Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych

Podejście to pozwala na badanie tożsamości komórkowej, integracji i funkcjonalności przeszczepionych interneuronów przez dłuższy czas w rozwoju zdrowych i chorych mózgów. Protokół opisuje szybką i wysoce wydajną generację ludzkich interneuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, takich jak prekursory, które przeżywają i dojrzewają w hipokampie naiwnych i transgenicznych myszy. Takie podejście pomaga nam ocenić potencjał terapeutyczny stosowania terapii komórkowej w zaburzeniach rozwojowych, w których interneurony są upośledzone.

Na początek usuń pożywkę do hodowli komórkowej z prekursorów interneuronów pochodzenia ludzkiego i ostrożnie spłucz DPBS bez wapnia i magnezu. Dodać 400 mikrolitrów roztworu do oddzielania komórek do każdego dołka płytki sześciodołkowej. Inkubuj przez dwie do trzech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze, aż brzegi komórek zaczną wyglądać na błyszczące.

Następnie dodać 600 mikrolitrów świeżej pożywki N2 do każdego dołka płytki sześciodołkowej, aby zatrzymać roztwór do odrywania komórek i mechanicznie odłączyć komórki za pomocą pipety, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przenieść zawiesinę komórkową do plastikowej probówki i odwirować przy 180 G przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego i ponownie zawiesić osad w pożywce transplantacyjnej.

Policz wszystkie komórki w zawiesinie za pomocą komory liczącej i licznika zliczania i dostosuj objętość do końcowego stężenia 100 000 komórek na mikrolitr. Zawiesinę komórkową należy przechowywać w zamkniętej probówce na lodzie do czasu przeszczepienia przez maksymalnie cztery godziny. Natychmiast po znieczuleniu umieść szczeniaka na mokrej chusteczce na powierzchni mokrego lodu na trzy minuty, aż kończyny górne staną się białawe.

Ostrożnie zawiesić komórki za pomocą pipety i załadować strzykawkę z zawiesiną komórek. Ustaw szczeniaka, umieszczając go na ramie stereotaktycznej i używając nauszników w przeciwnym kierunku. Następnie oczyść powierzchnię skóry za pomocą miękkiej chusteczki nasączonej etanolem.

Zidentyfikuj lambdę i ustaw współrzędne na zero na cyfrowej konsoli wyświetlacza instrumentu stereotaktycznego. Po przemieszczeniu strzykawki Hamiltona do pożądanych współrzędnych, użyj igły insuliny zgiętej pod kątem 90 stopni, aby przebić czaszkę, tworząc mały otwór. Następnie przyłóż strzykawkę Hamiltona w dół, aż igła przetnie czaszkę i wyzeruj współrzędną grzbietowo-brzuszną.

Opuść igłę, aż do uzyskania pożądanych współrzędnych grzbietowo-brzusznych. Po wstrzyknięciu komórek macierzystych należy powoli wycofać igłę. Zakończ procedurę, rozgrzewając szczenię rękami, aż zacznie się poruszać, zanim oddasz je matce.

Nie stwierdzono żadnej reakcji immunologicznej ani miejscowego stanu zapalnego przeciwko przeszczepionym komórkom ani w 14. dniu po urodzeniu, ani dwa miesiące po przeszczepie, co oceniono na podstawie braku reaktywnego mikrogleju zidentyfikowanego za pomocą Iba1, CD68 i galektyny-3. Zakres astroglejozy zależy od kwaśnego białka fibrylarnego gleju i cytokin zapalnych, takich jak interleukina-1, oraz braku limfocytów cytotoksycznych. U myszy z nokautem Cntnap2 ludzkie komórki interneuronalne pochodzące z komórek macierzystych przetrwały do dziewięciu miesięcy po przeszczepie i były zlokalizowane w miejscu wstrzyknięcia.

Chociaż były one również rozproszone po ipsilateralnym, a nawet przeciwległym hipokampie, jak zaobserwowano u myszy typu dzikiego. Protokół wymaga praktyki, aby zapewnić minimalne zakłócenia i kompresję mózgu, a także zachować dobrą równowagę między szybkością procedury a precyzją współrzędnych. Protokół ten jest kompatybilny z szeregiem technik, takich jak badania łączności lub odczyty funkcjonalne, takie jak elektrofizjologia lub badania behawioralne, w zależności od badań, pytania będącego przedmiotem zainteresowania.