Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Dzięki prostej mieszance składników i funkcjonalizowanym powierzchniom, protokół ten odtwarza istotną funkcję komórek, ruch napędzany przez montaż aktyny. Biochemiczne i biofizyczne mechanizmy wytwarzania siły można ocenić poprzez różnicowanie mieszanki składników i właściwości funkcjonalizowanej powierzchni. Główną zaletą tego protokołu jest to, że wszystkie składniki można kupić, więc wiedza z zakresu oczyszczania białek nie jest konieczna.

Dzięki temu osoby niebędące specjalistami mogą wykorzystywać ten system jako narzędzie w swoich badaniach. Protokół ten zapewnia moduł dydaktyczny na poziomie licencjackim, dając studentom praktyczne doświadczenie w manipulowaniu białkami i obserwowaniu samodzielnie przygotowanego systemu biologicznego pod mikroskopem. Mogą kontrolować i zmieniać parametry systemu.

Analiza fizyczna, taka jak równanie Langmuira, może być uruchamiana na trajektoriach. Zacznij od ponownego wyparcia liofilizowanych białek. Zbierz ciało stałe na dnie probówki, odwirowując pulsacyjnie proszki białkowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie dodaj wodę zgodnie z instrukcją producenta i inkubuj na lodzie przez co najmniej 15 minut. Delikatnie wymieszać, pipetując. Trzymaj go na lodzie przez kolejne 15 minut i ponownie wymieszaj.

Zebrać roztwór na dnie probówki przez odwirowanie. Remix i podwielokrotność na lodzie. Aby zdepolimeryzować oligomery aktyny powstałe podczas liofilizacji i zamrażania, należy rozcieńczyć podwielokrotność ponownie zawieszonej aktyny ośmiokrotnie w buforze G wzbogaconym dodatkowym ATP, DTT i 10% znakowaną aktyną.

Pozwól mu zdepolimeryzować na lodzie z okazjonalnym mieszaniem przez co najmniej kilka dni do tygodnia przed pomiarem stężenia białka. Aby zmierzyć stężenie białek w ponownie zawieszonych białkach, należy najpierw przygotować serię rozcieńczeń BSA. Zacznij od umieszczenia dwóch mililitrowych i 1,5-mililitrowych probówek w stojaku, jak opisano w rękopisie.

Napełnij 15-mililitrową stożkową rurkę do góry odczynnikiem Bradford i umieść ją na lodzie. Weź 200 mikrolitrów odczynnika Bradford i wyrzuć go z powrotem do stożkowej rurki, aby zwilżyć końcówkę pipety. Ponieważ roztwór jest lepki, pipetuj powoli, aby roztwór mógł dostać się i całkowicie opuścić końcówkę, nie tworząc pęcherzyków.

Następnie za pomocą wstępnie zwilżonej końcówki odpipetuj 200 mikrolitrów odczynnika Bradford do każdej z 1,5 mililitrowej probówki w stojaku. I włóż pozostałą zawartość 15-mililitrowej stożkowej rurki do butelki. Odmierz wodę do dwóch mililitrowych probówek w rzędzie pierwszym, trzecim i piątym.

Przygotować serię rozcieńczeń BSA, rozcieńczając skalibrowany roztwór podstawowy BSA zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia, przenosząc 900 mikrolitrów każdego roztworu do następnej probówki. Dodaj 800 mikrolitrów wody do probówki z odczynnikiem Bradford do ślepego próby i uruchom minutnik.

Wymieszaj 800 mikrolitrów każdego wzorca BSA z 200 mikrolitrami odczynnika Bradford w przygotowanych probówkach. W ciągu pięciu minut po wymieszaniu z odczynnikiem Bradford lub każdym wzorcem w jednorazowej kuwecie, odczytaj absorbancję przy 600 nanometrach. Proszę przedstawić na wykresie uzyskane wartości absorbancji w funkcji znanego stężenia BSA i uzyskać korelację liniową z wartością R równą 0,99.

W probówkach zawierających 2000 mikrolitrów wody delikatnie rozcieńczyć rozpuszczone białka, jak opisano w manuskrypcie. Natychmiast dodaj 800 mikrolitrów każdego roztworu do przygotowanego odczynnika Bradforda i wymieszaj. Odczytać absorbancje w spektrofotometrze w ciągu pięciu minut.

Oblicz stężenia białek przy użyciu wcześniej skonstruowanej krzywej standardowej. W celu powlekania kulkami należy wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury czterech stopni Celsjusza. Odpipetować 50 mikrolitrów buforu Xb do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.

Dokładnie wymieszaj zawiesinę perełkową o średnicy 4,5 mikrometra przez wirowanie i dodaj dziewięć mikrolitrów zawiesiny do probówki zawierającej bufor Xb. Odwirować próbki w temperaturze 20 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby pokryć kulki, ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania kulek i ponownie zawiesić granulki w 40 mikrolitrach dwumikromolowego SpVCA w buforze Xb, delikatnie pipetując.

Teraz mieszaj kulki w suchym bloku z prędkością 1000 obr./min przez 20 minut w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Następnie umyj powlekane kulki przez odwirowanie. Usunięcie supernatantu i ponowne zawieszenie kulek w 50 mikrolitrach zimnego Xb z 1% BSA.

Po umyciu kulek ponownie zawieś powlekany granulat kulek w 120 mikrolitrach zimnego Xb, 1% BSA. Przechowywać na lodzie w lodówce lub chłodni. Przygotować mieszaninę reakcji ruchliwości zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Szybko wymieszaj reakcję i uruchom timer. Znajdź całą mieszaninę reakcji ruchliwości na szkiełku. Przykryj go szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 milimetrów na 18 milimetrów i uszczelnij szkiełko nakrywkowe stopionym VALAP za pomocą małego pędzla.

Aby uzyskać średnie prędkości przemieszczenia dla całej populacji koralików, należy zarejestrować kontrast fazowy lub fluorescencyjne obrazy nieruchome w czasie, skanując cały szkiełko. Zmierz długość komety ręcznie i zapisz wartości. Wykreśl długość komety w funkcji czasu.

Nachylenie pasowania liniowego to średnia prędkość wzrostu. Wybierz filmy poklatkowe w mikroskopii kontrastu fazowego, aby ocenić prędkości poszczególnych ściegów. W zależności od prędkości koralików i wymaganej rozdzielczości rób klatki co 1 do 10 sekund.

Użyj narzędzia do śledzenia dowolnego programu do przetwarzania obrazu, aby uzyskać prędkości i trajektorie ściegów. Zmieszanie wzorców BSA z odczynnikiem Bradford daje roztwór o stopniowanych odcieniach niebieskiego. Wartości absorbancji są wykreślane w stosunku do standardowych stężeń białka, a korelacja liniowa służy do określania stężeń białek zawieszonych.

Mieszanie kulek kodowanych przez SPVCA i pożywki o ruchliwości zawierającej białko zamykające prowadzi do tworzenia się chmur aktynowych w ciągu kilku minut. Polaryzacja chmur następuje po około pięciu minutach, a produkcja komety po 15 do 20 minutach. Komety aktynowe wydłużają się przez wiele godzin, ale nie utrzymuje stałej prędkości.

Tak więc ruchliwość koralików jest oceniana w ciągu jednej godziny. Mieszanie ruchliwości z białkiem cappingowym lub gelsoliną daje komety w podobny sposób. Chmury aktynowe spolaryzowały się, tworząc komety w ciągu pierwszych 20 minut reakcji, a komety wydłużają się z czasem.

Ocena długości komet mierzonych w czasie służy do obliczania prędkości przemieszczenia. W przypadku braku aktywności czapecznej, wokół koralików tworzą się chmury aktynowe, ale nie dochodzi do tworzenia się komet. Ostrożne obchodzenie się z białkami i pipetowanie ich jest niezbędne dla powodzenia tej procedury, nie tylko podczas przygotowywania mieszanki ruchliwości, ale także podczas pomiaru stężeń białek za pomocą testu Bradforda.

Powstawanie komet i trajektorie koralików uzyskane za pomocą tego protokołu pozwalają na zrozumienie fizycznego mechanizmu ruchu za pomocą miękkiej materii i analizy fizyki statystycznej oraz eksperymentów biofizycznych, w tym pomiarów sił i mikromanipulacji.