Oczyszczanie polisomów z guzków symbiotycznych soi
1 lipca 2022
Ten protokół opisuje metodę oczyszczania eukariotycznych polisomów z nienaruszonych guzków soi. Po sekwencjonowaniu można wykorzystać standardowe potoki do analizy ekspresji genów do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkryptomu i translatomiu.
Protokół ten jest istotny, ponieważ według naszej wiedzy jest pierwszym, który opisuje nowy metal na bazie wirówki do kinetycznego oczyszczania polisomów z symbiotycznych guzków soi. Dużą zaletą tej techniki jest to, że w połączeniu z RNA-Seq pozwala na badanie relacji i zorganizowanej w złożoną tkankę, taką jak symbiotyczny guzek. Na początek zważ około 0,2 grama nienaruszonych guzków w naczyniu do ważenia i przenieś je do wstępnie schłodzonej dwumililitrowej probówki.
Następnie dodaj 1,2 mililitra buforu do ekstrakcji polisomów, pozwól próbce rozmrozić się przez dwie minuty i homogenizować za pomocą młynka do tkanek, aż do całkowitego rozerwania i homogenizacji guzków. Następnie inkubować próbki na lodzie z delikatnym mieszaniem przez 10 minut lub do momentu, gdy wszystkie próbki zostaną przetworzone i odwirować w temperaturze 16 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać szczątki. Następnie odzyskaj supernatant i powtórz etap wirowania.
Po dokładnym odzyskaniu oczyszczonego ekstraktu cytozolowego, przenieś 200 mikrolitrową podwielokrotność do czystej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej w celu całkowitej izolacji. Następnie wlej 4,5 mililitra 33,5% warstwy sacharozy do probówek wirówkowych i ostrożnie i powoli dodaj 4,5 mililitra warstwy 12% za pomocą mikropipety P-1000. Następnie umieść probówki na lodzie do momentu dodania oczyszczonego ekstraktu cytozolowego.
Załadować jeden mililitr oczyszczonego ekstraktu cytozolowego na wierzch poduszki sacharozy, ostrożnie pipetując na boczną ściankę probówki. Następnie przenieś probówki ultra wirówki do wstępnie schłodzonych wiader i odwiruj w temperaturze 217 874 G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu pozostałego ekstraktu cytozolowego i poduszki sacharozowej, ponownie zawiesić osad polissomalny z 200 mikrolitrami wstępnie schłodzonego buforu do resuspensji.
Następnie inkubuj przez 30 minut na lodzie, a następnie przenieś polisomalną re-zawiesinę do 1,5 mililitrowych, wstępnie schłodzonych probówek, aby kontynuować ekstrakcję RNA. Po homogenizacji próbek z 750 mikrolitrami odczynnika do izolacji RNA inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 200 mikrolitrów zimnego chloroformu i energicznie potrząsaj probówkami przez 15 sekund.
Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wirować w temperaturze 12 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu separacji faz i przenieść 500 mikrolitrów górnej fazy wodnej do czystej probówki bez naruszania różowej fazy organicznej. Następnie dodaj 375 mikrolitrów zimnego izopropanolu i 0,5 mikrolitra wolnego glikogenu RNA.
Następnie dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odwirowywać w temperaturze 12 000 razy G przez 15 minut. Następnie wyrzuć supernatant i przemyj osad RNA jednym mililitrem zimnego, 75% etanolu.
Wymieszaj przez krótkie wirowanie. Następnie odwirować w temperaturze 7,500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzuć supernatant i wysusz na powietrzu osad RNA.
Następnie rozpuść osad w 50 mikrolitrach wolnej wody RNA i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Oceń stężenie i integralność RNA za pomocą bardzo czułej elektroforezy kapilarnej i/lub elektroforezy na żelu agarozowym wolnym od 2% RNA. Po oszacowaniu objętości próbki dodać 0,1 objętości trzech molowych octanu sodu, trzy objętości zimnego etanolu i 0,5 mikrolitra RNA, wolnego glikogenu.
Następnie dokładnie je wymieszaj. Elektroforezę kapilarną przeprowadzono dla kilku całkowitych i polisomalnych frakcji próbek RNA, które wykazały ostre pasma rybosomalnego RNA, bez rozmazywanego wyglądu. Nie znajduje to jednak odzwierciedlenia w wartościach RIN, ponieważ wahają się one od 5,9 do 7,5, co odpowiada próbkom nienienaruszonym.
Bioanalizator nie zidentyfikował pików 18S i 25S, jak widać na elektroferogramach, zarówno dla próbek RNA całkowitych, jak i związanych z polisomami. Nie stwierdzono żadnych wizualnych oznak degradacji próbki. Jednak próbka została przeanalizowana w celu wizualizacji wyniku prawie całkowicie zdegradowanej próbki, dla porównania.
Najważniejsze jest, aby pracować w warunkach zachowania polisomów i RNA podczas całego protokołu. Po sekwencjonowaniu frakcji całkowitej i par RNA, standardowe wzorce analizowanej ekspresji genów mogą być wykorzystane do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkrypcji i translacji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę oczyszczania eukariotycznych polizomów z nienaruszonych brodawek sojowych. Technika ta umożliwia badanie ekspresji genów na poziomie transkryptomu i translatomu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia roślin
- Analiza ekspresji genów
Wstęp
- Oczyszczanie polisomów jest niezbędne do badania regulacji translacji.
- Zrozumienie ekspresji genów w guzkach symbiotycznych może dostarczyć cennych informacji na temat interakcji roślin z mikroorganizmami.
- Metoda ta jest pierwszą, która wykorzystuje podejście oparte na wirowaniu do kinetycznego oczyszczania polisomów z guzków soi.
- Technikę tę można połączyć z sekwencjonowaniem RNA-Seq w celu przeprowadzenia kompleksowej analizy.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody oczyszczania polisomów z guzków sojowych.
- Ułatwienie badania ekspresji genów w tkankach złożonych.
- Pogłębienie zrozumienia relacji między transkryptomem a translatomem.
Zastosowane Metody
- Ważenie nienaruszonych brodawek sojowych i przenoszenie ich do probówki.
- Homogenizacja brodawek za pomocą homogenizatora tkankowego w buforze do ekstrakcji polisomów.
- Inkubacja próbek na lodzie i wirowanie w celu wytrącenia resztek komórkowych.
- Odzyskanie supernatantu i powtórzenie wirowania w celu oczyszczenia.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczne oczyszczanie polisomów z brodawek sojowych.
- Umożliwia przeprowadzenie następującej po niej analizy RNA-Seq w celu identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji.
- Wykazuje potencjał do badania złożonych interakcji tkankowych.
- Ustanawia nowy protokół dla przyszłych badań w dziedzinie biologii roślin.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia nowatorskie podejście do oczyszczania polisomów.
- Otwiera on nowe możliwości w zakresie zrozumienia ekspresji genów w relacjach symbiotycznych.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do pogłębienia wiedzy na temat biologii roślin.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Oczyszczanie polisomów z symbiotycznych guzków soi umożliwia bezpośrednią analizę regulacji translacji w złożonych tkankach roślinnych, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego na wczesnym etapie odkrywania. Poprzez izolację zarówno całkowitego, jak i związanego z polisomami mRNA do sekwencjonowania RNA-seq, metoda ta zapewnia ilościowy wgląd w ekspresję genów na poziomach transkryptomu i translatomu. Możliwości te zwiększają pewność prognostyczną w zakresie walidacji celów i analizy szlaków w procesach biotechnologii roślin.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną ocenę kontroli translacyjnej w systemach roślinnych istotnych dla przebiegu chorób.
- Wspiera mechanistyczną weryfikację ryzyk poprzez rozróżnienie regulacji transkrypcyjnej od translacyjnej.
- Ułatwia walidację celu poprzez ilościowe porównanie pul mRNA.
Przesiew i opracowanie testu
- Przygotowuje wysokiej jakości, powtarzalne próbki RNA do dalszych etapów analizy RNA-seq.
- Standaryzuje ocenę integralności próbek za pomocą elektroforezy kapilarnej w celu weryfikacji przydatności do sekwencjonowania.
- Umożliwia rzetelną analizę różnicowej ekspresji genów zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i translacyjnym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki ekspresji genów z odkrywaniem biomarkerów translacyjnych w modelach interakcji roślin z mikroorganizmami.
- Zapewnia ciągłość od odkryć molekularnych po walidację funkcjonalną w złożonych tkankach.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój potencjalnych celów terapeutycznych/badawczych w oparciu o dowody translacyjne.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda integruje się z kontinuum procesu odkrywania — od wczesnego testowania hipotez, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po badania translacyjne w biotechnologii roślin.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia analizę regulacji translacyjnej w guzkach symbiotycznych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki analizy RNA do analiz porównawczych.
- Analityka: Zapewnia wysokiej jakości frakcje mRNA do analizy ekspresji różnicowej oraz analizy szlaków sygnałowych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia molekularne z wynikami funkcjonalnymi w złożonych tkankach roślinnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany schemat postępowania, który można dostosować do innych systemów roślinnych wymagających profilowania translacyjnego.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez rozstrzygnięcie regulacji translacyjnej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zstandaryzowane, skalowalne oczyszczanie RNA do sekwencjonowania wysokoprzepustowego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) poprzez integrację danych transkryptomu i translatomu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dowody translacyjne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z tkankami roślinnymi oraz w ocenie integralności RNA.
- Wymaga dostępu do aparatury do ultrawirowania oraz elektroforezy kapilarnej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia powtarzalnej jakości RNA.
- Może wymagać adaptacji dla innych gatunków roślin lub typów tkanek.
- Integralność próbek musi być zachowana przez cały czas w celu zapewnienia wiarygodnych analiz końcowych.
