Określanie asocjacji termodynamicznej i kinetycznej aptameru DNA i tetracykliny za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Protokół ten pozwala naukowcom określić powinowactwo wiązania aptamerów do celów wolnych w roztworze, zapewniając jednocześnie wgląd w mechanizm wiązania. Ponieważ ITC mierzy zmiany ciepła spowodowane wiązaniem, ani aptamer, ani ligand nie muszą być znakowane ani funkcjonalizowane, jak miałoby to miejsce w przypadku technik takich jak SPR. Nowi użytkownicy powinni zwrócić szczególną uwagę na pasujące we wszystkich składnikach powiązań.

Ponadto należy pamiętać, że technika ta wiąże się z wysokimi wymaganiami dotyczącymi próbek, które mogą być trudne do spełnienia w przypadku większych ligandów, takich jak białka. Aby rozpocząć, aktywuj membranę kolumny dializowej, napełnij buforem PBS, równoważ przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odwiruj przy 5 000 G przez 15 minut. Usunąć bufor i załadować 500 mikrolitrów próbek aptamerów do kolumny.

Odwirować przy 5 000 razy G i powtórzyć to cztery razy, aby wymienić oryginalny bufor na PBS. Zebrać dializowany aptamer DNA za pomocą pipety i przenieść go do nowej 1,5-mililitrowej probówki. Zebrać ostatni bufor przepływowy, aby rozpuścić tetracyklinę.

Upewnij się, że bufor do eksperymentu w strzykawce jest zgodny z buforem w komórce referencyjnej. Ponownie oznaczyć stężenie aptamerów za pomocą spektrometru widzialnego w promieniowaniu UV. Użyj ostatniego buforu wymiennego, aby dostosować stężenie do 40-mikromolowej tetracykliny i dwumikromolowego aptameru.

Złóż aptamer DNA, podgrzewając w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 10 minut, schładzając w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, a następnie wracając do temperatury pokojowej na 20 minut. Odgazować złożony aptamer i dializowaną tetracyklinę za pomocą stacji odgazowującej lub pompy próżniowej przez 25 minut w celu wyeliminowania rozpuszczonych gazów. Po oczyszczeniu i potwierdzeniu czystości maszyny, przetestuj dokładność maszyny za pomocą standardowego zestawu zawierającego EDTA i chlorek wapnia, korzystając z programu domyślnego i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Skonfiguruj parametry biegu. Sprawdź wymagane woluminy za pomocą uruchomionego kalkulatora programów. Przy tym parametrze pracy należy wykonać pomiar ITC za pomocą 230 mikrolitrów 40-mikromolowej tetracykliny w strzykawce ITC i 485 mikrolitrów dwumikromolowego aptameru w celi ITC za pomocą ITC.

Załadować dializowane płytki strzykawki z tetracykliną i złożony aptamer do celi próbki, unikając pęcherzyków, za pomocą pipety. Uruchom instrument ITC, klikając przycisk Start w oprogramowaniu. Otwórz oprogramowanie do analizy danych, klikając dwukrotnie, aby rozpocząć analizę danych.

Otwórz ścieżkę zapisanych nieprzetworzonych danych, aby poznać tendencję wiązania. Otwórz kartę Modelowanie i użyj różnych modeli powiązań, aby znaleźć najlepsze dopasowanie do krzywej danych. Następnie oprogramowanie automatycznie oblicza termogram ITC i różne parametry termodynamiczne, w tym entalpię, entropię, energię swobodną, stałą wiązania równowagi i stechiometrię.

Zbierz parametry termodynamiczne wyznaczone na podstawie danych i informacji o modelu dopasowania. Utwórz raport zawierający zdjęcia termogramu ITC i różnych parametrów termodynamicznych. Aptamer wybrany przez Kima i wsp. wiąże się z tetracykliną z powinowactwem wiązania stałej dysocjacji jeden równej 13 mikromolów i stałej dysocjacji dwa równej 53 nanomolom.

Model dopasowania i stechiometria z ITC pokazują, że aptamer wiąże się z tetracykliną poprzez stosunek wiązania 2:1 z sekwencyjnym modelem wiązania. Parametry termodynamiczne wyznaczone przez pomiar ITC dla miejsca drugiego wykazały, że entalpia pokonująca stosunkowo znaczną utratę entropii napędza silne wiązanie. Wiązanie napędzane entalpią z utratą entropii odnosi się do zmian konformacyjnych kwasu nukleinowego, które zostały zgłoszone jako zachowania wiążące między RNA a małą cząsteczką.

Aptamer i ligand muszą znajdować się w tym samym buforze. Aptamer należy ponownie złożyć, jeśli rozwinął się w wyniku ponownego fałdowania, a próbki należy odgazować. Uwzględnienie tych rozważań zapewni, że tylko interakcje aptamer-ligand przyczynią się do mierzonego sygnału.

Ze względu na wielkość docelowego aptameru, odpowiednią metodą następczą może być termoforeza w mikroskali w celu potwierdzenia zmierzonego powinowactwa wolnego od wiązania w roztworze.