Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

Protokół ten pokazuje, że połączenie transakcji RNA przekaźnika czucia z pomiarami migracji i inwazji komórek w czasie rzeczywistym opartymi na impedancji ułatwia identyfikację genu, który stymuluje migrację i inwazję komórek nowotworowych. System analizy komórek w czasie rzeczywistym oparty na impedancji umożliwia ilościowe, ciągłe i kompleksowe monitorowanie migracji komórek nowotworowych po zmianach ekspresji genów. Geny, które mają nadmierną ekspresję guzów i stymulują migrację komórek nowotworowych, można zidentyfikować jako potencjalny cel hamowania przerzutów w terapii raka.

Na początek dodaj 10 mikrolitrów 10-krotnego buforu reakcyjnego, 1,5 mikrolitra PNE jeden i 10 mikrogramów plazmidowego DNA do mikroprobówki wirówkowej, aby zlinearyzować plazmidowe DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego. Dodaj wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić objętość reakcji do 100 mikrolitrów. Wymieszaj go, stukając i obracając w dół, a następnie inkubuj mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Ponownie odwiruj i dodaj pięć mikrolitrów 10% SDS i jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr proteinazy K klasy RNA do mieszaniny reakcyjnej przed zmieszaniem i odwirowaniem. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 50 stopni Celsjusza dodaj po dwa mikrolitry 10-krotnego buforu transkrypcyjnego, ATP, GTP, UTP, CTP i T7 oraz jeden mikrogram zlinearyzowanego DNA do mikroprobówki wirówkowej w celu syntezy RNA za pośrednictwem polimerazy T7. Dodaj wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić objętość reakcji do 20 mikrolitrów.

Po odwirowaniu w dół inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny w celu syntezy RNA. Następnie odkręć i dodaj jeden mikrolitr DNA i dotknij przed 15 minutami inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć matrycę DNA. Rozpocznij wytrącanie RNA chlorkiem litu, dodając 10 mikrolitrów 7,5-molowego chlorku litu do mieszaniny reakcyjnej.

Po stukaniu i odkręceniu inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 30 minut. W celu zamknięcia podgrzej próbkę RNA w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie umieść ją na lodzie w celu schłodzenia. Następnie dodaj składniki reakcji zamykania i wymieszaj, stukając.

Odwirować i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. W przypadku ogonowania poli-A należy odwirować próbkę i dodać składniki reakcji ogonowania poli-A. Następnie postukaj, odwiruj i inkubuj mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

W celu wytrącenia chlorku litu i ilościowego określenia syntetycznego mRNA dodaj 50 mikrolitrów 7,5-molowego chlorku litu i przeprowadź wytrącanie chlorku litu. Wyjąć z zamrażarki porcję bulionu żelowego ECM i przechowywać go na lodzie. Rozcieńczyć 10 miligramów na litr żelu ECM do stężenia roboczego, mieszając 990 mikrolitrów DMEM z 10 mikrolitrami żelu ECM w mikroprobówce wirówkowej.

Wymieszać delikatnie pipetując. Dodaj 60 mikrolitrów rozcieńczonego żelu ECM do każdego z 16 dołków górnej komory płytki CIM. Umieścić górną komorę płytki CIM ze zdjętą pokrywą płytki na ochronnym arkuszu z tworzywa sztucznego w inkubatorze dwutlenku węgla na około cztery godziny, aby utworzyć warstwę żelu.

W celu elektroporacji dodaj jeden mililitr DPBS do zawiesiny komórek nowotworowych w każdej probówce. Dotknij zawieszenia ogniwa i obróć trzy razy w dół przez 10 sekund. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety.

Dodaj 110 mikrolitrów buforu do respensji R do osadu komórkowego, aby uzyskać 0,1 miliona komórek w 10 mikrolitrach. Dodaj syntetyczne mRNA do osadu komórkowego, aby uzyskać stężenie od 0,2 do 20 nanogramów na mikrolitr, w zależności od pożądanego poziomu ekspresji. Delikatnie wymieszaj i ponownie zawieś osad komórkowy, stukając.

Następnie należy elektroporować 10 mikrolitrów zawiesiny ogniwa za pomocą systemu elektroporacji pod napięciem 1 350 woltów przez 10 milisekund za każdym razem trzema impulsami. Po zakończeniu przenieś elektroporowane ogniwa do nowej mikroprobówki wirówkowej z 1,1 mililitra DMEM zawierającego 0,5% FBS. Otwórz program do analizy, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania do analizy komórek w czasie rzeczywistym.

Po otwarciu opcji ustawień domyślnego wzorca eksperymentu wybierz opcję uruchamiania trzech eksperymentów oddzielnie. Otwórz każdą kołyskę, klikając zakładkę z numerami. Następnie kliknij kartę notatek z eksperymentu.

Wybierz folder i zapisz dane, wprowadzając nazwę eksperymentu. Kliknij kartę układu i wybierz cztery studnie na raz, aby skonfigurować poczwórne zduplikowane studzienki dla każdego warunku uzdatniania. Wprowadź przykładowe informacje i kliknij przycisk Zastosuj.

Kliknij kartę harmonogramu, a następnie dodaj krok, aby ustawić dwuetapowy tryb pomiarów impedancji ogniwa. Następnie kliknij Zastosuj, aby skonfigurować pierwszy krok. Kliknij ponownie dodaj krok i wprowadź 10 minut jako interwał i 48 godzin dla czasu trwania migracji i inwazji.

Następnie kliknij Zastosuj, aby skonfigurować drugi krok. Na godzinę przed pomiarem impedancji ogniwa dodaj 160 mikrolitrów DMEM zawierającego 10% surowicy lub innych atraktantów chemioterapii do studzienek dolnej komory płytki CIM. Górną komorę zawierającą studzienki pokryte żelem ECM należy zmontować do inwazji lub studzienki niepowlekane do migracji, z dolną komorą.

Do testu migracji komórek dodaj 50 mikrolitrów pożywki o niskiej surowicy do studzienek górnej komory płytki CIM. Umieść płytkę CIM i kołyskę systemu w inkubatorze CO2. Kliknij zakładkę wiadomości.

Gdy połączenie jest w porządku, wyświetlany jest komunikat, płyta CIM jest gotowa do eksperymentu. Zmontowaną płytkę CIM należy wstępnie inkubować w inkubatorze dwutlenku węgla przez 30 do 60 minut przed analizą komórek w czasie rzeczywistym, aby zaaklimatyzować płytkę CIM do warunków hodowli. Aby uzyskać odczyt bazowy, kliknij przycisk Start dla każdej podstawki.

Gdy pojawi się okno Zapisz jako, zapisz plik eksperymentalny, aby wykonać odczyt linii bazowej. W celu umieszczenia w komorze wyjmij płytkę CIM z kołyski i umieść ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego na uchwycie płytki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów elektroporowanych ogniw zawierających 100 000 ogniw do studzienek górnej komory płytki CIM i pozostaw płytkę CIM pod szafą bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut w temperaturze pokojowej.

Zmierz impedancję ogniwa, przesuwając w pełni zmontowaną płytkę CIM z powrotem do odpowiedniej podstawki. Rozpocznij pomiar impedancji ogniwa w drugim kroku, klikając przycisk start podstawki i zakładkę wykresu. Następnie kliknij przycisk dodaj wszystko i zaznacz pola średniej i odchylenia standardowego, aby wyświetlić dane w czasie rzeczywistym.

Elektroporacja komórek glejaka U 118 mg z różnymi stężeniami syntetycznego mRNA cracku jednego spowodowała zależny od stężenia białka oznaczonego flagą crack one jeden dzień po transfekcji. 0,2 i dwa nanogramy na mikrolitr mRNA doprowadziły do niewykrywalnej lub skromnej ekspresji egzogennego białka crack one. 20 nanogramów na mikrolitr mRNA spowodowało wyższy poziom ekspresji niż endogenne białko crack one.

Test migracji komórek wykazał, że elektroporacja wynosiła 0,2 lub dwa nanogramy na mikrolitr, pęknięcie jednego mRNA nie wpłynęło znacząco na migrację komórek. Jednak elektroporacja z 20 nanogramami na mikrolitr pęka jeden mRNA doprowadziła do wyraźnej stymulacji migracji komórek, przy czym więcej komórek migrowało między dwiema a 13 godzinami, ujawniając, że migracja komórek glejaka była stymulowana przez wzrost poziomu białka pęknięcia pierwszego. Elektroporacja z syntetycznym mRNA cracku L doprowadziła do silnej ekspresji białka L oznaczonego flagą pękniętego L dzień po transfekcji.

Inwazja komórek kontrolnych zwalniała wraz ze wzrostem stężenia białka ECM. Pęknięcie L nad ekspresją komórek wykazało zależny od stężenia żelu ECM spadek inwazji komórek. Porównanie między komórkami kontrolnymi i nadekspresyjnymi pęknięcia L przy różnych stężeniach żelu ECM wykazało, że nadekspresja pęknięcia L generalnie stymulowała inwazję komórek przez warstwę żelu ECM.

Wyniki sugerują również, że na obie populacje komórek w różny sposób wpłynęło rosnące stężenie żelu ECM w różnych punktach czasowych. Komórki powinny być ponownie zawieszone szybko, delikatnie i całkowicie w elektroporacji ponownie zawieszonego pęcherzyka R, ponieważ długa inkubacja komórek w zawieszonym pęcherzyku R sprawia, że komórki są niezdrowe. Szybko i wolno migrujące komórki nowotworowe można wyizolować w celu scharakteryzowania różnic między dwiema populacjami komórek.