Name: Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: Poznaj metodę przeszczepu ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z komórek macierzystych do hipokampa myszy noworodków. Technika ta umożliwia ocenę integracji komórek i ich potencjału terapeutycznego w zaburzeniach neurorozwojowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (numer grantu: 2016-02605, M.A.), Szwedzką Fundację Mózgu F02021-0369 (M.A.), Fundację Crafoord (M.A.) oraz program Unii Europejskiej Horyzont 2020 (H2020-MSCA-ITN-2016) w ramach projektu Innowacyjnej Sieci Szkoleniowej Marie Skłodowska-Curie Training4CRM nr 722779 (M.K.). Jesteśmy niezmiernie wdzięczni za pomoc Andrésa Migueza z laboratorium Josepa Marii Canalsa (Laboratorium Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej, Uniwersytet w Barcelonie) za nauczanie stereotaktycznego przeszczepu komórek u nowonarodzonych myszy P2 oraz Mackenzie Howard, lidera grupy na Uniwersytecie Teksańskim w Austin, za porady i wstępne współrzędne do przeszczepu komórek do hipokampa nowonarodzonych myszy P2. Dziękujemy Susanne Geres za pomoc w opiece nad zwierzętami i Ling Cao za pomoc w przetwarzaniu tkanek, a także studentom, którzy w taki czy inny sposób przyczynili się do badania, a w szczególności Dianie Hatamian. Wreszcie, niektóre grafiki użyte do zilustrowania tego artykułu zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Radę Etyki Badań nad Zwierzętami w Malmö/Lund (Malmö/Lund Animal Research Ethics Board), numer zgody etycznej 12548-19, i przeprowadzono zgodnie z regulacjami Szwedzkiej Agencji ds. Dobrostanu Zwierząt (Swedish Animal Welfare Agency) oraz dyrektywą UE 2010/63/UE dotyczącą eksperymentów na zwierzętach. Myszy C57BL6/J i Białko podobne do białka stowarzyszonego z kontaktyną 2 (Cntnap2) w niniejszym badaniu wykorzystano myszy z nokautem (KO), zarówno samce, jak i samice, w 2. dobie postnatalnej (P). Wykorzystano ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs). Zwierzęta i komórki macierzyste pozyskano z komercyjnych źródeł (patrz Tabela materiałów).
1. Generowanie prekursorów hdIN
UWAGA: Wszystkie etapy w tej sekcji są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza. hESC hodowano jako komórki bez warstwy wspomagającej (feeder-free) na powlekonych płytkach, używając pożywki do hodowli komórek macierzystych, a pasażowano w formie kolonii.
<ol>
	<li>Przeprowadź programowanie hESC do prekursorów hdIN (Rysunek 1). 
	UWAGA: Podejście do programowania bezpośredniego opiera się na procedurze opisanej przez Gonzalez-Ramos i wsp.8 oraz Yang i wsp.9.
	<ol>
		<li>Przeprowadź transdukcję hESC wektorami lentiwirusowymi zawierającymi system Tet-On w świeżej pożywce do hodowli komórek macierzystych zawierającej 10 µM inhibitora ROCK (RI) (patrz Tabela Materiałów). Przechowuj w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wymień pożywkę na świeżą pożywkę do hodowli komórek macierzystych 16 h po transdukcji i utrzymuj transdukowane komórki w taki sam sposób, jak nietransdukowane hESC.</li>
		<li>Po osiągnięciu konfluencji odklej hESC jako pojedyncze komórki, używając roztworu do odklejania komórek (patrz Tabela Materiałów), i wysiej je na powlekane płytki 6-dołkowe w gęstości 3 x 105 komórek/dołek w pożywce do hodowli komórek macierzystych zawierającej 10 µM RI w dniu in vitro (DIV) −1.</li>
		<li>W 1 DIV zastąp pożywkę hodowlaną pożywką N2 zawierającą 2 g/L doksycykliny (DOX, patrz Tabela Materiałów). 
		UWAGA: DOX jest używany do indukcji ekspresji transgenów Ascl1 i Dlx29 od 1 DIV do 7 DIV, a następnie jest kontynuowana in vivo poprzez dodawanie go do wody pitnej25.</li>
		<li>W 2 DIV rozpoczyna się okres selekcji oporności na antybiotyki, który potrwa do 5 DIV. Dodaj puromycynę (puro) i hygromycynę (hygro) do świeżej pożywki (patrz Tabela Materiałów). Wymień pożywkę w 2 DIV, 4 DIV i 5 DIV. 
		UWAGA: Przed protokołem różnicowania zoptymalizuj stężenia puro i hygro, używając transdukowanych i nietransdukowanych hESC, aby zapewnić przeżycie tylko komórek niosących kasety oporności na antybiotyki. W tym protokole zastosowano 0.5 µg/mL puro i 750 µg/mL hygro.</li>
		<li>W 5 DIV okres selekcji antybiotykowej dobiega końca. Zmień pożywkę na pożywkę N2 uzupełnioną o 2 g/L DOX i 4 µM cytozyny β-D-arabinofuranozydy (Ara-C, patrz Tabela Materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Oś czasu edycji genów z transdukcją lentiwirusową; obrazy mikroskopowe pokazują barwienia MAP2, Ki67, Hoechst." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64272/64272fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Generowanie prekursorów hdIN z hESC poprzez nadekspresję Ascl1 i Dlx2. (A) Schematy protokołu różnicowania stosowanego do generowania prekursorów hdIN. (B-E) Immunocytochemia prekursorów hdIN w 7 DIV dla (B) markera neuronalnego MAP2, (C) markera proliferacyjnego Ki67, (D) ogólnego barwienia jąder oraz (E) nałożenia poprzednich markerów. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/64272fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek do transplantacji
UWAGA: Wszystkie etapy w tej sekcji są wykonywane w komorze do hodowli komórkowej. W 7 DIV prekursory hdIN są dysocjowane i wykorzystywane do transplantacji.
<ol>
	<li>Przeprowadź odrywanie komórek zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Usuń medium i ostrożnie opłucz komórki za pomocą DPBS bez wapnia i magnezu.</li>
		<li>Dodaj 400 µL roztworu do odrywania komórek (patrz Tabela materiałów) do każdego dołka płytki 6-dołkowej. 
		UWAGA: Upewnij się, że roztwór pokrywa całą powierzchnię.</li>
		<li>Inkubuj przez 2-3 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze, aż brzegi komórek zaczną wyglądać na błyszczące, co wskazuje na enzymatyczną degradację białek powierzchniowych komórek i ich odrywanie od powierzchni dołka. 
		UWAGA: Aby zwiększyć przeżywalność komórek, nie czekaj zbyt długo po tym, jak wszystkie komórki całkowicie się oddzielą i zaczną unosić się w medium.</li>
		<li>Następnie dodaj 600 µL świeżego medium N2 do każdego dołka płytki 6-dołkowej, aby zahamować działanie enzymu, a następnie mechanicznie, za pomocą pipety, pomóż oddzielić komórki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórek do plastikowej probówki (15 mL) i odwiruj przy 180 x g przez 4 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź resuspensję komórek.
	<ol>
		<li>Usuń nadsącz za pomocą systemu próżniowego (ostrożnie, nie naruszając osadu) i resuspenduj osad w medium transplantacyjnym zawierającym 10 µM RI, 1 µg/mL DNazy oraz 2 µg/µL DOX.</li>
		<li>Policz całkowitą liczbę komórek w zawiesinie za pomocą komory liczbowej i manualnego licznika komórek, a następnie dostosuj objętość do końcowego stężenia 100 000 komórek/µL.</li>
		<li>Przechowuj zawiesinę komórek w zamkniętej probówce na lodzie do momentu transplantacji, maksymalnie przez 4 h. 
		UWAGA: Transplantacja musi zostać przeprowadzona w tym samym dniu, w którym przygotowano zawiesinę komórek (7 DIV).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Transplantacja komórek do hipokampa
UWAGA: Wszystkie etapy w tej sekcji są wykonywane poza wyciągiem do hodowli komórkowych w pomieszczeniu dla zwierząt. Wczesna postnatalna transplantacja komórek do mózgu została przeprowadzona w dniu P2, przyjmując, że dzień P0 to dzień narodzin.
<ol>
	<li>Przygotowanie do eksperymentu z transplantacją zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Autoklawować cały sprzęt chirurgiczny lub, jeśli nie jest to możliwe, wysterylizować inną zatwierdzoną metodą.</li>
		<li>Zamontować strzykawkę do wstrzykiwania w uchwycie bez kapilary szklanej. Przepłukać igłę wodą. 
		UWAGA: Igła musi mieć rozmiar 33 G.</li>
		<li>Zagiąć pod kątem 90° końcówkę igły insulinowej 30 G.</li>
		<li>Przygotować własnoręcznie wykonowany uchwyt z masy plastycznej (typu Play-Doh) do pozycjonowania szczenięcia z głową w pozycji płaskiej (Rycina 2A).</li>
		<li>Wykonać klatkę z myszmi matką i szczeniętami przed przygotowaniem sprzętu do operacji, aby umożliwić im aklimatyzację w nowym środowisku.</li>
		<li>Przygotować tacę z wilgotnym lodem oraz pustą klatkę z papierem do izofluranu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie szczenięcia myszy.
	<ol>
		<li>Nasączyć kawałek papieru izofluranem (patrz Tabela materiałów) i umieścić go wewnątrz pustej klatki. Ostrożnie pobrać jedno szczenię i umieścić je w klatce z papierem nasączonym izofluranem. 
		UWAGA: Nigdy nie zostawiać z matką mniej niż trzech szczeniąt. Nie przekraczać 20-30 s znieczulenia izofluranem, w przeciwnym razie szczenię może zginąć.</li>
		<li>Zweryfikować efekt znieczulenia poprzez ustanie ruchów.</li>
		<li>Natychmiast po znieczuleniu umieścić szczenię na wilgotnej chusteczce na powierzchni wilgotnego lodu. Trzymać zwierzę na lodzie przez 3 min, aż kończyny górne staną się białawe (Rycina 2B, niebieska strzałka). Zazwyczaj zajmuje to 2-3 min.</li>
		<li>Wykorzystać ten czas na nabranie do strzykawki zawiesiny komórkowej. Wcześniej ostrożnie resuspenderować komórki za pomocą pipety.</li>
		<li>Umieścić szczenię w aparacie stereotaktycznym. Użyć prętów usznych w przeciwnym kierunku (Rycina 2A, purpurowe strzałki). 
		UWAGA: Tylna strona prętów usznych jest mniej ostra, a ponieważ szczenięta P2 nie mają uszu, należy użyć płaskiej strony, aby uniknąć zranienia zwierzęcia.</li>
		<li>Sprawdzić z boku, czy głowa jest prosto. Głowa musi być w pozycji płaskiej; w tym celu należy użyć uchwytu z masy plastycznej. 
		UWAGA: Szczenięta w tym wieku nie otworzyły jeszcze oczu, więc nie jest wymagany żaden dodatkowy krok w tym zakresie. Szczenięta w tym wieku nie mają futra, więc nie jest wymagane golenie obszaru. Nie podaje się specyficznego leczenia przeciwbólowego, ponieważ nie jest to otwarte nacięcie skóry i nie występuje szycie.</li>
		<li>Przez cały czas trwania operacji utrzymywać szczenię przykryte lodem (na papierowej chusteczce). 
		UWAGA: Nie dopuszczać do bezpośredniego kontaktu lodu ze skórą szczenięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonanie iniekcji.
	<ol>
		<li>Oczyścić powierzchnię skóry miękką chusteczką nasączoną etanolem.</li>
		<li>Zidentyfikować lambda i ustawić współrzędne na zero na cyfrowym panelu sterowania instrumentu stereotaktycznego (Rycina 2C, żółta przerywana linia). Szwy strzałkowy i jagodowy są łatwo widoczne gołym okiem jako czerwone linie ze względu na ich unaczynienie. 
		UWAGA: W przypadku trudności z wizualizacją lambda, położyć mały kawałek lodu na skórze i odczekać kilka minut do schłodzenia. Następnie usunąć lód; subtelne wybielenie skóry umożliwi wizualizację.</li>
		<li>Przesunąć igłę do wstrzykiwania do pożądanych współrzędnych. W opisanym protokole regionem docelowym był hipokamp, a współrzędne były następujące: przednio-tylne (AP) +0,85 oraz przyśrodkowo-boczne (ML) +1,35.</li>
		<li>Użyć zagiętej pod kątem 90° igły insulinowej, aby przebić czaszkę i stworzyć niewielki otwór.</li>
		<li>Opuścić igłę do wstrzykiwania, aż przebije czaszkę, a następnie wyzerować współrzędne grzbietowo-brzuszne (DV). Obniżyć igłę do pożądanych współrzędnych DV. W opisanym protokole współrzędne wynosiły DV −1,1.</li>
		<li>Wykonać iniekcję zgodnie z ustalonymi odstępami czasowymi. 
		UWAGA: W opisanym protokole dokładny harmonogram był następujący: (i) po opuszczeniu do współrzędnej DV odczekać 3 min, (ii) wstrzyknąć objętość 1 µL w ciągu 5 min, oraz (iii) po wstrzyknięciu całej objętości odczekać 3 min.</li>
		<li>Powoli wycofać igłę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakończenie procedury. 
	UWAGA: Operacja nie może trwać dłużej niż 15 min, aby zapewnić przeżycie szczenięcia i uniknąć uszkodzeń wynikających z hipotermii spowodowanej znieczuleniem.
	<ol>
		<li>Ogrzać szczenię w dłoniach, aż zacznie się ruszać, przed oddaniem go matce.</li>
		<li>Podawać DOX w stężeniu 1 mg/mL w 0,5% roztworze sacharozy jako wodę pitną przez co najmniej 2 dni przed i 3 tygodnie po transplantacji (PT), aby kontynuować różnicowanie komórek in vivo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Układ eksperymentalny do manipulacji tkankami z wykorzystaniem urządzeń mechanicznych do symulacji chirurgicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64272/64272fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Transplantacja stereotaktyczna u noworodków myszy w dniu P2. (A) Podłoże przypominające plastelinę służące do utrzymania ciała szczenięcia w pozycji oraz odwrócone uchwyty do uszu (różowe strzałki). (B) Biała przednia łapa (niebieska strzałka) wskazująca na zmniejszony przepływ krwi w tym obszarze, co świadczy o tym, że szczenię znajduje się pod wpływem anestezji hipotermicznej. (C) Przegląd układu z szczenięciem przykrytym lodem na papierze chłonnym. (c#) Powiększenie głowy szczenięcia z wprowadzoną do mózgu igłą wstrzykującą (żółta przerywana linia wskazująca szwy lambda i lambdoidalne). Rysunek został zaadaptowany z pracy Gonzalez Ramos et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/64272fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Kostović, I., Jovanov-Milošević, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+cerebral+connections+during+the+first+20-45+weeks%27+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Fetal+and+Neonatal%22%5BJournal%5D)">The development of cerebral connections during the first 20-45 weeks' gestation.</a> Seminars in Fetal and Neonatal. 11 (6), 415-422 (2006).</li>
<li>Innocenti, G. M., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exuberance+in+the+development+of+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exuberance in the development of cortical networks.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (12), 955-965 (2005).</li>
<li>Tang, X., Jaenisch, R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+GABAergic+signalling+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of GABAergic signalling in neurodevelopmental disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 22 (5), 290-307 (2021).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructure+of+the+neocortex%3A+Comparative+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Microstructure of the neocortex: Comparative aspects.</a> Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).</li>
<li>Radonjić, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+cortical+interneurons+in+primates%3A+The+role+of+the+dorsal+proliferative+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diversity of cortical interneurons in primates: The role of the dorsal proliferative niche.</a> Cell Reports. 9 (6), 2139-2151 (2014).</li>
<li>Turner, D. A., Shetty, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+prospects+for+neural+grafting+therapy+for+hippocampal+lesions+and+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy.</a> Neurosurgery. 52 (3), 632-644 (2003).</li>
<li>Gonzalez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+GABAergic+neurons+functionally+integrate+into+human+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks.</a> Scientific Reports. 11, 22050(2021).</li>
<li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pure+GABAergic+neurons+by+transcription+factor+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming.</a> Nature Methods. 14 (6), 621-628 (2017).</li>
<li>Nicholas, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+hPSC-derived+forebrain+interneurons+requires+an+extended+timeline+and+mimics+human+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+somatostatin+and+parvalbumin+neurons+by+expressing+a+single+transcription+factor+LIM+homeobox+6%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Induction of human somatostatin and parvalbumin neurons by expressing a single transcription factor LIM homeobox 6.</a> eLife. 7, 37382(2018).</li>
<li>Fandel, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+human+stem+cell-derived+interneuron+precursors+mitigate+mouse+bladder+dysfunction+and+central+neuropathic+pain+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplanted human stem cell-derived interneuron precursors mitigate mouse bladder dysfunction and central neuropathic pain after spinal cord injury.</a> Cell Stem Cell. 19 (4), 544-557 (2016).</li>
<li>Noakes, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+striatal+interneurons%3A+Differentiation+and+maturation+in+vitro+and+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived striatal interneurons: Differentiation and maturation in vitro and in the rat brain.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 191-200 (2019).</li>
<li>Parikshak, N. N., Gandal, M. J., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+and+gene+networks+in+neurodevelopmental+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systems biology and gene networks in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (8), 441-458 (2015).</li>
<li>Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li>
<li>Sloan, D. J., Wood, M. J., Charlton, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+intracerebral+neural+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The immune response to intracerebral neural grafts.</a> Trends in Neurosciences. 14 (8), 341-346 (1991).</li>
<li>Diehl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+for+in+vivo+research%3A+State-of-the-art+protocols+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression for in vivo research: State-of-the-art protocols and experimental approaches.</a> Cellular & Molecular Immunology. 14 (2), 146-179 (2017).</li>
<li>Osman, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporine-A+as+a+neuroprotective+agent+against+stroke%3A+Its+translation+from+laboratory+research+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke: Its translation from laboratory research to clinical application.</a> Neuropeptides. 45 (6), 359-368 (2011).</li>
<li>Quinnies, K. M., Cox, K. H., Rissman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+deficiency+influences+juvenile+social+behavior+and+maternal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immune deficiency influences juvenile social behavior and maternal behavior.</a> Behavioral Neuroscience. 129 (3), 331-338 (2015).</li>
<li>Fernandes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+immune+dysfunction%3A+their+neuroanatomical+differences+reflect+their+anxiety-behavioural+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mouse models of immune dysfunction: their neuroanatomical differences reflect their anxiety-behavioural phenotype.</a> Molecular Psychiatry. 27 (7), 3047-3055 (2022).</li>
<li>Lund, R. D., Rao, K., Hankin, M. H., Kunz, H. W., Gill, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+retina+and+visual+cortex+to+rat+brains+of+different+ages.+Maturation%2C+connection+patterns%2C+and+immunological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transplantation of retina and visual cortex to rat brains of different ages. Maturation, connection patterns, and immunological consequences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 495, 227-241 (1987).</li>
<li>Olsson, M., Bentlage, C., Wictorin, K., Campbell, K., Björklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+migration+and+target+innervation+by+striatal+precursors+after+grafting+into+the+neonatal+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extensive migration and target innervation by striatal precursors after grafting into the neonatal striatum.</a> Neuroscience. 79 (1), 57-78 (1997).</li>
<li>Mattis, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+immune-tolerance+in+mice+does+not+prevent+xenograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neonatal immune-tolerance in mice does not prevent xenograft rejection.</a> Experimental Neurology. 254, 90-98 (2014).</li>
<li>Nato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-tolerance+to+human+iPS-derived+neural+progenitors+xenografted+into+the+immature+cerebellum+is+overridden+by+species-specific+differences+in+differentiation+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immune-tolerance to human iPS-derived neural progenitors xenografted into the immature cerebellum is overridden by species-specific differences in differentiation timing.</a> Scientific Reports. 11, 651(2021).</li>
<li>Allison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+nature+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+interneurons+via+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining the nature of human pluripotent stem cell-derived interneurons via single-cell analysis.</a> Stem Cell Reports. 16 (10), 2548-2564 (2021).</li>
<li>Waloschková, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+GABAergic+interneurons+establish+efferent+synapses+onto+host+neurons+in+rat+epileptic+hippocampus+and+inhibit+spontaneous+recurrent+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived GABAergic interneurons establish efferent synapses onto host neurons in rat epileptic hippocampus and inhibit spontaneous recurrent seizures.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13243(2021).</li>
<li>Gonzalez Ramos, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Enhancing+neuronal+inhibition+by+cell+and+gene+therapy+as+a+novel+treatment+for+epilepsy%22">Enhancing neuronal inhibition by cell and gene therapy as a novel treatment for epilepsy</a>. , Lund University, Faculty of Medicine. PhD thesis (2022).</li>
<li>Paterno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+gamma+and+sharp-wave+ripple+oscillations+are+altered+in+a+Cntnap2+mouse+model+of+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hippocampal gamma and sharp-wave ripple oscillations are altered in a Cntnap2 mouse model of autism spectrum disorder.</a> Cell Reports. 37 (6), 109970(2021).</li>
<li>Penagarikano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+CNTNAP2+leads+to+epilepsy%2C+neuronal+migration+abnormalities%2C+and+core+autism-related+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits.</a> Cell. 147 (1), 235-246 (2011).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).</li>
<li>Angeletti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+doxycycline-controlled+expression+system+for+functional+studies+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An in vivo doxycycline-controlled expression system for functional studies of the retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 755-760 (2003).</li>
<li>Doxycycline. Drugs and Lactation Database (LactMed). , National Library of Medicine. Bethesda, MD. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500561">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500561</a> (2021).</li>
<li>Barker, R. A., Widner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+problems+in+central+nervous+system+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRX%22%5BJournal%5D)">Immune problems in central nervous system cell therapy.</a> NeuroRX. 1 (4), 472-481 (2004).</li>
<li>Hoornaert, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Innate+and+adaptive+immune+recognition+of+allogeneic+and+xenogeneic+cell+transplants+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: Innate and adaptive immune recognition of allogeneic and xenogeneic cell transplants in the central nervous system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1434-1441 (2017).</li>
<li>Englund, U., Fricker-Gates, R. A., Lundberg, C., Bjorklund, A., Wictorin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+neural+progenitor+cells+into+the+neonatal+rat+brain%3A+Extensive+migration+and+differentiation+with+long-distance+axonal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: Extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections.</a> Experimental Neurology. 173 (1), 1-21 (2002).</li>
<li>Fainstein, N., Ben-Hur, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region-dependent+rejection+of+neural+precursor+cell+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain region-dependent rejection of neural precursor cell transplants.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 136(2018).</li>
<li>Denham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+human+embryonic+stem+cells+extend+long-distance+axonal+projections+through+growth+along+host+white+matter+tracts+after+intra-cerebral+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, 11(2012).</li>
<li>Miguez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+progressive+degeneration+of+Huntington%27s+disease+patient-derived+neurons+reveals+human-specific+pathological+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">In vivo progressive degeneration of Huntington's disease patient-derived neurons reveals human-specific pathological phenotypes.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Niniejszy protokół opisuje solidną, szybką, prostą i szeroko dostępną metodologię generowania prekursorów hdIN in vitro i jej zastosowanie jako wczesna interwencyjna terapia komórkowa w przedklinicznych modelach zaburzeń neurorozwojowych.
Mimo że niektóre z charakterystycznych fenotypów zaburzeń neurorozwojowych pojawiają się w okresie dojrzewania lub dorosłości, zmiany patofizjologiczne są już obecne we wczesnym okresie rozwoju. Z tego powodu wczesna interwencja byłaby wysoce uzasadniona w celu osiągnięcia korzystnych efektów poprzez działanie w krytycznych okresach rozwoju mózgu przed objawami lub objawami klinicznymi. W przyszłości genetyczne badania przesiewowe i opracowanie biomarkerów pozwolą na leczenie profilaktyczne lub przedobjawowe, co będzie przełomem dla tych pacjentów. Dlatego prekursory hdIN zostały przeszczepione wcześnie po urodzeniu w mysim modelu Cntnap2 KO, gdy epileptogenne zmiany w sieci neuronalnej mogą trwać28 i w momencie, w którym zmiany komórkowe zostały opisane w tym modelu zwierzęcym29. Ważne jest jednak, aby wziąć pod uwagę potencjalne pułapki związane z ekstrapolacją wieku i czasem zachodzących pewnych procesów w mózgu myszy w porównaniu z ludzkim mózgiem.
Skupiając się na samej procedurze, przedstawiony tutaj protokół różnicowania opiera się na wykorzystaniu czynników transkrypcyjnych, które pozwalają na szybkie i bardzo wydajne programowanie komórek macierzystych w porównaniu z innymi protokołami opartymi na małych cząsteczkach 10,30. Potencjalną wadą tego podejścia może być wymóg stosowania wektorów lentiwirusowych, co niesie ze sobą ryzyko mutagenezy insercyjnej. Dwa krytyczne kroki w protokole to dodanie antybiotyków i środka antymitotycznego do pożywki w celu selekcji komórek wyrażających czynniki transkrypcyjne i wyeliminowania komórek proliferacyjnych, unikając odpowiednio ryzyka powstania potworniaka. Chociaż w tym badaniu przetestowano tylko prekursory hdIN, oczekuje się, że procedura będzie wykonalna z innymi źródłami komórek i protokołami programowania/różnicowania. Niemniej jednak należy zweryfikować inne podtypy neuronów i/lub modele.
Wiek prekursora hdIN do przeszczepienia, 7 DIV, został określony na podstawie (i) braku komórek proliferacyjnych, ocenianych na podstawie immunoreaktywności przeciwko Ki67, (ii) wraz z wcześniej opisaną obserwacją spadku ekspresji genów pluripotencji, takich jak POU5F1 oraz pojawieniem się markera neuronalnego MAP2 i markera interneuronalnego GAD1 w tym punkcie czasowym8. Jednak oryginalna praca opisująca ten protokół wykonywała przeszczepy w 14 DIV po wycofaniu DOX9. Rodzi to pytania o to, czy DOX w wodzie pitnej matki może dotrzeć do komórek wszczepionych do mózgów karmiących młodych poprzez mleko, czy też 7 DIV indukcji DOX wystarczy, aby ustalić los GABA-ergii. Chociaż Yang i wsp. zidentyfikowali 14 dni DOX jako wystarczające do wytworzenia stabilnych komórek neuronalnych in vitro9, Gonzalez-Ramos i wsp.8 wykryli ekspresję genu GAD1 już w 7 DIV, co wskazuje, że dalsza aktywacja GAD67 przez Ascl1 i Dlx2 już nastąpiła w tym punkcie czasowym. W związku z tym tworzenie wzorców rozpoczęło się od 7 DIV i może być mniej zależne od leczenia DOX. Co więcej, dowody na gryzoniach i ludziach wskazują na obecność DOX w mleku matki31,32, a przedstawione tutaj wyniki pokazują, że przeszczepione hdIN były immunoreaktywne dla Ascl1 po 2 tygodniach i 2 miesiącach PT oraz markerów interneuronowych później po 9 miesiącach PT. W populacji przeszczepionej, oprócz neuronów PV i SST dodatnich, w mniejszych ilościach znaleziono również inne markery subpopulacji interneuronów, takie jak kalretynina (CR) i kalbindyna (CB).
Trudnym aspektem tej procedury jest koordynacja czasu zarówno różnicowania, jak i wieku młodych. Zwykle ciąża myszy trwa 21 dni po założeniu klatki godowej, choć czasami może się to różnić. Taki scenariusz nie występuje w przypadku wykonywania przeszczepów komórek u dorosłych gryzoni, kiedy wszystko można dokładnie zaplanować i zaaranżować. Niemniej jednak można to łatwo złagodzić, ustawiając dwie lub trzy klatki kojarzące w odstępie 2 dni lub dwie do trzech partii różnicujących z 2-dniowym odstępem czasu.
Chociaż myszy użyte w tym badaniu nie miały ani niedoboru odporności, ani immunosupresji, przeszczepione komórki przeżyły do 9 miesięcy in vivo, a markery reakcji immunologicznej przeciwko komórkom ksenogenicznym lub miejscowego stanu zapalnego nie obserwowano ani po P14, ani po 2 miesiącach PT. Odrzucenie immunologiczne przeszczepionych komórek ksenogenicznych jest wyzwalane przeciwko MHC / peptydom, a kluczowymi mediatorami komórkowymi odrzucenia przeszczepu są limfocyty T i komórki mikrogleju33, Lokal mieszkalny 34. W związku z tym zbadano immunoreaktywność na markery limfocytów T, a także reaktywny mikroglej. Nie wykryto żadnych oznak odrzucenia immunologicznego przeszczepionych komórek w tkance gospodarza ani na podstawie poziomów reaktywnego mikrogleju, ani na podstawie obecności limfocytów T u myszy WT po P14 lub 2 miesiącach. Ponadto nie zaobserwowano miejscowego stanu zapalnego na podstawie ocenianych poziomów astroglejozy i cytokin zapalnych. Wynik ten może być częściowo zależny od tolerancji immunologicznej noworodków 35,36,37, obserwowanej przez inne tożsamości komórek, lokalizacje i modele zwierzęce 35,38. Englund i wsp. zidentyfikowali regionalne różnice w wynikach przeszczepionych komórek pod względem migracji i dojrzewania, w tym obserwacji przeszczepionych komórek w sąsiedniej istocie białej35.
Wreszcie, zaobserwowano większe rozproszenie przeszczepionych komórek w hipokampie w porównaniu z innymi badaniami przeszczepiającymi dorosłym gryzoniom, w których hdIN pozostały jako przeszczepiony rdzeń25. Dyspersja ta różniła się również od wyników zaobserwowanych wcześniej przez Yanga i wsp.9, co w tym przypadku można wytłumaczyć wiekiem komórek w momencie przeszczepu.

Budowa, dojrzewanie i doskonalenie sieci neuronalnych ma miejsce w okresie okołoporodowym i wczesnym okresie poporodowym i stanowi kluczowe okno czasowe dla rozwoju mózgu1. Od pourodzeniowego entuzjazmu łączności, mózg ewoluuje do precyzyjnego dostrajania połączeń, które rozciągają się aż do okresu dojrzewania2. W związku z tym zmiany w genach wyrażanych w tych okresach, a także czynniki zewnętrzne lub zniewagi, definiują predyspozycje jednostki do wielu zaburzeń neurorozwojowych. Upośledzenie funkcji poznawczych i motorycznych rozwija się z czasem, a leczenie farmakologiczne jest ograniczone, a większość z nich koncentruje się na objawach z ryzykiem wystąpienia poważnych skutków ubocznych.
Wykazano, że dysfunkcja hamowania ergicznego kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) jest główną przyczyną różnych zaburzeń neurorozwojowych3, takich jak zespół łamliwego chromosomu X, zespół Angelmana, epilepsja, schizofrenia i autyzm. GABA jest głównym przekaźnikiem hamującym ośrodkowego układu nerwowego i odgrywa zasadniczą rolę w utrzymaniu równowagi pobudzające / hamujące (E / I), synchronizacji neuronów odpalania i obliczeń. Interneurony GABA-ergiczne to niejednorodna populacja neuronów, o rosnącym stopniu złożoności funkcjonalnej w bardziej złożonych obszarach mózgu4 i z evolution5,6. Biorąc pod uwagę ograniczoną endogenną zdolność regeneracyjną ludzkiego mózgu i implikacje dysfunkcji interneuronów w kilku zaburzeniach neurologicznych, przeszczepienie interneuronów GABA-ergicznych może być obiecującą drogą terapeutyczną do zbadania. Idąc tym tropem, ludzkie komórki interneuronopodobne do GABA-ergiczne pochodzące z komórek macierzystych (hdINs) wydają się być najbardziej translacyjnym i realnym źródłem do tego celu w porównaniu z allogenicznymi prekursorami neuronalnymi gryzoni lub innymi źródłami stosowanymi gdzie indziej7. Dostępne są protokoły generowania neuronów GABA-ergicznych z różnych źródeł komórkowych8,9,10,11,12,13, ale potrzebna jest większa wiedza na temat tego, jak hdIN dojrzewają, integrują się i funkcjonują w czasie w rozwijającym się patologicznym mózgu. Kilka badań zidentyfikowało zmiany w genach aktywnych podczas wzorca korowego, ustanawiając łączność neuronalną14 i dostrajając fizjologiczną równowagę E/I15. Przeszczepianie hdIN u noworodków do modeli mysich z odpowiadającymi im zaburzeniami genetycznymi pozwala nam śledzić wzajemne oddziaływanie między gospodarzem a przeszczepem, co jest wiedzą niezbędną do określenia potencjalnych strategii terapeutycznych.
Immunomodulacja jest powszechnie i skutecznie stosowana w przeszczepach ksenoprzeszczepów, aby uniknąć wywołania odpowiedzi immunologicznej gospodarza i odrzucenia16. Jednak podawanie leków immunosupresyjnych, takich jak cyklosporyna A, powoduje toksyczne działanie na nerki po przewlekłym podaniu, jest pracochłonne ze względu na konieczność codziennych wstrzyknięć dootrzewnowych w celu osiągnięcia stabilnych stężeń ogólnoustrojowych, powodując stres u zwierząt17, i ma efekty niezgodne z celem, które mogą wchodzić w interakcje z patologią18. Ponadto wykazano, że osłabienie układu odpornościowego zmienia fenotypy behawioralne19, ze zmianami w odpowiednich regionach neuroanatomicznych20. Wykazano, że przeszczep w pierwszym tygodniu życia pozwala na adaptację do przeszczepionych komórek21,22, podczas gdy inni zgłaszali początkowe przeżycie, po którym nastąpiło odrzucenie przeszczepów w ciągu pierwszego miesiąca po urodzeniu23,24.
Ten protokół opisuje procedury od generacji hdIN do przeszczepu komórek u noworodków, skutkujące długoterminowym przeżyciem przeszczepu i pozwalające na badanie specyficzności neuronalnej, integracji synaptycznej, funkcji i potencjału terapeutycznego przeszczepionych ludzkich interneuronów podczas fizjologicznego i patologicznego rozwoju.

<table><tbody><tr><td>Igła 30 G</td><td>B Braun</td><td>4656300</td><td></td></tr><tr><td>Igła 33 G do strzykawki</td><td>Hamilton</td><td>Hamilton 7762-06</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 4-dołkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7920</td><td>Roztwór do oddzielania komórek stosowany do rozszczepiania komórek (prekursory hESC i hdIN)</td></tr><tr><td>Pipety o regulowanej objętości 10, 20, 200, 1000 i mikro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Plus 488/555/647</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anty-CD68 (Szczur)</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anty-CD8 (Królik)</td><td>Abcam</td><td></td><td>203035 1:200 Anty-Galektyna</td></tr><tr><td>3 (Koza)</td><td>R& Systemy D</td><td>AF1197</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anty-GFAP (Świnia Guiena)</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>173004</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anty-Iba1 (Królik)</td><td>WAKO</td><td>19119741</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anty-IL1 (Koza)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-106</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anty-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Anty-Ki67 (Królik)</td><td>Novocastra</td><td>NCL-Ki67p</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Anti-MAP2 (Kurczak)</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Anti-Mash1 (Ascl1)</td><td>Abcam</td><td>ab74065</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anty-parwalbumina (królik)</td><td>Swant</td><td>PV 27</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>Anty-somatostatyna (szczur)</td><td>Millipore</td><td>MAB354</td><td>1:150</td></tr><tr><td>Anti-STEM121 (Mysz)</td><td>Takara Bio</td><td>Y40410</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Awidyna/Biotyna Zestaw blokujący</td><td>VECTOR Laboratories</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>17482</td><td>Model zwierzęcy</td></tr><tr><td>Biotinylowany koń anty-mysz</td><td>VECTOR Laboratories</td><td>BA-2001</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Komora Burkera</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10628431</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Janvier Labs</td><td>Model</td> zwierzęcy <td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td>do probówek 15 ml</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon&nbsp;</td>Mikroskop <td></td><td>konfokalny A1RHD</td></tr><tr><td>Costar 6-well Clear TC-traktowany&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Cytozyna &beta;-D-arabinofuranozyd (AraC)</td><td>Sigma</td><td>C1768</td><td>4 &mikro; </td></tr><tr><td>Zestaw substratów M DAB, peroksydaza (z niklem)</td><td>VECTOR Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Digital Stereotax</td><td>KOPF</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific 11320082</td><td></td><td>Zastosowanie do roztworu N2</td></tr><tr><td>medium DNazy I</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7900</td><td>1 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>2 &mikro; g / mL</td></tr><tr><td>DPBS -/-</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>BX51 Mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Solveco</td><td></td><td>70%, 95%, 99,8%</td></tr> <tr><td>FUW-rTA</td><td>Addgene</td><td>20342</td><td>Wektor lentiwirusowy</td></tr><tr><td>FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycyna</td><td>Addgene</td><td>97329</td><td>Wektor</td></tr> <tr><td>lentiwirusowyFUW-TetO-DLX2-IRES-higromycyna</td><td>Addgene</td><td>97330</td><td>Wektor lentiwirusowy</td></tr><tr><td>H1 (WA01) ESC</td><td>WiCell</td><td>WA01</td><td>Linia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podstawie umowy MTA</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td></td><td>Hamilton 7634-01</td><td>5 &mikro; L</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>Bez wapnia, bez magnezu - Pożywka transplantacyjna</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Gibco (Invitrogen)</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td>5% CO2, 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Isoflurane Baxter</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręczny licznik komórek</td><td>VWR</td><td>720-1984</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matryca z kwalifikacją hESC, wolna od LDEV</td><td>354277</td><td>Corning</td><td>Do powlekania</td></tr><tr><td>Metanol Merck</td><td>Millipore</td><td>1060091000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Szkiełka nakrywkowe 24 x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>BBAD02400500#A113MNZ#0##</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>631-1551</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie mikroskopowe</td><td>Olympus</td><td>CellSens Nośniki</td><td></td></tr><tr><td>montażowe</td><td>Merck</td><td>10981</td><td>PVA-Dabco&nbsp;</td></tr><tr><td>Adapter myszy do stereotax</td><td>RWD</td><td>68030</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Kit Basal Medium i 5X Suplement - Pożywka do hodowli komórek macierzystych</td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>1M</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Pertex</td><td>HistoLab</td><td>811</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Filler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Play-Doh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna (Dichlorowodorek)</td><td>Gibco</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe okulary nakrywkowe grubość nr 1,5H (tol. &plusmn; 5 &mu; m) 13 mm i Oslash;</td><td>Marienfeld</td><td>MARI0117530</td><td>Do immunocytochemii</td></tr><tr><td>Surowica</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Koza, Osioł, Koń</td></tr><tr><td>Sterylne końcówki</td><td></td><td></td> do pipet <td>Do objętości 0,1-1000 i mikro; L</td></tr><tr><td>Sterylne pipety</td><td></td><td></td> serologiczne <td>5, 10, 25 ml</td></tr><tr><td>Sterylna woda Braun</td><td>B Braun</td><td>3626873</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>Do 0,5% roztworu sacharozy</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Probówki</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>15 ml, Pęseta Eppendorf 1,5 ml</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra czysta woda</td><td></td><td></td><td>System wodny MilliQ</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>VWR</td><td>28973.363</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (inhibitor ROCK)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td>10 &micro; M</td></tr></tbody></table>

przeszczep ludzkich neuronów gaba-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych

Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Neurodevelopmental Disorders

Zmniejszona liczba lub dysfunkcja interneuronów hamujących jest częstym czynnikiem przyczyniającym się do zaburzeń neurorozwojowych. Dlatego terapia komórkowa wykorzystująca interneurony w celu zastąpienia lub złagodzenia skutków zmienionych obwodów neuronalnych jest atrakcyjną drogą terapeutyczną. W tym celu potrzebna jest większa wiedza na temat tego, w jaki sposób ludzkie komórki interneuronopodobne GABA-ergiczne pochodzące z ludzkich komórek macierzystych dojrzewają, integrują się i funkcjonują w czasie w obwodach gospodarza. Szczególnie ważne w zaburzeniach neurorozwojowych jest lepsze zrozumienie, czy na te procesy w przeszczepionych komórkach wpływa ewoluujący i dojrzewający mózg gospodarza. Niniejszy protokół opisuje szybkie i wysoce wydajne wytwarzanie hdIN z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w oparciu o transgeniczną ekspresję czynników transkrypcyjnych Ascl1 i Dlx2. Te prekursory neuronalne są przeszczepiane jednostronnie, po 7 dniach in vitro, do hipokampa nowonarodzonych 2-dniowych myszy. Przeszczepione neurony rozpraszają się w hipokampie ipsi i przeciwległym mysim modelu zespołu dysplazji korowej i padaczki ogniskowej i przeżywają do 9 miesięcy po przeszczepie. Podejście to pozwala na badanie tożsamości komórkowej, integracji, funkcjonalności i potencjału terapeutycznego przeszczepionych interneuronów przez dłuższy czas w rozwoju zdrowych i chorych mózgów.

Zgodnie z protokołem przedstawionym w niniejszym opracowaniu i zilustrowanym na Rysunku 1A, prekursory hdIN w 7 DIV nie wykazywały jeszcze zdolności do proliferacji, co określono na podstawie (i) negatywnej immunoreaktywności dla markera cyklu komórkowego Ki67 oraz (ii) ekspresji markerów neuronalnych, takich jak białko MAP2 (microtubule-associated protein 2) (Rysunek 1B-E). Charakteryzację tę przeprowadzono na pozostałych komórkach, które przesiano na 24 h po przejściu wszystkich etapów procedury. Ponadto analiza ekspresji genów opublikowana wcześniej wskazała, że szybkie przejście ze stanu pluripotencji do fenotypu neuronalnego następuje około 4 DIV i 7 DIV8. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te potwierdziły obecność komórek postmitotycznych oraz brak ryzyka powstania potworniaków.
Następnie, przeżywalność prekursorów hdIN po wczesnym postnatalnym przeszczepieniu do hipokampa myszy typu dzikiego (WT) sprawdzono za pomocą immunohistochemii przeciwko ludzkiemu markerowi cytoplazmatycznemu STEM121. Prekursory hdIN przeszczepiono do prawego grzbietowego hipokampa naiwnych myszy immunokompetentnych w dniu P2, które następnie uśmiercono w dniu P14 oraz 2 miesiące po przeszczepieniu (PT). Przeszczepione komórki stwierdzono w całym grzbietowym hipokampie, a także rozproszone w cielem niejmościowym oraz w przeciwległym hipokampie w obu punktach czasowych. Ponadto, w obu punktach czasowych, przeszczepione hdIN wykazywały ekspresję Ascl1, jednego z czynników transkrypcyjnych indukcji (Supplementary Figure 1), i nie wykazywały zdolności do proliferacji, co wskazywał brak ekspresji Ki67 (Supplementary Figure 2).
Co istotne, nie stwierdzono reakcji odpornościowej ani miejscowego stanu zapalnego przeciwko przeszczepionym komórkom zarówno w 14. dniu po urodzeniu (P14), jak i 2 miesiące po przeszczepieniu (PT), co oceniono na podstawie braku reaktywnej mikroglei zidentyfikowanej przy użyciu Iba1, CD68 i galektyny-3 (Gal3) (Rycina 3), stopnia astrogliozy określonego przez kwaśne białko włókienkowe gleju (GFAP) i cytokiny zapalne, takie jak interleukina-1 (IL-1), oraz braku cytotoksycznych limfocytów T (CD8) (Rycina 4).
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna, tkanki mózgu; Iba1, CD68, Gal3; mikroglej, hipokamp, kora, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64272/64272fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: hdINs w P14 i 2 miesiące po transplantacji (PT) do hipokampa noworodków myszy WT bez wywoływania odrzucenia immunologicznego przez tkanki gospodarza. Immunofluorescencja dla markerów Iba1, CD68 i Gal3 w tkance mózgowej z (A-D) okolic obszaru rdzenia niedokrwiennego w mysim modelu udaru wywołanego elektrokoagulacją (kontrola dodatnia, Ctrl +), (E-H) zwierząt z grupy kontrolnej ujemnej (Ctrl-) w 2 miesiącu oraz (M-P) w P14, oraz (I-L) zwierząt po transplantacji komórek w 2 miesiącu i (Q-T) w P14. Białe strzałki wskazują przykłady naczyń krwionośnych widocznych we wszystkich kanałach ze względu na autofluorescencję. Skróty: Ctx = kora; Hip = hipokamp; DG = zakręt zębaty; CA1 = pole CA1. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/64272fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna; markery GFAP, IL1, CD8; przekrój mózgu; analiza komórkowa; Ctrl, 2 miesiące." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64272/64272fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: hdINs w 2 miesiące po przeszczepieniu (PT) do hipokampa nowonarodzonych myszy WT, bez wywoływania odrzutu immunologicznego przez tkankę gospodarza. Immunofluorescencja dla markerów IL1, GFAP i CD8 w tkance mózgowej z (A-D) obszaru sąsiadującego z rdzeniem niedokrwiennym w mysim modelu udaru wywołanego elektrokoagulacją (kontrola dodatnia, Ctrl +), (E-H) zwierząt z grupy kontrolnej ujemnej (Ctrl-) w 2 miesiącu oraz (I-L) zwierząt po transplantacji komórek w 2 miesiącu. Skróty: Ctx = kora mózgu; Hip = hipokamp; DG = zakręt zębaty. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/64272fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Podobnie, prekursory hdIN przeszczepiano do hipokampa myszy KO Cntnap2, będących modelem zaburzeń widma autyzmu oraz zespołu padaczkowego z dysplazją korową. W przypadku myszy KO Cntnap2 komórki hdIN rzeczywiście przeżyły do 9 miesięcy po przeszczepieniu (PT) i były zlokalizowane w miejscu wstrzyknięcia, choć – podobnie jak zaobserwowano u myszy WT – uległy one również rozproszeniu w obrębie hipokampa ipsilateralnego, a nawet kontralateralnego (Ryc. 5). Co więcej, większość przeszczepionych hdIN wykazywała immunoreaktywność na markery interneuronów, co było zgodne z wcześniejszymi wynikami in vitro8,26 oraz u dorosłych gryzoni in vivo25.
<img alt="Analiza histologiczna przekrojów hipokampa. Markery STEM121. Schemat porównania integracji komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64272/64272fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przeszczepione hdIN w hipokampie myszy Cntnap2 KO w 9 miesiącu po transplantacji (PT). (A) Immunochemia przeciwko cytoplazmatycznemu markerowi ludzkiemu STEM121 u myszy z przeszczepionymi komórkami (lewo) oraz w grupie kontrolnej/sham (prawo). (a1 i a2) Powiększone obrazy komórek wykazujących pozytywną reakcję z STEM121. (B) Immunofluorescencja dla STEM121 (magenta) oraz markerów interneuronów: parwalbuminy (PV) i somatostatyny (SST). Białe strzałki wskazują komórki podwójnie pozytywne dla STEM121 oraz odpowiedniego markera interneuronów. (C) Widok ortogonalny przeszczepionego hdIN wykazującego immunoreaktywność dla STEM121 i PV. Pasek skali: 200 µm (A i B), 100 µm (a1 i a2), 20 µm (powiększenie w małym kwadracie w a1 i a2 oraz w C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/64272fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek dodatkowy 1: Przeszczepione hdINs 2 miesiące po zabiegu (PT) w hipokampie noworodków myszy WT wykazujących ekspresję Ascl1. Immunofluorescencja przeciwko Ascl1 oraz cytoplazmatycznemu markerowi ludzkiemu STEM121 w obszarach (A) CA3 i (B) DG u myszy WT z przeszczepionymi komórkami. (a) Powiększony obraz komórki dodatniej dla STEM121. Białe strzałki wskazują komórki podwójnie dodatnie dla STEM121 i Ascl1. Pasek skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/Supplementary%20Figure%201_vertical_.eps" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Postmitotyczne przeszczepione hdINy w 2. miesiącu po transfuzji (PT) w hipokampie noworodków myszy WT. Immunofluorescencja przeciwko markerowi proliferacji Ki67 oraz cytoplazmatycznemu markerowi ludzkiemu STEM121 u myszy WT (A) naiwnych oraz (B) z przeszczepionymi komórkami. (b) Powiększony obraz komórki dodatniej dla STEM121. Żółta strzałka wskazuje komórkę dodatnią dla Ki67 i ujemną dla STEM121. Biała strzałka wskazuje komórki dodatnie dla STEM121 i ujemne dla Ki67. Biała gwiazdka wskazuje komorę boczną. Pasek skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64272/Supplementary%20Figure%202_vertical_.eps" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przeszczepienie ludzkich pluripotencjalnych neuronów GABA-ergicznych pochodzących z komórek macierzystych, generowanych przez programowanie neuronalne, może być potencjalnym podejściem do leczenia zaburzeń neurorozwojowych. Protokół ten opisuje wytwarzanie i przeszczepianie prekursorów neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do mózgów nowonarodzonych myszy, umożliwiając długoterminowe badanie przeszczepionych neuronów i ocenę ich potencjału terapeutycznego.

Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych

A reduced number or dysfunction of inhibitory interneurons is a common contributor to neurodevelopmental disorders. Therefore, cell therapy using ...

Podejście to pozwala na badanie tożsamości komórkowej, integracji i funkcjonalności przeszczepionych interneuronów przez dłuższy czas w rozwoju zdrowych i chorych mózgów. Protokół opisuje szybką i wysoce wydajną generację ludzkich interneuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, takich jak prekursory, które przeżywają i dojrzewają w hipokampie naiwnych i transgenicznych myszy. Takie podejście pomaga nam ocenić potencjał terapeutyczny stosowania terapii komórkowej w zaburzeniach rozwojowych, w których interneurony są upośledzone.Na początek usuń pożywkę do hodowli komórkowej z prekursorów interneuronów pochodzenia ludzkiego i ostrożnie spłucz DPBS bez wapnia i magnezu. Dodać 400 mikrolitrów roztworu do oddzielania komórek do każdego dołka płytki sześciodołkowej. Inkubuj przez dwie do trzech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze, aż brzegi komórek zaczną wyglądać na błyszczące.Następnie dodać 600 mikrolitrów świeżej pożywki N2 do każdego dołka płytki sześciodołkowej, aby zatrzymać roztwór do odrywania komórek i mechanicznie odłączyć komórki za pomocą pipety, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przenieść zawiesinę komórkową do plastikowej probówki i odwirować przy 180 G przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego i ponownie zawiesić osad w pożywce transplantacyjnej.Policz wszystkie komórki w zawiesinie za pomocą komory liczącej i licznika zliczania i dostosuj objętość do końcowego stężenia 100 000 komórek na mikrolitr. Zawiesinę komórkową należy przechowywać w zamkniętej probówce na lodzie do czasu przeszczepienia przez maksymalnie cztery godziny. Natychmiast po znieczuleniu umieść szczeniaka na mokrej chusteczce na powierzchni mokrego lodu na trzy minuty, aż kończyny górne staną się białawe.Ostrożnie zawiesić komórki za pomocą pipety i załadować strzykawkę z zawiesiną komórek. Ustaw szczeniaka, umieszczając go na ramie stereotaktycznej i używając nauszników w przeciwnym kierunku. Następnie oczyść powierzchnię skóry za pomocą miękkiej chusteczki nasączonej etanolem.Zidentyfikuj lambdę i ustaw współrzędne na zero na cyfrowej konsoli wyświetlacza instrumentu stereotaktycznego. Po przemieszczeniu strzykawki Hamiltona do pożądanych współrzędnych, użyj igły insuliny zgiętej pod kątem 90 stopni, aby przebić czaszkę, tworząc mały otwór. Następnie przyłóż strzykawkę Hamiltona w dół, aż igła przetnie czaszkę i wyzeruj współrzędną grzbietowo-brzuszną.Opuść igłę, aż do uzyskania pożądanych współrzędnych grzbietowo-brzusznych. Po wstrzyknięciu komórek macierzystych należy powoli wycofać igłę. Zakończ procedurę, rozgrzewając szczenię rękami, aż zacznie się poruszać, zanim oddasz je matce.Nie stwierdzono żadnej reakcji immunologicznej ani miejscowego stanu zapalnego przeciwko przeszczepionym komórkom ani w 14. dniu po urodzeniu, ani dwa miesiące po przeszczepie, co oceniono na podstawie braku reaktywnego mikrogleju zidentyfikowanego za pomocą Iba1, CD68 i galektyny-3. Zakres astroglejozy zależy od kwaśnego białka fibrylarnego gleju i cytokin zapalnych, takich jak interleukina-1, oraz braku limfocytów cytotoksycznych. U myszy z nokautem Cntnap2 ludzkie komórki interneuronalne pochodzące z komórek macierzystych przetrwały do dziewięciu miesięcy po przeszczepie i były zlokalizowane w miejscu wstrzyknięcia.Chociaż były one również rozproszone po ipsilateralnym, a nawet przeciwległym hipokampie, jak zaobserwowano u myszy typu dzikiego. Protokół wymaga praktyki, aby zapewnić minimalne zakłócenia i kompresję mózgu, a także zachować dobrą równowagę między szybkością procedury a precyzją współrzędnych. Protokół ten jest kompatybilny z szeregiem technik, takich jak badania łączności lub odczyty funkcjonalne, takie jak elektrofizjologia lub badania behawioralne, w zależności od badań, pytania będącego przedmiotem zainteresowania.

transplantation-human-stem-cell-derived-gabaergic-neurons-into-early

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pacjenci z guzami mózgu rutynowo poddawani są radioterapii czaszki, a choć metoda ta jest korzystna, często prowadzi do wyniszczających zaburzeń poznawczych. Ten poważny, nierozwiązany problem nie ma obecnie żadnego klinicznego lekarstwa, co skłoniło nas do podjęcia wysiłków w celu opracowania terapii opartych na komórkach macierzystych w celu przywrócenia funkcji poznawczych upośledzonych przez promieniowanie.

Strategie transplantacji komórek macierzystych w celu przywrócenia funkcji poznawczych upośledzonych przez radioterapię czaszki

Źródło: Furmanski, O., et al. Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2019 rok)W tym filmie indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki nerwowe pochodzące z komórek macierzystych są stereotaktycznie wstrzykiwane do granicy istoty szarej i istoty białej kory głębokiej w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Przeszczepione komórki...

Stereotaktyczny przeszczep zawiesiny komórek nerwowych myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu

Źródło: Quattrocolo, G., et al. Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje przeszczep komórek prekursorowych interneuronów do mózgu nowonarodzonego myszy przy użyciu podejścia homotopowego lub heterotopowego. Procedura polega na zabezpieczeniu znieczulonego szczeniaka biorcy, zidentyfikowaniu docelowego obszaru mózgu i wstrzyknięciu zawiesiny komórek prekursorowych pochodzących od szczeniaka dawcy na tym...

Przeszczep komórek prekursorowych interneuronów do mózgu szczeniaka myszy

Źródło: Gonzalez-Ramos, A., et al., Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Disorders. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje stereotaktyczne wstrzyknięcie komórek prekursorowych interneuronów pochodzenia ludzkiego do hipokampa genetycznie zmodyfikowanego szczeniaka myszy ze zmniejszonymi interneuronami hamującymi, mające na celu przywrócenie równowagi pobudzająco-hamującej.

Przeszczep komórek prekursorowych interneuronów pochodzenia ludzkiego do hipokampa szczeniaka myszy

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Wyzwanie dla młodych neuronów w nowych regionach mózgu może ujawnić ważne informacje na temat tego, jak środowisko kształtuje los i dojrzewanie neuronów. Protokół ten opisuje procedurę zbierania prekursorów interneuronów z określonych regionów mózgu i przeszczepiania ich homotopowo lub heterotopowo do mózgu młodych po urodzeniu.

Homochroniczne przeszczepianie prekursorów interneuronów do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Ten protokół demonstruje metodologie dla mysiego modelu urazowego mózgu z otwartą czaszką i przeszczepu hodowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do miejsca urazu. W skrócie opisano również testy behawioralne i histologiczne wyników tych procedur.

Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół, zaprojektowany do wykorzystania narzędzi chemogenetycznych do manipulowania aktywnością komórek progenitorowych interneuronów korowych przeszczepionych do kory mózgowej myszy po urodzeniu.

Przeszczepienie chemogenetycznie zmodyfikowanych progenitorów interneuronów korowych do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na przeszczepienie indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu drogą przeznosową u myszy immunokompetentnych. Przedstawiono metodę przygotowania i przeznosowego przeszczepienia komórek oraz podawania mieszaniny cytokin w celu utrzymania iPSMG.

Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Szczegółowo opisano transplantację mysich komórek macierzystych neuronów (NSCs) do rdzenia kręgowego myszy z utrwaloną demielinizacją. Przedstawiono przygotowanie NSCs, laminektomię dziewiątego kręgu piersiowego (T9) oraz transplantację NSCs, wraz z opieką przed- i pooperacyjną nad myszami.

Chirurgiczna transplantacja neuralnych komórek macierzystych myszy do rdzeni kręgowych myszy zainfekowanych neurotropowym wirusem zapalenia wątroby myszy

Poznaj metodę przeszczepu ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z komórek macierzystych do hipokampa myszy noworodków. Technika ta umożliwia ocenę integracji komórek i ich potencjału terapeutycznego w zaburzeniach neurorozwojowych.

Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych (Wideo) | JoVE Journal

Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych

Przeglądaj więcej filmów