Name: Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj rekonstrukcję ruchliwości opartej na aktynie przy użyciu dostępnych komercyjnie białek. Ta metoda pozwala badać mechanizmy biologicznego ruchu komórkowego bez potrzeby specjalistycznej wiedzy z zakresu oczyszczania protein.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy członkom naszego nowego domu w LPENS za ich ciepłe przyjęcie, a w szczególności zespołowi ABCDJ za wszelką pomoc i wsparcie. J.P. dziękuje za wsparcie finansowe od Fundacji ARC (Grant PJA 20191209604), a C.S. dziękuje za wsparcie finansowe od Human Frontiers Science Program Organization (Grant RGP0026/2020).

1. Przygotowanie buforów
UWAGA: Do wszystkich buforów należy używać ultraczystej H2O. Nie musi być ona sterylna. Wszystkie roztwory opisane w krokach 1.1-1.4 należy przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 µm, podzielić na aalikwoty po 500 µL-2 mL na probówkę, zależnie od przeznaczenia, i przechowywać w temperaturze -20 °C.
<ol>
	<li>Przygotuj 10% BSA, odważając 2 g BSA do probówki stożkowej o pojemności 50 mL i dopełniając wodą H2O do oznaczenia 20 mL. Mieszaj do czasu rozpuszczenia BSA (około 30 min), a następnie uzupełnij objętość do 20 mL. 
	UWAGA: Należy użyć BSA wysokiej jakości (patrz Tabela materiałów). Roztwór 10% BSA jest wykorzystywany zarówno podczas przygotowania kulek, jak i w mieszaninie do testów ruchliwości.</li>
	<li>W celu przygotowania kulek, przygotuj bufor Xb (10 mM HEPES, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl2 i 0,1 mM CaCl2, pH 7,5) jako roztwór 10x, a następnie rozcieńcz go przed użyciem (100 µL 10x roztworu zapasu Xb + 900 µL H2O). Przygotuj Xb/1% BSA, mieszając 100 µL 10x roztworu zapasu Xb + 100 µL 10% BSA + 800 µL H2O.</li>
	<li>Przygotuj bufor G (2 mM Tris, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM DTT, 2 mM ATP), który służy do rozcieńczania monomerycznej aktyny (G-aktyny). Dostosuj pH do wartości 7, a nie do pH 8, jak stosuje się tradycyjnie (patrz dyskusja).</li>
	<li>Przygotuj bufor do testów ruchliwości MB13 (10 mM HEPES, 1,5 mM ATP, 3 mM DTT, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1% BSA, pH 7,5). W niektórych zastosowaniach przydatny jest 10x MB13. Należy jednak przygotować 10x MB13 bez BSA, ponieważ prowadzi to do problemów podczas regulacji pH. Dodaj BSA z 10% roztworu zapasu (przygotowanego w kroku 1.1) podczas przygotowywania 1x MB13 z 10x MB13.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów białek
UWAGA: Do wszystkich resuspensji należy używać ultraczystej H2O. Nie musi być ona sterylna. Wszystkie białka należy przechowywać w lodzie i rozdzielać do schłodzonych wcześniej probówek. Należy manipulować nimi delikatnie, aby nie doprowadzić do powstania pęcherzyków powietrza, i nigdy nie używać vortexa do roztworów białek. W przypadku zapasów przechowywanych w -80°C, szybkie mrożenie w ciekłym azocie nie jest konieczne. Rozmiar aliquotów należy dostosować tak, aby uniknąć więcej niż około pięciu cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ nie wydaje się to wpływać na aktywność żadnego z białek. Alikwoty robocze można przechowywać w -20 °C przez kilka tygodni.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór G-aktyny (mięsień szkieletowy królika) zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Poddać proszek aktynowy (patrz Tabela materiałów) krótkiemu wirowaniu w temperaturze 4 °C, aby zebrać ciało stałe na dnie probówki.</li>
		<li>Dodać H2O zgodnie z instrukcjami producenta (1 mg białka w 100 µL zimnej H2O dla aktyny nieznakowanej, 100 µg białka w 100 µL zimnej H2O dla aktyny znakowanej ATTO).</li>
		<li>Pozostawić na lodzie przez co najmniej 15 min. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, pozostawić na lodzie przez kolejne 15 min i ponownie wymieszać. Poddać krótkim wirowaniu w temperaturze 4 °C, aby zebrać roztwór na dnie probówki, a następnie wymieszać ponownie.</li>
		<li>Przygotować alikwoty nieznakowanej aktyny o objętości 10-50 µL w zależności od przeznaczenia oraz alikwoty aktyny znakowanej ATTO o objętości 20 µL. Przechowywać alikwoty w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Aby zdepolimeryzować oligomery aktyny powstające podczas liofilizacji i zamrażania, rozcieńczyć alikwot resuspendowanej aktyny około 8-krotnie w buforze G z dodatkiem ATP i DTT (na przykład do 20 µL roztworu resuspendowanej aktyny z kroku 2.1.4 dodać 134 µL buforu G, 0,32 µL ATP o stężeniu 0,2 mM oraz 0,16 µL DTT o stężeniu 1 M). W przypadku znakowania fluorescencyjnego dodać około 10% aktyny znakowanej; na przykład dodać 5 µL aktyny znakowanej ATTO do 40 µL rozcieńczonej aktyny nieznakowanej. Pozostawić do depolimeryzacji na lodzie z okresowym mieszaniem (pipetowaniem) przez co najmniej kilka dni do tygodnia przed pomiarem stężenia białka metodą Bradforda, zgodnie z opisem w kroku 3. 
		UWAGA: Rozcieńczoną aktynę nieznakowaną i fluorescencyjną przechowywać na lodzie w chłodni lub lodówce; nigdy nie zamrażać ani nie dopuszczać do ocieplenia. Preparat będzie ulegać dalszej depolimeryzacji z upływem czasu i przy prawidłowej obsłudze może być używany przez co najmniej 6 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resuspender kompleks Arp2/3 (mózg świński) (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta (20 µg białka w 20 µL zimnej H2O), stosując sekwencję krótkiego wirowania, mieszania itd. na lodzie, jak opisano dla aktyny w kroku 2.1. Połączyć roztwory białek z resuspensji dwóch probówek z proszkiem, aby uzyskać większy zapas do powtarzalnych eksperymentów. Przygotować alikwoty o objętości 2 µL i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Resuspender profilinę (ludzka rekombinowana) (patrz Tabela materiałów) w stężeniu 4x wyższym niż określono w instrukcjach producenta (100 µg białka w 25 µL zimnej H2O), stosując sekwencję krótkiego wirowania, mieszania itd. na lodzie, tak jak dla aktyny w kroku 2.1. Przed oznaczeniem stężenia białka połączyć roztwory białek z resuspensji dwóch probówek z proszkiem, aby uzyskać większy zapas do powtarzalnych eksperymentów. 
	UWAGA: Przechowywać na lodzie w chłodni lub lodówce; nigdy nie zamrażać ani nie dopuszczać do ocieplenia. Przy prawidłowej obsłudze resuspendowana profilina jest stabilna przez co najmniej 6 miesięcy do 1 roku.</li>
	<li>Resuspender białko capping protein (α1β2, ludzkie rekombinowane) (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta (50 µg białka w 50 µL zimnej H2O), stosując sekwencję krótkiego wirowania, mieszania itd. na lodzie, jak opisano dla aktyny w kroku 2.1. Schłodzić 50 µL glicerolu na lodzie i dodać do niego 50 µL resuspendowanego białka capping protein; delikatnie wymieszać. Przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Roztwór nie zamarza, a jego aktywność jest wysoka, więc roztwór może być przechowywany jako pojedyncza alikwota przez miesiące, a nawet lata, jeśli jest obchodzony ostrożnie. Mysie rekombinowane białko capping protein, najczęściej stosowane w przeszłości w eksperymentach in vitro13, wkrótce będzie dostępne w sprzedaży.</li>
	<li>Resuspender gelsolinę (ludzka rekombinowana, z tagiem His) (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta (20 µg białka w 20 µL zimnej H2O), stosując sekwencję krótkiego wirowania, mieszania itd. na lodzie, jak opisano dla aktyny w kroku 2.1. Na jeden dzień eksperymentów zużywa się około 2 µL gelsoliny; dlatego należy przygotować duże alikwoty (5-10 µL) i przechowywać je w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Protokół z użyciem gelsoliny jest podany jako alternatywa. Zaleca się stosowanie białka capping protein zamiast gelsoliny, zakupionego lub oczyszczonego zgodnie z opisem w13.</li>
	<li>Resuspender VCA (ludzkie WASP-VCA, z tagiem GST) (patrz Tabela materiałów) w stężeniu 2x wyższym niż określono w instrukcjach producenta (500 µg białka w 250 µL zimnej H2O), stosując sekwencję krótkiego wirowania, mieszania itd. na lodzie, tak jak dla aktyny w kroku 2.1. Przygotować alikwoty o objętości 10 µL i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	​UWAGA: Po wprowadzeniu do sprzedaży SpVCA (ludzkie pVCA, z tagami streptawidyny i His) lub jeśli możliwe jest oczyszczanie białka14, zaleca się stosowanie SpVCA zamiast VCA. VCA nie daje powtarzalnie struktur typu „comets” w warunkach opisanych w niniejszym protokole.</li>
</ol>
3. Pomiar stężeń białek
<ol>
	<li>Przygotuj krzywą standardową metodą Bradforda, wykonując dwa nakładające się rozcieńczenia seryjne BSA. 
	UWAGA: Krzywą wzorcową należy sporządzać jedynie raz na kilka miesięcy (lub rzadziej), pod warunkiem, że nie zmieniono spektrofotometru.
	<ol>
		<li>W pierwszym rzędzie statywu na mikroprowetki należy umieścić probówki do serii rozcieńczeń BSA nr 1: cztery probówki o pojemności 2 ml, a następnie cztery probówki o pojemności 1,5 ml. W trzecim rzędzie statywu należy umieścić probówki do serii rozcieńczeń BSA nr 2 w taki sam sposób jak dla serii nr 1. W piątym rzędzie statywu należy umieścić po jednej probówce o pojemności 2 ml dla każdej próbki przeznaczonej do pomiaru oraz dwie probówki o pojemności 1,5 ml. W piątym rzędzie należy dodać jedną probówkę o pojemności 1,5 ml na próbę ślepą.</li>
		<li>Odmierz odczynnik Bradforda (patrz Tabela materiałów) do probówek o pojemności 1,5 ml.
		<ol>
			<li>Napełnij do pełna probówkę stożkową o pojemności 15 ml odczynnikiem Bradforda, aby ułatwić pipetowanie (nadmiar zostanie zwrócony do butelki z roztworem zapasowym w lodówce), utrzymując ją w lodzie. Pobierz 200 µL Odczynnik Bradforda i wypchnij go z powrotem do probówki stożkowej, aby zwilżyć końcówkę pipety. Ponieważ roztwór jest lepki, pipetuj powoli, aby umożliwić całkowite wniknięcie i wypłynięcie roztworu z końcówki bez tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
			<li>Za pomocą „nawilżonej” końcówki powoli naciągnąć pipetą 200 µL odczynu Bradforda do każdej z probówek 1,5 ml w statywie (cztery dla każdego rozcieńczenia BSA, jedna dla próby ślepej i dwie dla każdej mierzonej próbki). Należy to zrobić w pierwszej kolejności, aby odczyn Bradforda mógł całkowicie ogrzać się do temperatury pokojowej przed zmieszaniem z roztworami białek. Pozostałą zawartość probówki stożkowej 15 ml należy przelać z powrotem do butelki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odmierz H2do probówek o pojemności 2 ml. W pierwszym rzędzie statywu dodać 1,990 µL H2Do pierwszej probówki i 900 µL do trzech pozostałych probówek. W rzędzie 3 dodać 1,992.5 µL do pierwszej probówki i 900 µL do trzech pozostałych probówek. Dodać 2,000 µL H2Do każdej z probówek z próbkami w rzędzie 5. 
		UWAGA: W przypadku wszystkich objętości większych niż 1,000 µL, użyj 1,000 µL pipetą, lecz podaj pełną ilość, wykonując pipetowanie dwukrotnie. Ważne jest, aby przygotować wszystko przed rozpoczęciem kolejnych etapów, aby uniknąć pozostawienia białek w wysokim rozcieńczeniu w H2O przez długi czas.</li>
		<li>Aby przygotować serię rozcieńczeń BSA nr 1, wymieszaj 10 µL skalibrowanego roztworu BSA o stężeniu 2 mg/ml (patrz Tabela materiałów) do probówki z 1,990 µL H2Aby przygotować 10 µg/mL roztworu. Z niego należy przygotować trzy rozcieńczenia szeregowe (5 µg/mL, 2.5 µg/mLi 1.25 µg/mL BSA) poprzez przeniesienie 900 µL każdego roztworu do kolejnej probówki (zawierającej 900 µL H2O).</li>
		<li>Aby przygotować seria rozcieńczeń BSA nr 2, należy zmieszać 7.5 µL odmierzona ilość BSA o stężeniu 2 mg/mL do probówki z 1,992.5 µL H2Aby wykonać 7.5 µg/mL roztworu. Z niego należy przygotować trzy rozcieńczenia seryjne (3.75 µg/mL, 1.875 µg/mL i 0.9375 µg/mL BSA) poprzez przeniesienie 900 µL każdego roztworu do następnej probówki (zawierającej 900 µL H2O).</li>
		<li>Wymieszać i odczytać absorbancję w celu wygenerowania krzywej wzorcowej. Dodać 800 µL H2do probówki z odczynnikiem Bradforda dla próby ślepej i uruchom sprężynę czasomierza. Wymieszaj tak wydajnie, jak to możliwe, unikając powstawania pęcherzyków powietrza, 800 µL każdego standardu BSA z 200 µL odczynnik Bradforda do przygotowanych probówek. Po zmieszaniu wszystkich wzorców z odczynnikiem Bradforda (&lt; (5 min), wlej każdy standard do jednorazowej kuwety i zmierz absorbancję przy 600 nm w spektrofotometrze po uprzednim wyzerowaniu urządzenia. 
		UWAGA: Ta sama kuweta może być wykorzystana do odczytu całej serii, pod warunkiem że w pierwszej kolejności odczytany zostanie standard o najniższym stężeniu, a kuweta zostanie dokładnie opróżniona pomiędzy pomiarami. Powtórz wyznaczanie krzywej wzorcowej do momentu, aż dopasowanie liniowe osiągnie wartość R co najmniej 0,99. Przejdź do odczytu próbek dopiero po opanowaniu techniki pipetowania i delikatnego mieszania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar stężeń aktyny i białek wiążących aktynę
	<ol>
		<li>W probówkach o pojemności 2 ml zawierających 2,000 µL z H2O (przygotowane w kroku 3.1.3), ostrożnie wymieszaj z następującymi składnikami: 2 µL zarówno kompleks Arp2/3, jak i profilina, 4 µL oznaczonej G-aktyny, 5 µL zarówno gelsolina, jak i VCA oraz 8 µL białka capping (rekombinowanego ludzkiego). Natychmiast pobrać 800 µL roztworu i wymieszać z uprzednio przygotowanym odczynnikiem Bradforda, a następnie powtórzyć czynność, aby uzyskać dwa odczyty różniące się od siebie o nie więcej niż 5%–10% dla każdej próbki. Większa różnica wskazuje na problem z resuspensją lub sposobem postępowania z próbką. Odczytu należy dokonać w ciągu kilku minut od wymieszania z odczynnikiem Bradforda. 
		UWAGA: W przypadku korzystania z krzywej standardowej z innego dnia, oprócz próbek należy przygotować jedynie próbę ślepej z kroku 3.1.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz stężenia aktyny oraz białek wiążących aktynę, wykorzystując krzywą wzorcową i czynnik rozcieńczenia. Powtórz pomiar dla każdej nowej resuspensji. Masu cząsteczkową należy uwzględnić w celu przeliczenia uzyskanych odczytów z mg/mL. poprzez Metoda Bradforda do µM Są to: aktyna 43 kD, kompleks Arp2/3 224 kD, profilina 15 kD, gelsolina 95 kD, białko capping protein 68 kD (rekombinowane ludzkie) lub 63,5 kD (rekombinowane mysie), VCA 43 kD oraz SpVCA 54 kD (masa cząsteczkowa monomeru).</li>
</ol>
4. Powlekanie kulek
<ol>
	<li>Wstępnie schłodzić wirówkę do 4 °C i ustawić ogrzewany suchy blok (patrz Tabela Materiałów) na 18 °C.</li>
	<li>Przemyć kuleczki: do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL pipetować 50 µL buforu Xb, dodać 9 µL zawiesiny kuleczek o średnicy 4,5 µm lub 2 µL zawiesiny kuleczek o średnicy 1 µm (zawiesina 2,5 % w/v) (patrz Tabela Materiałów). Dokładnie wymieszać i wirować próbki przy 20 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Całkowita powierzchnia kuleczek dla obu rozmiarów wynosi 3 cm2: 
	<img alt="Wzór wyznaczania wartości S, obliczanie objętości kuleczek, równanie analizy zawiesiny, badania naukowe." src="/files/ftp_upload/64261/64261eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
	wartość ta została wyznaczona poprzez obliczenie liczby kuleczek, a następnie ich całkowitej powierzchni przy użyciu klasycznych równań na objętość i powierzchnię sfer. Można stosować kuleczki o innych rozmiarach, jeśli dostosuje się ich ilość tak, aby całkowita powierzchnia pozostała stała i wynosiła 3 cm2.</li>
	<li>Powlec kuleczki: ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu kuleczek, a następnie resuspender osad w 40 µL 2 µM SpVCA (lub 7 µM VCA) w buforze Xb poprzez delikatne pipetowanie. Mieszać przy 18 °C, 1 000 rpm przez 20 min.</li>
	<li>Przemyć powleczone kuleczki: odwirować mieszaninę (20 000 x g przez 10 min w 4 °C) i ostrożnie usunąć supernatant. Resuspender kuleczki w 50 µL zimnego Xb/1% BSA i wirować przy 20 000 x g przez 10 min w 4 °C. Usunąć supernatant i powtórzyć etap płukania 1x.</li>
	<li>Resuspender osad powleczonych kuleczek z kroku 4.4 w 120 µL zimnego Xb/1% BSA dla obu rozmiarów kuleczek, tak aby stosunek powierzchni kuleczek do 1 µL roztworu był taki sam. Przechowywać w lodzie w lodówce lub pomieszczeniu chłodniczym. Powleczone kuleczki będą funkcjonować prawidłowo przez co najmniej kilka tygodni.</li>
</ol>
5. Przygotowanie mieszaniny do badania ruchliwości i preparatów do obserwacji
UWAGA: Całkowita objętość mieszaniny do badania ruchliwości wynosi 8,4 µL, aby zapewnić prześwit o wielkości około 25 µm między preparatem a szkiełkiem nakrywnym o wymiarach 18 mm x 18 mm, tak aby kulek o wszystkich rozmiarach (do 10 µm średnicy) nie zostały zmiażdżone. Podstawowa mieszanina do badania ruchliwości zawiera około 5 µM G-aktyny (10% znakowanej fluorescencyjnie aktyny) z 5 µM profiliny, 50 nM kompleksu Arp2/3 oraz 25 nM białka capping protein (lub 240 nM żelsoliny).
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną do badania motyliczności. Dokładne ilości aktyny (a tym samym profiliny) zależą od stężenia obliczonego w kroku 3.3, jednak reprezentatywna reakcja przebiega następująco. Mieszać na lodzie, w następującej kolejności: 3,2 µL MB13, 1,5 µL profiliny o stężeniu 30 µM rozpuszczonej w MB13, 1 µL białka capping protein o stężeniu 0,21 µM rozpuszczonego w MB13 lub gelsoliny rozcieńczonej do 2 µM w MB13, 1 µL kompleksu Arp2/3 o stężeniu 0,47 µM rozpuszczonego w MB13, 0,2 µL zawiesiny kulek (wymieszać w vortexie bezpośrednio przed użyciem) oraz 1,5 µL aktyny o stężeniu 30 µM w buforze G. Wymieszać dokładnie, lecz szybko, i uruchomić stoper.</li>
	<li>Nanieść całą mieszaninę reakcyjną do badania motyliczności na szkiełko przedmiotowe. Przykryć szkiełkiem nakrywką o wymiarach 18 mm x 18 mm i uszczelnić ją za pomocą stopionego VALAP, używając małego pędzla. VALAP to mieszanina lanoliny, parafiny i wazeliny (patrz Tabela materiałów) w stosunku wagowym 1:1:1, stopiona i wymieszana.</li>
</ol>
6. Obserwacja mikroskopowa
<ol>
	<li>Natychmiast obserwuj reakcje ruchliwości, używając obiektywu 100x w mikroskopie prostym lub odwróconym (patrz Tabela materiałów), wyposażonym w kontrast fazowy i/lub mikroskopię epifluorescencyjną (kubik GFP, patrz Tabela materiałów). Obserwacje prowadzi się w temperaturze pokojowej (23-25 °C).
	<ol>
		<li>Aby uzyskać średnie prędkości przemieszczenia dla całej populacji kulek, rejestruj w czasie statyczne obrazy w kontraście fazowym lub fluorescencyjnym, skanując cały preparat. Zmierz ręcznie długość komet i nanieś ją na wykres w funkcji czasu. Nachylenie dopasowania liniowego stanowi średnią prędkość wzrostu.</li>
		<li>Aby ocenić prędkość poszczególnych kulek, wykonaj filmy time-lapse w mikroskopii kontrastu fazowego. W zależności od prędkości kulek i wymaganej rozdzielczości, przejmuj klatki co 1-10 s. Użyj narzędzia do śledzenia (tracking tool) w dowolnym programie do przetwarzania obrazów, aby wyznaczyć prędkości i trajektorie kulek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Campellone, K. G., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleator+arms+race%3A+cellular+control+of+actin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A nucleator arms race: cellular control of actin assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 237-251 (2010).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li>
<li>Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics%2C+architecture+and+mechanics+in+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics, architecture and mechanics in cell motility.</a> Physiological Reviews. 94 (1), 235-263 (2014).</li>
<li>Tilney, L. G., Tilney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wily+ways+of+a+parasite%3A+induction+of+actin+assembly+by+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The wily ways of a parasite: induction of actin assembly by Listeria.</a> Trends in Microbiology. 1 (1), 25-31 (1993).</li>
<li>Moore, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cables+and+comet+tails+organize+mitochondrial+networks+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis.</a> Nature. 591 (7851), 659-664 (2021).</li>
<li>Taunton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-dependent+propulsion+of+endosomes+and+lysosomes+by+recruitment+of+N-WASP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin-dependent propulsion of endosomes and lysosomes by recruitment of N-WASP.</a> Journal of Cell Biology. 148 (3), 519-530 (2000).</li>
<li>Velarde, N., Gunsalus, K. C., Piano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+roles+of+actin+in+C.+elegans+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse roles of actin in C. elegans early embryogenesis.</a> BMC Developmental Biology. 7, 142(2007).</li>
<li>Merrifield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+vesicles+move+at+the+tips+of+actin+tails+in+cultured+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytic vesicles move at the tips of actin tails in cultured mast cells.</a> Nature Cell Biology. 1 (1), 72-74 (1999).</li>
<li>Samarin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+VASP+enhances+actin-based+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How VASP enhances actin-based motility.</a> Journal of Cell Biology. 163 (1), 131-142 (2003).</li>
<li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li>
<li>Boujemaa-Paterski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+heterogeneity+regulates+steering+in+actin-based+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Network heterogeneity regulates steering in actin-based motility.</a> Nature Communications. 8 (1), 655(2017).</li>
<li>Akin, O., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capping+protein+increases+the+rate+of+actin-based+motility+by+promoting+filament+nucleation+by+the+Arp2%2F3+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex.</a> Cell. 133 (5), 841-851 (2008).</li>
<li>Palmgren, S., Ojala, P. J., Wear, M. A., Cooper, J. A., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+with+PIP2%2C+ADP-actin+monomers%2C+and+capping+protein+regulate+the+activity+and+localization+of+yeast+twinfilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions with PIP2, ADP-actin monomers, and capping protein regulate the activity and localization of yeast twinfilin.</a> Journal of Cell Biology. 155 (2), 251-260 (2001).</li>
<li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+or+myosin+contraction%3A+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 368 (1629), 20130005(2013).</li>
<li>Marcy, Y., Prost, J., Carlier, M. -F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+generated+during+actin-based+propulsion%3A+a+direct+measurement+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 5992-5997 (2004).</li>
<li>Carlier, M. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%3A+protein+structure+and+filament+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Actin: protein structure and filament dynamics.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (1), 1-4 (1991).</li>
<li>Loisel, T. P., Boujemaa, R., Pantaloni, D., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+actin-based+motility+of+Listeria+and+Shigella+using+pure+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins.</a> Nature. 401 (6753), 613-616 (1999).</li>
<li>Reymann, A. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+branched+actin+filament+networks+by+stochastic+fragmentation+with+ADF%2Fcofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Turnover of branched actin filament networks by stochastic fragmentation with ADF/cofilin.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (14), 2541-2550 (2011).</li>
<li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+variations+with+pH+of+Actin+Depolymerizing+Factor%2FCofilin%27s+multiple+actions+on+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative variations with pH of Actin Depolymerizing Factor/Cofilin's multiple actions on actin filaments.</a> Biochemistry. 58 (1), 40-47 (2019).</li>
<li>Plastino, J., Blanchoin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stability+of+the+actin+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic stability of the actin ecosystem.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), 219832(2019).</li>
<li>Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+actin+filament+dynamics+in+nonmuscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).</li>
<li>Suarez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+regulates+F-actin+network+homeostasis+by+favoring+formin+over+Arp2%2F3+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin regulates F-actin network homeostasis by favoring formin over Arp2/3 complex.</a> Developmental Cell. 32 (1), 43-53 (2015).</li>
<li>Courtemanche, N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+profilin+with+the+barbed+end+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of profilin with the barbed end of actin filaments.</a> Biochemistry. 52 (37), 6456-6466 (2013).</li>
<li>Achard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bprimer%26%2334%3B-based+mechanism+underlies+branched+actin+filament+network+formation+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A &#34;primer&#34;-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility.</a> Current Biology. 20 (5), 423-428 (2010).</li>
<li>Sykes, C., Plastino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments+up+against+a+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actin filaments up against a wall.</a> Nature. 464 (7287), 365-366 (2010).</li>
<li>vander Gucht, J., Paluch, E., Plastino, J., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+release+drives+symmetry+breaking+for+actin-based+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7847-7852 (2005).</li>
<li>McGough, A. M., Staiger, C. J., Min, J. -K., Simonetti, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gelsolin+family+of+actin+regulatory+proteins%3A+modular+structures%2C+versatile+functions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The gelsolin family of actin regulatory proteins: modular structures, versatile functions.</a> FEBS Letters. 552 (2-3), 75-81 (2003).</li>
<li>Abou-Ghali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capping+protein+is+not+necessary+for+polarized+actin+network+growth+and+actin+based+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Capping protein is not necessary for polarized actin network growth and actin based motility.</a> Journal of Biological Chemistry. 295, 15366-15375 (2020).</li>
<li>Yarar, D., D'Alessio, J. A., Jeng, R. L., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+determinants+in+WASP+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Motility determinants in WASP family proteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (11), 4045-4059 (2002).</li>
<li>Padrick, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+regulation+of+WASP%2FWAVE+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Hierarchical regulation of WASP/WAVE proteins.</a> Molecular Cell. 32 (3), 426-438 (2008).</li>
<li>Bussonier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+detection+of+a+long-range+actin+network+emanating+from+a+biomimetic+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex.</a> Biophysical Journal. 107 (4), 854-862 (2014).</li>
<li>Paluch, E., vander Gucht, J., Joanny, J. -F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformations+in+actin+comets+from+rocketing+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Deformations in actin comets from rocketing beads.</a> Biophysical Journal. 91 (8), 3113-3122 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.

Opisany tutaj protokół opisuje, w jaki sposób uzyskać wzrost sieci aktynowej na powierzchni koralików, powstawanie komet i ruchliwość koralików przy użyciu komercyjnie dostępnych białek. Czasami jednak komety nie są obserwowane w sposób powtarzalny lub są niejednorodne między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym. Poniższa dyskusja podkreśla niektóre kluczowe punkty protokołu i sugeruje niektóre parametry, które można dostosować. Jednym z czynników, o których należy pamiętać, jest to, że na powstawanie komet i prędkość koralików ma wpływ temperatura, przy czym temperatury znacznie powyżej 25 °C lub znacznie poniżej 23 °C negatywnie wpływają na powstawanie komet i dostarczają niepowtarzalnych danych. Zdecydowanie zaleca się korzystanie z mikroskopu o kontrolowanej temperaturze lub mikroskopu w pomieszczeniu o kontrolowanym klimacie. Chociaż znakowana fluorescencyjnie aktyna jest często włączana do mieszanki ruchliwości w celu obserwacji komet za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, gdy komety mają długość większą niż średnica koralika, są również widoczne pod mikroskopią kontrastu fazowego jako ciemna plama obok koralika. Wizualizacja z kontrastem fazowym jest bardziej odpowiednia dla obrazowania poklatkowego, ponieważ pewna fototoksyczność jest związana z obrazowaniem fluorescencyjnym, nawet za pomocą wirującego dysku. Ponieważ koraliki osiadają z czasem, mikroskop odwrócony wytwarza mniejszy dryf poziomych ściegów niż mikroskop pionowy i jest bardziej odpowiedni do filmów. Stosowanie stopionego VALAP do uszczelniania szkieł jest ważne, ponieważ substancje takie jak lakier do paznokci zakłócają tworzenie się komet. Duże ilości VALAP można przygotować w zlewce, a następnie zgarnąć w celu ponownego napełnienia mniejszych zlewek, które są bardziej podatne na szybkie topnienie. VALAP jest dobry przez lata w temperaturze pokojowej.
Kolejnym kluczowym aspektem technicznym jest skrupulatne przygotowanie mieszanki buforowej i ruchliwej. Należy zachować ostrożność podczas przygotowywania MB13, szczególnie na etapie regulacji pH. pH MB13 należy szybko dostosować do obojętnego za pomocą NaOH, aby uniknąć hydrolizy ATP, ale nie za szybko, ponieważ EGTA rozpuszcza się, gdy pH zbliża się do neutralnego. EGTA jest kluczowym składnikiem, ponieważ kompleksuje wapń związany z aktyną, dając w mieszance ruchliwości bardziej aktywną formę magnezu16. MB13 przygotowana zbyt szybko lub zbyt wolno powoduje nieoptymalne formowanie się komety lub nawet jej brak. Dodatkową kluczową kwestią jest uważne śledzenie stężenia KCl w mieszance ruchliwości podczas zabawy z warunkami. Na przykład, przy użyciu 1x MB13 w mieszaninie reakcyjnej i rozcieńczaniu profiliny, białka zamykającego i kompleksu Arp2/3 w MB13, końcowe stężenie KCl w reakcji ruchliwości wynosi około 40-50 mM ze względu na rozcieńczenie buforem G. To stężenie daje najlepsze wyniki w teście komet, a każde więcej niż 60 mM KCl zmniejsza aktywność zarodkowania kompleksu Arp2/3.
Jeśli chodzi o białka, krytycznym technicznym aspektem otrzymywania komet aktynowych jest właściwe obchodzenie się z komercyjnymi białkami wiążącymi aktynę, w szczególności precyzyjne pipetowanie ilości mikrolitrów. Liniowość krzywej wzorcowej Bradforda jest dobrym testem pipetowania, a krzywa może być następnie wykorzystana do rutynowych pomiarów stężeń białek. Rzeczywiście, w przypadku stosowania ponownie zawieszonych białek komercyjnych w procedurze komety, ważne jest, aby zawsze weryfikować stężenia białka, ponieważ zmienność partii i błąd użytkownika podczas ponownego zawieszania mogą prowadzić do różnic między rzeczywistymi a oczekiwanymi stężeniami. Czasami niewielkie różnice w stężeniach białek mogą prowadzić do całkowitego braku komet.
Innym ważnym aspektem przedstawionej tutaj metody jest zastosowanie G-aktyny skompleksowanej z profiliną jako paliwa do polimeryzacji. Historycznie rzecz biorąc, systemy in vitro wykorzystywały wstępnie spolimeryzowaną aktynę nitkowatą (F-aktynę) jako źródło aktyny: depolimeryzacja w polimeryzacji podawanej luzem na powierzchni10,17. Miało to tę zaletę, że kontrolowało poziomy G-aktyny, ale dodawało warstwę złożoności wymagającą dodatkowych składników do katalizowania depolimeryzacji. Ponieważ obrót sieci aktyny nie jest konieczny do wytwarzania sił i ruchliwości, które są napędzane przez zarodkowanie i polimeryzację na powierzchni kulki, podczas gdy czynniki depolimeryzacji aktyny, takie jak ADF / kofilina, działają na starzejące się sieci daleko od powierzchni18, większość odtworzenia in vitro ruchliwości opartej na aktynie odbywa się obecnie bez obrotu dla uproszczenia. Istnieją jednak pewne wady stosowania G-aktyny. Po pierwsze, przy stosowaniu komercyjnej aktyny, która została poddana liofilizacji, obecne są oligomery. Opisane tutaj etapy depolimeryzacji są bardzo ważne w uzyskaniu powtarzalnych wyników. W szczególności, chociaż bufor G jest tradycyjnie dostosowywany do pH 8, niższe pH (na przykład pH 7) wydaje się działać lepiej w testach opisanych w tym artykule, prawdopodobnie dlatego, że niskie pH zwiększa depolimeryzację19. Inną wadą stosowania G-aktyny jest to, że po umieszczeniu w warunkach soli sprzyjających polimeryzacji dochodzi do spontanicznego zarodkowania i F-aktyna tworzy się zarówno w masie, jak i na powierzchni kulki. Kompleksowanie G-aktyny z profiliną hamuje spontaniczne zarodkowanie w polimeryzacji masowej i spiczastej końca, skupiając w ten sposób zarówno zarodkowanie, jak i polimeryzację z zadziorowym końcem na powierzchni20. Profilina-G-aktyna jest fizjologicznie istotna, ponieważ duża część aktyny w komórce jest obecna w tej formie21. W tym przypadku stosuje się stosunek profiliny do aktyny 1:1; jednak wyższe współczynniki (na przykład 3:1) dokładniej hamują polimeryzację w masie, chociaż wyższe proporcje hamują również kompleks Arp2/3 i do pewnego stopnia wydłużenie kolczastego końca22,23.
Aktywność cappingu jest również kluczowa dla formowania się komet, ponieważ zapewnia wprowadzenie nowej aktyny na powierzchnię poprzez cykle zarodkowania przez aktywowany powierzchniowo kompleks Arp2/324,25. Bez pokrywy, chmury aktyny nie łamią symetrii, tworząc komety, ponieważ polimeryzacja na powierzchni nie wytwarza wystarczającego napięcia, aby rozbić obłok26. W przeszłości używaliśmy oczyszczonego w domu rekombinowanego mysiego białka capping13, ale testy przeprowadzone na potrzeby tego artykułu wskazują, że dostępne na rynku rekombinowane ludzkie białko capping jest równie skuteczne, jak komercyjnie dostępna gelsolina, chociaż należy użyć 10 razy więcej żelsoliny, a w przypadku niektórych zastosowań może nie być odpowiednia, ponieważ ma działanie odcinające aktynę, a także capping27.
Wreszcie, solidność tej metody polega na zastosowaniu bardzo aktywnego aktywatora kompleksu Arp2/3, streptawidyny-pVCA (SpVCA)28. SpVCA obejmuje domenę wiążącą profilinę-G-aktynę WASP (domena p) oprócz domeny wiązania kompleksu Arp2/3, ponieważ stwierdzono, że jest ona najbardziej efektywna w warunkach profiliny-G-aktyny29. Co ważniejsze, zastosowanie znacznika streptawidyny, pierwotnie wprowadzonego w celu umożliwienia funkcjonalizacji powierzchni poprzez połączenie biotyna-streptawidyna, ma dodatkowy efekt zwiększenia aktywacji kompleksu Arp2/3, prawdopodobnie ze względu na fakt, że streptawidyna jest tetramerem, a zatem grupuje aktywator, o którym wiadomo, że zwiększa aktywność kompleksu Arp2/330. Komercyjnie produkowany SpVCA jest obecnie w fazie rozwoju i wkrótce będzie dostępny w sprzedaży. Należy również zauważyć, że chociaż 40 μL 2 μM SpVCA jest rutynowo używane do pokrycia 3cm2 powierzchni koralików, inne stężenia powłok (wyższe i niższe) również działają, a zabawa z tymi warunkami daje różne prędkości wzrostu i morfologie komety. Rzeczywiście, gdy komety się nie tworzą lub rozmiar komety nie jest jednorodny na szkiełku, należy przetestować różne warunki powlekania, a także różne stężenia KCl i profiliny w mieszance ruchliwości. Stężenia aktyny, kompleksu Arp2/3 i białka ograniczającego w mieszance ruchliwości mogą być również zmieniane w celu optymalizacji powstawania komet, ale w naszych rękach zmiana tych proporcji często daje mylące wyniki.
Podsumowując, opisane tutaj metody powodują składanie aktyny na powierzchniach i ruchliwości koralików, ale można użyć dowolnej powierzchni, którą można sfunkcjonalizować za pomocą SpVCA. W przypadkach, gdy opisana tutaj adsorpcja nie działa, ugrupowanie streptawidyny można wykorzystać do przyłączenia SpVCA do powierzchni zainteresowania po biotynylacji. Powstałe w ten sposób struktury aktynowe, komety lub inne, mogą być używane do testowania różnych biochemicznych i biofizycznych aspektów sieci aktynowych i są szczególnie odpowiednie do fizycznych manipulacji za pomocą mikropipet, pęset optycznych i ablacji laserowych 15,26,31,32. Oprócz zastosowań dla społeczności naukowej, opisane tutaj podejście jest odpowiednie jako narzędzie dydaktyczne dla studentów biofizyki do studiowania pojęć materii aktywnej, takich jak łamanie symetrii i samoorganizacja.

Polimeryzacja aktyny w komórkach jest przestrzennie i czasowo kontrolowana przez ścisłą regulację zarodkowania filamentu aktyny poniżej sygnalizacji komórkowej1. Zarodkowanie zachodzi poprzez tworzenie trimera aktyny, a następnie oba końce powstającego włókna polimeryzują spontanicznie, chociaż jeden koniec jest bardziej dynamiczny (koniec kolczasty) niż drugi (spiczasty koniec)2. Kiedy zarodkowanie i polimeryzacja z zadziorowym końcem są skierowane w stronę powierzchni, wytwarzają wystarczającą siłę (w zakresie od piko-nanoniutona), aby wypchnąć błonę komórkową do ruchu i przesunąć obiekty o rozmiarach mikronów do wnętrza komórki z hydrolizą ATP jako źródłem energii3. Niektóre przykłady obejmują bakterie Listeria monocytogenes, które wykorzystują komety aktynowe do rozprzestrzeniania się z komórki do komórki, oraz mitochondria, w których ruch oparty na komecie aktyny jest ważny dla losowego dziedziczenia podczas mitozy4,5. Komety aktynowe na endosomach i innych pęcherzykach wewnątrzkomórkowych są zaangażowane w oderwanie od błon dawcy6,7,8.
Dzięki przedstawionej tutaj metodzie, aspekty sygnalizacyjne komórkowej polimeryzacji aktyny są pomijane, a polimeryzacja aktyny jest wytwarzana na mikrometrycznych kulkach polistyrenowych poprzez powlekanie ich aktywatorami rozgałęzionego zarodkowania aktyny, w szczególności aktywną domeną ludzkiego białka WASP, VCA (zwanego również WA lub WCA)1. Powlekane kulki są następnie inkubowane w mieszance zawierającej składniki niezbędne do polimeryzacji aktyny, w tym główny nukleator polimeryzacji aktyny w komórkach, kompleks Arp2/3, który jest aktywowany przez VCA na powierzchni kulki w celu utworzenia nowych włókien jako rozgałęzień po bokach włókien potomnych1. Aktyna początkowo polimeryzuje równomiernie wokół koralika, ale potem spontanicznie łamie symetrię, tworząc kometę aktynową, która popycha koralik do przodu, odtwarzając w ten sposób przypominające komórki wystające sieci i komety w kontrolowany sposób. Podobne podejścia z kulkami i innymi powlekanymi powierzchniami były stosowane w przeszłości przez nas i innych do badania biochemii i biofizyki polimeryzacji aktyny9,10,11,12, ale do tych eksperymentów wymagana była rozległa wiedza specjalistyczna w zakresie białek wiążących aktynę. Przedstawiony tutaj protokół opisuje, w jaki sposób solidnie tworzyć komety aktynowe i ruchliwość całkowicie za pomocą komercyjnie dostępnych (lub wkrótce dostępnych) odczynników, dzięki czemu podejście to jest dostępne dla każdego, w tym w środowisku edukacyjnym do nauczania pojęć biofizycznych. Kluczowe cechy obejmują znaczenie delikatnego i niezawodnego pipetowania, zastosowanie monomeru skompleksowanego z profiliną jako źródła aktyny oraz zasadnicze stosowanie wysoce aktywnego aktywatora kompleksu Apr2/3 jako odczynnika do powlekania kulek.

<table><tbody><tr><td>Aktyna, mięsień królika, koniugat Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen (ThermoFisher Scientific)</td><td>A12373 (niedawno wycofany)</td><td>Ten produkt można zastąpić aktyną ATTO-488 firmy Hypermol.</td></tr><tr><td>Aktyna, mięsień królika, ATTO-488</td><td>Hypermol</td><td>8153</td><td></td></tr><tr><td>Aktyna, mięśnie szkieletowe królika</td><td>Cytoszkielet</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Kompleks Arp2/3</td><td>Cytoszkielet</td><td>RP01P</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer, podstawowy</td><td>Eppendorf</td><td>035739</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Odczynnik</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>BSA, wysokiej jakości</td><td>standard Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>BSA 2 mg / ml (Pierce)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23209</td><td></td></tr><tr><td>Białko cappingowe (a1b2, rekombinowane myszy)</td><td>Oczyszczane w domu (odniesienie 13)</td><td></td><td>Ten produkt będzie wkrótce dostępny na rynku w Cytoskeleton.</td></tr><tr><td>Białko zamykające (a1b2, rekombinowany ludzko)</td><td>Hypermol</td><td>8322</td><td></td></tr><tr><td>Cube, GFP: U-MNIBA3 lub U-MWB2</td><td>Olympus</td><td>wycofane</td><td>Można użyć dowolnej kostki GFP, dostosowanej do używanego mikroskopu.</td></tr><tr><td>Suchy blok, mieszanie: ThermoMixer C (chłodzony)</td><td>Eppendorf</td><td>035963</td><td></td></tr><tr><td>** ze SmartBlock, 24 mikroprobówki 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>035969</td><td></td></tr><tr><td>Gelsolin (rekombinowany przez człowieka, His-tagged)</td><td>Cytoszkielet</td><td>HPG6</td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Sigma</td><td>49909</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka 5427R + rotor</td><td>Eppendorf</td><td>934126</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy: BX51</td><td>Olympus</td><td>wycofany z produkcji</td><td>Można użyć dowolnego pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w optykę z kontrastem fazowym.</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony: IX70</td><td>Olympus</td><td>wycofany z produkcji</td><td>Można użyć dowolnego mikroskopu odwróconego epifluorescencji wyposażonego w optykę z kontrastem fazowym.</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sigma</td><td>76244</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Sigma</td><td>16415</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Research Plus</td><td>Pipety Eppendorf</td><td></td><td>Gilson nie sprawdzają się tak dobrze w przypadku dostarczania bardzo małych objętości (0,5 i mikro; L, na przykład).</td></tr><tr><td>**10 &mikro; L</td><td></td><td>933954</td><td></td></tr><tr><td>**2,5 &mikro; L</td><td></td><td>933953</td><td>Te dwa rozmiary są niezbędne, ale zaleca się stosowanie wysokiej jakości pipet (na przykład pełnego zestawu Research Plus).</td></tr><tr><td>Kulki karboksylowe z polistyrenu</td><td>Polysciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>**ok. 1 &mikro; M średnica</td><td></td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>**ok. 4,5 &mikro; m średnica</td><td></td><td>17140-5</td><td></td></tr><tr><td>Profilin 1 (rekombinowana przez człowieka, nieoznakowana)</td><td>Cytoszkielet</td><td>PR02</td><td></td></tr><tr><td>SpVCA (ludzka domena WASP pVCA, N-ter His-tag, C-ter Streptawidin tag)</td><td>Oczyszczany w domu (odniesienie 14)</td><td></td><td>Ten produkt będzie wkrótce dostępny na rynku w Cytoskeleton.</td></tr><tr><td>VCA (ludzka domena WASP VCA, oznaczona GST)</td><td>Cytoszkielet</td><td>VCG03</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Wiele ruchów komórek i zmian kształtu oraz niektóre typy wewnątrzkomórkowej ruchliwości bakterii i organelli są napędzane przez biopolimer aktyny, który tworzy dynamiczną sieć na powierzchni komórki, organelli lub bakterii. Biochemiczne i mechaniczne podstawy wytwarzania siły podczas tego procesu można badać poprzez odtwarzanie ruchu opartego na aktynie w sposób bezkomórkowy na obojętnych powierzchniach, takich jak kulki, które są funkcjonalizowane i inkubowane z kontrolowanym zestawem składników. W odpowiednich warunkach elastyczna sieć aktynowa gromadzi się na powierzchni koralika i pęka pod wpływem naprężeń generowanych przez wzrost sieci, tworząc "kometę aktynową", która popycha koralik do przodu. Jednak takie eksperymenty wymagają oczyszczenia z wielu różnych białek wiążących aktynę, co często stawia je poza zasięgiem niespecjalistów. W tym artykule szczegółowo opisano protokół powtarzalnego otrzymywania komet aktynowych i ruchliwości kulek przy użyciu dostępnych na rynku odczynników. Powłokę ściegu, rozmiar ściegu i mieszaninę ruchliwości można zmienić, aby zaobserwować wpływ na prędkość ściegu, trajektorie i inne parametry. Test ten może być wykorzystany do badania aktywności biochemicznej różnych białek wiążących aktynę oraz do wykonywania ilościowych pomiarów fizycznych, które rzucają światło na właściwości substancji czynnej sieci aktynowych. Będzie to użyteczne narzędzie dla społeczności, umożliwiające badanie ruchliwości opartej na aktynie in vitro bez specjalistycznej wiedzy na temat oczyszczania białek wiążących aktynę.

Jednym z kluczowych aspektów powtarzalnego tworzenia komet aktynowych na kuleczkach jest delikatne i precyzyjne pipetowanie wrażliwych białek wiążących aktynę. Przygotowanie krzywej wzorcowej metodą Bradforda jest dobrym sposobem oceny umiejętności pipetowania. Rysunek 1A,B przedstawia probówki do krzywej wzorcowej oraz przykład wyglądu dwóch rozcieńczeń seryjnych BSA po zmieszaniu z odczynnikiem Bradforda. Należy zwrócić uwagę na stopniowanie odcienia niebieskiego (wyższe stężenie białka daje bardziej niebieski roztwór). Po odczycie spektrofotometrem i naniesieniu na wykres, roztwory te tworzą krzywą wzorcową przedstawioną na Rysunku 1C. Aby poćwiczyć precyzyjne pipetowanie, badanie należy powtarzać aż do uzyskania liniowego współczynnika korelacji 0,999, jak pokazano na wykresie.
Po dokładnej ocenie stężeń komercyjnych białek resuspendTime za pomocą metody Bradforda, przygotowuje się powlekane kuleczki oraz mieszaninę do badań motylości, a następnie łączy się je ze sobą. Rysunek 2A przedstawia reprezentatywne obrazy różnych etapów powstawania komet: chmury aktynowe formują się w ciągu kilku minut od zmieszania kuleczek powlekanych SpVCA z medium do badań motylości; polaryzacja chmur następuje po około 5 min, a produkcja komet po 15–20 min. Komety aktynowe, widoczne zarówno w mikroskopii epifluorescencyjnej, jak i fazokontrastowej (Rysunek 2A), wydłużają się przez wiele godzin, jednak nie utrzymują stałej prędkości, dlatego motylość kuleczek jest zazwyczaj oceniana w ciągu 1 h. Z kolei w przypadku kuleczek powlekanych VCA uzyskanie jasnych chmur aktynowych zajmuje 30 min (Rysunek 2B) i nie powstają komety, choć symetria zaczyna zostać zaburzona po 1–2 h (strzałka na Rysunku 2B), a chmury wykazują polaryzację po inkubacji przez noc).
Rysunek 3 przedstawia przykład oceny prędkości kulek w obecności białka capping protein. Ponieważ wszystkie kulki przełamują symetrię w w przybliżeniu tym samym czasie, wykonywane są nagrania typu „pseudo-time-lapse”, w których skanowane jest preparat i w czasie wykonywane są zdjęcia całej populacji komet (Rysunek 3A). Komety nie depolimeryzują; w związku z tym wzrost długości komet mierzony w czasie może być wykorzystany do obliczenia prędkości przemieszczenia (Rysunek 3B). Do tworzenia komet zamiast białka capping protein można użyć gelsoliny, pod warunkiem dodania 10-krotnie większej ilości gelsoliny, aby zrekompensować jej mniejszą aktywność cappingową. Komety utworzone w obecności gelsoliny są jakościowo takie same i poruszają się z podobnymi prędkościami jak kulki z białkiem capping protein (Rysunek 3C). Aktywność cappingowa jest kluczowa dla koncentracji polimeryzacji na powierzchni kulki; gdy do mieszaniny ruchowej nie dodano ani białka capping protein, ani gelsoliny, chmury aktyny nigdy nie polaryzują się, aby utworzyć komety, choć wokół kulek powstają jasne chmury aktyny (Rysunek 3D). Komety na kulkach mogą być wykorzystane do pomiaru generowania siły opartej na aktynie w różnych kontekstach biochemicznych poprzez zmianę składu mieszaniny ruchowej i obserwację efektu wpływającego na ruch przy użyciu różnych technik mikromanipulacyjnych, na przykład15.
<img alt="Metoda Bradforda: analiza stężenia białek z rozcieńczeniami BSA, odczynnikami i wykresem krzywej wzorcowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Krzywa wzorcowa w metodzie Bradforda. (A) Schemat przygotowania probówek do sporządzenia krzywej wzorcowej metodą Bradforda. Probówki z próbkami nie zostały przedstawione. (B) Zdjęcie dwóch nakładających się serii rozcieńczeń BSA po zmieszaniu z odczynnikiem Bradforda. (C) Absorbancja roztworów przedstawionych w punkcie (B) przy 600 nm została zmierzona spektrofotometrem i naniesiona na wykres w funkcji stężeń białek w roztworach BSA. Dopasowanie liniowe służy do obliczenia stężenia w próbce. Współczynnik korelacji R dla dopasowania liniowego wynosi 0,999. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Agregacja kulek SpVCA i VCA w czasie; obraz mikroskopowy; punkty czasowe od 1 min do 17 godzin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Tworzenie się komet na kuleczkach powlekanych SpVCA w porównaniu do kuleczek powlekanych VCA. (A) Reprezentatywne kuleczki powlekane SpVCA (różne kuleczki na każdym zdjęciu) przedstawione w czasie. Podano czas od momentu zmieszania. Chmury aktyny tworzą się natychmiast, a polaryzacja chmur prowadzi do powstania komet, które wydłużają się przez wiele godzin. (B) Reprezentatywne kuleczki powlekane VCA (różne kuleczki na każdym zdjęciu) przedstawione w czasie. Aby zaobserwować początki polaryzacji chmur aktyny (strzałka), konieczny jest czas powyżej 1 h, a nawet długie inkubacje nie prowadzą do powstania komet. Wszystkie obrazy przedstawiają kuleczki o średnicy 4,5 µm; obrazowanie epifluorescencyjne fluorescencyjnej aktyny połączone z wizualizacją w kontraście fazowym dla punktów czasowych 15 i 20 min w (A), paski skali = 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Time-lapse polimeryzacji aktyny, efekty CP/gelsoliny, wykres długości komety w funkcji czasu, badanie białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza komet i prędkości kulek. (A) i (C) W obecności białka zamykającego (CP) lub gelsoliny chmury aktyny polaryzują się, tworząc komety w ciągu pierwszych 20 min reakcji, a komety wydłużają się w czasie. Czas od zmieszania podano dla każdego obrazu; każdy obraz przedstawia inną kulkę. Występuje pewna zmienność między kulkami a preparatem, ale średnio kulki poruszają się z prędkościami rzędu mikrona/submikrona na minutę (0,2-1 µm/min) w standardowych warunkach opisanych w niniejszej pracy. (B) Reprezentatywny wykres przedstawiający ocenę długości komet (cała populacja kulek) w czasie. Nachylenie korelacji liniowej odpowiada średniej prędkości przemieszczania się, w tym przypadku 0,24 µm/min. (D) W przypadku braku aktywności zamykającej (brak białka zamykającego lub gelsoliny) wokół kulek tworzą się chmury aktyny, ale nie powstają komety. Wszystkie obrazy przedstawiają kulki o średnicy 4,5 µm, obrazowanie epifluorescencyjne fluorescencyjnej aktyny, paski skali = 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komety aktynowe na powierzchni koralików przy użyciu dostępnych na rynku składników białkowych. Takie systemy naśladują wystające struktury znajdujące się w komórkach i mogą być wykorzystywane do badania fizjologicznych mechanizmów wytwarzania siły w uproszczony sposób.

Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

Dzięki prostej mieszance składników i funkcjonalizowanym powierzchniom, protokół ten odtwarza istotną funkcję komórek, ruch napędzany przez montaż aktyny. Biochemiczne i biofizyczne mechanizmy wytwarzania siły można ocenić poprzez różnicowanie mieszanki składników i właściwości funkcjonalizowanej powierzchni. Główną zaletą tego protokołu jest to, że wszystkie składniki można kupić, więc wiedza z zakresu oczyszczania białek nie jest konieczna.Dzięki temu osoby niebędące specjalistami mogą wykorzystywać ten system jako narzędzie w swoich badaniach. Protokół ten zapewnia moduł dydaktyczny na poziomie licencjackim, dając studentom praktyczne doświadczenie w manipulowaniu białkami i obserwowaniu samodzielnie przygotowanego systemu biologicznego pod mikroskopem. Mogą kontrolować i zmieniać parametry systemu.Analiza fizyczna, taka jak równanie Langmuira, może być uruchamiana na trajektoriach. Zacznij od ponownego wyparcia liofilizowanych białek. Zbierz ciało stałe na dnie probówki, odwirowując pulsacyjnie proszki białkowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie dodaj wodę zgodnie z instrukcją producenta i inkubuj na lodzie przez co najmniej 15 minut. Delikatnie wymieszać, pipetując. Trzymaj go na lodzie przez kolejne 15 minut i ponownie wymieszaj.Zebrać roztwór na dnie probówki przez odwirowanie. Remix i podwielokrotność na lodzie. Aby zdepolimeryzować oligomery aktyny powstałe podczas liofilizacji i zamrażania, należy rozcieńczyć podwielokrotność ponownie zawieszonej aktyny ośmiokrotnie w buforze G wzbogaconym dodatkowym ATP, DTT i 10% znakowaną aktyną.Pozwól mu zdepolimeryzować na lodzie z okazjonalnym mieszaniem przez co najmniej kilka dni do tygodnia przed pomiarem stężenia białka. Aby zmierzyć stężenie białek w ponownie zawieszonych białkach, należy najpierw przygotować serię rozcieńczeń BSA. Zacznij od umieszczenia dwóch mililitrowych i 1,5-mililitrowych probówek w stojaku, jak opisano w rękopisie.Napełnij 15-mililitrową stożkową rurkę do góry odczynnikiem Bradford i umieść ją na lodzie. Weź 200 mikrolitrów odczynnika Bradford i wyrzuć go z powrotem do stożkowej rurki, aby zwilżyć końcówkę pipety. Ponieważ roztwór jest lepki, pipetuj powoli, aby roztwór mógł dostać się i całkowicie opuścić końcówkę, nie tworząc pęcherzyków.Następnie za pomocą wstępnie zwilżonej końcówki odpipetuj 200 mikrolitrów odczynnika Bradford do każdej z 1,5 mililitrowej probówki w stojaku. I włóż pozostałą zawartość 15-mililitrowej stożkowej rurki do butelki. Odmierz wodę do dwóch mililitrowych probówek w rzędzie pierwszym, trzecim i piątym.Przygotować serię rozcieńczeń BSA, rozcieńczając skalibrowany roztwór podstawowy BSA zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia, przenosząc 900 mikrolitrów każdego roztworu do następnej probówki. Dodaj 800 mikrolitrów wody do probówki z odczynnikiem Bradford do ślepego próby i uruchom minutnik.Wymieszaj 800 mikrolitrów każdego wzorca BSA z 200 mikrolitrami odczynnika Bradford w przygotowanych probówkach. W ciągu pięciu minut po wymieszaniu z odczynnikiem Bradford lub każdym wzorcem w jednorazowej kuwecie, odczytaj absorbancję przy 600 nanometrach. Proszę przedstawić na wykresie uzyskane wartości absorbancji w funkcji znanego stężenia BSA i uzyskać korelację liniową z wartością R równą 0,99.W probówkach zawierających 2000 mikrolitrów wody delikatnie rozcieńczyć rozpuszczone białka, jak opisano w manuskrypcie. Natychmiast dodaj 800 mikrolitrów każdego roztworu do przygotowanego odczynnika Bradforda i wymieszaj. Odczytać absorbancje w spektrofotometrze w ciągu pięciu minut.Oblicz stężenia białek przy użyciu wcześniej skonstruowanej krzywej standardowej. W celu powlekania kulkami należy wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury czterech stopni Celsjusza. Odpipetować 50 mikrolitrów buforu Xb do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.Dokładnie wymieszaj zawiesinę perełkową o średnicy 4,5 mikrometra przez wirowanie i dodaj dziewięć mikrolitrów zawiesiny do probówki zawierającej bufor Xb. Odwirować próbki w temperaturze 20 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby pokryć kulki, ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania kulek i ponownie zawiesić granulki w 40 mikrolitrach dwumikromolowego SpVCA w buforze Xb, delikatnie pipetując.Teraz mieszaj kulki w suchym bloku z prędkością 1000 obr./min przez 20 minut w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Następnie umyj powlekane kulki przez odwirowanie. Usunięcie supernatantu i ponowne zawieszenie kulek w 50 mikrolitrach zimnego Xb z 1% BSA.Po umyciu kulek ponownie zawieś powlekany granulat kulek w 120 mikrolitrach zimnego Xb, 1% BSA. Przechowywać na lodzie w lodówce lub chłodni. Przygotować mieszaninę reakcji ruchliwości zgodnie z opisem w manuskrypcie.Szybko wymieszaj reakcję i uruchom timer. Znajdź całą mieszaninę reakcji ruchliwości na szkiełku. Przykryj go szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 milimetrów na 18 milimetrów i uszczelnij szkiełko nakrywkowe stopionym VALAP za pomocą małego pędzla.Aby uzyskać średnie prędkości przemieszczenia dla całej populacji koralików, należy zarejestrować kontrast fazowy lub fluorescencyjne obrazy nieruchome w czasie, skanując cały szkiełko. Zmierz długość komety ręcznie i zapisz wartości. Wykreśl długość komety w funkcji czasu.Nachylenie pasowania liniowego to średnia prędkość wzrostu. Wybierz filmy poklatkowe w mikroskopii kontrastu fazowego, aby ocenić prędkości poszczególnych ściegów. W zależności od prędkości koralików i wymaganej rozdzielczości rób klatki co 1 do 10 sekund.Użyj narzędzia do śledzenia dowolnego programu do przetwarzania obrazu, aby uzyskać prędkości i trajektorie ściegów. Zmieszanie wzorców BSA z odczynnikiem Bradford daje roztwór o stopniowanych odcieniach niebieskiego. Wartości absorbancji są wykreślane w stosunku do standardowych stężeń białka, a korelacja liniowa służy do określania stężeń białek zawieszonych.Mieszanie kulek kodowanych przez SPVCA i pożywki o ruchliwości zawierającej białko zamykające prowadzi do tworzenia się chmur aktynowych w ciągu kilku minut. Polaryzacja chmur następuje po około pięciu minutach, a produkcja komety po 15 do 20 minutach. Komety aktynowe wydłużają się przez wiele godzin, ale nie utrzymuje stałej prędkości.Tak więc ruchliwość koralików jest oceniana w ciągu jednej godziny. Mieszanie ruchliwości z białkiem cappingowym lub gelsoliną daje komety w podobny sposób. Chmury aktynowe spolaryzowały się, tworząc komety w ciągu pierwszych 20 minut reakcji, a komety wydłużają się z czasem.Ocena długości komet mierzonych w czasie służy do obliczania prędkości przemieszczenia. W przypadku braku aktywności czapecznej, wokół koralików tworzą się chmury aktynowe, ale nie dochodzi do tworzenia się komet. Ostrożne obchodzenie się z białkami i pipetowanie ich jest niezbędne dla powodzenia tej procedury, nie tylko podczas przygotowywania mieszanki ruchliwości, ale także podczas pomiaru stężeń białek za pomocą testu Bradforda.Powstawanie komet i trajektorie koralików uzyskane za pomocą tego protokołu pozwalają na zrozumienie fizycznego mechanizmu ruchu za pomocą miękkiej materii i analizy fizyki statystycznej oraz eksperymentów biofizycznych, w tym pomiarów sił i mikromanipulacji.

reconstitution-actin-based-motility-with-commercially-available

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie przeprowadzamy test ruchliwości in vitro, aby przeanalizować interakcje aktyna-miozyna. Ślizgający się ruch włókien aktynowych na unieruchomionych cząsteczkach miozyny jest wizualizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test ślizgowych włókien aktynowych: test ruchliwości in vitro w celu zbadania translokacji włókien aktynowych na unieruchomione miozyny

Test odwróconej ruchliwości: technika in vitro do wizualizacji ruchu miozyny na unieruchomionych włóknach aktyny

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Przedstawiono tutaj procedurę ekspresji i oczyszczania miozyny 5a, po której następuje dyskusja na temat jej charakterystyki, przy użyciu testów opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro zarówno zespołowych, jak i pojedynczych, oraz jak te metody mogą być modyfikowane do charakterystyki niemięśniowej miozyny 2b.

Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten artykuł przedstawia protokoły do inżynierii i charakteryzowania przestrajalnych trójwymiarowych sieci kompozytowych współsplątanych filamentów aktynowych i mikrotubul. Kompozyty przechodzą aktywną restrukturyzację i ruch balistyczny, napędzany silnikami miozyny II i kinezyny, a także są dostrojone przez względne stężenia aktyny, mikrotubul, białek motorycznych i pasywnych środków sieciujących.

Rekonstrukcja i charakterystyka kompozytów aktynowo-mikrotubulowych o regulowanej dynamice i mechanice napędzanej silnikiem

W tej pracy zastosowano podejście do rekonstytucji in vitro do badania poroselastyczności żeli z aktomiozyną w kontrolowanych warunkach. Określa się ilościowo dynamikę żelu aktomiozyny i wbudowanego rozpuszczalnika, za pomocą której wykazano porosprężystość sieci. Omawiamy również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.

Mechanika (poro-)elastycznych kurczliwych sieci aktomyozyny jako modelowy układ cytoszkieletu komórkowego

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

Poznaj rekonstrukcję ruchliwości opartej na aktynie przy użyciu dostępnych komercyjnie białek. Ta metoda pozwala badać mechanizmy biologicznego ruchu komórkowego bez potrzeby specjalistycznej wiedzy z zakresu oczyszczania protein.

Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Przeglądaj więcej filmów