Name: Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę ilościowego pomiaru migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA. Technika oparta na impedancji umożliwia identyfikację genów stymulujących migrację.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Medical Writing Center w Children's Mercy Kansas City za edycję tego rękopisu. Praca ta była wspierana przez Natalie's A.R.T. Foundation (do T.P.) oraz przez grant MCA Partners Advisory Board z Children's Mercy Hospital (CMH) i University of Kansas Cancer Center (KUCC) (dla T.P.).

1. Synteza mRNA
UWAGA: Do syntezy mRNA, wszystkie odczynniki i sprzęt muszą być specjalnie poddane obróbce, aby dezaktywować RNazy przed użyciem. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, przyrządów i odczynników użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Linearyzacja DNA 
	UWAGA: Mysie cDNA CrkI i CrkL zostały sklonowane do wektora ekspresyjnego pFLAG-CMV-5a w celu dodania znacznika epitopu FLAG na C-końcu i subklonowane do wektora pcDNA3.1/myc-His w celu włączenia promotora T7, jak wcześniej opisano18,19.
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl 10x buforu reakcyjnego, 1,5 μl PmeI (10 000 jednostek/ml) i 10 μg plazmidowego DNA do probówki mikrowirówkowej, aby zlinearyzować plazmidowe DNA enzymem restrykcyjnym. Dodać wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić objętość reakcji do 100 μl.</li>
		<li>Wymieszać przez stukanie, odwirować w dół i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Odwirować i dodać 5 μl 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 1 μl proteinazy K (20 mg/ml, stopień RNA) do mieszaniny reakcyjnej. Mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Pod wyciągiem dodać 100 μl dolnej fazy fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego do mieszaniny reakcji plazmidowej w celu ekstrakcji. Wirować, a następnie odwirowywać przy 18 800 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną fazę do nowej rurki.</li>
		<li>Powtórzyć krok 1.1.4 z chloroformem: alkoholem izoamylowym w stosunku 24:1.</li>
		<li>W nowej probówce doprowadzić objętość reakcji do 300 μl, dodając 200 μl wody wolnej od nukleaz, a następnie dodać 30 μl 3 M octanu sodu i 600 μl 100% etanolu.</li>
		<li>Wymieszać przez wirowanie, a następnie umieścić w temperaturze -20 °C na 30-60 minut w celu wytrącenia etanolu DNA.</li>
		<li>Wirować przy 18 800 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić sklarowany osad i przepłukać osad 1 ml 70% etanolu. Powtarzać wirowanie przez 10 minut, a następnie całkowicie usunąć supernatant.</li>
		<li>Suszyć z otwartą nakrętką przez 2 minuty, dodać 30 μl wody wolnej od nukleaz i ponownie zawiesić osad DNA.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Sprawdź rozmiar i ilość zlinearyzowanego DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza RNA z wykorzystaniem polimerazy RNA T7
	<ol>
		<li>Dodaj po 2 μl 10-krotnego buforu transkrypcyjnego, ATP, GTP, UTP, CTP i T7 oraz 1 μg zlinearyzowanego DNA do probówki mikrowirówkowej. Dodaj wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić objętość reakcji do 20 μl.</li>
		<li>Mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w celu syntezy RNA.</li>
		<li>Odwirować, dodać 1 μl DNazy (2 U/μL) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu usunięcia matrycy DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie RNA chlorkiem litu
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl chlorku litu (7,5 M) do mieszaniny reakcyjnej. Mieszaninę reakcyjną mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować w temperaturze -20 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Odwirować przy 18 800 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i przepłukać osad 500 μl 70% etanolu. Powtarzać wirowanie przez 10 minut, a następnie całkowicie usunąć supernatant.</li>
		<li>Wysuszyć z otwartą nakrętką przez 2 minuty, dodać 30 μl wody wolnej od nukleaz i ponownie zawiesić osad RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ograniczenie
	<ol>
		<li>Podgrzewać próbkę RNA w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie umieścić ją na lodzie w celu schłodzenia.</li>
		<li>Dodaj po 5 μl 10x buforu zamykającego, 10 mM GTP i 1 mM (10x) S-adenozylometioniny (SAM), po 2 μl mieszaniny enzymów cappingujących i mieszaniny enzymów O-metylotransferazy oraz 1,25 μl inhibitora RNazy. Wymieszać przez stukanie, odwirować i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogony z poli(A)
	<ol>
		<li>Odwiruj próbkę, a następnie dodaj 6 μl wody wolnej od nukleaz, 20 μl 5x buforu E-PAP, 10 μl 25 mM MnCl2, 10 μl 10 mM ATP i 4 μl enzymu ogonowego poli(A) E-PAP. Mieszać przez stukanie, odwirować i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie chlorku litu i oznaczanie ilościowe syntetycznego mRNA
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl chlorku litu (7,5 M) i przeprowadzić wytrącanie chlorku litu zgodnie z opisem w krokach 1.3.1-1.3.3.</li>
		<li>Zmierz stężenie mRNA za pomocą spektrofotometru.</li>
		<li>Sprawdź wielkość i ilość mRNA za pomocą elektroforezy żelowej z formaldehydem (1%-2%), agarozą (1%).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Żelowa powłoka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na płytkach inwazji i migracji komórek (CIM)
UWAGA: Płytka do inwazji i migracji komórek (CIM) to komercyjnie produkowana 16-dołkowa płytka do analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji. W teście inwazji komórkowej pokryj płytki CIM żelem ECM, jak opisano wcześniej, ale z pewnymi modyfikacjami11.
<ol>
	<li>Wyjąć z zamrażarki porcję bulionu żelowego ECM i przechowywać go na lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć żel ECM (10 mg/ml) do stężenia roboczego (100 μg/ml) przez zmieszanie 990 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco (bez surowicy i antybiotyków) z 10 μl żelu ECM w probówce do mikrowirówki. Wymieszać delikatnie pipetując.</li>
	<li>Dodać 60 μl rozcieńczonego żelu ECM do każdego z 16 dołków górnej komory płytki CIM. Zastosuj metodę odwrotnego pipetowania, unikając pęcherzyków powietrza20,21. 
	UWAGA: Zoptymalizuj stężenie żelu ECM dla każdej linii komórkowej. W przypadku linii komórkowych glejaka do optymalizacji użyto żelu ECM od 0,1 μg/μL do 1 μg/μL.</li>
	<li>Umieścić górną komorę płytki CIM ze zdjętą pokrywą płytki na ochronnym arkuszu z tworzywa sztucznego wewnątrz inkubatora CO2 na około 4 godziny, aby utworzyć warstwę żelu. 
	UWAGA: Podczas powlekania płytki CIM żelem ECM, elektrody górnej komory płytki CIM nie powinny mieć bezpośredniego kontaktu z rękami eksperymentatora ani z powierzchniami sprzętu, w tym z komorą bezpieczeństwa biologicznego lub inkubatorem CO2 .</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek nowotworowych
UWAGA: Wszystkie materiały do hodowli komórkowych muszą być sterylne. Zbierz i poddaj elektroporację komórkom nowotworowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE), jak opisano wcześniej, ale z pewnymi modyfikacjami11.
<ol>
	<li>Hodowla komórek nowotworowych
	<ol>
		<li>Hodowla komórek U-118MG w 10 ml DMEM zawierającego 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyków na naczynie do hodowli tkanek polistyrenowych o wymiarach 100 mm x 20 mm w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 (warunek hodowli).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zubożenie komórek nowotworowych w surowicy 
	UWAGA: Narażenie komórek na chemoatraktanty obecne w FBS musi być zminimalizowane przed testami migracji i inwazji komórek poprzez zastosowanie wysokiego stężenia FBS.
	<ol>
		<li>Usuń starą pożywkę i dodaj 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM zawierającego 0,5% FBS i 1% antybiotyków na miskę (pożywka o niskiej surowicy).</li>
		<li>Powtórz krok 3.2.1.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 4 godziny lub dłużej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie komórek nowotworowych
	<ol>
		<li>Usuń starą pożywkę, dodaj 8 ml wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) Dulbecco na naczynie, wyjmij DPBS, dodaj podgrzaną 0,05% trypsynę-EDTA (2 ml / miskę), aby pokryć powierzchnię i inkubować w inkubatorze CO2 przez 30 s.</li>
		<li>Ostrożnie odessać trypsynę-EDTA, dodać pożywkę o niskiej surowicy (7 ml / talerz), a następnie zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml lub 15 ml.</li>
		<li>Podziel niewielką objętość komórek i użyj ręcznego automatycznego licznika komórek do zliczenia komórek.</li>
		<li>Oblicz całkowitą liczbę komórek i wymaganą objętość dla 10 000 komórek/μl.</li>
		<li>Odwirować komórki, odwirowując je w stężeniu 100 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant, dodać obliczoną objętość DMEM zawierającą 0,5% FBS (bez antybiotyków) i delikatnie zawiesić osad komórkowy.</li>
		<li>Przenieść 110 μl zawiesiny komórkowej, zawierającej 1,1 miliona komórek, do probówki mikrowirówkowej dla każdego zabiegu.</li>
		<li>Powtórzyć krok 3.3.6, aby przenieść komórki do czterech probówek do mikrowirówek w celu przeprowadzenia czterech różnych zabiegów. 
		UWAGA: Płytka CIM ma w sumie 16 dołków. Zaprojektuj cztery różne zabiegi do porównania, tak aby do każdego zabiegu można było przypisać cztery dołki płytki CIM. Wykorzystaj elektroporowane komórki do następujących eksperymentów: analizy western blot (0,3 miliona komórek na 35 mm naczynie do hodowli tkankowej), cztery dołki testów migracji komórek w czasie rzeczywistym (0,1 miliona komórek / studzienkę) i cztery dołki testów inwazji komórek w czasie rzeczywistym (0,1 miliona komórek / studzienkę) dla każdego zabiegu. Dostosuj liczbę ogniw, które muszą zostać poddane elektroporacji, jeśli zmieni się projekt eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Elektroporacja komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Aby usunąć pożywkę, dodać 1 ml DPBS do zawiesiny komórek w każdej probówce, odwirować zawiesinę komórek trzy razy przez 10 s za każdym razem, obracając probówkę o 180° co 10 s za pomocą mini wirówki i usunąć supernatant za pomocą mikropipety. 
	UWAGA: Ważne jest, aby uformować zwartą, ale łatwą do ponownego zawieszenia osadę komórkową.</li>
	<li>Dodać 110 μl buforu do respensji R do osadu komórkowego, aby uzyskać 0,1 miliona komórek w 10 μl.</li>
	<li>Dodaj syntetyczne mRNA do osadu komórkowego, aby uzyskać stężenie 0,2-20 ng / μl w zależności od pożądanego poziomu ekspresji. Delikatnie wymieszać i ponownie zawiesić osad komórkowy, stukając lub delikatnie pipetując. 
	UWAGA: Użyj różnych stężeń syntetycznego mRNA, zbadaj ekspresję białka za pomocą analizy western blot i określ stężenie syntetycznego mRNA, które prowadzi do pożądanego poziomu ekspresji, w celu zbadania specyficznej korelacji między ekspresją białka a efektami biologicznymi.</li>
	<li>Elektroporować 10 μl zawiesiny ogniwa za pomocą systemu elektroporacji pod napięciem 1 350 V przez 10 ms za każdym razem trzema impulsami.</li>
	<li>Przenieś elektroporowane ogniwa do nowej probówki mikrowirówkowej z 1,1 ml DMEM zawierającego 0,5% FBS.</li>
	<li>Powtarzaj elektroporację, aż reszta zawiesiny ogniwa zostanie poddana elektroporacji. Połącz elektroporowane ogniwa w probówce mikrowirówkowej, aby uzyskać 1,1 miliona komórek w 1,1 ml. 
	UWAGA: Zarówno końcówki do elektroporacji 100 μl, jak i 10 μl mogą być używane do elektroporacji dużej objętości ogniw, ale końcówki do elektroporacji dla 10 μl i 100 μl są zawarte w dwóch oddzielnych zestawach i należy je zakupić osobno. W obu zestawach znajduje się bufor do ponownego zawieszenia R.</li>
	<li>Po wykonaniu wszystkich odpowiednich elektroporacji delikatnie ponownie zawiesić połączone ogniwa.</li>
	<li>Umieść 0,3 miliona komórek w naczyniu do hodowli tkankowej z polistyrenu o wymiarach 35 mm x 10 mm z 2 ml DMEM zawierającego 5% FBS i hoduj komórki przez 1 dzień w warunkach hodowli w celu przygotowania całkowitego lizatu komórkowego i analiz western blot.</li>
	<li>Pozostałe elektroporowane ogniwa należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu, aż system analizy ogniw w czasie rzeczywistym będzie gotowy.</li>
</ol>
5. Konfiguracja analizatora komórek w czasie rzeczywistym, programu i płytek CIM
UWAGA: Przygotuj analizator komórek w czasie rzeczywistym i dwie płytki CIM, jak wcześniej opisano11.
<ol>
	<li>Równoważenie analizatora komórek w czasie rzeczywistym
	<ol>
		<li>Przenieś analizator komórek w czasie rzeczywistym do inkubatora CO2 na kilka godzin przed użyciem, aby zrównoważyć system w warunkach hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja programu analitycznego
	<ol>
		<li>Otwórz program do analizy, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania do analizy komórek w czasie rzeczywistym na pulpicie.</li>
		<li>Po otwarciu opcji Default Experiment Pattern Setup (Ustawienia domyślnego wzorca eksperymentu) wybierz opcję uruchamiania trzech eksperymentów oddzielnie. 
		UWAGA: Każda kołyska ma osobne okienko. Istnieją różne zakładki, w których można ustawić interwał i czas trwania pomiaru, analizę danych i inne warunki eksperymentalne.</li>
		<li>Otwórz każdą kołyskę, klikając zakładkę Numer.</li>
		<li>Kliknij kartę Notatki z eksperymentu, wybierz folder, w którym zostaną zapisane dane, a następnie wprowadź nazwę eksperymentu.</li>
		<li>Kliknij kartę Układ, ustaw poczwórne studzienki dla każdego warunku uzdatniania, wybierając cztery studzienki jednocześnie i wprowadzając informacje o próbce, a następnie kliknij Zastosuj.</li>
		<li>Kliknij zakładkę Harmonogram | Dodaj krok, aby skonfigurować dwuetapowy tryb pomiarów impedancji ogniwa. Następnie kliknij Zastosuj, aby skonfigurować pierwszy krok.</li>
		<li>Kliknij ponownie Dodaj krok, wprowadź 10 minut jako interwał i 48 godzin jako czas trwania migracji i inwazji, a następnie kliknij Zastosuj, aby skonfigurować drugi krok. 
		UWAGA: Pierwszy krok polega na jednorazowym pomiarze bazowym (jedno przemiatanie w odstępie 1 minuty). Drugi etap mierzy impedancję ogniwa na potrzeby eksperymentu (na przykład 289 przemiatania w 10-minutowym odstępie przez 48 godzin) w kołysce. Dostosuj interwał i czas trwania w zależności od projektu eksperymentalnego.</li>
		<li>Przejdź do następnej stacji dokującej i skonfiguruj ją, powtarzając kroki 5.2.3-5.2.7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płyt CIM
	<ol>
		<li>Na godzinę przed rozpoczęciem pomiaru impedancji ogniwa napełnij studzienki dolnej komory płytki CIM 160 μl DMEM zawierającego 10% surowicy lub innych chemoatraktantów.</li>
		<li>Górną komorę, w której znajdują się studzienki pokryte żelem ECM (do inwazji) lub studzienki niepowlekane (do migracji), należy połączyć z dolną komorą.</li>
		<li>Dodać 50 μl pożywki o niskiej surowicy do studzienek górnej komory płytki CIM w celu przeprowadzenia testu migracji komórek i umieścić płytkę CIM w kołysce systemu.</li>
		<li>Kliknij kartę Wiadomość i upewnij się, że wyświetlany jest komunikat Połączenia ok. Płyta CIM jest teraz gotowa do eksperymentu.</li>
		<li>Zmontowaną płytkę CIM należy wstępnie inkubować w inkubatorze CO2 przez 30-60 minut przed analizą komórek w czasie rzeczywistym, aby zaaklimatyzować płytkę CIM do warunków hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza komórek w czasie rzeczywistym i eksport danych
UWAGA: Wykonaj odczyt linii bazowej, rozsiewanie komórek, pomiar impedancji komórek i eksport danych zgodnie z wcześniejszym opisem11.
<ol>
	<li>Odczyt bazowy 
	UWAGA: Linię bazową należy odczytać po zaaklimatyzowaniu płytki CIM i przed dodaniem komórek do studzienek górnej komory.
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk Start dla każdej kołyski. Gdy pojawi się okno Zapisz jako, zapisz plik eksperymentalny, aby wykonać odczyt linii bazowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie komórek
	<ol>
		<li>Wyjmij płytkę CIM z kołyski i umieść ją w szafie bezpieczeństwa biologicznego na uchwycie płytki.</li>
		<li>Dodaj 100 μl (zawierających 100 000 ogniw) elektroporowanych ogniw do studzienek górnej komory płytki CIM zgodnie z programem w jednostce sterującej. Zastosuj metodę odwróconego pipetowania, unikając pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Pozostaw płytkę CIM pod szafą bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że komórki równomiernie rozprowadzają się na dnie studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar impedancji ogniwa
	<ol>
		<li>Przenieś w pełni zmontowaną płytkę CIM z powrotem do odpowiedniej kołyski. Kliknij przycisk Start podstawki, aby rozpocząć pomiar impedancji ogniwa w drugim kroku.</li>
		<li>Kliknij kartę Wykres, a następnie kliknij przycisk Dodaj wszystko i zaznacz pola Średnia i STD DEV, aby wizualizować dane w czasie rzeczywistym. 
		UWAGA: Domyślną opcją kreślenia jest Czas dla osi x i Indeks komórki dla osi y. Sekcja Wybór wykresu umożliwia użytkownikowi wybranie alternatywnych opcji dla osi y: Znormalizowany indeks komórki lub Indeks komórki delta. Po wykonaniu ostatniego zamiatania eksperyment zostaje zakończony, a wyniki są automatycznie zapisywane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksport danych do analizy
	<ol>
		<li>Kliknij zakładkę Wykres i zaznacz pola Średnia i STD DEV, aby skopiować dane dla każdego dołka z osobna.</li>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy obszar kreślenia i wybierz polecenie Kopiuj dane w formacie listy.</li>
		<li>Otwórz pusty plik arkusza kalkulacyjnego, wklej dane, a następnie zapisz plik.</li>
		<li>Wróć do programu analitycznego, kliknij zakładkę Płyta dla każdej kołyski i wybierz opcję Zwolnij, aby zamknąć eksperyment dla kołyski.</li>
		<li>Wróć do pliku arkusza kalkulacyjnego i dostosuj czas nieprzetworzonych danych tak, aby czas rozpoczęcia w drugim kroku stał się rzeczywistym czasem rozpoczęcia pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+cell+motility+to+prevent+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor cell motility to prevent metastasis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).</li>
<li>Eccles, S. A., Box, C., Court, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%2Finvasion+assays+and+their+application+in+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).</li>
<li>Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invaders+exposed%3A+Understanding+and+targeting+tumor+cell+invasion+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 92(2020).</li>
<li>Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+adaptive+glioblastoma%3A+An+overview+of+proliferation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion.</a> Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).</li>
<li>Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-cancer+study+of+copy+number+gain+and+up-regulation+in+human+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes.</a> Life Sciences. 211, 206-214 (2018).</li>
<li>Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-related+genes+increases+with+copy+number+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types.</a> Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Park, T., Large, N., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+glioblastoma+phenotypes+in+vitro+establishes+cell+migration+as+a+robust+readout+of+Crk+and+CrkL+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390(2021).</li>
<li>Urcan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+xCELLigence+impedance+analysis+of+the+cytotoxicity+of+dental+composite+components+on+human+gingival+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Materials%22%5BJournal%5D)">Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts.</a> Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).</li>
<li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability%2C+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536(2012).</li>
<li>Mudduluru, G., Large, N., Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance-based+real-time+measurement+of+cancer+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), e60997(2020).</li>
<li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li>
<li>Park, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+and+CrkL+as+therapeutic+targets+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment.</a> Cells. 10 (4), 739(2021).</li>
<li>Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dawn+of+mRNA+vaccines%3A+The+COVID-19+case%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case.</a> Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).</li>
<li>Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+effects+of+mRNA+vaccines+in+malignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases.</a> Molecular Cancer. 20 (1), 52(2021).</li>
<li>Kwon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+synthetic+mRNA%3A+In+vitro+synthesis+of+mRNA+and+its+applications+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 156, 172-193 (2018).</li>
<li>Campillo-Davo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+messenger+RNA+electroporation+for+physical+gene+delivery+in+immune+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy.</a> Pharmaceutics. 13 (3), 396(2021).</li>
<li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+requires+CT10+regulator+of+kinase+%28Crk%29+and+Crk-like+%28CrkL%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li>
<li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li>
<li>Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+comparison+between+conventional+%28method-I%29+and+reverse+%28method-Ii%29+pipetting%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting.</a> Clinical Chemistry. 30 (6), 958(1984).</li>
<li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences%3A+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformation%22%5BJournal%5D)">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li>
<li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRK+proteins+selectively+regulate+T+cell+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+adaptor+protein+Crk+is+indispensable+for+malignant+feature+of+glioblastoma+cell+line+KMG4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+Abl+kinase+by+Crk+Y251+and+Abi1+controls+invasive+phenotypes+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma.</a> Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+tyrosine+phosphorylation+regulates+PDGF-BB-inducible+Src+activation+and+breast+tumorigenicity+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li>
<li>Raudenska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engine+shutdown%3A+Migrastatic+strategies+and+prevention+of+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases.</a> Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).</li>
<li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro%3F+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).</li>
<li>Farasani, A., Darbre, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+exposure+to+triclosan+increases+migration+and+invasion+of+human+breast+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro.</a> Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).</li>
<li>Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+flubendazole+on+adhesion+and+migration+in+SW480+and+SW620+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).</li>
<li>Lago-Baameiro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARK7%2FDJ-1+inhibition+decreases+invasion+and+proliferation+of+uveal+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tumori%22%5BJournal%5D)">PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells.</a> Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).</li>
<li>Escalona, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knock+down+of+TIMP-2+by+siRNA+and+CRISPR%2FCas9+mediates+diverse+cellular+reprogramming+of+metastasis+and+chemosensitivity+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 422(2022).</li>
<li>Mosca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+S-adenosyl-L-methionine+on+the+invasion+and+migration+of+head+and+neck+squamous+cancer+cells+and+analysis+of+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms.</a> International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).</li>
<li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGI174+protein+and+its+functional+domain+peptides+exert+antitumour+effects+on+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma.</a> International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).</li>
<li>Witte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1-induced+cell+migration+in+pancreatic+carcinoma+cells+is+RAC1+and+NOX4-dependent+and+requires+RAC1+and+NOX4-dependent+activation+of+p38+MAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK.</a> Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).</li>
<li>Bui, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aquaporin+3+expression+by+the+AhR+pathway+is+critical+to+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration.</a> Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+in+membrane+repair+capacity+between+cancer+cell+lines+and+a+normal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line.</a> The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Migracja i inwazja są ważnymi cechami komórek nowotworowych. Pomiar ruchliwości komórek nowotworowych i zrozumienie podstawowego mechanizmu, który kontroluje ruchliwość komórek nowotworowych, dostarcza krytycznych informacji na temat interwencji terapeutycznych 2,27. Opracowano kilka metod badania migracji komórek7. Test gojenia się ran za pomocą zadrapań lub wkładek hodowlanych jest prostą i często stosowaną metodą, która zapewnia kontras...

Ruchliwość komórek nowotworowych odgrywa kluczową rolę w przerzutach1,2. Rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych do sąsiednich i odległych zdrowych tkanek utrudnia leczenie raka i przyczynia się do nawrotów3,4. Dlatego tak ważne jest zrozumienie mechanizmów ruchliwości komórek nowotworowych i opracowanie odpowiednich strategii terapeutycznych. Ponieważ wiele komórek nowotworowych ma zmienione profile ekspresji genów, ważne jest, aby zrozumieć, które zmiany w profilu ekspresji genów prowadzą do zmienionej ruchliwości komórek nowotworowych5,6.
Opracowano kilka testów do pomiaru migracji komórek in vitro. Niektóre testy dostarczają tylko ograniczonych informacji, ponieważ pozwalają na pomiary tylko w określonych punktach czasowych, podczas gdy inne oferują wyczerpujące informacje na temat ruchliwości komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym7. Chociaż wiele z tych testów ruchliwości komórek może dostarczyć wyników ilościowych w danym czasie lub punkcie końcowym, nie dostarczają one wystarczająco szczegółowych informacji na temat dynamicznych zmian w tempie migracji komórek w okresie eksperymentalnym. Ponadto badanie potencjalnych zmian w szybkości migracji komórek może być trudne w zależności od projektu eksperymentalnego, typów komórek i liczby komórek. Co więcej, efekty nieskomplikowanych zabiegów mogą być badane za pomocą prostej kwantyfikacji tradycyjnych testów ruchliwości, ale bardziej wyrafinowana kwantyfikacja może być wymagana do badania złożonych efektów różnych terapii skojarzonych8.
Opracowano przyrząd do monitorowania prądu elektrycznego na dnie płytki mikromiareczkowej pokrytej mikroelektrodami9. Przyleganie komórek do powierzchni studzienki utrudnia przepływ elektronów, a impedancja koreluje z ilościowym i jakościowym wiązaniem komórek. Obecność mikroelektrod na dnie studni pozwala na pomiar adhezji, rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek. Obecność mikroelektrod pod mikroporowatą membraną górnej komory pozwala na pomiar migracji komórek i inwazji do dolnej komory, przy czym górna komora jest pokryta białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aby umożliwić inwazję10.
Poprzednio wykazano, że oparte na impedancji pomiary migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym dostarczają danych w czasie rzeczywistym podczas całego eksperymentu, a także natychmiastowych porównań i kwantyfikacji w różnych warunkach eksperymentalnych11. W artykule dotyczącym tej metody wywołano knockdown genów w celu zbadania roli białek będących przedmiotem zainteresowania w migracji i inwazji komórek nowotworowych. Ponieważ pełnoobjawowy efekt knockdown genu w testowanych warunkach eksperymentalnych trwał 3-4 dni po elektroporacji z małymi interferującymi RNA (siRNA)8, komórki zostały ponownie posiane po elektroporacji i ponownie zebrane 3 dni później w celu opartego na impedancji pomiaru migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.
CT10 regulator kinazy (Crk) i Crk-like (CrkL) to białka adaptorowe, które pośredniczą w interakcjach białko-białko poniżej różnych szlaków kinazy receptorowej czynnika wzrostu i niereceptorowej kinazy tyrozynowej 12. Podwyższony poziom białek Crk i CrkL przyczynia się do złego rokowania w kilku nowotworach u ludzi, w tym glejaku13. Nie jest jednak jasne, w jaki sposób podwyższony poziom białek Crk i CrkL prowadzi do złego rokowania. Dlatego ważne jest, aby określić wpływ nadekspresji Crk i CrkL na funkcje komórek nowotworowych. Wcześniej przeprowadzono badanie nokaucji genów, aby wykazać, że endogenne poziomy białek Crk i CrkL są wymagane do migracji i inwazji komórek glejaka8. W tym przypadku opracowano zmodyfikowany system testów, aby zająć się wpływem nadekspresji Crk i CrkL na migrację i inwazję komórek nowotworowych.
Ostatnio, synteza mRNA in vitro i jej zastosowania terapeutyczne przyciągnęły ponownie uwagę ze względu na rozwój szczepionek mRNA przeciwko SARS-CoV-2 (recenzowane przez Verbeke et al.14). Ponadto poczyniono niezwykłe postępy w stosowaniu syntetycznego mRNA w leczeniu nowotworów i innych chorób15,16. Elektroporacja komórek jest skuteczną metodą dostarczania syntetycznego mRNA i indukowania przejściowych modyfikacji genetycznych (przejrzane przez Campillo-Davo i wsp.17), a zastosowanie syntetycznego mRNA umożliwia szybką i wydajną ekspresję genów w unieśmiertelnionych fibroblastach18. W tym artykule metodycznym połączono nadekspresję genów przy użyciu syntetycznego mRNA z analizami komórek w czasie rzeczywistym w celu zbadania migracji i inwazji komórek nowotworowych. Jednak schemat eksperymentalny stosowany dla siRNA nie działa z syntetyczną transfekcją mRNA, ponieważ poziom białek egzogennych gwałtownie wzrasta i stopniowo spada po transfekcji syntetycznego mRNA18. W związku z tym metoda została zmodyfikowana w celu przeprowadzenia analizy migracji i inwazji komórek w czasie rzeczywistym zaraz po transfekcji bez dodatkowej hodowli komórek.
Ten artykuł o metodzie pokazuje, że połączenie pomiarów w czasie rzeczywistym opartych na impedancji z transfekcją komórek nowotworowych za pomocą syntetycznych mRNA zapewnia szybką i wszechstronną analizę wpływu regulacji w górę genów na migrację i inwazję komórek nowotworowych. W artykule opisano szczegółowe procedury pomiaru, w jaki sposób nadekspresja Crk i CrkL wpływa na migrację i inwazję komórek glejaka. Badając zależny od stężenia wpływ syntetycznego mRNA na migrację komórek nowotworowych, artykuł jasno opisuje, w jaki sposób wzrost poziomu białka stymuluje migrację komórek nowotworowych. Ponadto przedstawiono podejście polegające na różnicowaniu stężenia żelu ECM w celu oceny wpływu zmian w ekspresji genów na inwazję komórek nowotworowych.

<table><tbody><tr><td>AlphaImager HP</td><td>ProteinSimple</td><td>92-13823-00</td><td>System obrazowania w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>&przeciwciało alfa-tubuliny</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Służy do wykrywania białka alfa-tubuliny (rozcieńczenie 1:3,000)</td></tr><tr><td>Płytka CIM 16</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>5665825001</td><td>Płytki do inwazji i migracji komórek</td></tr><tr><td>Przeciwciało Crk</td><td>BD Biosciences</td><td>610035</td><td>Służy do wykrywania białek CrkI i CrkII (rozcieńczenie 1:1,500)</td></tr><tr><td>Przeciwciało CrkL</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-319</td><td>Służy do wykrywania białka CrkL (rozcieńczenie 1:1,500)</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Pożywka (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>302002</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Bufor stosowany do mycia komórek</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH30910.03</td><td>Suplement pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Heracell VIOS 160i Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030285</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW koza przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG</td><td>Li-Cor</td><td>926-32210</td><td>Przeciwciało drugorzędowe do analizy Western blot (rozcieńczenie 1:10 000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW kozie przeciwciało anty-królicze IgG drugorzędowe</td><td>Li-Cor</td><td>926-32211</td><td>Przeciwciało drugorzędowe do analizy Western blot&nbsp; (Rozcieńczenie 1:10 000)</td></tr><tr><td>Chlorek litu&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9480</td><td>Używany do wytrącania RNA</td></tr><tr><td>Matrigel Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Żel macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)</td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji MEGAscript T7</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td>Używany do syntezy RNA</td></tr><tr><td>Markery Millennium RNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td>Używany do elektroforezy w żelu agarozowym formaldehydowym</td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>ISC BioExpress</td><td>C1301P-ISC</td><td>Służy do rozkręcania komórek</td></tr><tr><td>Mózg myszy QUICK-Clone cDNA</td><td>TaKaRa</td><td>637301</td><td>Źródło genów (insertów) do klonowania</td></tr><tr><td>NanoQuant</td><td>Tecan</td><td>M200PRO</td><td>System kwantyfikacji kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>System elektroporacji neonowej &nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>System do elektroporacji1</td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej 10 &micro; Zestaw L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1025</td><td>Zestaw do elektroporacji</td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej 100 &micro; Zestaw L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td>Zestaw do elektroporacji</td></tr><tr><td>NorthernMax bufor żelowy denaturujący</td><td>Invitrogen</td><td>AM8676</td><td>Używany do elektroforezy w żelu agarozowym formaldehydowym</td></tr><tr><td>NorthernMax Barwnik obciążeniowy</td><td>formaldehydowy Invitrogen</td><td>AM8552</td><td>Używany do elektroforezy w żelu agarozowym formaldehydowym</td></tr><tr><td>Bufor biegowy NorthernMax</td><td>Invitrogen</td><td>AM8671</td><td>Używany do elektroforezy w żelu agarozowym formaldehydowym</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Teknova</td><td>W3331</td><td>Używany do różnych reakcji podczas syntezy mRNA</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imager</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>Imager do analizy Western blot</td></tr><tr><td>pcDNA3.1/myc-His</td><td>Invitrogen</td><td>V80020</td><td>Wektor, do którego sklonowano inserty (mysie cDNA CrkI i CrkL)</td></tr><tr><td>pFLAG-CMV-5a</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7523</td><td>Źródło znacznika epitopu LGR</td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2069</td><td>Używany do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560L</td><td>Używany do linearyzacji plazmidów do syntezy mRNA</td></tr><tr><td>Zestaw do ogonów poli(A)</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td>Używany do reakcji ogona poli(A)</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowej z polistyrenu (styl 100 x 20 mm)</td> <td>Corning</td><td>353003</td><td>Używany do hodowli komórek przed transfekcją</td></tr><tr><td>Polistyrenowe naczynie do hodowli tkanek (35 x 10 mm)</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Służy do hodowli transfekowanych komórek</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td>Służy do usuwania białka w mieszaninie reakcyjnej</td></tr><tr><td>Oczyszczacz Axiom Klasa II, typ C1</td><td>Labconco Corporation</td><td>304410001</td><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego do sterylnego obchodzenia się z komórkami</td></tr><tr><td>Bufor do ponownego zawieszania R</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Bufor wchodzący w skład zestawów do elektroporacji, MPK1025 i MPK10096. Bufor służy do regeneracji ogniw przed elektroporacją, a jego skład jest informacją zastrzeżoną.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Roztwór do dekontaminacji RNA</td></tr><tr><td>Berło</td><td>Millipore</td><td>C85360</td><td>Ręczny automatyczny licznik komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw 2'-O-metylotransferazy</td><td>ScriptCap Cellscript</td><td>C-SCMT0625</td><td>Używany do reakcji cappingu</td></tr><tr><td>System capCap m7G</td><td>Cellscript</td><td>C-SCCE0625</td><td>Służy do reakcji capping</td></tr><tr><td>Roztwór dodecylosiarczanu sodu</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td>Detergent stosowany w reakcji proteinazy K</td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend XT</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004532</td><td>Wirówka stołowa do odwirowania komórek</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Służy do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>U-118MG&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB15</td><td>Adherentna linia komórkowa pochodząca od ludzkiego pacjenta z glejakiem</td></tr><tr><td>Przeciwciało Winkuliny</td><td>Sigma</td><td>V9131</td><td>Służy do wykrywania białka winkuliny (rozcieńczenie 1:100 000)</td></tr><tr><td>xCELLigence RTCA DP</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>380601050</td><td>Instrument używany do analizy</td></tr> <tr><td>komórek w czasie rzeczywistym1Parametry elektroporacji oraz inne powiązane informacje dla różnych linii komórkowych są dostępne na stronie internetowej producenta (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mrna

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Komórki nowotworowe są bardzo ruchliwe i inwazyjne oraz wykazują zmienione wzorce ekspresji genów. Wiedza o tym, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów regulują migrację i inwazję komórek nowotworowych, jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów infiltracji komórek nowotworowych do sąsiednich zdrowych tkanek i przerzutów. Wcześniej wykazano, że knockdown genów, a następnie oparty na impedancji pomiar w czasie rzeczywistym migracji i inwazji komórek nowotworowych umożliwia identyfikację genów wymaganych do migracji i inwazji komórek nowotworowych. W ostatnim czasie szczepionki mRNA przeciwko SARS-CoV-2 zwiększyły zainteresowanie wykorzystaniem syntetycznego mRNA do celów terapeutycznych. W tym przypadku metoda wykorzystująca syntetyczne mRNA została zmieniona w celu zbadania wpływu nadekspresji genów na migrację i inwazję komórek nowotworowych. Badanie to pokazuje, że zwiększona ekspresja genów za pomocą syntetycznej transfekcji mRNA, a następnie pomiar w czasie rzeczywistym oparty na impedancji, może pomóc w identyfikacji genów, które stymulują migrację i inwazję komórek nowotworowych. Niniejsza praca metodyczna zawiera ważne szczegóły dotyczące procedur badania wpływu zmienionej ekspresji genów na migrację i inwazję komórek nowotworowych.

Białka Crk i CrkL odgrywają istotną rolę w motylości wielu typów komórek, w tym neuronów22, limfocytów T23, fibroblastów18,19 oraz różnych komórek nowotworowych13. Ponieważ zgłoszono podwyższony poziom białek Crk i CrkL w glejakach wielopostaciowych24,25,26, w niniejszej pracy badano wpływ nadekspres...

Wiele genów o podwyższonej regulacji stymuluje migrację i inwazję komórek nowotworowych, co prowadzi do złych rokowań. Określenie, które geny regulują migrację i inwazję komórek nowotworowych, ma kluczowe znaczenie. Protokół ten przedstawia metodę badania wpływu zwiększonej ekspresji genu na migrację i inwazję komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.

Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

Protokół ten pokazuje, że połączenie transakcji RNA przekaźnika czucia z pomiarami migracji i inwazji komórek w czasie rzeczywistym opartymi na impedancji ułatwia identyfikację genu, który stymuluje migrację i inwazję komórek nowotworowych. System analizy komórek w czasie rzeczywistym oparty na impedancji umożliwia ilościowe, ciągłe i kompleksowe monitorowanie migracji komórek nowotworowych po zmianach ekspresji genów. Geny, które mają nadmierną ekspresję guzów i stymulują migrację komórek nowotworowych, można zidentyfikować jako potencjalny cel hamowania przerzutów w terapii raka.Na początek dodaj 10 mikrolitrów 10-krotnego buforu reakcyjnego, 1,5 mikrolitra PNE jeden i 10 mikrogramów plazmidowego DNA do mikroprobówki wirówkowej, aby zlinearyzować plazmidowe DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego. Dodaj wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić objętość reakcji do 100 mikrolitrów. Wymieszaj go, stukając i obracając w dół, a następnie inkubuj mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Ponownie odwiruj i dodaj pięć mikrolitrów 10% SDS i jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr proteinazy K klasy RNA do mieszaniny reakcyjnej przed zmieszaniem i odwirowaniem. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze 50 stopni Celsjusza dodaj po dwa mikrolitry 10-krotnego buforu transkrypcyjnego, ATP, GTP, UTP, CTP i T7 oraz jeden mikrogram zlinearyzowanego DNA do mikroprobówki wirówkowej w celu syntezy RNA za pośrednictwem polimerazy T7. Dodaj wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić objętość reakcji do 20 mikrolitrów.Po odwirowaniu w dół inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny w celu syntezy RNA. Następnie odkręć i dodaj jeden mikrolitr DNA i dotknij przed 15 minutami inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć matrycę DNA. Rozpocznij wytrącanie RNA chlorkiem litu, dodając 10 mikrolitrów 7,5-molowego chlorku litu do mieszaniny reakcyjnej.Po stukaniu i odkręceniu inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 30 minut. W celu zamknięcia podgrzej próbkę RNA w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie umieść ją na lodzie w celu schłodzenia. Następnie dodaj składniki reakcji zamykania i wymieszaj, stukając.Odwirować i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. W przypadku ogonowania poli-A należy odwirować próbkę i dodać składniki reakcji ogonowania poli-A. Następnie postukaj, odwiruj i inkubuj mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.W celu wytrącenia chlorku litu i ilościowego określenia syntetycznego mRNA dodaj 50 mikrolitrów 7,5-molowego chlorku litu i przeprowadź wytrącanie chlorku litu. Wyjąć z zamrażarki porcję bulionu żelowego ECM i przechowywać go na lodzie. Rozcieńczyć 10 miligramów na litr żelu ECM do stężenia roboczego, mieszając 990 mikrolitrów DMEM z 10 mikrolitrami żelu ECM w mikroprobówce wirówkowej.Wymieszać delikatnie pipetując. Dodaj 60 mikrolitrów rozcieńczonego żelu ECM do każdego z 16 dołków górnej komory płytki CIM. Umieścić górną komorę płytki CIM ze zdjętą pokrywą płytki na ochronnym arkuszu z tworzywa sztucznego w inkubatorze dwutlenku węgla na około cztery godziny, aby utworzyć warstwę żelu.W celu elektroporacji dodaj jeden mililitr DPBS do zawiesiny komórek nowotworowych w każdej probówce. Dotknij zawieszenia ogniwa i obróć trzy razy w dół przez 10 sekund. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety.Dodaj 110 mikrolitrów buforu do respensji R do osadu komórkowego, aby uzyskać 0,1 miliona komórek w 10 mikrolitrach. Dodaj syntetyczne mRNA do osadu komórkowego, aby uzyskać stężenie od 0,2 do 20 nanogramów na mikrolitr, w zależności od pożądanego poziomu ekspresji. Delikatnie wymieszaj i ponownie zawieś osad komórkowy, stukając.Następnie należy elektroporować 10 mikrolitrów zawiesiny ogniwa za pomocą systemu elektroporacji pod napięciem 1 350 woltów przez 10 milisekund za każdym razem trzema impulsami. Po zakończeniu przenieś elektroporowane ogniwa do nowej mikroprobówki wirówkowej z 1,1 mililitra DMEM zawierającego 0,5% FBS. Otwórz program do analizy, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania do analizy komórek w czasie rzeczywistym.Po otwarciu opcji ustawień domyślnego wzorca eksperymentu wybierz opcję uruchamiania trzech eksperymentów oddzielnie. Otwórz każdą kołyskę, klikając zakładkę z numerami. Następnie kliknij kartę notatek z eksperymentu.Wybierz folder i zapisz dane, wprowadzając nazwę eksperymentu. Kliknij kartę układu i wybierz cztery studnie na raz, aby skonfigurować poczwórne zduplikowane studzienki dla każdego warunku uzdatniania. Wprowadź przykładowe informacje i kliknij przycisk Zastosuj.Kliknij kartę harmonogramu, a następnie dodaj krok, aby ustawić dwuetapowy tryb pomiarów impedancji ogniwa. Następnie kliknij Zastosuj, aby skonfigurować pierwszy krok. Kliknij ponownie dodaj krok i wprowadź 10 minut jako interwał i 48 godzin dla czasu trwania migracji i inwazji.Następnie kliknij Zastosuj, aby skonfigurować drugi krok. Na godzinę przed pomiarem impedancji ogniwa dodaj 160 mikrolitrów DMEM zawierającego 10% surowicy lub innych atraktantów chemioterapii do studzienek dolnej komory płytki CIM. Górną komorę zawierającą studzienki pokryte żelem ECM należy zmontować do inwazji lub studzienki niepowlekane do migracji, z dolną komorą.Do testu migracji komórek dodaj 50 mikrolitrów pożywki o niskiej surowicy do studzienek górnej komory płytki CIM. Umieść płytkę CIM i kołyskę systemu w inkubatorze CO2. Kliknij zakładkę wiadomości.Gdy połączenie jest w porządku, wyświetlany jest komunikat, płyta CIM jest gotowa do eksperymentu. Zmontowaną płytkę CIM należy wstępnie inkubować w inkubatorze dwutlenku węgla przez 30 do 60 minut przed analizą komórek w czasie rzeczywistym, aby zaaklimatyzować płytkę CIM do warunków hodowli. Aby uzyskać odczyt bazowy, kliknij przycisk Start dla każdej podstawki.Gdy pojawi się okno Zapisz jako, zapisz plik eksperymentalny, aby wykonać odczyt linii bazowej. W celu umieszczenia w komorze wyjmij płytkę CIM z kołyski i umieść ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego na uchwycie płytki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów elektroporowanych ogniw zawierających 100 000 ogniw do studzienek górnej komory płytki CIM i pozostaw płytkę CIM pod szafą bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut w temperaturze pokojowej.Zmierz impedancję ogniwa, przesuwając w pełni zmontowaną płytkę CIM z powrotem do odpowiedniej podstawki. Rozpocznij pomiar impedancji ogniwa w drugim kroku, klikając przycisk start podstawki i zakładkę wykresu. Następnie kliknij przycisk dodaj wszystko i zaznacz pola średniej i odchylenia standardowego, aby wyświetlić dane w czasie rzeczywistym.Elektroporacja komórek glejaka U 118 mg z różnymi stężeniami syntetycznego mRNA cracku jednego spowodowała zależny od stężenia białka oznaczonego flagą crack one jeden dzień po transfekcji. 0,2 i dwa nanogramy na mikrolitr mRNA doprowadziły do niewykrywalnej lub skromnej ekspresji egzogennego białka crack one. 20 nanogramów na mikrolitr mRNA spowodowało wyższy poziom ekspresji niż endogenne białko crack one.Test migracji komórek wykazał, że elektroporacja wynosiła 0,2 lub dwa nanogramy na mikrolitr, pęknięcie jednego mRNA nie wpłynęło znacząco na migrację komórek. Jednak elektroporacja z 20 nanogramami na mikrolitr pęka jeden mRNA doprowadziła do wyraźnej stymulacji migracji komórek, przy czym więcej komórek migrowało między dwiema a 13 godzinami, ujawniając, że migracja komórek glejaka była stymulowana przez wzrost poziomu białka pęknięcia pierwszego. Elektroporacja z syntetycznym mRNA cracku L doprowadziła do silnej ekspresji białka L oznaczonego flagą pękniętego L dzień po transfekcji.Inwazja komórek kontrolnych zwalniała wraz ze wzrostem stężenia białka ECM. Pęknięcie L nad ekspresją komórek wykazało zależny od stężenia żelu ECM spadek inwazji komórek. Porównanie między komórkami kontrolnymi i nadekspresyjnymi pęknięcia L przy różnych stężeniach żelu ECM wykazało, że nadekspresja pęknięcia L generalnie stymulowała inwazję komórek przez warstwę żelu ECM.Wyniki sugerują również, że na obie populacje komórek w różny sposób wpłynęło rosnące stężenie żelu ECM w różnych punktach czasowych. Komórki powinny być ponownie zawieszone szybko, delikatnie i całkowicie w elektroporacji ponownie zawieszonego pęcherzyka R, ponieważ długa inkubacja komórek w zawieszonym pęcherzyku R sprawia, że komórki są niezdrowe. Szybko i wolno migrujące komórki nowotworowe można wyizolować w celu scharakteryzowania różnic między dwiema populacjami komórek.

real-time-quantitative-measurement-tumor-cell-migration-invasion

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Ta metoda pozwala na monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym oraz ilościowe pomiary różnych parametrów migracji komórkowej, takich jak prędkość, przemieszczenie i wektor prędkości. W przeciwieństwie do metod tradycyjnych, to podejście w czasie rzeczywistym nie opiera się na ilościowych pomiarach migracji w punkcie końcowym; zamiast tego umożliwia ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów.

Ilościowa analiza przypadkowej migracji komórek z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse

Przepływ płynu śródmiąższowego jest zwiększony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W niniejszej pracy opisujemy technikę nakładania przepływu płynu śródmiąższowego na komórki zatopione w macierzy, a następnie pomiaru jego wpływu na inwazję komórek. Technika ta może być łatwo zaadaptowana do badania innych układów.

Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Test ścieżki motylości fagokinetycznej jest metodą stosowaną do oceny ruchu komórek. W szczególności test ten mierzy w sposób ilościowy chemokinezę (losową motylość komórek) w czasie. Metoda ta wykorzystuje zdolność komórek do tworzenia mierzalnego śladu ich ruchu na szkiełkach nakrywkowych powlekanych koloidalnym złotem.

Ilościowa ocena migracji komórek z wykorzystaniem testu ruchliwości w śladach fagokinetycznych

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Test inwazji komórkowej in vitro służy do pomiaru potencjału przerzutów raka poprzez ilościowe określenie potencjału komórkowego do inwazji i migracji za pomocą wkładek do hodowli komórkowych zawierających matrycę białkową. Komórki są zmuszane do migracji przez matrycę białkową i porowatą błonę w kierunku chemoatraktantu, a następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii świetlnej.

Zastosowanie mysich komórek nowotworowych sutka w teście inwazji in vitro jako miary zachowania komórek onkogennych

Rak jest chorobą śmiertelną ze względu na jego zdolność do dawania przerzutów do różnych narządów. Określenie zdolności komórek nowotworowych do migracji i inwazji w różnych warunkach leczenia ma kluczowe znaczenie dla oceny strategii terapeutycznych. Protokół ten przedstawia metodę oceny zdolności przerzutowych linii komórkowej raka glejaka w czasie rzeczywistym.

Oparty na impedancji pomiar migracji i inwazji komórek rakowych w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę ilościowego pomiaru migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA. Technika oparta na impedancji umożliwia identyfikację genów stymulujących migrację.

Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

Przeglądaj więcej filmów