Name: Oczyszczanie polisomów z guzków symbiotycznych soi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania polisomów z guzków symbiotycznych soi przy użyciu wirówki. Technika ta umożliwia badanie ekspresji genów na poziomie transkryptomu i translatomu w złożonych tkankach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez CSIC I+D 2020 grant nr 282, FVF 2017 grant nr 210 oraz PEDECIBA (María Martha Sainz).

1. Wzrost roślin i inokulacja ryzobii
<ol>
	<li>Aby wytworzyć wymagane guzki, wysiewaj wybrane nasiona soi na wybranym podłożu w komorze wzrostowej w kontrolowanych warunkach. 
	UWAGA: W tym protokole nasiona wysiano w plastikowej butelce o pojemności 0,5 litra wypełnionej mieszanką piasku i wermikulitu (1:1). W komorze wzrostowej ustawiono odpowiednio temperaturę cyklu dzień/noc 28 °C / 20 °C oraz fotoperiod światła / ciemności wynoszący odpowiednio 16 godzin / 8 godzin. Natężenie promieniowania czynnego fotosyntetycznie wynosiło 620 μmol·m−2·s−1.</li>
	<li>Przygotuj wcześniej płynną pożywkę z ekstraktem drożdżowym i mannitolem (YEM) (patrz tabela materiałów). Podłoże należy sterylizować w autoklawie.</li>
	<li>W tym samym dniu, w którym wysiewano nasiona, zaszczepić jedną kolbę zawierającą 100 ml YEM szczepem Bradyrhizobium elkanii U1302. Inkubować kolbę w temperaturze 28 °C na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min.
	<ol>
		<li>Pozwól ryzobii rosnąć przez 2 dni i zaszczep sadzonki 2 ml kultury.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Usuwanie deficytu wody (opcjonalnie)
UWAGA: Ten protokół opisuje sposób leczenia niedoboru wody w roślinach soi. Ta część może być zmieniona lub całkowicie pominięta w zależności od danego pytania eksperymentalnego.
<ol>
	<li>Sadzonki soi należy uprawiać przez 19 dni (faza rozwojowa V2-3) bez ograniczeń wody. Utrzymuj podłoże na poziomie wydajności polowej za pomocą B&D-medium17 uzupełnionego 0,5 mM KNO3.</li>
	<li>W 20 dniu wycofaj podlewanie. 
	UWAGA: W tym przypadku zawartość wody była mierzona codziennie za pomocą grawimetrii (zawartość grawimetryczna wody) w okresach wzrostu i deficytu wody.</li>
	<li>Za pomocą porometru, zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów), mierzyć przewodność szparkową w trzech egzemplarzach na powierzchni liścia odbądźcowego (patrz Tabela Materiałów), od 20 dnia do końca okresu niedoboru wody. 
	UWAGA: Koniec okresu deficytu wody określano indywidualnie dla każdej rośliny, gdy wartość przewodności szparkowej wynosiła około 50% wartości uzyskanej w 20 dniu od siewu.</li>
</ol>
3. Zbiór guzków
<ol>
	<li>Zbierz ciekły azot do czystego pojemnika i oznacz probówki o pojemności 15 ml (po jednej na każdą roślinę). 
	UWAGA: Z ciekłym azotem należy obchodzić się w rękawicach kriogenicznych, osłonach twarzy i okularach ochronnych.</li>
	<li>Odzyskaj każdą roślinę z osobna. Wytnij i wyrzuć część nadziemną. Dokładnie umyj korzeń wodą, aby usunąć resztki podłoża.</li>
	<li>Odłącz każdy guzek od korzenia i zbierz je do schłodzonej probówki o pojemności 15 ml. Probówki należy zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Przygotowanie ekstraktów cytozolowych
UWAGA: Ostatecznym celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej jakości całkowitego RNA (TOTAL) i RNA związanego z polisomami (PAR). Dlatego należy pracować w warunkach, które zapobiegają degradacji RNA, zawsze utrzymując próbki w temperaturze 4 °C i używając sprzętu i roztworów laboratoryjnych wolnych od RNaz. O ile nie określono inaczej, wszystkie roztwory przygotowuje się ze sterylnej ultraczystej wody.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów zapasów buforowych
	<ol>
		<li>Przygotować nadające się do sterylizacji w autoklawie roztwory podstawowe wymienione w Tabeli 1, sterylizować w autoklawie przez 15 minut i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować nadające się do sterylizacji filtracyjnej roztwory podstawowe wymienione w tabeli 1, wysterylizować je metodą filtracyjną i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor do ekstrakcji polisomów (PEB, patrz Tabela 1) i przechowywać go na lodzie. 
	UWAGA: Podane objętości dotyczą sześciu próbek.</li>
	<li>Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C i umieścić 2 ml probówek mikrowirówek na lodzie.</li>
	<li>Odważyć około 0,2 g nienaruszonych guzków w naczyniu wagowym i przenieść je do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml. 
	UWAGA: Wykonaj ten krok szybko, aby uniknąć rozmrożenia próbek. Alternatywnie można użyć szacowanej objętości guzka 0,4-0,5 ml zamiast 0,2 g.</li>
	<li>Dodać 1,2 ml PEB, pozostawić próbkę do rozmrożenia przez 2 minuty i homogenizować za pomocą młynka do tkanek, aż do całkowitego rozerwania i homogenizacji guzków. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby zmielić guzki po rozmrożeniu, ponieważ będą one na tyle miękkie, że można je łatwo rozbić młynkami do tkanek (patrz Tabela materiałów) w probówkach do mikrowirówek. Zamrożone guzki są trudne do zmielenia. Zaleca się również umieszczenie probówek w chłodziarce stołowej (0 °C) w celu prawidłowej homogenizacji przy jednoczesnym utrzymaniu próbek w niskiej temperaturze.</li>
	<li>Próbki należy inkubować na lodzie, delikatnie mieszając przez 10 minut lub do momentu, gdy wszystkie próbki zostaną przetworzone.</li>
	<li>Wirować przy 16 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia zanieczyszczeń. Odzyskać supernatant i powtórzyć etap wirowania.</li>
	<li>Ostrożnie odzyskać oczyszczony ekstrakt cytozolowy i przenieść 200 μl podwielokrotności do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu CAŁKOWITEJ izolacji (próbki CAŁKOWITE; patrz sekcja 7).</li>
</ol>
5. Przygotowanie poduszek z sacharozy
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje dwuwarstwową poduszkę sacharozową (12% i 33,5%) w probówkach ultrawirówek o pojemności 13,2 ml (zobacz Tabelę Materiałów). Wszystkie roztwory przygotowywane są ze sterylnej ultraczystej wody.
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe sacharozy i soli.
	<ol>
		<li>Przygotować 100 ml 2 M roztworu sacharozy (68,5%, tabela 1).</li>
		<li>Przygotuj 10x roztwór soli (Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować dwie warstwy poduszki z sacharozą, jak opisano w tabeli 2. Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się ze składem roztworów podstawowych antybiotyków (CHX i CHL). 
	UWAGA: Podane objętości dotyczą sześciu poduszek.</li>
	<li>Wlać 4,5 ml 33,5% warstwy sacharozy do probówek wirówkowych. Następnie ostrożnie i powoli dodaj 4,5 ml warstwy 12% za pomocą mikropipety P1000. Umieść probówki na lodzie do momentu dodania oczyszczonego ekstraktu cytozolowego.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie polisomów
<ol>
	<li>Załadować 1 ml oczyszczonego ekstraktu cytozolowego (krok 4.8) na wierzch poduszki sacharozy, ostrożnie pipetując na ściankę boczną probówki.</li>
	<li>Przenieść probówki ultrawirówek do wstępnie schłodzonych wiader i odwirować przy ciśnieniu 217 874 × g (35 000 obr./min w referencyjnym wirniku [patrz tabela materiałów]) przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić pozostały ekstrakt cytozolowy i poduszkę sacharozową, a następnie ponownie zawiesić osad polissomalny z 200 μl wstępnie schłodzonego RB (uprzednio przygotowanego zgodnie z tabelą 1).</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut na lodzie, a następnie przenieść polisomalną zawiesinę do wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 1,5 ml. Kontynuuj ekstrakcję RNA (próbki PAR).</li>
</ol>
7. Ekstrakcja RNA i kontrola jakości
UWAGA: Ten krok jest wykonywany dla próbek TOTAL (krok 4.8) i PAR (krok 6.4).
<ol>
	<li>Przygotować 75% EtOH sterylną ultraczystą wodą i schłodzić do temperatury -20 °C. Dodatkowo schłodzić chloroform i izopropanol do temperatury -20 °C.</li>
	<li>Homogenizować próbki z 750 μl odczynnika do izolacji RNA i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 200 μl zimnego chloroformu i energicznie wstrząsać probówkami przez 15 s. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
	<li>Wirować przy 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu separacji faz. Przenieść 500 μl górnej fazy wodnej do czystej probówki, nie naruszając różowej fazy organicznej, i dodać 375 μl zimnego izopropanolu i 0,5 μl glikogenu wolnego od RNaz (patrz tabela materiałów). Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. 
	UWAGA: Glikogen jest nośnikiem stosowanym jako współstrącacz w celu zwiększenia odzysku kwasów nukleinowych z wytrącania alkoholu.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odwirowywać przy 12 000 × g przez 15 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć osad RNA 1 ml zimnego 75% EtOH. Wymieszaj przez krótkie wirowanie. 
	UWAGA: W tym momencie próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
	<li>Wirować przy 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety i wysuszyć na powietrzu osad RNA.</li>
	<li>Rozpuścić osad w 50 μl wody wolnej od RNaz i inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Oceń stężenie i integralność RNA za pomocą wysoce czułej elektroforezy kapilarnej18 (patrz Tabela Materiałów) i/lub elektroforezy na 2% wolnym od RNaz żelu agarozowym19 (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Jeśli próbki RNA nie zostaną natychmiast wykorzystane lub mają zostać wysłane do zakładu sekwencjonowania w celu przygotowania biblioteki sekwencjonowania RNA, zaleca się użycie EtOH do ich wytrącenia.</li>
</ol>
8. Wytrącanie RNA
<ol>
	<li>Schłodzić wirówkę i EtOH do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 3 M octan sodu.</li>
	<li>Przygotować 70% EtOH w sterylnej ultraczystej wodzie i schłodzić do temperatury -20 °C.</li>
	<li>Oszacuj objętość próbki. Dodać 0,1 objętości 3 M octanu sodu, 3 objętości zimnego EtOH i 0,5 μl glikogenu wolnego od RNaz. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Pozostawić w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie potrzebny. 
	UWAGA: Próbki wytrącone RNA mogą być przechowywane przez okres do 1 roku w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
9. Standardowy potok do analizy ekspresji genów
<ol>
	<li>Wykonuj średnio 40 mln odczytów sparowanych końców Illumina, z długością odczytu >100 bp, aby zapewnić pewną analizę danych transkryptomu i translatomu. 
	UWAGA: Standardowa analiza danych sekwencyjnych RNA obejmuje następujące kroki 9.2-9.5.</li>
	<li>Przeprowadź kontrolę jakości odczytu za pomocą FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) lub wielopróbkowego MultiQC20.</li>
	<li>Usuń sekwencje adaptera i niskiej jakości, używając między innymi Trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, sickle23 lub Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/).</li>
	<li>Jeśli genom referencyjny jest dostępny dla gatunku, przeprowadź mapowanie odczytu względem odniesienia, a następnie kwantyfikację liczebności, używając Bowtie224, TopHat225 lub Salmon26 i featureCounts27, oprócz innych narzędzi open source.</li>
	<li>Przeprowadź analizę statystyczną w celu identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji, między innymi za pomocą edgeR28, DESeq229 lub limma30. 
	UWAGA: To oprogramowanie typu open source może być używane lokalnie za pośrednictwem wiersza poleceń. Alternatywnie można je obsługiwać za pomocą przeglądarki internetowej na serwerze publicznym, takim jak Galaxy31 lub GEOexplorer32, które oferują graficzny interfejs użytkownika, dzięki czemu do ich użycia nie jest wymagana znajomość wiersza poleceń.</li>
</ol>

<ol><li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+tissue-specific+transcriptome+analyses+of+Medicago+truncatula+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64377(2013).</li>
<li>Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+nitrogen-fixing+symbiosis+with+legumes%3A+How+many+rhizobium+recipes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes.</a> Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).</li>
<li>King, H. A., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translatome+profiling%3A+Methods+for+genome-scale+analysis+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation.</a> Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).</li>
<li>Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15(2017).</li>
<li>Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS ONE. 8 (8), 71425(2013).</li>
<li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li>
<li>Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+RNA-Seq+and+microarray+gene+expression+data+in+two+zones+of+the+Arabidopsis+root+apex+relevant+to+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22Applications+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight.</a> Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197(2018).</li>
<li>Shulse, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+transcriptome+profiling+of+plant+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types.</a> Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+mRNA+translation+contributes+to+gene+regulation+under+non-stress+and+dehydration+stress+conditions+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302(2013).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+regulation+of+protein+abundance+from+proteomics+and+transcriptomis+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+mRNAs+strongly+correlate+to+proteins+in+a+multivariate+manner+and+their+translation+ratios+are+phenotype+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+New+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+adaptive+response+of+Arabidopsis+thaliana+to+prolonged+thermal+stress+by+ribosomal+profiling+and+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq.</a> BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+leghaemoglobin+synthesis+in+snake+beans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA+nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).</li>
<li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiQC%3A+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Marcel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Joshi, J., Fass, N. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/najoshi/sickle">https://github.com/najoshi/sickle</a> (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+Accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).</li>
<li>Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmon+provides+fast+and+bias-aware+quantification+of+transcript+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.</a> Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).</li>
<li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((featureCounts%3A+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2015).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2018+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).</li>
<li>Hunt, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEOexplorer%3A+A+webserver+for+gene+expression+analysis+and+visualisation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li>
<li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).</li>
<li>Di Paolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDCD4+regulates+axonal+growth+by+translational+repression+of+neurite+growth-related+genes+and+is+modulated+during+nerve+injury+responses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses.</a> RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).</li>
<li>Smircich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+translation+control+as+a+key+mechanism+generating+differential+gene+expression+in+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi.</a> BMC Genomics. 16 (1), 443(2015).</li>
<li>Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+and+translatome+regulation+of+pathogenesis+in+Alzheimer%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).</li>
<li>Zanetti, M. E., Chang, I. -F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopurification+of+polyribosomal+complexes+of+Arabidopsis+for+global+analysis+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression.</a> Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).</li>
<li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+ribosome+footprints+to+understand+translation+at+a+genome+wide+level%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).</li>
<li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Badanie regulacji ekspresji genów na poziomie translacyjnym ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia różnych procesów biologicznych, ponieważ punktem końcowym ekspresji genów w komórce jest obfitość białek13,14. Można to ocenić, analizując translatomię tkanki lub organizmu będącego przedmiotem zainteresowania, dla którego frakcja polisomilna powinna zostać oczyszczona, a powiązane z nią mRNA przeanalizowane 3,4,34,35,36.<s...

Rośliny strączkowe, takie jak soja (Glycine max), mogą wchodzić w symbiozę ze specyficznymi bakteriami glebowymi zwanymi rizobiami. Ta mutualistyczna relacja indukuje tworzenie nowych organów – brodawek symbiotycznych – na korzeniach rośliny. Brodawki są organami roślinnymi goszczącymi bakterie i składają się z komórek gospodarza, których cytoplazma jest kolonizowana przez wyspecjalizowaną formę rizobiów zwaną bakteroidami. Bakteroidy te katalizują redukcję azotu atmosferycznego (N2) do amoniaku, który jest przekazywany roślinie w zamian za węglowodany1,2.
Choć ta symbioza wiążąca azot jest jedną z najlepiej przebadanych symbioz roślinno-mikrobowych, wiele aspektów wymaga lepszego zrozumienia, na przykład to, w jaki sposób rośliny poddane różnym abiotycznym warunkom stresowym modulują interakcję z partnerem symbiotycznym oraz jak wpływa to na metabolizm brodawek. Procesy te można lepiej zrozumieć, analizując translatom brodawek (tj. podzbiór cząsteczek mRNA, które są aktywnie tłumaczone). Polirybosomy lub polizomy to kompleksy wielu rybosomów związanych z mRNA, powszechnie wykorzystywane do badania translacji3. Metoda profilowania polizomów polega na analizie mRNA związanych z polizomami i była z sukcesem stosowana do badania potranskrypcyjnych mechanizmów kontroli ekspresji genów występujących w różnorodnych procesach biologicznych4,5.
Historycznie analiza ekspresji genomu koncentrowała się przede wszystkim na określaniu poziomu mRNA6,7,8,9. Istnieje jednak brak korelacji między poziomem transkrypcji a poziomem białek ze względu na różne etapy potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów, w szczególności translacji10,11,12. Ponadto nie zaobserwowano zależności między zmianami na poziomie transkryptomu a zmianami zachodzącymi na poziomie translatomu13. Bezpośrednia analiza zestawu mRNA podlegających translacji pozwala na dokładniejszy i pełniejszy pomiar ekspresji genów w komórce (której punktem końcowym jest ilość białka) niż pomiar uzyskany przy analizie samych poziomów mRNA14,15,16.
Niniejszy protokół opisuje sposób oczyszczania polisomów pochodzenia roślinnego z nienaruszonych brodawek sojowych za pomocą różnicowego wirowania przez dwuwarstwową poduszkę sacharozową (Rysunek 1). Ponieważ w brodawkach obecne są również rybosomy pochodzące od bakteroidów, oczyszczana jest mieszanina rybosomów i gatunków RNA, mimo że frakcja eukariotyczna stanowi główną część (90%-95%). Opisano również następującą po tym izolację, kwantyfikację oraz kontrolę jakości RNA (Rysunek 1). Protokół ten, w połączeniu z analizą RNA-seq, powinien dostarczyć wyników eksperymentalnych dotyczących regulacji translacyjnej eukariotycznych mRNA w złożonej tkance, taką jak symbiotyczna brodawka.
<img alt="Schemat eksperymentu z roślinami i rizobiami; zbiór brodawek, ekstrakt cytozolowy, oczyszczanie polizomów, kontrola jakości RNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64269/64269fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przegląd proponowanej metodologii oczyszczania polizomów eukariotycznych z brodawek symbiotycznych. Schemat przedstawia przegląd kroków opisanych w protokole: od (1) wzrostu roślin i (2) zbioru brodawek, przez (3) przygotowanie ekstraktów cytozolowych, (3) pobranie próbek TOTAL i (4) próbek PAR, aż po (5) ekstrakcję RNA i kontrolę jakości. Skróty: PEB = bufor do ekstrakcji polizomów; RB = bufor do resuspensji; TOTAL = całkowite RNA; PAR = mRNA powiązane z polizomami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64269/64269fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td><silny>Wzrost roślin i inokulacja ryzobii</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Daihan Scientific</td><td></td><td>Model SHO-1D</td></tr><tr><td>YEM-medium</td><td>Amresco</td><td>J850 (ekstrakt drożdżowy) 0122 (mannitol)</td><td></td></tr><tr><td><silny>Leczenie deficytu wody</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Merck</td><td></td><td></td>221295</tr><tr><td>Porometr</td><td>Urządzenie</td><td></td> dekątne <td>Model SC-1</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przygotowanie ekstraktów cytozolowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brij L23</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1254</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sigma</td><td></td><td>Model 2K15</td></tr><tr><td>Chloranphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DOC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA 360</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Młynek do tkanek z tworzywa sztucznego</td><td>Fisher Scientific</td><td>12649595</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>PTE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2393</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie wagowe&nbsp;</td><td>Deltalab</td><td>1911103</td><td></td></tr><tr><td>Przygotowanie poduszek sacharozowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Invitrogen</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter Ultrawirówka Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Optima L-100K</td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td>Probówki 13,2 ml</td></tr><tr><td>Ekstrakcja RNA i kontrola jakości</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>R0492</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td></td><td>Model 2100. Test nano całkowitego RNA eukariontu</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>DI</td><td>41191</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Dorwil</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Mallinckrodt</td><td>3032-06</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Sigma</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Ambion</td><td>102960028</td><td></td></tr><tr><td><silny>Różne</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 15 ml</td><td>Biologix</td><td>10-0152</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące 10 i mikro; L</td><td>BioPointe Scientific</td><td>321-4050</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące 1000 &mikro; L</td><td>BioPointe Scientific</td><td>361-1050</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące 20 i mikro; L</td><td>BioPointe Scientific</td><td>341-4050</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące 200 &mikro; L</td><td>Probówki do mikrowirówek Tarsons</td><td>528104</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml</td><td>Probówki do mikrowirówek Tarsons</td><td>500010-N</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml</td><td>Tarsons</td><td>500020-N</td><td></td></tr><tr><td>Firma sekwencjonująca</td><td>Macrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna kolba 250 ml</td><td>Marienfeld</td><td>4110207</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie polisomów z guzków symbiotycznych soi

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

Celem tego protokołu jest dostarczenie strategii badania translatomii eukariotycznej symbiotycznego guzka soi (Glycine max). W artykule opisano metody zoptymalizowane do izolowania polirybosomów pochodzenia roślinnego i związanych z nimi mRNA, które mają być analizowane przy użyciu sekwencjonowania RNA. Po pierwsze, lizaty cytoplazmatyczne uzyskuje się poprzez homogenizację w warunkach zachowania polisomów i RNA z całych, zamrożonych guzków soi. Następnie lizaty są oczyszczane przez wirowanie z niską prędkością, a 15% supernatantu jest używane do izolacji całkowitego RNA (TOTAL). Pozostały oczyszczony lizat służy do izolowania polisomów przez ultrawirowanie przez dwuwarstwową poduszkę sacharozową (12% i 33,5%). MRNA związane z polisomami (PAR) jest oczyszczane z granulek polissomalnych po ponownym wysiedleniu. Zarówno TOTAL, jak i PAR są oceniane za pomocą wysoce czułej elektroforezy kapilarnej, aby spełnić standardy jakości bibliotek sekwencjonowania dla sekwencjonowania RNA. Jako przykład dalszego zastosowania, po sekwencjonowaniu, można wykorzystać standardowe potoki do analizy ekspresji genów w celu uzyskania genów o zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkryptomu i translatomiu. Podsumowując, metoda ta, w połączeniu z sekwencją RNA, pozwala na badanie translacyjnej regulacji eukariotycznych mRNA w złożonej tkance, takiej jak guzek symbiotyczny.

Ocena ilościowa i jakościowa frakcji TOTAL oraz PAR oczyszczonych zgodnie z wyżej opisaną procedurą jest kluczowa dla określenia powodzenia procesu, ponieważ w przypadku większości zastosowań w dalszych etapach, takich jak sekwencjonowanie RNA, wysokiej jakości próbki są niezbędne do przygotowania bibliotek i sekwencjonowania. Ponadto integralność cząsteczek RNA pozwala na uchwycenie obrazu profilu ekspresji genów w momencie pobrania próbki18. W tym kontekście, podczas wykonywania tych pomiarów pr...

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania eukariotycznych polisomów z nienaruszonych guzków soi. Po sekwencjonowaniu można wykorzystać standardowe potoki do analizy ekspresji genów do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkryptomu i translatomiu.

Oczyszczanie polisomów z guzków symbiotycznych soi

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ według naszej wiedzy jest pierwszym, który opisuje nowy metal na bazie wirówki do kinetycznego oczyszczania polisomów z symbiotycznych guzków soi. Dużą zaletą tej techniki jest to, że w połączeniu z RNA-Seq pozwala na badanie relacji i zorganizowanej w złożoną tkankę, taką jak symbiotyczny guzek. Na początek zważ około 0,2 grama nienaruszonych guzków w naczyniu do ważenia i przenieś je do wstępnie schłodzonej dwumililitrowej probówki.Następnie dodaj 1,2 mililitra buforu do ekstrakcji polisomów, pozwól próbce rozmrozić się przez dwie minuty i homogenizować za pomocą młynka do tkanek, aż do całkowitego rozerwania i homogenizacji guzków. Następnie inkubować próbki na lodzie z delikatnym mieszaniem przez 10 minut lub do momentu, gdy wszystkie próbki zostaną przetworzone i odwirować w temperaturze 16 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać szczątki. Następnie odzyskaj supernatant i powtórz etap wirowania.Po dokładnym odzyskaniu oczyszczonego ekstraktu cytozolowego, przenieś 200 mikrolitrową podwielokrotność do czystej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej w celu całkowitej izolacji. Następnie wlej 4,5 mililitra 33,5% warstwy sacharozy do probówek wirówkowych i ostrożnie i powoli dodaj 4,5 mililitra warstwy 12% za pomocą mikropipety P-1000. Następnie umieść probówki na lodzie do momentu dodania oczyszczonego ekstraktu cytozolowego.Załadować jeden mililitr oczyszczonego ekstraktu cytozolowego na wierzch poduszki sacharozy, ostrożnie pipetując na boczną ściankę probówki. Następnie przenieś probówki ultra wirówki do wstępnie schłodzonych wiader i odwiruj w temperaturze 217 874 G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu pozostałego ekstraktu cytozolowego i poduszki sacharozowej, ponownie zawiesić osad polissomalny z 200 mikrolitrami wstępnie schłodzonego buforu do resuspensji.Następnie inkubuj przez 30 minut na lodzie, a następnie przenieś polisomalną re-zawiesinę do 1,5 mililitrowych, wstępnie schłodzonych probówek, aby kontynuować ekstrakcję RNA. Po homogenizacji próbek z 750 mikrolitrami odczynnika do izolacji RNA inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 200 mikrolitrów zimnego chloroformu i energicznie potrząsaj probówkami przez 15 sekund.Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wirować w temperaturze 12 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu separacji faz i przenieść 500 mikrolitrów górnej fazy wodnej do czystej probówki bez naruszania różowej fazy organicznej. Następnie dodaj 375 mikrolitrów zimnego izopropanolu i 0,5 mikrolitra wolnego glikogenu RNA.Następnie dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odwirowywać w temperaturze 12 000 razy G przez 15 minut. Następnie wyrzuć supernatant i przemyj osad RNA jednym mililitrem zimnego, 75% etanolu.Wymieszaj przez krótkie wirowanie. Następnie odwirować w temperaturze 7,500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzuć supernatant i wysusz na powietrzu osad RNA.Następnie rozpuść osad w 50 mikrolitrach wolnej wody RNA i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Oceń stężenie i integralność RNA za pomocą bardzo czułej elektroforezy kapilarnej i/lub elektroforezy na żelu agarozowym wolnym od 2% RNA. Po oszacowaniu objętości próbki dodać 0,1 objętości trzech molowych octanu sodu, trzy objętości zimnego etanolu i 0,5 mikrolitra RNA, wolnego glikogenu.Następnie dokładnie je wymieszaj. Elektroforezę kapilarną przeprowadzono dla kilku całkowitych i polisomalnych frakcji próbek RNA, które wykazały ostre pasma rybosomalnego RNA, bez rozmazywanego wyglądu. Nie znajduje to jednak odzwierciedlenia w wartościach RIN, ponieważ wahają się one od 5,9 do 7,5, co odpowiada próbkom nienienaruszonym.Bioanalizator nie zidentyfikował pików 18S i 25S, jak widać na elektroferogramach, zarówno dla próbek RNA całkowitych, jak i związanych z polisomami. Nie stwierdzono żadnych wizualnych oznak degradacji próbki. Jednak próbka została przeanalizowana w celu wizualizacji wyniku prawie całkowicie zdegradowanej próbki, dla porównania.Najważniejsze jest, aby pracować w warunkach zachowania polisomów i RNA podczas całego protokołu. Po sekwencjonowaniu frakcji całkowitej i par RNA, standardowe wzorce analizowanej ekspresji genów mogą być wykorzystane do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkrypcji i translacji.

polysome-purification-from-soybean-symbiotic-nodules

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przygotowanie wysokiej jakości ekstraktów z komórek drożdży jest niezbędnym pierwszym krokiem w analizie pojedynczych białek lub całych proteomów.  Tutaj opisujemy szybki, wydajny i niezawodny protokół homogenizacji pączkujących komórek drożdży, który został zoptymalizowany w celu zachowania funkcji białek, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych.

Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Ten manuskrypt opisuje wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

Aby uzyskać podstawowe informacje na temat sorpcji i recyklingu złota z układów wodnych, zbadano oddziaływanie nanocząstek Au(III) i Au(0) na białka warstwy S. Absorpcję polimerów białkowych badano za pomocą ICP-MS, a monowarstw białkowych za pomocą QCM-D. Późniejsze AFM umożliwia obrazowanie nanostruktur.

Interakcja Au polimerów Slp1 i monowarstwy z Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS i AFM jako narzędzia do badań biomolekuł i metali

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę przesiewową, która może być szeroko stosowana do szybkiego badania przesiewowego supresorów wyciszających RNA u patogenów roślinnych.

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Protokół został opracowany w celu skutecznego wydobywania nienaruszonych histonów z materiałów z liści sorgo w celu profilowania modyfikacji histonów po translacji, które mogą służyć jako potencjalne markery epigenetyczne do pomocy w inżynierii upraw odpornych na suszę.

Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół

Poznaj metodę oczyszczania polisomów z guzków symbiotycznych soi przy użyciu wirówki. Technika ta umożliwia badanie ekspresji genów na poziomie transkryptomu i translatomu w złożonych tkankach roślinnych.

Oczyszczanie polisomów z guzków symbiotycznych soi

Przeglądaj więcej filmów