Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Protokół ten pozwala na uzyskanie nowych informacji na temat naturalnej mikroflory C. elegans. Jednocześnie wyizolowane mikroorganizmy mogą być wykorzystywane w kontrolowanych eksperymentach laboratoryjnych w celu scharakteryzowania interakcji między mikrobiotą a gospodarzem oraz biologii C. elegans. Protokół ten koncentruje się na izolowaniu drobnoustrojów związanych z C.elegans w naturze, które są zatem kluczowe dla zrozumienia biologii tego ważnego gospodarza modelowego w bardziej naturalnym kontekście.

Pomocne będzie zapoznanie się z wyglądem Caenorhabditis w porównaniu z innymi nicieniami. Pipetowanie pod lunetą sekcyjną może początkowo być trudne, ale praktyka będzie pomocna. Zacznij od zebrania próbek środowiskowych, takich jak kompost lub zgniłe owoce, w oddzielnych plastikowych torbach, tubkach lub czystych pojemnikach.

Równomiernie rozprowadzić kawałki pobranych próbek środowiskowych na sterylnej dziewięciocentymetrowej pustej szalce Petriego i dodać około 20 mililitrów sterylnej lepkiej pożywki, aby pokryć próbkę pożywką. Pod mikroskopem preparacyjnym poszukaj nicieni Caenorhabditis zgodnie z wytycznymi dotyczącymi izolowania Caenorhabditis elegans i pokrewnych nicieni. Za pomocą pipety o pojemności od 20 do 100 mikrolitrów zebrać z płytki najmniejszą możliwą ilość płynu zawierającego nicienie Caenorhabditis i przenieść ją na trzycentymetrową szalkę Petriego zawierającą od jednego do trzech mililitrów sterylnego M9T.

Aby ustalić populację robaków, poszczególne robaki można przenieść na płytkę z pożywką wzrostową nicieni lub NGM. Aby umyć nicienie i usunąć drobnoustroje obecne na zewnątrz nicieni, inkubuj je w M9T przez 10 do 15 minut. Odpipetować najmniejszą możliwą ilość płynu zawierającego nicienie i przenieść ją na nową, sterylną trzycentymetrową szalkę Petriego zawierającą od jednego do trzech mililitrów świeżego M9T.

W celu bezstronnej identyfikacji drobnoustrojów związanych z nicieniami, przygotuj 96-dołkową płytkę z około trzema sterylnymi kulkami o średnicy jednego milimetra i dodaj mieszaninę 19,5 mikrolitra buforu PCR i 0,5 mikrolitra proteinazy K na studzienkę. Przenieś pojedyncze umyte nicienie do każdej studzienki z jak najmniejszą ilością płynu. Rozdrobnić przeniesione nicienie za pomocą homogenizatora kulkowego przez trzy minuty przy 30 hercach i odwirować płytki lub probówki przy 8 000 G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej, aby ciecz opadła na dno.

Aby zidentyfikować C. elegans, należy podgrzać próbki w cyklerze PCR przez godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza i 15 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby wyizolować DNA poszczególnych nicieni, lub użyć komercyjnych zestawów do wyizolowania DNA populacji robaków. Zamroź wyizolowane DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania. Użyj DNA i pary starterów NLP 30 do przodu i NLP 30 do tyłu i wytwórz produkt PCR ze 154 parami zasad.

Aby wyizolować bakterie, przygotuj 96-dołkową płytkę z około trzema sterylnymi kulkami o średnicy jednego milimetra, 20 mikrolitrami buforu M9 na studzienkę i odpipetuj pojedynczą umytą nicień do każdej studzienki z jak najmniejszą ilością płynu. Rozdrobnij nicienie, jak pokazano przed użyciem homogenizatora perełkowego, a następnie wykonaj krótkie odwirowanie płytki, aby ciecz opadła na dno. Po zakończeniu zebrać zawiesinę i stopniowo rozcieńczyć ją w proporcji od 1 do 10.

Rozłożyć do 100 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny na dziewięciocentymetrowych płytkach agarowych. Następnie inkubuj płytki w temperaturze od 15 do 20 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin. Aby uzyskać czystą kulturę bakteryjną, należy pobrać pojedynczą kolonię z inkubowanej płytki za pomocą sterylnej pętli lub wykałaczki i rozprowadzić ją na nowej płytce agarowej zawierającej tę samą pożywkę agarową, która została użyta podczas oczyszczania.

Upewnij się, że używasz tylko 1/3 talerza. Następnie wysterylizuj pętlę wielokrotnego użytku lub użyj nowej sterylnej pętli i przeciągnij ją przez pierwszą smugę, aby utworzyć drugą smugę na kolejnej 1/3 płytki próbki. Powtórz to, przeciągając pętlę przez drugą smugę i tworząc trzecią smugę, aby osiągnąć wzrost pojedynczej kolonii.

Inkubować płytkę w tych samych warunkach wzrostu, które są używane do izolacji, a w razie potrzeby powtórzyć etap oczyszczania. Hoduj czyste kolonie w płynnym podłożu, używając tej samej temperatury i warunków wzrostu. Następnie scharakteryzuj bakterie, ekstrahując bakteryjne DNA z czystych płynnych kultur, amplifikując rybosomalny RNA 16S przy użyciu 27 starterów do przodu i 1495 wstecznych i wykonując PCR zgodnie z opisem w tekście.

Kiedy zebrane próbki owoców i kompostu zostały rozprowadzone na szalkach Petriego i zanurzone w ciekłym lub lepkim podłożu, spowodowało to, że robaki opuściły materiał podłoża i wypłynęły na powierzchnię podłoża. Mikroorganizmy wyizolowano jako czyste pojedyncze kolonie, a oczyszczenie odegrało istotną rolę, ponieważ niektóre bakterie związane z C. elegans mogą tworzyć biofilmy lub łatwo się agregować, co prowadzi do powstania kultur wielogatunkowych. PCR przy użyciu starterów specyficznych dla C.elegans, a mianowicie NLP 30 do przodu i NLP 30 do tyłu, spowodował amplifikację produktu 154 par zasad dla C.elegans.

DNA wyizolowane z pojedynczych robaków skutkowało słabymi prążkami PCR, podczas gdy ekstrakcja DNA z populacji robaków składających się z co najmniej 50 robaków dała większą ilość i wyraźniejsze prążki. Sukces PCR specyficznego dla C.elegans został potwierdzony przez przeprowadzenie DNA szczepu laboratoryjnego, a mianowicie N2, jako kontroli pozytywnej jednocześnie z DNA izolowanych nicieni: Drobnoustroje są wszędzie. Dlatego tak ważne jest, aby pracować w sterylnych warunkach, aby upewnić się, że te mikroorganizmy, które są izolowane, są naprawdę związane z robakiem w naturze.

Wyizolowane drobnoustroje można wykorzystać do badania interakcji między gospodarzem a mikrobiotą lub roli drobnoustrojów w biologii gospodarza, na przykład starzenia się, rozwoju lub odporności w kontrolowanych eksperymentach laboratoryjnych. Mikroorganizmy wyizolowane za pomocą tej techniki są obecnie wykorzystywane przez społeczność C.elegans w celu lepszego zrozumienia różnorodności mikrobioty w zależności od kondycji gospodarza lub roli drobnoustrojów w odporności.