody></table>

określanie asocjacji termodynamicznej i kinetycznej aptameru dna i tetracykliny za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

Określenie powinowactwa wiązania i zachowania między aptamerem a jego celem jest najważniejszym krokiem w wyborze i użyciu aptameru do aplikacji. Ze względu na drastyczne różnice między aptamerem a małymi cząsteczkami, naukowcy muszą włożyć wiele wysiłku w scharakteryzowanie ich właściwości wiążących. Kalorymetria miareczkowa izotermiczna (ITC) jest skutecznym podejściem do tego celu. ITC wykracza poza wyznaczanie stałych dysocjacji (Kd) i może zapewnić zmiany entalpii i stechiometrię wiązania interakcji między dwiema cząsteczkami w fazie roztworu. Podejście to polega na ciągłym miareczkowaniu przy użyciu cząsteczek bezznacznikowych i rejestruje ciepło uwalniane w czasie po zdarzeniach wiązania wytwarzanych przez każde miareczkowanie, dzięki czemu proces może z dużą czułością mierzyć wiązanie między makrocząsteczkami a ich małymi celami. W artykule przedstawiono krok po kroku procedurę pomiaru ITC wybranego aptameru z małym celem, jakim jest tetracyklina. Przykład ten dowodzi wszechstronności tej techniki i jej potencjału w innych zastosowaniach.

ITC pozwala na dokładne wyznaczenie stałej dysocjacji (Kd), stechiometrii wiązania oraz parametrów termodynamicznych oddziaływań dwucząsteczkowych6. W tym przykładzie aptamer wybrany przez Kim i współpracowników9,11 wiąże się z tetracykliną z powinowactwami wiązania Kd 1 = 13 µM, Kd 2 = 53 nM. Co ciekawe, wiązanie to określono przy użyciu metody filtracji równowagowej, a raportowa...

Obecny protokół opisuje użycie izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC) do analizy kinetyki asocjacji i dysocjacji wiązania między aptamerem DNA a tetracykliną, w tym przygotowania próbek, uruchamiania wzorców i próbek oraz interpretacji uzyskanych danych.

Określanie asocjacji termodynamicznej i kinetycznej aptameru DNA i tetracykliny za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Protokół ten pozwala naukowcom określić powinowactwo wiązania aptamerów do celów wolnych w roztworze, zapewniając jednocześnie wgląd w mechanizm wiązania. Ponieważ ITC mierzy zmiany ciepła spowodowane wiązaniem, ani aptamer, ani ligand nie muszą być znakowane ani funkcjonalizowane, jak miałoby to miejsce w przypadku technik takich jak SPR. Nowi użytkownicy powinni zwrócić szczególną uwagę na pasujące we wszystkich składnikach powiązań.Ponadto należy pamiętać, że technika ta wiąże się z wysokimi wymaganiami dotyczącymi próbek, które mogą być trudne do spełnienia w przypadku większych ligandów, takich jak białka. Aby rozpocząć, aktywuj membranę kolumny dializowej, napełnij buforem PBS, równoważ przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odwiruj przy 5 000 G przez 15 minut. Usunąć bufor i załadować 500 mikrolitrów próbek aptamerów do kolumny.Odwirować przy 5 000 razy G i powtórzyć to cztery razy, aby wymienić oryginalny bufor na PBS. Zebrać dializowany aptamer DNA za pomocą pipety i przenieść go do nowej 1,5-mililitrowej probówki. Zebrać ostatni bufor przepływowy, aby rozpuścić tetracyklinę.Upewnij się, że bufor do eksperymentu w strzykawce jest zgodny z buforem w komórce referencyjnej. Ponownie oznaczyć stężenie aptamerów za pomocą spektrometru widzialnego w promieniowaniu UV. Użyj ostatniego buforu wymiennego, aby dostosować stężenie do 40-mikromolowej tetracykliny i dwumikromolowego aptameru.Złóż aptamer DNA, podgrzewając w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 10 minut, schładzając w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, a następnie wracając do temperatury pokojowej na 20 minut. Odgazować złożony aptamer i dializowaną tetracyklinę za pomocą stacji odgazowującej lub pompy próżniowej przez 25 minut w celu wyeliminowania rozpuszczonych gazów. Po oczyszczeniu i potwierdzeniu czystości maszyny, przetestuj dokładność maszyny za pomocą standardowego zestawu zawierającego EDTA i chlorek wapnia, korzystając z programu domyślnego i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.Skonfiguruj parametry biegu. Sprawdź wymagane woluminy za pomocą uruchomionego kalkulatora programów. Przy tym parametrze pracy należy wykonać pomiar ITC za pomocą 230 mikrolitrów 40-mikromolowej tetracykliny w strzykawce ITC i 485 mikrolitrów dwumikromolowego aptameru w celi ITC za pomocą ITC.Załadować dializowane płytki strzykawki z tetracykliną i złożony aptamer do celi próbki, unikając pęcherzyków, za pomocą pipety. Uruchom instrument ITC, klikając przycisk Start w oprogramowaniu. Otwórz oprogramowanie do analizy danych, klikając dwukrotnie, aby rozpocząć analizę danych.Otwórz ścieżkę zapisanych nieprzetworzonych danych, aby poznać tendencję wiązania. Otwórz kartę Modelowanie i użyj różnych modeli powiązań, aby znaleźć najlepsze dopasowanie do krzywej danych. Następnie oprogramowanie automatycznie oblicza termogram ITC i różne parametry termodynamiczne, w tym entalpię, entropię, energię swobodną, stałą wiązania równowagi i stechiometrię.Zbierz parametry termodynamiczne wyznaczone na podstawie danych i informacji o modelu dopasowania. Utwórz raport zawierający zdjęcia termogramu ITC i różnych parametrów termodynamicznych. Aptamer wybrany przez Kima i wsp. wiąże się z tetracykliną z powinowactwem wiązania stałej dysocjacji jeden równej 13 mikromolów i stałej dysocjacji dwa równej 53 nanomolom.Model dopasowania i stechiometria z ITC pokazują, że aptamer wiąże się z tetracykliną poprzez stosunek wiązania 2:1 z sekwencyjnym modelem wiązania. Parametry termodynamiczne wyznaczone przez pomiar ITC dla miejsca drugiego wykazały, że entalpia pokonująca stosunkowo znaczną utratę entropii napędza silne wiązanie. Wiązanie napędzane entalpią z utratą entropii odnosi się do zmian konformacyjnych kwasu nukleinowego, które zostały zgłoszone jako zachowania wiążące między RNA a małą cząsteczką.Aptamer i ligand muszą znajdować się w tym samym buforze. Aptamer należy ponownie złożyć, jeśli rozwinął się w wyniku ponownego fałdowania, a próbki należy odgazować. Uwzględnienie tych rozważań zapewni, że tylko interakcje aptamer-ligand przyczynią się do mierzonego sygnału.Ze względu na wielkość docelowego aptameru, odpowiednią metodą następczą może być termoforeza w mikroskali w celu potwierdzenia zmierzonego powinowactwa wolnego od wiązania w roztworze.

determining-thermodynamic-kinetic-association-dna-aptamer

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

ITC jest potężnym narzędziem do badania wiązania liganda z jego gospodarzem. Jednak w układach złożonych kilka modeli może równie dobrze dopasowywać się do danych. Metoda opisana w niniejszej pracy umożliwia wyjaśnienie odpowiedniego modelu wiązania dla układów złożonych oraz wyznaczenie odpowiadających im parametrów termodynamicznych.

Gromadzenie zbiorów danych izotermicznej kalorymetrii miareczkowej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Przedstawiono ogólny protokół wykorzystania izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do monitorowania termodynamiki wiązania w układach biologicznych o umiarkowanym powinowactwie wiązania.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

Ten film opisuje wysoce wydajną anizotropię fluorescencji, która pomaga monitorować interakcję między czynnikami transkrypcyjnymi a DNA. Test monitoruje interakcje cząsteczki DNA znakowanej fluoroforem z jej specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym, mierząc stopień polaryzacji spowodowanej rotacją molekularną lub anizotropią DNA znakowanego fluoroforem.

Anizotropia fluorescencyjna w celu określenia powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego i DNA

Ten film demonstruje różnicową kalorymetrię skaningową - technikę badania interakcji między biomolekułą a ligandem. Wiązanie aptameru DNA i liganda termolabilnego bada się poprzez zastosowanie powtarzających się cykli ogrzewania i chłodzenia do próbki oraz uzyskanie skanów do analizy termodynamicznej.

Różnicowa kalorymetria skaningowa do badania interakcji DNA aptamer-termolabilny ligand

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa mierzy przepływ ciepła uwalnianego lub pochłanianego w reakcjach chemicznych. Metoda ta może być stosowana do ilościowego określania katalizy enzymatycznej. W tym artykule ogólnie opisano protokół konfiguracji instrumentalnej, prowadzenia eksperymentu i analizy danych, który jest stosowany do charakterystyki enzymatycznej hydrolizy mocznika za pomocą ureazy fasoli jack.

Gorąca kataliza biologiczna: kalorymetria miareczkowa izotermiczna w celu scharakteryzowania reakcji enzymatycznych

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Termoforeza w mikroskali (MST) to czuła technologia do charakteryzowania interakcji aptamer-cel. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół MST do charakteryzowania oddziaływań aptamer-małe cząsteczki.

Mapowanie miejsca wiązania aptameru na ATP za pomocą termoforezy w mikroskali

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę określania powinowactwa wiązania w równowadze i w roztworze z wysoką czułością na dużą skalę. Poprawia to analizę ilościową wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA. Metoda opiera się na zautomatyzowanych pomiarach anizotropii fluorescencji w kontrolowanym systemie dostarczania.

Pomiar wysokiej czułości powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA za pomocą miareczkowania kompetencyjnego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Stabilność termiczną aktywności enzymu można łatwo zmierzyć za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Większość obecnie stosowanych testów stabilności białek mierzy rozwijanie białek, ale nie dostarcza informacji o aktywności enzymatycznej. ITC umożliwia bezpośrednie określenie wpływu modyfikacji enzymów na stabilność aktywności enzymu.

Pomiar stabilności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Obecny protokół demonstruje użycie szybkiego, 3-stopniowego, opartego na aptamie testu wykładniczego amplifikacji do wykrywania celów. Przygotowanie próbki, wzmocnienie sygnału i rozwój koloru są omówione w celu wdrożenia tego systemu do rozpoznawania obecności teofiliny w porównaniu z kofeiną.

Wykrywanie celów oparte na aptamierach ułatwione przez 3-stopniową izotermiczną reakcję amplifikacji wykładniczej G-Quadruplex

Protokół przedstawia dwie metody określania kinetyki aptamerów fluorogennego RNA: Szpinak2 i Brokuły. Pierwsza metoda opisuje, w jaki sposób mierzyć kinetykę aptamerów fluorogennych in vitro za pomocą czytnika płytkowego, podczas gdy druga metoda szczegółowo opisuje pomiar kinetyki aptamerów fluorogennych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.

Wyznaczanie kinetyki in vitro i komórkowej inkinety włączania fluorogenicznych aptamerów RNA

Poznaj metodę ITC do badania wiązań aptameru DNA z tetracykliną. Technika izotermicznej kalorymetrii miareczkowej pozwala określić powinowactwo wiązania bez konieczności etykietowania próbek.

Określanie asocjacji termodynamicznej i kinetycznej aptameru DNA i tetracykliny za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (Wideo) | JoVE Journal

Określanie asocjacji termodynamicznej i kinetycznej aptameru DNA i tetracykliny za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Przeglądaj więcej filmów