Name: Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj metodę izolacji naturalnej mikrobioty Caenorhabditis elegans z próbek środowiskowych. Technika PCR i hodowla bakterii umożliwiają badanie interakcji mikrobiota-gospodarz w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe od Niemieckiej Fundacji Naukowej (projekty A1.1 i A1.2 Centrum Badawczego 1182 nad pochodzeniem i funkcją metaorganizmów). Dziękujemy członkom laboratorium Schulenburg za ich rady i wsparcie.

1. Przygotowanie buforów i pożywek
<ol>
	<li>Przygotować bufor S, dodając do kolby 5,85 g NaCl, 1,123 g K2HPO4, 5,926 g KH2PO4 oraz 1 L dejonizowanej H2O, a następnie autoklawować przez 20 min w temperaturze 121 °C.</li>
	<li>Przygotować medium lepkie, dodając bufor S zawierający 1,2% (w/v) hydroksymetylocelulozy (substancji nadającej medium lepkość), 5 mg/mL cholesterolu, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2 oraz 0,1% (v/v) acetonu. Autoklawować i mieszać medium lepkie do momentu uzyskania całkowitej homogeniczności. 
	UWAGA: Proces ten może trwać kilka godzin. Bufor S można również przygotować bezpośrednio i dodać do medium lepkiego bez wcześniejszej sterylizacji.</li>
	<li>Przygotować bufor M9, dodając do kolby o pojemności 1 L 3 g KH2PO4, 6 g NA2HPO4·2 H2O, 5 g NaCl oraz 1 L dejonizowanej H2O. Autoklawować roztwór, a po ochłodzeniu dodać 1 mL 1 M MgSO4 (123,24 g MgSO4·7H2O w 500 mL dejonizowanej H2O, sterylizowane przez filtrację).</li>
	<li>Przygotować 10% (v/v) roztwór zapasu Triton X-100, mieszając 5 mL Triton X-100 z 45 mL buforu M9. Zsterylizować roztwór przez filtrację przy użyciu filtra 0,2 µm.</li>
	<li>Przygotować bufor M9 z Triton X-100 (M9-T), dodając 2,5 mL 10% (v/v) roztworu zapasu Triton X-100 do 1 L buforu M9 po autoklawowaniu, aby uzyskać 0,025% (v/v) M9-T.</li>
	<li>Przygotować 30% (v/v) glicerol w buforze S, mieszając 15 mL sterylnego 100% glicerolu i 35 mL sterylnego buforu S w probówce o pojemności 50 mL.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek środowiskowych (Rycina 1)
<ol>
	<li>Pobrać próbki środowiskowe, takie jak kompost lub zgniłe owoce, i umieścić każdą próbkę w oddzielnej plastikowej torbie, probówce lub innym czystym pojemniku. 
	UWAGA: Aby przyciągnąć nicienie, na kilka tygodni przed pobraniem próbek na kompoście można umieścić jabłka.</li>
	<li>Rozłożyć kawałki próbki środowiskowej równomiernie w pustej, sterylnej szalce Petri o średnicy 9 cm. 
	UWAGA: Próbki o wyższym stopniu rozkładu z większym prawdopodobieństwem zawierają C. elegans. Opcjonalnie, w celu zwiększenia kontrastu można użyć szalki Petri wypełnionej pożywką agarową bez peptonu (PFM).</li>
	<li>Ostrożnie przykryć próbkę około 20 mL sterylnego medium lepkiego. 
	UWAGA: Nicienie wypływają na powierzchnię w ciągu 1-2 h. Medium lepkie spowalnia ruch robaków i ułatwia ich pobieranie. Alternatywnie można zastosować sterylny bufor M9, jednak ruch robaków będzie wtedy szybszy.</li>
</ol>
<img alt="Schemat przygotowania próbek: pobranie, przeniesienie na szalkę, pokrycie pożywką, przemywanie nicieni, przeniesienie do buforu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64249/64249fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Izolacja nicieni z podłoży. Próbki podłoża umieszcza się w pustych szalkach Petriego i pokrywa lepką pożywką w celu wypłukania nicieni. Nicienie przenosi się do M9-T i wielokrotnie przemywa, aby usunąć bakterie z powierzchni ciała. Pojedyncze nicienie mogą być wykorzystane do izolacji DNA, izolacji powiązanych bakterii lub przeniesione na płytki agarowe w celu hodowli populacji nicieni. Rysunek stworzony przy użyciu BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64249/64249fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Izolacja nicieni z rodzaju Caenorhabditis (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Wyszukaj nicienie Caenorhabditis za pomocą mikroskopu stereoskopowego, postępując zgodnie z wytycznymi przedstawionymi w rozdziale WormBook dotyczącym izolacji C. elegans i pokrewnych nicieni opracowanym przez Barrière i Félixa27. 
	UWAGA: Hermafrodyty/samice Caenorhabditis mają jelito o jasnobrązowym kolorze (przy oświetleniu przeświutowym). Ponadto komórki jelita posiadają duże jądra komórkowe, które są widoczne jako białe kropki. W przeciwieństwie do nich, inne gatunki nicieni często mają ciemnobrązowe jelito i mogą wykazywać asymetrię przednio-tylną w intensywności pigmentu, a zazwyczaj nie posiadają widocznych jąder. Vulva dorosłych hermafrodyt/samic Caenorhabditis znajduje się w środkowej części zwierzęcia. Lokalizacja ta nie zawsze występuje u innych taksonów nicieni. Nicienie Caenorhabditis posiadają dwie cebulki gardzieli, które są widoczne przy odpowiednim powiększeniu i oświetleniu przeświutowym, co odróżnia je od wielu innych taksonów nicieni. Nicienie Caenorhabditis mają spiczasty ogon, podczas gdy niektóre inne nicienie mają ogon zaokrąglony.</li>
	<li>Zbierz nicienie Caenorhabditis pod mikroskopem stereoskopowym w jak najmniejszej ilości cieczy, używając pipety 20-100 µL. Przenieś zebrane nicienie bezpośrednio do 1-3 mL sterylnego M9-T w sterylnej szalce Petriego o średnicy 3 cm w celu przemycia robaków i usunięcia nieprzylegających drobnoustrojów (krok 3.3) lub alternatywnie przenieś pojedyncze robaki na płytkę z pożywką NGM (nematode growth medium) w celu utworzenia populacji nicieni (krok 3.4).</li>
	<li>Przemyj nicienie, aby usunąć drobnoustroje z ich zewnętrznej powierzchni. 
	UWAGA: Protokół ten wzbogaca bakterie jelitowe, ale nie eliminuje całkowicie bakterii przylegających do kutykuli robaka.
	<ol>
		<li>Inkubuj nicienie przez 10-15 min w M9-T.</li>
		<li>Przenieś nicienie pipetą w jak najmniejszej ilości cieczy do 1-3 mL świeżego M9-T w nowej sterylnej szalce Petriego o średnicy 3 cm.</li>
		<li>Powtórz inkubację i przenieś nicienie do świeżego M9-T jeszcze dwa razy. 
		UWAGA: Następujące kroki można wykonać zarówno na pojedynczych robakach, jak i na populacjach nicieni. Robaki można teraz wykorzystać do charakterystyki C. elegans i powiązanych drobnoustrojów, a także do izolacji bakterii (kroki 4 i 5). Alternatywnie można je przenieść pojedynczo na płytki NGM w celu utworzenia populacji nicieni (krok 3.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uzyskać populację nicieni, przenieś pojedynczego nicienia pipetą na płytkę NGM. 
	UWAGA: Tylko nicienie hermafrodytyczne, takie jak C. elegans lub C. briggsae, są w stanie wytworzyć potomstwo z pojedynczych osobników. Jednak pojedyncze robaki innych gatunków mogą również dać potomstwo, jeśli zostały wcześniej zapłodnione.
	<ol>
		<li>Naturalnie izolowane nicienie zazwyczaj zawierają w jelitach bakterie, które wydalają na płytki NGM, gdzie bakterie te rosną i służą jako pokarm dla C. elegans. Nie dodawaj oddzielnych organizmów pokarmowych, takich jak standardowy laboratoryjny szczep E. coli OP50. 
		UWAGA: Hodowla robaków na płytkach wpływa na skład powiązanej społeczności bakteryjnej, jednak skład ten pozostaje porównywalny do składu naturalnych izolatów C. elegans6,7.</li>
		<li>Pozostaw nicienie do namnożenia na okres do 10 dni w odpowiedniej temperaturze (np. 15-20 °C dla obszarów strefy umiarkowanej). Zamroź te nicienie (krok 3.5) lub wykorzystaj je do charakterystyki C. elegans i powiązanych drobnoustrojów, a także do izolacji drobnoustrojów (kroki 4 i 5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie nicieni do długoterminowego przechowywania
	<ol>
		<li>Pozostaw nicienie na płytkach do czasu, aż bakterie pokarmowe znikną, a na płytkach pozostaną głównie małe stadia larwalne. Zmyj robaki z płytek do 1,5 mL buforu S.</li>
		<li>W sterylnej probówce 2 mL dokładnie wymieszaj 500 µL buforu S z nicieniami z 500 µL 30% (v/v) glicerolu w buforze S. Niezwłocznie zamroź probówki w temperaturze -80 °C do długoterminowego przechowywania; w przeciwnym razie glicerol może zaszkodzić nicieniom.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie nicieni do identyfikacji molekularnej C. elegans oraz drobnoustrojów
<ol>
	<li>W celu nieuprzedzonego zidentyfikowania mikrobów związanych z nicieniami, przygotować płytkę 96-dołkową, zawierającą w każdym dołku trzy sterylne kuleczki o średnicy 1 mm, 19,5 µL buforu do PCR oraz 0,5 µL Proteinazy K (20 mg/mL). Do każdego dołka nanieść pojedynczego, wypłukanego nicienia, przenosząc jak najmniejszą ilość cieczy.</li>
	<li>Można również wykorzystać populacje nicieni. W tym przypadku nicienie należy wypłukać z płytek buforem M9 i przenieść ~300 µL buforu M9 zawierającego nicienie do probówek o pojemności 2 mL z 10-15 kuleczkami.</li>
	<li>Rozbić nicienie za pomocą homogenizatora kulkowego (np. poprzez wytrząsanie kulkowe przez 3 min w częstotliwości 30 Hz). Krótko odwirować płytkę lub probówki, aby ciecz osiadła na dnie (np. przez 10 s przy 8000 x g w temperaturze pokojowej [RT]).</li>
	<li>Identyfikacja C. elegans
	<ol>
		<li>Wyizolować DNA pojedynczych nicieni, podgrzewając próbki w cyklerze PCR przez 1 h w 50 °C i 15 min w 95 °C. DNA z populacji nicieni wyizolować dowolną wybraną metodą izolacji (przykładowe protokoły różnych metod izolacji z użyciem zestawów komercyjnych7,9). DNA zamrozić w -20 °C do długoterminowego przechowywania.</li>
		<li>Do identyfikacji C. elegans wykorzystać wyizolowane DNA oraz parę starterów nlp30-F (Tabela 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') i nlp30-R (Tabela 1, 5'-TACTTTCCCCATCCGTATC-3') w reakcji PCR, zgodnie z instrukcjami wybranego dostawcy polimerazy Taq.</li>
		<li>Zastosować następujące warunki PCR: wstępna denaturacja w 95 °C przez 2 min, następnie 35 cykli: 95 °C przez 45 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min oraz końcowa elongacja w 72 °C przez 5 min. C. elegans generuje produkt PCR o długości 154 bp.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scharakteryzować bakterie związane z nicieniami poprzez sekwencjonowanie amplikonów 16S regionu V3-V4, wykorzystując wyizolowane DNA.
	<ol>
		<li>Przygotować bibliotekę 16S przy użyciu wybranych starterów 16S i postępować zgodnie z protokołem zestawu do przygotowania bibliotek. Jedną z opcji jest zastosowanie starterów 341F (Tabela 1, 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') i 806R (Tabela 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') obejmujących region V3-V4 genu 16S rRNA, co pozwala na uzyskanie sekwencji, które można sklasyfikować w standardowych bazach danych z dobrą rozdzielczością7. 
		UWAGA: Ilość wejściowego DNA jest w tym kroku krytyczna. Ilość DNA pozyskanego z pojedynczych nicieni będzie znacznie mniejsza niż ta otrzymana z populacji nicieni. W przypadku pojedynczych nicieni może być konieczne zwiększenie ilości wejściowego DNA lub zwiększenie liczby cykli PCR7.</li>
		<li>Biblioteki można sekwencjonować na platformie sekwencyjnej przy użyciu odpowiedniego zestawu do sekwencjonowania. 
		UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano platformę MiSeq z odpowiednim zestawem odczynników MiSeq Reagent Kit. Odczynniki są stale ulepszane i powinny być dobierane zgodnie z najnowszymi standardami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Izolacja i hodowla bakterii związanych z nicieniami (Rycina 2)
<ol>
	<li>Aby wyizolować bakterie, należy przygotować płytkę 96-dołkową zawierającą trzy sterylne kuleczki o średnicy 1 mm, 20 µL buforu M9 na dołek, a następnie przenieść do każdego dołka pojedynczego, wypłukanego nicienia, przenosząc jak najmniejszą ilość cieczy. 
	UWAGA: Alternatywnie populacje nicieni można zmyć z płytek buforem M9 i ~300 µL buforu M9 zawierającego nicienie można przenieść do probówek o pojemności 2 ml zawierających 10–15 kulek. W każdym przypadku nicienie powinny pochodzić z hodowli, co do której stwierdzono, że jest C. elegans stosując kroki 4.1–4.4.</li>
	<li>Rozbij nicienie za pomocą homogenizatora kulkowego (np. poprzez homogenizację kulkową przez 3 min w częstotliwości 30 Hz). Krótko odwiruj płytkę lub probówki, aby zebrać ciecz na dnie (np. przez 10 s przy 8000 x g w temperaturze pokojowej). 
	UWAGA: Zastosowanie tej metody pozwoliło na wyizolowanie taksonów bakteryjnych podobnych do tych ujawnionych w procesie sekwencjonowania amplikonów 16S rDNA7, co sugeruje, że opisane homogenizowanie za pomocą kulek pozostawia większość komórek bakteryjnych nienaruszonymi.</li>
	<li>Należy zebrać nadsącz, przeprowadzić jego rozcieńczenia seryjne w stosunku 1:10, a następnie wysiać na płytki do 100 µL na płytki agarowe o średnicy 9 cm.
	<ol>
		<li>Aby zapewnić możliwość hodowli większości bakterii, należy zastosować różne pożywki alternatywne o odmiennym składzie odżywczym, w tym rozcieńczony agar sojowy z tryptonem (TSA, rozcieńczenie 1:10), agar MacConkey’ego, agar glukozowy Sabourauda, agar ziemniaczany z dekstrozą lub agar drożdżowy z peptonem i dekstrozą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować płytki w średnich warunkach temperaturowych miejsca pobrania próbek (np. w temperaturach od 15-20 °C (dla lokalizacji o klimacie umiarkowanym) przez 24–48 h.</li>
	<li>Należy zastosować standardową technikę wysiewu metodą trzech smug oraz sterylną pętlę w celu uzyskania czystych kultur bakteryjnych (Rycina 2).
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnej pętli lub wykałaczki pobrać pojedynczą kolonię z płytki i wysiać ją na nową płytkę z agarem, zawierającą to samo podłoło agarowe, którego użyto do puryfikacji. Należy upewnić się, że obsiano jedynie około 1/3 powierzchni płytki.</li>
		<li>Użyj nowej sterylnej pętlaki lub wysterylizuj pętlak wielokrotnego użytku, a następnie przeciągnij go przez pierwszy obszar posiewu, aby wykonać drugi posiew na kolejnej 1/3 powierzchni tej samej płytki.</li>
		<li>Powtórz ten krok, przesuwając sterylną pętlę przez drugą linię posiewu.</li>
		<li>Inkubować płytkę w tych samych warunkach hodowli, które zastosowano podczas izolacji. Technika ta powinna doprowadzić do wzrostu pojedynczych kolonii w obszarze trzeciego smugowania. 
		UWAGA: Może być konieczne kilkukrotne powtórzenie etapu oczyszczania, ponieważ izolaty naturalne mają tendencję do tworzenia biofilmów i/lub agregatów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultywuj czyste kolonie w medium ciekłym (tego samego typu co medium agarowe), stosując tę samą temperaturę i czas wzrostu, co powyżej (krok 5.4).</li>
	<li>Przygotować zapasy bakterii poprzez dodanie 300 µL hodowli bakteryjnej do 200 µL 86% (v/v) glicerolu (w odpowiedniej pożywce wzrostowej, np. TSB) i pipetuj w górę i w dół, aby właściwie wymieszać. Alternatywnie, przygotuj zapasy w DMSO poprzez zmieszanie 50 µL kultury bakteryjnej z 50 µL 7% (v/v) DMSO. Zamrozić w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Charakterystyka bakterii z wykorzystaniem sekwencjonowania pełnego genu 16S rybosomalnego RNA
	<ol>
		<li>Wyizoluj bakteryjne DNA z czystych kultur w cieczy, stosując odpowiednią metodę (np. zestaw do izolacji DNA; z doświadczenia wynika, że protokół ekstrakcji oparty na CTAB sprawdza się bardzo dobrze)22).</li>
		<li>Amplifikuj gen 16S rRNA, używając starterów 27F (Tabela 1, 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') oraz 1495R (Tabela 1, 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3')28 oraz następujące warunki PCR: 95 °C, 2 min, 22x (95 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 100 s) oraz końcowy okres elongacji w 72 °C, 5 min.</li>
		<li>Aby uzyskać pełne sekwencje, należy dodatkowo zastosować dwie wewnętrzne primery sekwencjonujące, takie jak 701F (Tabela 1, 5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3') oraz 785R (Tabela 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')6.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu hodowli bakterii z rozcieńczeniami seryjnymi, inkubacją, selekcją kolonii i przygotowaniem do mrożenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64249/64249fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2Identyfikacja gatunkowa i izolacja pojedynczych bakterii. Pojedyncze nicienie są rozbijane za pomocą homogenizatora kulkowego, a następnie izoluje się DNA w celu oznaczenia gatunku poprzez PCR lub sekwencjonowanie. Alternatywnie, rozdrobniony materiał nicieniowy poddaje się rozcieńczaniu seryjnemu i wysiewa na płytki z podłożem wzrostowym. Płytki inkubuje się do momentu pojawienia się kolonii bakteryjnych, a pojedyncze kolonie przenosi się metodą kreskowania na nowe płytki w celu uzyskania kultur czystych. Pojedyncze kolonie kultur czystych są wykorzystywane do hodowli płynnych kultur bakteryjnych w celu przygotowania stoków bakterii do długoterminowego przechowywania w temperaturze -80 °CRysunek stworzony za pomocą BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64249/64249fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Schulenburg, H., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+biotic+environment+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).</li>
<li>Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+Caenorhabditis+elegans+across+1.5+years+in+selected+North+German+locations%3A+the+importance+of+substrate+type%2C+abiotic+parameters%2C+and+Caenorhabditis+competitors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors.</a> BMC Ecology. 14 (1), 4(2014).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Travelling+at+a+slug%27s+pace%3A+possible+invertebrate+vectors+of+Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 15 (1), 19(2015).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li>
<li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+gateway+to+a+new+host-microbiome+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38(2016).</li>
<li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time%2C+substrate+and+individual+bacterial+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource%5BTitle%5D)+AND+%22G3+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+repertoire+contained+within+the+native+microbiota+of+the+model+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans.</a> The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).</li>
<li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+effects+of+C.+elegans+protective+natural+microbiota+on+host+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728(2022).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF%CE%B2%2FBMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604(2019).</li>
<li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li>
<li>Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+metabolic+and+gene+regulatory+networks+modulates+the+C.+elegans+dietary+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response.</a> Cell. 153 (1), 253-266 (2013).</li>
<li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+systems+biology+uncovers+metabolites+affecting+C.+elegans+gene+expression+and+life+history+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits.</a> Cell. 156 (4), 759-770 (2014).</li>
<li>MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+developmental+acceleration+independent+of+TOR+and+insulin+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans.</a> Cell. 153 (1), 240-252 (2013).</li>
<li>O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurotransmitter+produced+by+gut+bacteria+modulates+host+sensory+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour.</a> Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).</li>
<li>Snoek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-parent+recombinant+inbred+line+population+of+C.+elegans+allows+identification+of+novel+QTLs+for+complex+life+history+traits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits.</a> BMC Biology. 17 (1), 24(2019).</li>
<li>Avery, L., Shtonda, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+transport+in+the+C.+elegans+pharynx%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Food transport in the C. elegans pharynx.</a> Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+delicate+balance+between+bacterial+iron+and+reactive+oxygen+species+supports+optimal+C.+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development.</a> Cell Host & Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+life+in+compost%3A+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li>
<li>Félix, M. -A., Duveau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+dynamics+and+habitat+sharing+of+natural+populations+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> BMC Biology. 10 (1), 59(2012).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+and+linkage+disequilibrium+in+natural+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations.</a> Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).</li>
<li>Dolgin, E. S., Félix, M. -A., Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hakuna+Nematoda%3A+genetic+and+phenotypic+diversity+in+African+isolates+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).</li>
<li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+animal+models+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans and related nematodes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarri%C3%A8re%2C+A+%22WormBook%22">WormBook</a>. , ed. The C elegans research community 1-19 (2014).</li>
<li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).</li>
<li>Haber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites%3A+Evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).</li>
<li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+network+rewiring+of+propionate+flux+compensates+vitamin+B12+deficiency+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans.</a> eLife. 5, 17670(2016).</li>
</ol>

Oświadczamy, że nie mamy konfliktu interesów.

Nicień Caenorhabditis elegans jest jednym z najintensywniej badanych organizmów modelowych w badaniach biologicznych. Został wprowadzony przez Sydneya Brennera w 1960 roku, pierwotnie w celu zrozumienia rozwoju i funkcji układu nerwowego29. Od tego czasu C. elegans stał się potężnym modelem do badania podstawowych procesów we wszystkich dyscyplinach biologicznych, w tym biologii behawioralnej, neurobiologii, starzenia się, biologii ewolucyjnej, biologii komórki, biologii rozwoju ...

W naturze, C. elegans jest powszechnie spotykany w zgniłej materii roślinnej, zwłaszcza w zgniłych owocach, takich jak jabłka lub na pryzmatach kompostu1. Jest również powiązany z niektórymi żywicielami bezkręgowców, takimi jak ślimaki i2,3. Siedliska te są bogate w drobnoustroje, które nie tylko służą jako pokarm dla robaka, ale mogą również tworzyć z nim stabilne związki. Informacje na temat różnorodności naturalnie związanych mikroorganizmów zostały opublikowane dopiero w 2016 roku4,5,6. Od tego czasu te i tylko kilka nowszych badań ujawniło, że C. elegans jest związany z różnymi bakteriami i grzybami, w tym najczęściej z bakteriami z rodzaju Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter i kilkoma innymi6,7,8. Kilka powiązanych bakterii może stabilnie skolonizować jelito robaka, chociaż nie wszystkie6,9,10,11,12. Prawdopodobnie będą miały kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia biologii C. elegans, ponieważ mogą zapewniać odżywianie, chronić przed patogenami i ewentualnie innymi stresorami oraz wpływać na kluczowe cechy historii życia, takie jak tempo reprodukcji, rozwój lub reakcje behawioralne.
Na przykład, naturalnie związane izolaty z rodzajów Pseudomonas, Ochrobactrum, a także Enterobacter lub Gluconobacter mogą chronić robaka przed infekcją patogenami i zabijaniem na różne sposoby5,6,11,13,14. Specyficzny izolat z rodzaju Comamonas wpływa na reakcję żywieniową nicieni, rozwój, długość życia i płodność15,16,17. Bakterie Providencia wytwarzają neuromodulator tyraminę i w ten sposób modulują aktywność układu nerwowego gospodarza i wynikające z niej reakcje behawioralne18. Wykazano, że zestaw różnych naturalnie powiązanych bakterii wpływa na tempo wzrostu populacji, płodność i reakcje behawioralne5,6,9,11,19.
Do tej pory dokładna różnorodność i spójność rodzimej mikroflory C. elegans w różnych siedliskach i lokalizacjach geograficznych nie jest w pełni zrozumiała, a dalsze powiązania między robakiem a mikrobami z jego środowiska pozostają do odkrycia. W kilku wcześniejszych badaniach wykorzystano szczepy bakterii wyizolowane z pewnego środowiska glebowego, naturalnych siedlisk C. elegans lub z eksperymentów mezokosmicznych (tj. środowisk laboratoryjnych, które odtwarzają naturalne siedliska) ze szczepami laboratoryjnymi C. elegans4,5,20. Mimo że badania te dostarczyły nowych informacji na temat wpływu drobnoustrojów na określone cechy nicieni (np. metabolizm nicieni21), znaczenie tych interakcji dla biologii C. elegans w przyrodzie jest niejasne. Dlatego w niniejszym manuskrypcie opisano metody bezpośredniego izolowania C. elegans od natury oraz izolowania, a następnie charakteryzowania naturalnie związanych drobnoustrojów zarówno z pojedynczych robaków, jak i grup robaków. Opisane metody są zaktualizowaną i ulepszoną wersją procedur stosowanych wcześniej do izolacji i charakterystyki naturalnego C. elegans i jego rodzimej mikroflory2,6,7. Biorąc pod uwagę, że C. elegans jest powszechnie spotykany w rozkładającej się materii roślinnej na całym świecie (zwłaszcza w gnijących owocach, regionach umiarkowanych i jesienią)1,2,22,23,24,25, protokół ten może być stosowany przez dowolne laboratorium, gdy istnieje zainteresowanie powiązaniem C. elegans cech naturalnie związanych drobnoustrojów, a tym samym bardziej naturalnie odpowiedniego kontekstu. To ostatnie ma kluczowe znaczenie dla pełnego zrozumienia biologii nicieni, ponieważ wiadomo z wielu innych systemów gospodarzy, że związana z nimi mikrobiota może wpływać na różne cechy historii życia26, aspekt, który jest obecnie w dużej mierze zaniedbywany w wielu badaniach C. elegans w prawie wszystkich dyscyplinach nauk przyrodniczych.

<table><tbody><tr><td>COMSOL</td><td>COMSOL</td><td></td><td>multifizyczne oprogramowanie symulacyjne</td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Nicień Caenorhabditis elegans wchodzi w interakcje z dużą różnorodnością mikroorganizmów w naturze. Ogólnie rzecz biorąc, C. elegans jest powszechnie spotykany w zgniłej materii roślinnej, zwłaszcza w zgniłych owocach, takich jak jabłka lub na pryzmatach kompostu. Jest również związany z niektórymi żywicielami bezkręgowców, takimi jak ślimaki i. Siedliska te są bogate w drobnoustroje, które służą jako pokarm dla C. elegans i które mogą również trwale kolonizować jelita nicieni. Do tej pory dokładna różnorodność i spójność rodzimej mikroflory C. elegans w różnych siedliskach i lokalizacjach geograficznych nie jest w pełni poznana. W tym miejscu opisujemy odpowiednie podejście do izolowania C. elegans od natury i charakteryzowania mikrobioty robaków. Nicienie można łatwo odizolować od materiału kompostowego, gnijących jabłek, ślimaków lub zwabić, umieszczając jabłka na pryzmatach kompostu. Najlepszy czas na znalezienie C. elegans na półkuli północnej przypada na okres od września do listopada. Robaki można wypłukać z zebranego materiału substratowego poprzez zanurzenie substratu w roztworze buforowym, a następnie zebranie nicieni i przeniesienie ich na pożywkę wzrostową nicieni lub bufor PCR w celu późniejszej analizy. Dalej ilustrujemy, w jaki sposób próbki można wykorzystać do izolacji i oczyszczania mikroorganizmów związanych z robakami oraz do przetwarzania robaków do analizy składu społeczności rybosomalnego RNA 16S. Ogólnie rzecz biorąc, opisane metody mogą stymulować nowe badania nad charakterystyką mikroflory C. elegans w różnych siedliskach i lokalizacjach geograficznych, pomagając w ten sposób w uzyskaniu kompleksowego zrozumienia różnorodności i stabilności mikrobioty nicieni jako podstawy przyszłych badań funkcjonalnych.

Nicień C. elegans jest często spotykany w rozkładających się owocach, takich jak jabłka, a także w próbkach kompostu. W północnych Niemczech C. elegans oraz gatunki spokrewnione (szczególnie C. remanei, ale również C. briggsae) występują głównie od września do listopada2. Nicienie te najczęściej spotyka się w rozkładającej się materii roślinnej, zwłaszcza w gnijących owocach, takich jak jabłka lub gruszki, a także w kompoście, w szczególności w materiale o wysok...

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Protokół ten pozwala na uzyskanie nowych informacji na temat naturalnej mikroflory C. elegans. Jednocześnie wyizolowane mikroorganizmy mogą być wykorzystywane w kontrolowanych eksperymentach laboratoryjnych w celu scharakteryzowania interakcji między mikrobiotą a gospodarzem oraz biologii C. elegans. Protokół ten koncentruje się na izolowaniu drobnoustrojów związanych z C.elegans w naturze, które są zatem kluczowe dla zrozumienia biologii tego ważnego gospodarza modelowego w bardziej naturalnym kontekście.Pomocne będzie zapoznanie się z wyglądem Caenorhabditis w porównaniu z innymi nicieniami. Pipetowanie pod lunetą sekcyjną może początkowo być trudne, ale praktyka będzie pomocna. Zacznij od zebrania próbek środowiskowych, takich jak kompost lub zgniłe owoce, w oddzielnych plastikowych torbach, tubkach lub czystych pojemnikach.Równomiernie rozprowadzić kawałki pobranych próbek środowiskowych na sterylnej dziewięciocentymetrowej pustej szalce Petriego i dodać około 20 mililitrów sterylnej lepkiej pożywki, aby pokryć próbkę pożywką. Pod mikroskopem preparacyjnym poszukaj nicieni Caenorhabditis zgodnie z wytycznymi dotyczącymi izolowania Caenorhabditis elegans i pokrewnych nicieni. Za pomocą pipety o pojemności od 20 do 100 mikrolitrów zebrać z płytki najmniejszą możliwą ilość płynu zawierającego nicienie Caenorhabditis i przenieść ją na trzycentymetrową szalkę Petriego zawierającą od jednego do trzech mililitrów sterylnego M9T.Aby ustalić populację robaków, poszczególne robaki można przenieść na płytkę z pożywką wzrostową nicieni lub NGM. Aby umyć nicienie i usunąć drobnoustroje obecne na zewnątrz nicieni, inkubuj je w M9T przez 10 do 15 minut. Odpipetować najmniejszą możliwą ilość płynu zawierającego nicienie i przenieść ją na nową, sterylną trzycentymetrową szalkę Petriego zawierającą od jednego do trzech mililitrów świeżego M9T.W celu bezstronnej identyfikacji drobnoustrojów związanych z nicieniami, przygotuj 96-dołkową płytkę z około trzema sterylnymi kulkami o średnicy jednego milimetra i dodaj mieszaninę 19,5 mikrolitra buforu PCR i 0,5 mikrolitra proteinazy K na studzienkę. Przenieś pojedyncze umyte nicienie do każdej studzienki z jak najmniejszą ilością płynu. Rozdrobnić przeniesione nicienie za pomocą homogenizatora kulkowego przez trzy minuty przy 30 hercach i odwirować płytki lub probówki przy 8 000 G przez 10 sekund w temperaturze pokojowej, aby ciecz opadła na dno.Aby zidentyfikować C. elegans, należy podgrzać próbki w cyklerze PCR przez godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza i 15 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby wyizolować DNA poszczególnych nicieni, lub użyć komercyjnych zestawów do wyizolowania DNA populacji robaków. Zamroź wyizolowane DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania. Użyj DNA i pary starterów NLP 30 do przodu i NLP 30 do tyłu i wytwórz produkt PCR ze 154 parami zasad.Aby wyizolować bakterie, przygotuj 96-dołkową płytkę z około trzema sterylnymi kulkami o średnicy jednego milimetra, 20 mikrolitrami buforu M9 na studzienkę i odpipetuj pojedynczą umytą nicień do każdej studzienki z jak najmniejszą ilością płynu. Rozdrobnij nicienie, jak pokazano przed użyciem homogenizatora perełkowego, a następnie wykonaj krótkie odwirowanie płytki, aby ciecz opadła na dno. Po zakończeniu zebrać zawiesinę i stopniowo rozcieńczyć ją w proporcji od 1 do 10.Rozłożyć do 100 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny na dziewięciocentymetrowych płytkach agarowych. Następnie inkubuj płytki w temperaturze od 15 do 20 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin. Aby uzyskać czystą kulturę bakteryjną, należy pobrać pojedynczą kolonię z inkubowanej płytki za pomocą sterylnej pętli lub wykałaczki i rozprowadzić ją na nowej płytce agarowej zawierającej tę samą pożywkę agarową, która została użyta podczas oczyszczania.Upewnij się, że używasz tylko 1/3 talerza. Następnie wysterylizuj pętlę wielokrotnego użytku lub użyj nowej sterylnej pętli i przeciągnij ją przez pierwszą smugę, aby utworzyć drugą smugę na kolejnej 1/3 płytki próbki. Powtórz to, przeciągając pętlę przez drugą smugę i tworząc trzecią smugę, aby osiągnąć wzrost pojedynczej kolonii.Inkubować płytkę w tych samych warunkach wzrostu, które są używane do izolacji, a w razie potrzeby powtórzyć etap oczyszczania. Hoduj czyste kolonie w płynnym podłożu, używając tej samej temperatury i warunków wzrostu. Następnie scharakteryzuj bakterie, ekstrahując bakteryjne DNA z czystych płynnych kultur, amplifikując rybosomalny RNA 16S przy użyciu 27 starterów do przodu i 1495 wstecznych i wykonując PCR zgodnie z opisem w tekście.Kiedy zebrane próbki owoców i kompostu zostały rozprowadzone na szalkach Petriego i zanurzone w ciekłym lub lepkim podłożu, spowodowało to, że robaki opuściły materiał podłoża i wypłynęły na powierzchnię podłoża. Mikroorganizmy wyizolowano jako czyste pojedyncze kolonie, a oczyszczenie odegrało istotną rolę, ponieważ niektóre bakterie związane z C. elegans mogą tworzyć biofilmy lub łatwo się agregować, co prowadzi do powstania kultur wielogatunkowych. PCR przy użyciu starterów specyficznych dla C.elegans, a mianowicie NLP 30 do przodu i NLP 30 do tyłu, spowodował amplifikację produktu 154 par zasad dla C.elegans.DNA wyizolowane z pojedynczych robaków skutkowało słabymi prążkami PCR, podczas gdy ekstrakcja DNA z populacji robaków składających się z co najmniej 50 robaków dała większą ilość i wyraźniejsze prążki. Sukces PCR specyficznego dla C.elegans został potwierdzony przez przeprowadzenie DNA szczepu laboratoryjnego, a mianowicie N2, jako kontroli pozytywnej jednocześnie z DNA izolowanych nicieni: Drobnoustroje są wszędzie. Dlatego tak ważne jest, aby pracować w sterylnych warunkach, aby upewnić się, że te mikroorganizmy, które są izolowane, są naprawdę związane z robakiem w naturze.Wyizolowane drobnoustroje można wykorzystać do badania interakcji między gospodarzem a mikrobiotą lub roli drobnoustrojów w biologii gospodarza, na przykład starzenia się, rozwoju lub odporności w kontrolowanych eksperymentach laboratoryjnych. Mikroorganizmy wyizolowane za pomocą tej techniki są obecnie wykorzystywane przez społeczność C.elegans w celu lepszego zrozumienia różnorodności mikrobioty w zależności od kondycji gospodarza lub roli drobnoustrojów w odporności.

isolation-characterization-natural-microbiota-model-nematode

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Taylor, M. N., et.al. Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności interakcji Caenorhabditis elegans z bakteriami. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje narażenie wolnych od zarazków, dopasowanych do wieku robaków Caenorhabditis elegans na szczep bakteryjny w celu kolonizacji jelit. Wyjaśnia selektywne usuwanie nieprzylegających i zewnętrznych bakterii, pozostawiając tylko żywe bakterie przylegające do nabłonka jelitowego w celu...

Ocena kolonizacji bakteryjnej jelit u C. elegans wolnych od zarazków

Źródło: Petersen, C. i in., Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje izolację i hodowlę gatunków bakterii związanych z Caenorhabditis elegans. Liza C. elegans oparta na koralikach, a następnie selektywna hodowla, umożliwia izolację różnorodnych szczepów mikroorganizmów do dalszej analizy.

Izolacja i hodowla bakterii związanych z Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Ten protokół przedstawia metodę efektywnego wydobywania żywych nicieni z naturalnych substratów w terenie.

Szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka Baermanna

Ten protokół może być używany do przeprowadzania badań ekologicznych na dużą skalę nicieni Caenorhabditis. Podstawową zaletą tej metody jest sprawna organizacja i analiza danych ekologicznych i molekularnych związanych z nicieniami zebranymi z natury.

Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę izolacji naturalnej mikrobioty Caenorhabditis elegans z próbek środowiskowych. Technika PCR i hodowla bakterii umożliwiają badanie interakcji mikrobiota-gospodarz w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów